Nuestras sociedades necesitan soluciones para reducir el consumo de recursos, así como de gases de efecto invernadero (GHG en inglés). La identificación de los residuos como un recurso valioso puede ayudar a reducir el consumo de recursos y en consecuencia las emisiones de GHG. Por lo tanto, el enfoque ha sido originalmente puesto en la recuperación y el reciclaje. Sin embargo, los gestores de residuos y los investigadores han destacado la reciente importancia de los residuos comercializados en mercados globales. Esta perspectiva global podría afectar los ahorros de emisiones de GHG atribuidas al reciclaje. Por lo tanto, el objetivo de esta tesis es en primer lugar calcular y evaluar las emisiones de GHG de la gestión en España de los residuos sólidos municipales (MSW, en inglés). En segundo lugar un enfoque especial se pone en las emisiones de GHG del reciclaje teniendo en cuenta el mercado y el comercio internacional, especialmente para los residuos de papel, aluminio y plástico. Una nueva herramienta llamada CO2ZW ®, el análisis de ciclo de vida consecuencial (CLCA en inglés) y el análisis del flujo de materiales (MFA en inglés) se aplicaron para las evaluaciones de GHG y de recursos. La aplicación de la CO2ZW ® para evaluar la gestión de los MSW confirmó que existe un alto potencial para la mitigación del cambio climático en España a través del aumento de la recuperación material junto con la reducción de la eliminación de los vertederos. La aplicación del MFA demostró que existe una considerable acumulación de productos de papel, aluminio y plástico que en los próximos años se convertirá en residuos pero el incremento de la oferta de residuo probablemente será exportado. Por otra parte, bajo el supuesto de que el reciclaje evita la producción de materia prima, se determinó también que el reciclaje evita emisiones de GHG. Sin embargo, los residuos pueden ser reciclados en España o en el extranjero, y el reciclaje puede sustituir la producción mundial o la española. Las emisiones de GHG varían en cada caso. Las producciones mundiales más competitivas de pulpa virgen, aluminio primario y plástico virgen fueron identificadas como los escenarios base bajo el CLCA. Las producciones nacionales españoles fueron evaluados como escenarios alternativos. Los resultados mostraron que los procesos más competitivos generan más emisiones de GHG, ya que son más ineficientes y a menudo se encuentran en países con alto contenido de carbón en su mix eléctrico Por lo tanto, si estos procesos se evitan mediante el reciclaje, más emisiones de GHG son mitigados que si se evitan los procesos españoles. Además, el aumento de la exportación de residuos disminuye los beneficios de GHG en todos los escenarios evaluados con excepción de la exportación de chatarra de aluminio. Los resultados no sólo pueden ayudar a los investigadores para evaluar las emisiones de GHG de la gestión de residuos, pero también pueden ser utilizados por los productores, gestores de residuos y los políticos de residuos para evaluar y proponer la mejor estrategia para reducir el consumo de recursos junto con las emisiones de GHG. / Our societies need solutions to reduce resource consumption as well as greenhouse gas (GHG) emissions. Identifying waste as a valuable resource can help reduce resource consumption and consequently GHG emissions. Therefore, focus has originally been placed on recovery and recycling. However, waste managers and researchers have recently highlighted the importance of wastes traded in global markets. This global perspective could affect the savings of GHG emissions attributed to recycling. Thus, the goal of this thesis is firstly to calculate and evaluate the GHG emissions from municipal solid waste (MSW) management in Spain. Secondly a special focus is put on the GHG emissions of recycling considering the market and the international trade, specifically for waste paper, aluminium old scrap and plastic waste. A new tool called CO2ZW®, consequential life cycle assessment (CLCA) and material flow analysis (MFA) were applied for the GHG and resource assessments. The application of the CO2ZW® to evaluate the MSW management confirmed that there is a high potential for climate change mitigation in Spain through the increase of material recovery along with reducing disposal to landfills. The application of MFA showed that there is a considerable accumulation of paper, aluminium and plastics products which in coming years will become waste but the increase in waste supply will probably be exported. Moreover, under the assumption that recycling avoids raw material production, it was also determined that recycling avoids GHG emissions. However, waste can be recycled in Spain or abroad, and recycling can substituted global or Spanish raw material production. The GHG emissions varied in each case. The most competitive global productions of virgin pulp, primary aluminium and virgin plastic were identified as the base scenarios under CLCA. The Spanish national productions were assessed as alternative scenarios. Results showed that the most competitive processes generate more GHG emissions as they are more inefficient and they are often located in countries with high hard coal content in their electricity mixes. Therefore, if these processes are avoided by recycling, more GHG emissions are mitigated than if the Spanish processes are avoided. In addition, increasing the export of waste decreases the GHG benefits for all scenarios evaluated except for the aluminium old scrap export. The results not only help researchers to evaluate the GHG emissions from waste management but also can be used by producers, waste managers and waste politicians to evaluate and propose the best strategy to reduce the resource consumption and the GHG emissions.

Aquesta tesis s’emmarca en el camp de les carboxipeptidases citosòliques de mamífers, centrant-­‐se particularment en els membres 2 i 3 d’aquesta subfamília de metalocarboxipeptidases. Aquest treball constitueix el primer estudi sobre la funció d’aquests enzims a través d’aproximacions in silico, in vitro i in vivo. Aquesta tesis consta de les parts descrites a continuació. El primer capítol introdueix el camp de les matalocarboxipeptidases, els microtúbuls, les modificacions post-­‐traduccionals de la tubulina i estableix els objectius de la tesi. El segon capítol és una compilació dels procediments experimentals i materials utilitzats en el treball experimental. El tercer capítol presenta la caracterització funcional de la carboxipeptidasa citosòlica 3 humana. Els resultats d’aquest estudi han estat la base pel quart capítol, on es descriu la funció de la CCP2. Ambdues CCP2 i CCP3 isoformes de ratolí s’estudien mitjançant enginyeria de proteïnes i utilitzant els models de ratolí knockout de CCP2 i CCP3. Els capítols III i IV es subdivideixen en un resum del capítol, els resultats que descriuen el detall dels descobriments i una discussió. A continuació es presenta una discussió general sobre CCP2 i CCP3, el seu rol en la cèl·∙lula i en el context de la subfamília de carboxipeptidases que, en mamífers, consta de sis gens codificants per enzims amb activitat deglutamilasa. La tesis finalitza amb un resum de les conclusions. El capítol IV juntament amb els experiments de modelat estructural del capítol III són la base de la següent publicació científica: Tort O, Tanco S, Rocha C, Bièche I, Seixas C, Bosc C, Andrieux A, Moutin MJ, Avilés FX, Lorenzo J, Janke C. The cytosolic carboxypeptidases CCP2 and CCP3 catalyze posttranslational removal of acidic amino acids. MBoC. doi:10.1091/mbc.E14-­‐06-­‐1072 / This thesis is situated in the field of the mammalian cytosolic carboxypeptidases, particularly focusing in members 2 and 3 from this subfamily of metallocarboxypeptidases. This work gives insight for the first time into the role of those enzymes by in silico, in vitro and in vivo approaches. The thesis is divided in parts as described below. The first chapter introduces the fields of metallocarboxypeptidases, microtubules, tubulin posttranslational modifications and settle the objectives of the thesis. The second chapter is a compilation of the experimental procedures and materials used for the experimental work. The third chapter presents the functional characterization of human cytosolic carboxypeptidase 3. The results from this study were the basis for chapter four, where the function of CCP2 is described and both CCP2 and CCP3 mouse isoforms are studied by protein engineering and using CCP2 and CCP3 knock-­‐out mouse models. Chapters III and IV are subdivided into a summary of the chapter, the results describing the findings in detail and a discussion. The following chapter sets a general discussion on CCP2 and CCP3, their role in the cell and in the context of a family, in mammals, of six genes coding deglutamylating enzymes. A final section includes a summary of the conclusions. Chapter IV together with the modeling experiments form Chapter III is the basis of the following scientific paper: Tort O, Tanco S, Rocha C, Bièche I, Seixas C, Bosc C, Andrieux A, Moutin MJ, Avilés FX, Lorenzo J, Janke C. The cytosolic carboxypeptidases CCP2 and CCP3 catalyze posttranslational removal of acidic amino acids. MBoC. doi:10.1091/mbc.E14-­‐06-­‐1072

La via canònica de Wnt és essencial pel desenvolupament embrionari i per la proliferació cel·lular. A més, la desregulació d’aquesta via causa diferents malalties, com per exemple el càncer. La unió del lligand Wnt als receptors específics promou la fosforilació de Dvl-2 per una quinasa directament associada a p120-catenina, la CK1ε, i indueix una cascada d’activació que inhibeix l’activitat de la quinasa GSK-3 sobre la β-catenina. Com a resultat, la β-catenina s’estabilitza i es transloca al nucli on activa l’expressió de gens diana. Els nostres resultats expliquen com la CK1ε és activada ràpidament en Wnt i permet els diferents esdeveniments que acumulen la β-catenina. Prèviament s’havia descrit que la CK1ε presenta un domini autoregulador que inhibeix l’activitat quinasa de la CK1ε quan aquest està fosforilat, suggerint que es necessita una fosfatasa encara no descrita perquè s’activi la senyalització de Wnt. En aquest treball es mostra que la PP2A permet la defosforilació de la CK1ε en Wnt, i també s’ha identificat la PR61ε com la subunitat reguladora de la PP2A que controla l’activació de CK1ε. A més, la PR61ε interacciona directament amb el receptor Fz i s’associa al complex LRP5/6-p120-catenina-CK1ε després de l’activació de Wnt. En global, aquests resultats suggereixen que la PR61ε regula específicament la defosforilació de la CK1ε mediada per la PP2A, i té un paper essencial en la senyalització de Wnt. Un altre pas determinant de l’activació de la via de Wnt és la inhibició de l’activitat de la GSK-3, tot i que el mecanisme pel qual s’inactiva la quinasa encara és matèria de debat. S’han proposat dos models per explicar-ho, un dependent del reclutament de la GSK-3 al correceptor LRP5/6 fosforilat, que crea un lloc d’inhibició, i l’altre basat en el segrest de la quinasa dins de cossos multivesiculars (MVBs). Degut a que el nostre grup ha descobert una connexió directa entre les cadherines i la p120-catenina (dues proteïnes involucrades en les unions adherents) amb el correceptor LRP5/6, es va hipotetitzar que les cadherines podrien estar involucrades en l’endocitosi de la GSK-3 dependent dels factors Wnt. Els nostres resultats demostren que el complex receptor de Wnt que conté la GSK-3, s’internalitza dins de MVBs, i que aquesta endocitosi depèn de la dissociació prèvia de la p120-catenina-cadherina del correceptor LRP5/6. La disrupció de la interacció cadherina-LRP5/6 és regulada per la fosforilació de la cadherina i requereix de la separació prèvia de la p120-catenina. D’aquesta manera, mutants de la p120-catenina i de la cadherina que no es dissocien del complex bloquegen el segrest de la GSK-3 dins de MVBs. Aquests mutants inhibeixen l’acumulació de β-catenina, tot i que no de forma total. Aquests resultats expliquen com es segresta la GSK-3 dins dels MVBs i suggereixen que aquest mecanisme d’internalització, juntament amb la inhibició de la GSK-3 per la interacció directa amb l’LRP5/6 fosforilat, són necessaris per la completa estabilització de la β-catenina en Wnt. / Canonical Wnt signalling is essential for embryonic development and cell proliferation. Deregulation of this pathway leads to some diseases, such as cancer. Binding of extracellular Wnt ligands to specific receptors induces the phosphorylation of Dvl-2 protein by CK1ε- associated-p120-catenin kinase, and a cascade of events that inhibit the activity of GSK3 kinase on β-catenin. As a result, β-catenin is stabilized and translocated to the nucleus where it activates the expression of target genes. Our results explain how CK1ε is quickly activated in Wnt signalling, allowing the cascade of events that accumulate β-catenin. It was previously described that CK1ε presents an autoregulation domain which strongly inhibits CK1ε kinase activity when it is phosphorylated, suggesting that a phosphatase is required to activate Wnt signalling. However, which phosphatase dephosphorylates CK1ε in Wnt and how this phosphatase regulates the pathway were not clear. In this study, we have described that PP2A permits the dephosphorylation of CK1ε upon Wnt, and we have also identified PR61ε as the regulatory subunit of PP2A that controls this CK1ε activation. PR61ε directly interacts with Fz receptor, and associates with LRP5/6-p120-catenin-CK1ε complex upon Wnt activation. Taken together, these results suggest that PR61ε specifically regulates PP2A-mediated CK1ε dephosphorylation and plays an essential role in Wnt signaling. Another key step in the pathway is the local inhibition of GSK3 activity on β-catenin, although the mechanism of this inactivation remains unclear. Two models have been proposed, one dependent on the recruitment and subsequent block of GSK3 by phosphorylated LRP5/6 coreceptor that creates an inhibitory site, and another one based on its sequestration into multivesicular bodies (MVBs). Since our group has uncovered a physical link between cadherins and p120-catenin (two proteins involved in adherens junctions) with the Wnt coreceptor LRP5/6, we wonder whether cadherins may be involved in the endocytosis of GSK3 triggered by Wnt factors. Our results demonstrate that Wnt receptor complexes containing GSK3 are internalized into multivesicular bodies and this endocytosis depends on the previous dissociation of p120-catenin and cadherin from LRP5/6 coreceptor. Thus, disruption of cadherin-LRP5/6 interaction is regulated by cadherin phosphorylation and requires the previous release of p120-catenin. Accordingly, p120-catenin and cadherin mutants unable to dissociate from the complex block GSK3 sequestration into MVBs. These mutants substantially inhibit, but do not completely prevent, the β-catenin accumulation caused by Wnt. These results elucidate how GSK3 is sequestered into MVBs and suggest that this mechanism of internalization together with the inhibition of GSK3 by direct interaction with phosphorylated LRP5/6, are both required for complete β-catenin stabilization upon Wnt stimulation.

Les metal·lotioneïnes (MT) constitueixen una superfamília de metal·loproteïnes de baix pes molecular que es caracteritzen pel seu elevat contingut en residus Cys, els quals els confereixen les seues propietats coordinants i reductores. És com a conseqüència d’aquestes propietats que se’ls atribueixen funcions d’homeòstasi i destoxicació de metalls, així com de regulació i protecció en processos redox. Les MT són ubíqües i les seues seqüències són molt diverses. En la present Tesi Doctoral hem tractat d’ampliar els coneixements actuals sobre aquestes metal·loproteïnes i aprofundir en la seua relació estructura-funció. Així, d’una banda s’han analitzat les preferències metàl·liques envers metalls mono- i divalents de les dues isoformes de MT presents en l’eriçó de mar (Strongylocentrotus purpuratus), SpMTA i SpMTB, les quals presenten patrons de Cys alineables. S’ha determinat que SpMTA mostra millors habilitats per a coordinar Zn(II) i Cd(II) que SpMTB i que, en canvi, SpMTB mostra millors propietats per a coordinar Cu(I) que SpMTA. Aquestes preferències metàl·liques s’han relacionat amb una diferenciació funcional en l’organisme. D’altra banda, s’han estudiat els sistemes MT de les plantes de soja (Glycine max) i gira-sol (Helianthus annuus), les quals s’ha vist que sintetitzen representants de les quatre subfamílies en què es divideix la família de les MT de planta, que presenten patrons de Cys no alineables. Així, s’ha determinat que les MT1 i MT2 de gira-sol estudiades (HaMT1 i HaMT2) presenten una major capacitat de coordinació de Cd(II) que les MT1 i MT2 de soja (GmMT1 i GmMT2), probablement a causa del seu major contingut en Cys. A més, s’ha vist que les His C-terminals que ambdues MT3 (GmMT3 i HaMT3) contenen i que es troben semiconservades en la subfamília participen en l’enllaç al Cd(II). MT4 de soja (GmMT4) presenta la mutació natural His54Tyr que trenca amb el patró de Cys i His conservat en la subfamília MT4, la qual s’ha demostrat que suposa una disminució en la capacitat de coordinació de Zn(II). En canvi, tant GmMT4 com MT4 de gira-sol (HaMT4), que presenta el patró típic de Cys i His, presenten capacitats de coordinació de Cd(II) anàlogues, donat que cap de les seues His no participa en l’enllaç al Cd(II). A més, l’estudi de capacitats antioxidants i/o de captadors de radicals lliures de les quatre MT de soja ha permés proposar que la llargària de l’espaiador (regió lliure de Cys) és determinant per a la protecció enfront de l’oxidació de les Cys provocada per l’exposició a peròxid d’hidrogen, així com que Zn-GmMT1 és el complex que ha mostrat les millors propietats per a protegir les cèl·lules davant l’atac de les espècies reactives d’oxigen. / Metallothioneins (MT) constitute a low molecular weight metalloprotein superfamily characterised by their high Cys residue content, which confers them their coordinative and reducing properties. As a result of these properties, MTs are proposed to be involved in homeostasis and metal detoxification functions, as well as in regulation and protection during redox processes. MTs are ubiquitous and their sequences are extremely variable. In this PhD Thesis we have tried to expand the current knowledge about these metalloproteins and to deepen into their structure-function relationship. Thus, on the one hand, the metallic preferences towards mono- and divalent metal ions of the two MT isoforms present in sea urchin (Strongylocentrotus purpuratus), SpMTA and SpMTB, which display alignable Cys patterns, have been analysed. It has been determined that SpMTA shows better Zn(II)- and Cd(II)-binding abilities than SpMTB, and that, on the contrary, SpMTB shows better Cu(I)-binding abilitites than SpMTA. These metallic preferences have been related to a functional differentiation within the organism. On the other hand, the MT systems from the soybean (Glycine max) and sunflower (Helianthus annuus) plants have been studied, which have been proven to synthesise representatives of the four subfamilies in which the plant MT family is divided, and that show non-alignable Cys patterns. Thus, it has been shown that sunflower MT1 and MT2 (HaMT1 and HaMT2) display a greater Cd(II)-binding capacity than MT1 and MT2 from soybean (GmMT1 and GmMT2), probably due to their higher Cys content. In addition, it has been shown that the C-terminal His present in both MT3 (GmMT3 and HaMT3), which are semiconserved within this subfamily, are involved in Cd(II) coordination. Soybean MT4 (GmMT4) presents the natural His54Tyr mutation that breaks the highly conserved Cys and His pattern in MT4 subfamily, which has been shown to provoke a decrease in its Zn(II)-binding capacity. However, both GmMT4 and sunflower MT4 (HaMT4), which presents the typical MT4 Cys and His pattern, show analogous Cd(II) coordination capacities, since none of their His are involved in Cd(II) binding. In addition, the study of the antioxidant and/or free radicals scavenging capacities of the four soybean MTs has allowed to propose that the length of the spacer (Cys-free region) is crucial to protect Cys from the oxidation caused by hydrogen peroxide exposure, and that the Zn-GmMT1 complex has been the best suited to protect the cells against the attack by reactive oxygen species.

El VIH és un patogen intracel·lular obligat i per tant està totalment subjecte als recursos intracel·lulars disponibles. El tractament antiretroviral actual suprimeix la replicació viral però no evita la persistència i la proliferació de les cèl·lules infectades de forma latent, posant en evidència la necessitat de desenvolupar noves estratègies que aconsegueixin eliminar de forma definitiva el virus. El descobriment de nous factors cel·lulars del VIH pot aportar noves dianes per al desenvolupament d’aquestes estratègies. Diversos estudis de cribatge i d’identificació de gens han identificat un número molt elevat de factors cel·lulars del VIH. Per poder traslladar el coneixement científic a la clínica cal un estudi més acurat que defineixi els mecanismes funcionals i la regulació de cadascun d’aquests factors. Partint de l’estudi sobre la dependència del VIH al complex proteic Mediator (MED) i per altra banda de la restricció del VIH mitjançada pel factor antiviral SAMHD1, en aquesta tesi demostro com en les interaccions virus-hoste sovint hi ha un comú denominador en quant a la seva implicació en el metabolisme cel·lular. Aquest tret comú suggereix que els factors cel·lulars del VIH, tot i que en la seva relació estreta amb el virus el potenciïn o l’inhibeixin, alhora sempre són modulats per mecanismes complexes associats a la regulació cel·lular que finalment són els què governen la replicació viral. S’inclou una avaluació de l’activitat MED sobre la replicació del VIH amb la identificació de 9 sobre 28 proteïnes del complex MED que de forma significativa afecten la replicació del VIH, sempre en una etapa posterior a la integració. D’entre les subunitats MED identificades algunes tenen un rol predominant en la transcripció de gens virals inicials i d’altres en la generació de transcrits virals més tardans, però totes comprometen la transcripció del VIH que és induïda per la proteïna viral Tat. Els assaigs de coimmunoprecipitació, a més, han suggerit que aquesta dependència passa per una interacció física entre MED i Tat. D’entre l’ampli grup de proteïnes cel·lulars que modulen el VIH, només algunes inhibeixen el virus. SAMHD1 ho aconsegueix bloquejant l’enzim del VIH transcriptasa inversa. La seva regulació sobre els nivells de dNTPs intracel·lulars s’investiga al llarg del segon capítol. L’activitat de SAMHD1 influencia la potència dels inhibidors de la transcriptasa inversa anàlegs a nucleòtids, de manera que una reducció intracel·lular dels nivells de SAMHD1 porta a una disminució significativa de la sensibilitat del VIH enfront els inhibidors anàlegs a Timidina. Un estudi molecular més extens ha permès identificar que en els limfòcits T CD4+ proliferants i en els macròfags s’expressa una forma fosforilada de SAMHD1 que correspon amb la susceptibilitat a la infecció. Específicament s’ha identificat CDK6 i ciclina D3 com un complex regulador de CDK2, que alhora controlaria la progressió a cicle cel·lular i la fosforilació de SAMHD1 per tal d’inactivar-lo en cèl·lules T i en macròfags, fent-los susceptibles a la infecció. La inhibició de CDKN1A (ó p21) porta a un alleujament en la restricció de VIH modulada per SAMHD1, generant més replicació viral. L’inhibidor de CDK6 palbociclib confirma la via de senyalització proposada ja que bloqueja efectivament la fosforilació de SAMHD1, els nivells intracel·lulars de dNTP, la transcripció inversa i l’activació de CDK2. En els propers anys l’estudi acurat del factors cel·lulars del VIH-1 permetrà el desenvolupament d’estratègies terapèutiques “anti-VIH” basades en fer diana a l’hoste més que en el virus, donant noves propostes que facin front a les limitacions del tractament antiretroviral. / HIV is an obligate intracellular pathogen and its replication is entirely reliant on intracellular resources, depending on its capacity of recruitment and utilization of a wide array of host proteins to complete the viral life cycle. Current antiretroviral treatments generally suppress viral replication but do not avoid persistence and proliferation of latently infected cells over time, thus not curing HIV/AIDS and evidencing the need to develop new strategies that may finally converge in eliminating the virus. The discovery of human cellular factors could provide new targets for the development of these strategies. Previous siRNA-based screenings and whole-genome studies published a high amount of alleged HIV-1 host factors but their functional mechanisms need to be addressed to translate scientific knowledge into the clinic. By studying both the HIV dependency on a protein complex from the cellular transcriptional machinery called Mediator (MED) and the HIV restriction mediated by the antiviral factor SAMHD1 whose mechanism of regulation is still under debate, I show how viral-host interactions usually converge in their implication on cell metabolism, suggesting that identified host factors that either enhance or inhibit HIV-1 are in turn modulated by cell regulation-associated mechanisms that finally govern viral replication. Concretely, we provide an evaluation of the MED complex activity on HIV replication identifying nine out of 28 human MED proteins significantly affecting HIV replication, all pointing at a post-integration step. Moreover, the identified MED proteins modulating the generation of new viral transcripts were differentially affecting early or late stages of HIV-1 transcription, apart from compromising particularly the HIV transcription induced by the HIV-1 protein Tat. Interestingly, co-immunoprecipitation experiments also suggested physical interaction between MED and Tat. Among the high number of cellular proteins modulating HIV, only a few actively inhibit viral replication. SAMHD1 achieves it by blocking the viral reverse transcriptase. Here, the regulation modulating the intracellular dNTP levels is investigated. The influence of SAMHD1 activity on nucleoside reverse transcriptase inhibitors was demonstrated, showing that a reduction of SAMHD1 levels significantly decreased HIV sensitivity solely on thymidine-analogue inhibitors. Proliferating primary CD4+ T cells or macrophages were then observed to express a phosphorylated form of SAMHD1 that corresponded with susceptibility to infection in cell culture and that was not present in non-cycling cells. Identified phosphorylation sites in cycling cells are mainly driven by cyclin-dependent kinases (CDK). In fact, we identified CDK6 and cyclin D3 as an upstream regulator of CDK2 induces SAMHD1 phosphorylation in primary T cells and macrophages. CDK2 is strongly linked to cell cycle progression and coordinates SAMHD1 phosphorylation and inactivation. Knockdown of the cellular CDK2 inhibitor CDKN1A (p21) led to a relief of the SAMHD1 restriction, increasing virus replication. The CDK6 inhibitor palbociclib blocked SAMHD1 phosphorylation, intracellular dNTP levels, HIV-1 reverse transcription and reduced CDK2 activation and its antiviral activity was lost when SAMHD1 was degraded by Vpx. Altogether, our results reinforce the idea that in the following years the deeper study of HIV-1 cellular factors will probably raise the possibility of a new class of “anti-HIV” therapeutics targeting the host rather than the virus, collectively giving new proposals to the unresolved challenge of curing HIV infection and AIDS.

Aquesta Tesi engloba la fabricació mitjançant electrodeposició de capes nanocristal·lines de Cu-Ni en tot el rang de composicions, així com la seva caracterització morfològica (microscòpia electrònica de rastreig i de forces atòmiques), microestructural (difracció de raigs X i microscòpia electrònica de transmissió), mecànica (nanoindentació), magnètica (emprant els magnetòmetres d’efecte Kerr magneto-òptic i superconducting quantum interference device – SQUID-), de resistència a la corrosió (mètode de polarització potenciodinàmica), així com la seva estabilitat tèrmica. El procés d’electrodeposició s’ha realitzat en corrent continu en una cel·la convencional de tres elèctrodes. Els banys utilitzats contenen el mateix tipus de sals metàl·liques (sulfats de Cu i Ni) i additius (citrat, dodecilsulfat de sodi i sacarina), però s’ha variat la relació de concentracions [Cu(II)]/[Ni(II)] per tal d’obtenir capes en tot el rang de composicions (Cu1-xNix). Convé destacar l’important paper que fa la sacarina com a agent refinador de gra, ja que la seva presència en el bany permet obtenir capes llises i nanocristal·lines (mida de cristall ~30 nm) amb propietats mecàniques notablement superiors a capes de composició anàloga amb mides de cristall més grans (~400 nm). Per a tots els banys, un augment en el valor absolut de la densitat de corrent comporta un augment del sobrepotencial i, de retruc, un increment del contingut de Ni en els dipòsits. D’aquesta manera, dins de la sèrie de capes nanocristal·lines fabricades, s’observa que la duresa, la resistència al desgast i a la deformació plàstica i la recuperació elàstica milloren en augmentar el contingut en Ni de l’aliatge. S’han assolit valors de duresa de H = 8.2 GPa en capes amb composició Cu0.13Ni0.87, que són força elevats si es comparen amb els valors de duresa que poden trobar-se a la literatura per a capes de naturalesa similar. Tot i així la presència de Cu també pot ésser beneficiosa per a certes aplicacions on s’hagi de sotmetre el material a temperatures elevades, ja que la seva presència contribueix a augmentar l’estabilitat tèrmica de l’aliatge bo i desplaçant l’inici del creixement de gra i, de retruc, el deteriorament de les propietats mecàniques, cap a temperatures de recuit superiors (p.e. T = 575 K per a Cu0.44Ni0.56) en comparació amb aquelles capes amb continguts més baixos de Cu (p.e. T = 525 K per a Cu0.12Ni0.88 i T = 425 K per a Ni pur). Pel que fa a les propietats magnètiques s’ha observat comportament ferromagnètic modulable en capes amb un contingut de Ni superior al 70 at% i s’han estudiat els canvis en els cicles d’histèresi magnètica amb la temperatura de recuit. Quant a la resistència a la corrosió en medi clorur, aquesta augmenta en incrementar el contingut de Ni dels dipòsits. També s’observa que el procés de nanoestructuració no deteriora de forma significativa la resistència a la corrosió del material. Així doncs queda demostrat que, gràcies a l’elevat grau de modulació que s’aconsegueix en les propietats mecàniques i magnètiques, el Cu-Ni és un bon candidat per a la seva implementació en sistemes electromecànics tant a escala micromètrica com nanomètrica. I per aquest mateix motiu, el treball de Tesi finalitza amb la presentació dels resultats derivats de la miniaturització d’aquest aliatge utilitzant el mateix concepte sintètic, de manera que es demostra la fabricació de matrius ordenades de nanocolumnes de diàmetres compresos entre 100 nm i 200 nm així com la seva composició i caracterització magnètica. / This Thesis dissertation encompasses the fabrication of nanocrystalline Cu-Ni films in all range of compositions by means of electrodeposition and their morphological (using scanning electron and atomic force microscopies), microstructural (by X-ray diffraction and transmission electron microscopy), mechanical (by nanoindentation) and magnetic (using magneto-optical Kerr effect and superconductor quantum interferometer device –SQUID- magnetometers) characterization, as well as their corrosion resistance (by potentiodynamic polarization method) and thermal stability. The electrodeposition process has been carried out by direct current in a conventional three-electrode cell configuration. The baths used throughout the work contain the same metallic salts (Cu and Ni sulphates) and additives (citrate, sodium dodecylsulphate and saccharine), but the [Cu(II)]/Ni(II)] concentration ratio in solution has been changed to obtain Cu-Ni films in all range of compositions (Cu1-xNix). Saccharine exerts a key role as a grain-refining agent since its addition to the bath leads to smooth, nanocrystalline films (crystallite size ~30 nm) with markedly improved mechanical performance compared to films with similar composition but larger crystallite sizes (~400 nm). For all the baths, an increase of the absolute value of the current density causes an increase in the overpotential which, in turns, yields to the deposits with larger Ni contents. Within the fabricated nanocrystalline films series, larger hardness, improved wear resistance and resistance to plastic deformation and larger elastic recovery are observed as the Ni content in the alloy increases. Hardness values around 8.2 GPa have been achieved for Cu0.13Ni0.87 films, which are larger than those found in the literature for films of similar nature. Even so, the presence of Cu can be beneficial for certain applications where the material has to operate at high temperatures. Namely, the presence of Cu increases the thermal stability by delaying grain growth toward higher annealing temperatures (T = 575 K for Cu0.44Ni0.56) as compared to films with lower Cu contents (T = 525 K for Cu0.12Ni0.88 and T = 425 K for pure Ni). Accordingly, a delay in the deterioration of the mechanical properties is seen. Regarding magnetic behaviour, tuneable ferromagnetic behaviour for Ni contents beyond 70 at% has been found and the changes in the magnetic hysteresis loops with the annealing temperature have been explored. Concerning the corrosion resistance in chloride environments, it improves as the Ni content increases in the deposits. It is also shown that the nanostructuring process does not significantly worsen the corrosion resistance of the material. It is thus demonstrated that, owing to their tuneable mechanical and magnetic properties, Cu-Ni alloys are good candidates for their implementation in electromechanical systems both at micro- and nanoscales. For this reason, this Thesis dissertation ends up with the presentation of the results about the miniaturization of this alloy using the same synthetic concept. In this sense, the fabrication of arrays of ordered nanopillars of 100 and 200 nm in diameter is demonstrated and their composition and magnetic properties are disclosed.

Los neuroesteroides son cruciales en la maduración sináptica durante el desarrollo y especialmente la allopregnanolona que, en rata, se sintetiza en forma de pico durante la segunda semana de vida . Estudios previos han demostrado que la alteración de estos niveles postnatales afecta críticamente el desarrollo del sistema nervioso central. Además, hay diversas pruebas experimentales que relacionan la alteración de los neuroesteroides neonatales con alteraciones conductuales en edad adulta. Por tanto, el estudio de los periodos críticos durante el desarrollo del individuo y su cerebro, y entre ellos el papel de los neuroesteroides, es importante en el campo de la psicobiología y las neurociencias, ya que su alteración determina una mayor vulnerabilidad a la psicopatología en edad adulta. Por ello, en la presente tesis doctoral hemos estudiado cómo la alteración de los niveles neonatales de allopregnanolona modifican el comportamiento adulto, focalizando en el rol del hipocampo dorsal. Para ello, hemos llevado a cabo el estudio de la respuesta conductual de exploración, ansiedad y aprendizaje aversivo en respuesta a la administración de neurosteroides en animales adultos a los que se les habían manipulado previamente los niveles de allopregnanolona en edades postnatales. Nuestros resultados demuestran que el hipocampo es (junto con otras áreas) uns estructura relevante en referencia a los efectos moduladores del comportamiento que tienen los neurosteroides y que la modulación de los niveles postnatales de allopregnanolona altera su respuesta. A continuación, y para poder desenmascarar parte de los mecanismos responsables de las alteraciones conductuales observadas en los estudios previos, estudiamos cambios en las subunidades del receptor GABA-A (inducidos por la modulación neonatal de neurosteroides) focalizando en las subunidades alpha4 y delta, debido a que su modulación por parte del neurosteroide allopregnanolona ha sido descrita como su principal mecanismo de acción. Además y dado que durante los periodos postnatales el receptor GABA-A cambia de exitatorio a inibitorio debido al incremento en la expressión de los cotransporadores de cloro y potassio de tipo 2 (KCC2), otro de los objetivos fue examinar como la alteración neonatal de los niveles de allopregnanolona puede afectar a su expresión. Nuestros resultados indican que la alteración neontal de neurosteroides modifica la expresión hipocampal de las subunidades alpha4 y delta de los receptors GABA-A no sólo durante el desarrollo postnatal sino a largo plazo hasta la edad adulta. Por otro lado, también hemos observado que la alteración neonatal de los niveles de allopregnanolona produce cambios en el patrón temporal de expressión del KCC2 en hipocampo, lo cual podría estar indicando una alteración en el tiempo de maduración del receptor GABA-A. Por todo ello, los presentes resultados nos llevan a concluir que el mantenimiento de los niveles de allopregnanolona durante el periodo postnatal son importantes para el desarrollo de la circuitería hipocampal y la respuesta conductual adulta. / Several works have point out the importance of the neurosteroid allopregnanolone for the maturation of the central nervous system and for adult behaviour. The alteration of neonatal allopregnanolone levels in the first weeks of life alters emotional adult behavior. Without discarding other brain structures, some of these behavioral alterations seem to be related to a different functioning of the hippocampus in adult age. We focus here in the study of the importance of neonatal neurosteroid levels for the adult response to novel environmental stimuli, anxiety-related behaviors and aversive learning. Our results show that alteration of neonatal physiological allopregnanolone levels modifies adult behavioural response to intrahippocampal administration of neurosteroids in the adulthood, thereby indicating that some of these effects are related to a different functioning of the dorsal hippocampus, as the behavioral effects (decrease in anxiety and aversive learning) of intrahippocampal allopregnanolone or pregnenolne sulphate infusions in adult age are not present in those subjects that their neonatal allopregnanolone levels were altered. Furthermore, we also explored some of the mechanism that could be underlying this hippocampal affectation. Results indicate that changes can be related to alterations in the expression of gamma-aminobutyric-acid receptors (GABAAR) containing α4 and δ subunits, molecular alterations that can persist into adult age and that can explain, in part, the reported behavioral disturbances. In addition, as during early development GABAAR predominantly produces depolarization and shifts to hyperpolarization in mature neurons depending on the progressive increase of the neuron-specific K+ /Cl- co-transporter 2 (KCC2) (a chloride exporter) levels, we analysed whether alteration of neonatal neurosteroids during development may also affect the progression increase of KCC2 in the hippocampus. Our data indicated that manipulation of allopregnanolone levels during early development modify hippocampal KCC2 expression In conclusion, the results of the present study indicate that the maintenance of physiological neonatal allopregnanolone levels plays an important role for the correct maturation of the hippocampus and for related behavioral responses. Moreover, neonatal allopregnanolone manipulations have a drastic impact on hippocampal GABAAR expression that can lead to an adult altered inhibitory system that responds differently to environmental cues. Finally, we also show that manipulation of neonatal neurosteroids affects KCC2 hippocampal expression, further indicating the relevance of neonatal neurosteroids levels for the hippocampal development.

No description available.

Se ha escogido la técnica PECVD para obtener depósitos de subóxido de silicio, SiOx, de espesores del orden de la micra, sobre substratos de Si de dos pulgadas. Hemos logrado depósitos con contenidos de oxígeno entre 1.3 y 2.0, y un intervalo de índices de refracción comprendidos entre 1.96 (próximo al Si3N4) y 1.46 (SiO2). La estructura (en particular, la porosidad), uniformidad y tensión de las capas son mejores cuanto menor es el contenido de oxígeno. Además, las capas crecidas contienen impurezas en forma de enlaces Si-H, N-H, Si-OH y H2O. El contenido de impurezas varia de forma gradual desde capas pobres en oxígeno con una gran cantidad de enlaces Si-H y N-H, y nulo contenido de Si-OH y H2O, y capas de estructura próxima al óxido estequiométrico, con nulo contenido de enlaces Si-H y N-H, y alto contenido de Si-OH y H2O.Se ha investigado las condiciones de temperatura, potencia y presión de los procesos de depósito, susceptibles de mejora de la calidad de las capas crecidas. El aumento de la temperatura de depósito (hasta 350oC) y de la potencia (hasta 50 W, límite impuesto por la disminución de uniformidad), disminuye el contenido de impurezas de las capas; sin embargo, el aumento gradual de la tensión con el aumento del contenido de oxígeno de las capas, aconseja que los depósitos se crezcan a menores valores de temperatura y potencia en la obtención de capas ricas en oxígeno. Por lo que se refiere a la presión, valores bajos (100 mTorr), favorecen la disminución de impurezas; sin embargo, el aumento del orden estructural que comporta el aumento de la presión (hasta 300 mTorr), inhibe el acomodo de impurezas en capas ricas en oxígeno, por lo que la calidad de los depósitos se verá favorecida procediendo a un aumento de la presión a medida que se crezcan capas con un previsible mayor contenido de Si-OH y H2O.La mejora de las condiciones de depósito no soluciona dos problemas fundamentales; por un lado, no se han podido suprimir las impurezas ni las tensiones de las capas y, por otro, las capas ricas en oxígeno son inestables frente a la humedad. El estudio de la acción de la humedad y los esfuerzos posteriores para estabilizar las capas, al proceder a un recocido térmico a una temperatura inferior a 350oC, dan resultados parciales, siendo los efectos reversibles. Como solución se ha propuesto proceder a un recocido térmico rápido a alta temperatura (950oC) de las capas. Las capas tratadas son estructuralmente compactas e insensibles a la acción exterior de la humedad, no contienen cantidades de impurezas apreciables, excepto un bajo contenido de enlaces Si-H en entornos O3-SiH; además, el nivel de tensiones desaparece en capas ricas en Si y aumenta gradualmente con el contenido de oxígeno, llegando a ser un 50% inferior al de las capas depositadas sin un tratamiento posterior. El índice de refracción se amplia al intervalo 2.32-1.46.

No description available.