La coevolució hoste-paràsit descriu el procés de canvi evolutiu recíproc en dos organismes, hoste i paràsit, que interactuen. La coevolució hoste-paràsit s'ha estudiat fonamentalment a nivell interespecífic, i encara que processos similars poden donar-se també a nivell intraspecific, hi han molt pocs estudis en aquesta línia. A nivell microevolutiu, la dinàmica i la coevolució de les interaccions hoste-paràsit pot dependre en última instancia de la variabilitat genètica i de la seva estructuració en ambdós grups. En el present projecte de tesi, hem escollit les baldrigues del gènere Calonectris diomedea i els seus ectoparàsits, tres especies de polls de la ploma (Halipeurus abnormis, Austromenopon echinatum i Saemundssonia peusi) i una puça (Xenopsylla gratiosa); com a model d'estudi. L'objectiu principal d'aquesta tesi és investigar l'estructuració genètica de les baldrigues del gènere Calonectris i els seus ectoparàsits. Com a objectius específics ens proposem: i) Estudiar l'estructura filogeogràfica de les espècies del complex Calonectris combinant dades morfologiques i moleculars, ii) Estudiar l'estructuració genètica de les poblacions de l'espècie de baldriga cendrosa al llarg de tot el seu rang de distribució i identificar-ne els mecanismes de diferenciació implicats, iii) Estudiar l'estructuració ecològica de la comunitat d'ectoparàsits de la baldriga cendrosa, iv) Investigar la congruència en l'estructuració genètica d'hoste i ectoparàsits. Tanmateix, examinar si una especificitat diferencial per l'hoste es reflecteix en diferències en el grau de similitud de les relacions genètiques d'hoste i ectoparàsits, i finalment v) Avaluar la utilitat dels marcadors intrínsecs com a eines per assignar les baldrigues a les seves poblacions d'origen. Els nostres resultats indiquen: i) Les baldrigues del complex Calonectris mostren una estructura filogeogràfica molt marcada. Tant les dades morfològiques com els anàlisi filogenètics agrupen les poblacions en quatre clades principals d'acord amb les seves distribucions espacials segregades i la taxonomia convencional, ii) Les poblacions de baldriga cendrosa s'estructuren genèticament en dos grups corresponents les subespècies de baldriga cendrosa Atlàntica i Mediterrània. El front oceanogràfic Almeria- Orà apareix com la barrera efectiva entre les dues subespècies, iii) Les comunitats d'ectoparàsits de la baldriga cendrosa i la baldriga de Cap Verd s'estructuren a diferents nivells jeràrquics d'organització i diversos factors espacials hi juguen un paper molt important, iv) Tot i l'estructuració filogeogràfica i poblacional de l'hoste, no hem trobat estructuració genètica en cap de les tres espècies de polls de la ploma que apareixen genèticament indiferenciats. Contràriament, la puça mostra una nivells de variabilitat interespecífica alts, v) L'avaluació de diversos marcadors intrínsecs per l'assignació de baldrigues cendroses a les seves colònies de cria, demostra que és possible utilitzar marcadors biogeoquímics en plomes, elements traça i isòtops estables, com una eina efectiva en l'anàlisi de la mortalitat d'ocells marins al mar a una escala local. / In this project we chose Cory's shearwater ("Calonectris diomedea"), which includes the Mediterranean ("C. d. diomedea") and the Atlantic ("C. d. borealis") Cory's shearwater subspecies, and the Cape Verde ("C. edwardsii") shearwater, three closely related seabird taxa that host three lice ("Halipeurus abnormis", "Austromenopon echinatum" and "Saemundssonia peusi") and one flea species ("Xenopsylla gratiosa"); as a study model. The main objective of this thesis is to investigate the genetic structure of "Calonectris" shearwaters and their ectoparasites. More specifically: i) to investigate phylogenetic relationships and the biogeographic history of the "Calonectris" species complex, using both molecular and morphometric data, ii) to evaluate the population genetic structure of Cory's shearwater ("Calonectris diomedea") across its whole distribution and identify causal mechanisms of population differentiation, iii) to investigate ectoparasite community structure in Calonectris shearwaters at three levels of organization of parasite assemblages (infra-, component and regional community levels), iv) to investigate congruence between patterns of genetic structure and levels of genetic differentiation among Calonectris ectoparasites and their host taxa, and to examine whether host specificity is reflected in differences in the degree of similarity between host and ectoparasite population genetic relationships, and v) to assess the existence of spatial patterns of variation in Calonectris shearwaters by using genetic, morphometric and biogeochemical markers and evaluate the utility of all four markers as effective tools assigning Calonectris shearwaters to source populations.

Los peces planos comprenden un grupo de especies de gran interés biológico y comercial. En respuesta al descenso de la pesca y al ritmo de capturas, en los últimos años han surgido diversas iniciativas dirigidas a la acuicultura de estas especies. Este proyecto de tesis doctoral se ha centrado en el lenguado del Senegal (S. senegalensis), una especie de alto valor añadido y un candidato con mucho potencial para la acuicultura. Quedan aún muchas incógnitas acerca de su reproducción, que deberán ser respondidas para optimizar su cultivoUno de los problemas detectados en el cultivo de S. senegalensis es la poca efectividad para inducir la reproducción de los machos, y en especial para conseguir un esperma de buena calidadEste proyecto de tesis se propone investigar los mecanismos fisiológicos implicados en la espermatogénesis y la producción de esperma de S. senegalensis mediante el análisis del proteoma del testículo de individuos salvajes y en cultivo bajo diferentes condiciones y la caracterización de proteínas potenciales implicadas en este proceso.Inicialmente se han estudiado el proteoma de S. senegalensis mediante secuenciación peptídico por espectrometría de masas. Posteriormente se ha analizado el proteoma de testículos de individuos salvajes en diferentes estadios de espermatogénesis mediante electroforesis bidimensional y espectrometría de masas. Resuelto este apartado, se abordaron los estudios comparativos del proteoma de individuos criados en cautividad con y sin tratamientos hormonales. Los estudios proteómicos se complementaron con análisis de nivel de expresión mRNA con microarrays. Finalmente, la información obtenida a durante el proyecto referente a la expresión de proteínas, la expresión de mRNA y la histología se ha integrado en una plataforma informática visual diseñada especialmente para S. senegalensis. / The flatfishes represent a group of species with a high biological and economical interest. Due to the decrease in fish hatchings, in the last years different several projects related to the aquaculture of these species were proposed. The project of this doctoral thesis has focused on the Senegal sole (Solea senegalensis), a flatfish specie with a great commercial interest and a candidate with high potential for aquaculture. However, lots of questions about its reproduction haven't been so far properly addressed, and they should be approached in order to optimize the culture of the Senegal sole. The main problems detected for this specie in captivity are the low spermiation volume and the impaired quality of spermatozoa motility males.This thesis aims to investigate the molecular mechanisms involved in the spermatogenesis and sperm production of S. senegalensis through the analysis of the testis proteome of wild and cultured animals under several conditions, in order to unveil the candidate proteins related to these processes.Initially, the proteome of S. senegalensis has been approached by de novo peptide sequencing based on mass spectrometry. Afterwards, the testis proteome from wild and cultured individuals in several spermatogenic stages was compared using two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Once this point was performed, a comparative study of testis proteome from individuals cultured with and without hormonal treatment was approached. Both proteomic studies were complemented with mRNA expression analysis using microarrays.Finally, the information related to protein expression obtained during the different parts of the project, the mRNA expression and the histological analysis were integrated in a bioinformatic visual atlas specifically designed for S. senegalensis.

La conjugación bacteriana es uno de los mecanismos de transferencia horizontal genética más importante y la causa principal de la rápida adquisición de resistencia a los antibióticos en las bacterias. La capacidad de las bacterias para conjugarse fue descubierta en 1946 en cultivos de E. coli y, años más tarde, en bacterias Gram-positivas. El proceso de conjugación comienza con el corte de un enlace fosfo-diester específico por medio de una relaxasa que juega un papel clave en la iniciación de dicha transferencia.En el plásmido R388 de E. coli, TrwC es la transferasa que cataliza la etapa inicial y final de la transferencia conjugativa del ADN. La estructura cristalina del dominio N-terminal de la relaxasa TrwC en complejo con un oligonucleótico de 27 bases que contiene la horquilla de reconocimiento y el enlace fosfo-diester a cortar ha sido determinada por difracción de rayos X. Asimismo, se han resuelto las estructuras de una serie de complejos ternarios proteína-ADN-metal con diferentes cationes divalentes ocupando el sitio activo. Un análisis sistemático, mediante difracción anómala, permitió determinar sin ambigüedad la naturaleza del metal localizado en el sitio activo, encontrándose que Zn2+, Ni2+ y Cu2+ se unían a la tríada de histidinas. La comparación de las estructuras de los diferentes complejos sugiere la existencia de dos caminos que permiten la salida de la cadena de ADN del centro activo y que probablemente son utilizados en diferentes etapas de la reacción de proceso de conjugación. La información estructural permitió proponer (i) un mecanismo enzimático en el que el ión metálico polariza el enlace fosfo-diester a cortar facilitando el ataque por parte de la tirosina catalítica, y (ii) la serie de eventos que ocurren durante el procesamiento del ADN a transferir y que explican la función biológica de la relaxasa.Asimismo se ha estudiado y caracterizado por difracción de rayos X el dominio N-terminal de la relaxasa MobM del plásmido pMV158 de Streptococcus agalactiae en complejo con un oligonucleótido de 26 bases que mimetiza la secuencia del oriT justo hasta el sitio de corte (nic). El plegamiento global de la proteína muestra un núcleo central formado por cinco hebras betas anti-paralelas flanqueadas por dos pares de hélices alfa. Este plegamiento es estructuralmente homólogo al observado en la relaxasas de bacterias Gram-negativas, pese a la baja homología de secuencia existente entre dichas proteínas. La cadena de ADN se une a MobM mediante numerosas interacciones electrostáticas alojándose a lo largo de la amplia cavidad que la superficie de la proteína presenta. Los contactos intermoleculares se agrupan en cuatro regiones; los dos más importantes involucran dos giros betas consecutivos de la cadena proteica que penetra en el surco menor del ADN y un largo lazo flexible que rodea el extremo de simple cadena del ADN. / Bacterial conjugation is one of the most important horizontal gene transfer mechanisms and the main cause of the rapidly spread of the antibiotic resistance in bacteria. The ability of bacteria to conjugate was discovered in 1946 in E. coli cultures and years later in Gram-positive bacteria. The conjugative process begins with the cleavage of a specific phosphodiester bond through a relaxase protein, playing a key role in the initiation of the transfer.TrwC is the DNA strand transferase that catalyzes the initial and final stages of conjugative DNA transfer in the plasmid R388 from E. coli. We have solved the crystal structure of the N-terminal relaxase domain of TrwC in complex with a 27 base-long DNA oligonucleotide that contains both the recognition hairpin and the scissile phosphate. In addition, a series of ternary structures of protein-DNA complexes with different divalent cations at the active site have been solved. Systematic anomalous difference analysis allowed us to determine unambiguously the nature of the metal bound. Zn2+, Ni2+ and Cu2+ were found to bind the histidine-triad metal binding site. Comparison of the structures of the different complexes suggests two pathways for the DNA to exit the active pocket. They are probably used at different steps of the conjugative DNA-processing reaction. The structural information allows us to propose (i) an enzyme mechanism where the scissile phosphate is polarized by the metal ion facilitating the nucleophilic attack of the catalytic tyrosine, and (ii) a probable sequence of events during conjugative DNA processing that explains the biological function of the relaxase.We also investigated the N-terminal relaxase domain of the protein MobM from plasmid pMV158 from Streptococcus agalactiae, and herein we report the X-ray crystal structure of the complex between this domain and a 26-mer oligonucleotide that mimics the oriT sequence just upstream the nic site. The overall fold of the protein shows a core domain comprising five anti-parallel beta-strands flanked by pairs of alfa-helices. This fold resembles that of Gram-negative relaxases in spite of the very low sequence homology. The DNA molecule binds to MobM through a number of electrostatic interactions following a large crevice over the surface of the protein. Intermolecular contacts are clustered in four main regions; the two most important ones involve a bulge formed by two consecutive beta-turns, and a long unstructured loop that wraps around the single stranded DNA part.

La infecció tuberculosa latent (ITBL) afecta actualment a un terç de la humanitat, és a dir, a 2.500 milions de persones. L'interès en el seu estudi i tractament es basa en el fet que en un 10% dels casos tindrà lloc un recreixement bacil·lar, que donarà lloc a una tuberculosi (TB) activa.Aquest fet és especialment perillós perquè encara es desconeixen els mecanismes implicats en aquesta reactivació, o sigui que ens manquen factors pronòstics. I perquè, a més a més, el tractament de la ITBL és extremadament llarg (9 mesos d'isoniazida), i això fa que moltes vegades aquesta mesura terapèutica ni es plantegi a nivell de mesura sanitària.A partir de les observacions obtingudes en l'estudi de l'evolució de les lesions en el model de TB experimental en el ratolí, es va generar un model de TB "humanitzat" que generava necrosi intragranulomatosa pulmonar (INPG). Inicialment, la INPG s'originava mitjançant la inoculació de LPS intranasal, però degut a l'elevada taxa de mortalitat dels animals, el model es va estandarditzar portant a terme la infecció per aerosol amb soques de M. tuberculosis capaces de desenvolupar INPG de manera espontània.Gràcies a aquest model humanitzat es va poder provar un nou règim terapèutic basat en la hipòtesi que la inoculació, després d'una pauta curta de tractament antibiòtic, amb fragments de M. tuberculosis cultivats en condicions d'estrès i detoxificats (vacuna RUTI) seria capaç de controlar la reactivació bacil·lar, i ser una eina terapèutica eficaç per reduir el temps de tractament actual de la ITBL. En aquest sentit, els estudis inicials mostraven la reactivitat de diferents subtipus d'IgG contra proteïnes presents en la vacuna, i la capacitat bactericida de la resposta immune generada, en soques de ratolí resistent (C57BL/6) i susceptible (DBA/2).Portant a terme estudis més amplis sobre la resposta immune generada mitjançant la immunoteràpia amb RUTI després d'una pauta curta de tractament antibiòtic, s'ha volgut avaluar tant el component humoral, com el cel·lular.Realitzant sèrum-teràpia passiva amb anticossos, obtinguts després de portar a terme aquest tractament combinat en ratolins DBA/2, es va veure que el model de ratolí severament immunodeprimit SCID era capaç de controlar la reactivació bacil·lar i presentava un nombre inferior d'abscessos pulmonars. Pel que fa a l'avaluació de la resposta cel·lular, els resultats obtinguts mitjançant el mateix esquema de tractament confirmen el que s'observa en els estudis anteriors.I finalment, cal destacar una total absència de toxicitat deguda a la inoculació de la vacuna RUTI, ni en el model de ratolí, ni en el conill porquí. / It has been estimated that one third of mankind harbors a latent infection with Mycobacterium tuberculosis. In a 10% of cases a reactivation in the bacillary load will generate active tuberculosis (TB).This is especially dangerous because we don't know the mechanisms implicated in this reactivation process. In other words, we don't have prediction factors. Furthermore, the chemotherapy treatment is 9 months of isoniazida.Studies about evolution of the lung lesions in the experimental TB model in mice allowed us to generate a TB "humanized" model. The main purpose of this model was to generate pulmonary intragranulomatous necrosis (INPG). Initially, necrosis was generated with intranasal inoculation of LPS, but there was a high mortality associated (up to 20%). Then "humanized" model were standardized with aerosol infection with Mycobacterium tuberculosis strains that develop necrosis spontaneously.The new "humanized" model allow us to test a new immunotherapeutic strategy based on the hypothesis that after a short-term chemotherapy the vaccine RUTI (Mycobacterium tuberculosis fragmented and detoxified) is able to control bacillary reactivation, and it could be a good immunotherapeutic tool to reduce the duration of treatment.In this sense, initial studies showed that all subtypes of IgG against proteins contained in the vaccine were implied. And the immune response generated with RUTI implied a bactericidal activity in resistant (C57BL/6) and susceptible (DBA/2) mice strains.Further studies were carried out in order to evaluate humoral and cellular components of immune response generated with RUTI.Passive serum-therapy with polyclonal antibodies obtained from DBA/2 mice immunized with RUTI in immunodepressed mice model (scid) revealed a capacity to control bacillary reactivation by humoral immune response and a reduction in the presence of granulomas and abscesses. And RUTI-immunotherapy treated mice revealed the same capacity.Finally, any toxicity effects were found in RUTI vaccinated animals.Our data suggest that RUTI would be useful immunotherapeutic vaccine against Mycobacterium tuberculosis infection by triggering a wide response against a lot of peptides present both in growing and non growing bacilli.

La presente memoria de Tesis Doctoral versa sobre la sísmica de reflexión de alta resolución y sus objetivos principales han sido los siguientes: establecer una validación de esta metodología, poner de manifiesto su potencial de aplicación en el reconocimiento de estructuras geológicas superficiales y mostrar su integración en estudios multidisciplinares de incidencia medioambiental. Por esa razón, tanto la estructura en capítulos como la redacción del texto han seguido un hilo narrativo que hace más hincapié en evaluar el potencial, las limitaciones y el poder resolutivo de la prospección sísmica del subsuelo poco profundo, que en presentar las técnicas del proceso de datos sísmicos. Aunque los casos analizados en la memoria están dirigidos a objetivos diferentes se complementan entre sí, concluyéndose que la sísmica de reflexión de alta resolución es una técnica extremadamente flexible que puede adaptarse a situaciones muy diferentes; desde un estudio geológico, a aplicaciones a la obra civil, a valoraciones medioambientales, etc. A través de cada caso presentado también se van desarrollando diferentes aspectos metodológicos de la sísmica de reflexión superficial que la distinguen de la sísmica profunda y que han de tenerse en cuenta durante el tratamiento de los datos.

Large scale global oceanic circulation redistributes heat and freshwater and therefore affects global climate. One of its main forcing mechanisms is, in addition to surface heat and freshwater fluxes, the diapycnal (across lines of equal density) mixing in the ocean interior. The energy needed to drive the mixing processes is mainly provided by tides and wind [Wunsch, 2002]. It is transformed into internal wave energy, cascading through a range of smaller scales leading finally into turbulence and molecular dissipation. Water masses in the ocean are stratified and often separated by relatively thin layers with strong gradients in temperature and/or salinity across which heat and mass transfer occur in order to maintain global circulation and stratification. However, these processes are difficult to observe in practice. Below a few meters, the ocean is opaque to light, and thus to direct optical observations of deep processes [Thorpe, 2005]. Therefore, the development of scientific methodologies and instruments to directly or indirectly measure processes in the ocean interior are of high importance to understanding those processes and their implications.The motivation behind this research is two-tier: 1) broadly, and academically, it is the scientific curiosity of understanding the ocean in order to better comprehend its role in the context of Earth systems; 2) expressly, the motivation is to develop the methodological toolset necessary to observe the ocean on a spatial and temporal scale not possible with traditional oceanographic techniques, thus allowing the foundation of more accurate models of ocean circulation and thereby, ocean-climate interactions.The toolset is emerging as a robust technique of physical oceanography known as 'seismic oceanography'. By definition, seismic oceanography is the application of multichannel seismic (MCS) reflection profiling to physical oceanography. This definition, however, could be subject to future revision and refinement because the development of seismic oceanography observational tools will inevitably lead to newer perspectives.The Mediterranean Outflow Water (henceforth, MOW) is a natural laboratory for seismic oceanography. The MOW was chosen to test seismic reflection in oceanography for three main reasons: 1) The strong oceanographic signature of the MOW. Due to the penetration of the MOW into the North Atlantic through the Strait of Gibraltar, strong characteristic contrasts in temperature (1.5 °C) and salinity (0.3 psu) and thus, density (0.4 kg/m3) are observed between the MOW and the surrounding Atlantic waters [Baringer and Price, 1997]. These contrasts in density (along with sound speed) are the contributing factors to reflection coefficient, making the identification of structures and processes possible. 2) The large variety of oceanographic and topographic features, such as a continental slope, undulating seafloor (including seamounts and basins) and mesoscale Mediterranean salt lenses (meddies). These structures and processes are believed to play an important role in maintaining the temperature and salinity distribution in the north Atlantic [Bower et. al., 1997]. 3) Finally, extensive archived data sets of bothoceanographic and seismic data place interpretive constraints on the data collected.Part I of this thesis consists of two peer-reviewed papers published by the author and coauthors (Chapters 1 and 2), one manuscript submitted for publication (Chapter 3) and two published peer-reviewed research letters that the author played a lesser role developing (Chapter 4). Part II of the thesis addresses the seismological (Chapter 5) and oceanographic backgrounds (Chapter 6) in the context of some of the structures and processes that are amenable to seismic ensonification. Part III consists of general discussions and conclusions (Chapter 7) and potential future research and development (Chapter 8). / La motivació que hi ha al darrera d'aquest treball es pot separar en dos nivells: 1) En termes generals, i acadèmicament, és la curiositat purament científica d'estudiar l'oceà per tal de comprendre millor el seu paper en el context de les Ciències de la Terra; 2) Concretament, la motivació és desenvolupar les eines necessàries per a observar l'oceà a una escala espaial i temporal que no és possible amb les tècniques tradicionals oceanogràfiques, permetent així generar models més precisos de circulació oceànica i, per tant, de les interaccions oceà-clima.L'objectiu a curt i mitjà termini d'aquesta tesi és el desenvolupament de noves eines d'oceanografia física que proporcionin noves perspectives sobre la dinàmica oceànica. Aquest conjunt d'eines està emergint com una metodologia sòlida dins de l'oceanografia física coneguda com 'oceanografia sísmica'. Per definició, l'oceanografia sísmica és l'aplicació de la sísmica de reflexió multicanal (MCS) a l'oceanografia física. Aquesta definició, però, podria estar subjecte a una futura revisió i perfeccionament, ja que el desenvolupament d'eines d'oceanografia sísmica inevitablement donarà lloc a noves perspectives.La part principal d'aquesta tesi la constitueixen quatre articles, publicats per l'autor i co-autors al llarg del seu període d'investigació (capítols 1, 2 i 4); així com un article sotmès (Capítol 3). En la segona part, com a suport per als lectors no familiaritzats, s'aborden els antecedents sismològics (Capítol 5) i oceanogràfics (Capítol 6) en el context d'algunes de les estructures i processos que són susceptibles de ser identificats mitjançant la sísmica. Les conclusions generals es presenten en el Capítol 7 i en el Capítol 8 es donen algunes recomanacions per a futures investigacions i desenvolupaments (Part III). La tesi es complementa amb quatre apèndixs, on a banda d'un ampli resum en català (Apèndix I), hi ha els diagrames de flux utilitzats per l'autor en el processament de les dades sísmiques (Apèndix II), un conjunt de set desplegables de les seccions sísmiques en gran format (Apèndix III) i finalment un glossari de termes útils per ajudar als lectors no iniciats en qualsevol de les branques de la sismologia o l'oceanografia (Apèndix IV).

La resistencia bacteriana a los antimicrobianos, y en particular la producción de ß- lactamasas plasmídicas de espectro extendido (BLEE), es un grave problema descrito principalmente en cepas de origen clínico. Sin embargo, no existen muchos datos sobre la prevalencia y la capacidad de difusión de estas resistencias en otros ambientes. Por ello, los objetivos de esta Tesis se enmarcan en un amplio proyecto coordinado cuya finalidad ha sido el estudio de la prevalencia de BLEE, cefamicinasas y carbapenemasas en diversos ambientes, determinar la transmisibilidad de estas resistencias y, finalmente, identificar y caracterizar los plásmidos que las codifican. En este trabajo, en primer lugar se han estudiado 107 cepas procedentes de granjas de aves, de cerdos y de conejos, siendo todas ellas Escherichia coli, a excepción de una cepa de Enterobacter cloacae. No se ha encontrado ninguna cepa portadora de la resistencia a carbapenémicos, aunque si se describe la presencia de la ß-lactamasa plasmídica CMY-2 y de una gran diversidad de enzimas BLEE. Además, el 93% de las cepas fueron resistentes a dos o más de los antibióticos no ß-lactámicos probados. En las granjas de aves, la enzima CTX-M-14 y la cefamicinasa CMY-2 han sido las más frecuentes. Por el contrario, en las de cerdos la enzima CTX-M-1 ha sido la más prevalente. Se describe, por primera vez, la presencia de las enzimas TEM-52 y SHV-2 en las granjas de aves, la enzima SHV-5 en las de cerdos y la enzima CMY-2 en las de conejos. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que las granjas de animales actúan como un reservorio de genes de BLEE y CMY-2. Asimismo, se ha determinado el grupo filogenético y el estatus ExPEC de las 106 cepas de E. coli aisladas de granjas de animales. La mayoría de las cepas han sido definidas como comensales al pertenecer a los filogrupos A y B1. Aunque una proporción significativa de cepas procedentes de granjas de aves pertenece a los filogrupos B2 y D, ambos vinculados a cepas patógenas. Por el contrario, en granjas de cerdos las cepas mayoritarias han sido las pertenecientes al filogrupo A. Del total de las cepas estudiadas, sólo 10 se han caracterizado como ExPEC, presentando éstas una media de nueve factores implicados en la virulencia. La gran mayoría de estas cepas proceden de granjas de aves, pertenecen al filogrupo D y codifican la enzima CMY-2. Además, cabe enfatizar el hecho no descrito hasta el momento, de que dos de las tres cepas aisladas de conejos han sido caracterizadas como ExPEC.En segundo lugar, se han seleccionado 111 cepas de enterobacterias, aisladas de granjas de animales, de alimentos, de muestras clínicas, de muestras fecales de portadores sanos, de brotes alimentarios y de aguas residuales y se ha estudiado la transmisibilidad de las BLEE y CMY-2. Más del 70% de dichas cepas transfirieron por conjugación estas resistencias. Además, un 29,2% de las cepas transconjugantes obtenidas presentaron resistencias a los antibióticos no ß-lactámicos. Por otra parte, las enzimas CTX-M-1, CTX-M-32, CTX-M-14a, familia SHV y CMY-2 fueron las que se transfirieron con una mayor frecuencia.Finalmente, se han caracterizado los plásmidos conjugativos, presentes en las 111 cepas que codificaban BLEE y CMY-2. Para ello, se ha determinado su peso molecular mediante electroforesis en campo pulsante, y se ha identificado el grupo de incompatibilidad al cual pertenecen. Esta identificación se ha llevado a cabo mediante hibridación con sondas frías por dot blot y Southern blot y por PCR y secuenciación. Los resultados obtenidos indican que hay una clara concordancia entre los plásmidos que, aún procediendo de diversos ambientes, presentan características muy similares como son la enzima que codifican, el grupo de incompatibilidad al que pertenecen y, en ciertos casos su tamaño. Así, la extensa mayoría de los plásmidos que codifican de la enzima CTX-M-14a, pertenece al grupo IncK. De igual forma, las enzimas del grupo CTX-M-1 se han localizado en plásmidos IncN. La enzima CMY-2 se ha transferido en plásmidos de alto peso molecular portadores de dos replicones, IncQ e IncA/C2. En cambio, la enzima CTX-M-9 se ha vehiculizado en plásmidos con grupos Inc muy variados, aunque cabe destacar el hecho de que tres de ellos pertenecen al IncHI2. / Bacterial resistance mediated by extended spectrum ß-lactamases (ESBL) is a great concern that has been described mainly in clinical strains. However, there is no so much data about the prevalence and capacity of diffusion of this type of resistances in other environments.Therefore, the objectives of the present Thesis have been to study the prevalence of ESBL, plasmidic class C ß-lactamase and carbapenemases in diverse environments, to determine the transmissibility of these resistances and, finally, to identify and characterize the plasmid that codify these resistances. First of all, in this work it have been studied 107 strains from poultry, pig and rabbit farms, being all of them Escherichia coli but one Enterobacter cloacae strain. None strains have carried resistance to carbapenemics, although it have been described the CMY-2 enzyme and a great variety of ESBL. Moreover, the 93% of the strains showed resistance to two o more non-ß-lactam antibiotics tested. In poultry farms, the enzymes CTX-M-14 and CMY-2 were the most frequent. By the contrary, in pig farms, the enzyme CTX-M-1 was the most prevalent. To the best of our knowledge, this is the first time that it is described the enzymes TEM-52 and SHV-2 in poultry farms, the enzyme SHV-5 in pig farms and the CMY-2 in rabbit farms. The results obtained here; show that animal farms act as a reservoir or ESBL and CMY-2 genes. Moreover, it have been determined the phylogenetic group and the ExPEC status of the 106 E. coli strains. The majority of the strains have been identified like commensal even though they belong to the groups A and B1. However, a high percentage of the strains coming from poultry farms belong to the phylogenetic groups B2 and D, being both groups associated to pathogenic strains. By the contrary, in pig farms the majority of the strains derive from the phylogenetic group A. Only, ten strains have been characterized as ExPEC, carrying these strains nine virulence markers of average. The majority of the ExPEC strains derived form poultry farms been associated to the phylogenetic group D and codifying the enzyme CMY-2. It is important to denote that two of the three strains isolated from rabbit farms are ExPEC.Secondly, it has been selected 111 strains from Enterobacteriaceae, isolated from several environments: animal farms, food, food-borne outbreaks, community, clinical patients and human sewage and it has been studied the transmissibility of the ESBL and CMY-2. More than 70% of these strains transferred by conjugation these resistances. Moreover, a 29.2% of the transconjugant strains showed resistance to non-ß-lactam antibiotics. The enzymes CTX-M-1, CTX-M-32, CTX-M-14a, the family SHV and CMY-2 were the most transferable.Finally, it have been characterized the conjugative plasmids carrying ESBL of CMY-2 of the 111 strains. To do that, it have been determined the molecular weight of the plasmids by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and their incompatibility group have been identified. The identification of the incompatibility group have been done by dot blot, Southern blot, PCR and sequencing. The results obtained show that there are a high degree of correlation among the Inc group to which the plasmids belong, the enzyme that they encode, and their size. So, the majority of plasmids that codify the enzyme CTX-M-14a belong to IncK group. Similarly, the enzymes of the group CTX- M-1 have been located in IncN plasmids. The plasmidic class C ß-lactamase, CMY-2, have been transferred in plasmids with high molecular weigh carrying the replicons IncQ and IncA/C2. By contrast, conjugative plasmids codifying of the enzyme CTX-M- 9 belong to different Inc groups, although three of them pertain to IncHI2.

Les aplicacions xenogèniques podrien anar des del xenotrasplantament d'òrgans sòlids, a l'empelt de teixits o cèl·lules. El principal obstacle per a la seva aplicació és la forta resposta immunitària generada pel xenoempelt, mediada tant per mecanismes cel·lulars com humorals. Diverses vies de senyalització i molècules estan relacionades amb aquest rebuig. En aquest treball s'estudien la via del TNF/TNFR i del CD200/CD200R. El TNFα s'uneix específicament a dos receptors, el TNFR1 i el TNFR2. Diferents estudis han demostrat la seva implicació en el rebuig agut de l'empelt xenogènic. En aquest treball s'ha identificat i caracteritzat diverses variants del TNFR2 porcí generades a partir de dos tipus diferents de splicings. El primer, provoca la deleció de l'exó 4, per homologia amb la seqüència humana. El segon engloba el que correspondria per homologia als exons 7 al 10 humans i provoca que la predicció de la proteïna resultant sigui soluble. En els experiments de PCR en temps real es va detectar els dos tipus de splicing a nivell de RNA en tots els teixits analitzats. Els nivells globals més elevats els trobem en cèl·lules del sistema immunitari com els PBMC o els monòcits aïllats i en òrgans com la melsa i el pulmó. La determinació de les diferents variants per separat mostren com els dos tipus de splicings són més abundants en monòcits aïllats o PBMC. Els estudis de localització subcel·lular ens van permetre identificar dos patrons d'expressió diferents. Per una banda el pTNFR2 té un marcat patró membranal. En canvi, la isoforma que conté el splicing a l'exó 4 és totalment intracel·lular, amb una alta colocalització amb el reticle endoplasmàtic. Tot i així els estudis realitzats amb la tècnica de FRET, han posat de relleu la interacció entre pTNFR2 i pTNFR2ΔE4 en l'espai intracel·lular. Els receptors de TNF formen homotrímers per ser funcionals, en aquest treball també hem demostrat que les proteïnes solubles són capaces de combinar-se entre elles de forma específica i que aquesta combinació és funcional. El CD200 regula l'activitat de les cèl·lules mieloides a través de la interacció amb el seu receptor. Diferents estudis han descrit el paper immunoregulador de la interacció CD200-CD200R en el control del rebuig de l'al·lotrasplantament i del xenotrasplantament concordant. La segona part d'aquesta tesi està dedicada a la identificació i caracterització del CD200 i CD200R porcins. Els resultats obtinguts identifiquen, per primera vegada, el CD200 porcí i tres variants del seu receptor. Una anàlisi bioinformàtica va permetre caracteritzar la molècula i comprovar que té un patró molt similar al descrit pel CD200 d'altres espècies, dos dominis d'immunoglobulines, una transmembrana i una regió citosòlica curta sense motius senyalitzadors coneguts. La primera variant de receptor pCD200R1, té una homologia elevada amb la variant a del receptor humà. La primera i segona variant soluble, el pCD200R2 i pCD200R3, contenen un canvi en el marc de lectura i que fa aparèixer un codó de stop primerenc, just abans de la zona de transmembrana. El receptor porcí té els tres llocs d'unió a CD200 més crítics conservats. Gràcies a la tecnologia de la ressonància de plasmó de superfície, vam determinar que les constant d'afinitats entre CD200-CD200R estan al voltant de 10-7 i 10-8 M tan en sistemes al·logènics com xenogènics. Amb la finalitat d'identificar les proteïnes porcines del CD200 i del seu receptor, es van generar antipèptids i es van produir anticossos policlonals en conills útils tan en anàlisi de Western Blot com per citometria de flux. Els experiments de PCR en temps real van determinar i quantificar l'expressió del CD200 porcí. Els resultat van confirmar que està àmpliament distribuït per diferents teixits i tipus cel·lulars / Clinical xenotransplantation is precluded by the strong immune rejection of the xenograft in which several molecules and pathways are involved. In this doctoral thesis, we studied the TNF/TNFR2 and CD200/CD200R pathways in the pig-to-human xenogeneic setting. First, we cloned the cDNA of porcine TNF-Receptor 2 and obtained four isoforms, two membrane-bound (pTNFR2 and pTNFR2ΔE4) and two soluble (pTNFR2ΔE7-10 and pTNFR2ΔE4ΔE7-10), generated by 2 different alternative splicings. The global expression and the relative proportion of each alternative splicing were determined by quantitative RT-PCR. All cells/tissues tested expressed the receptor at various levels and had a low-to-moderate percentage of each alternative splicing. We never found pTNFR2ΔE4 on the cell surface, but demonstrated by FRET experiments that it was capable of associating to the full pTNFR2 intracellularly. Next, we produced fusion proteins with the two different extracellular domains and determined their affinity to pig and human TNFα by plasmon resonance. The pTNFR2-GST bound both pTNFα and hTNFα with high and comparable affinity to the human receptor. On the contrary, pTNFR2ΔE4-GST showed no binding to hTNFα and very little to pTNFα. We further confirmed with pull down experiments that pTNFR2 and pTNFR2ΔE4 bound together after producing them simultaneously as soluble fusion proteins with different tags in mammalian cells. Moreover, pTNFR2ΔE4-GST failed to inhibit the hTNFα effect on endothelial cells in a competition assay, but was able to diminish the TNF blockade mediated by pTNFR2-GST. Thus, we reveal a new way the TNF/TNFR pathway is regulated. In other hand, we have cloned porcine CD200 and three variants of its receptor. As in other species, the porcine CD200 mRNA expression was widely distributed in the multiple tissues tested. We produced rabbit anti-peptide and polyclonal antibodies specific for pig CD200 and both detected it successfully by flow cytometry and western blotting. We also examined if ligand and receptor binding was conserved among species by plasmon resonance. Porcine CD200 interacted with human CD200R with an affinity comparable to that of human CD200. Finally, we expressed recombinantly human and porcine CD200 on the surface of porcine cells in order to protect them against xenograft rejection.

L’Oceà Atlàntic Nord i l’Oceà Àrtic són components essencials per la regulació de la variabilitat climàtica a Europa. En aquesta regió, les reconstruccions climàtiques de temperatura superficial del mar (SST) que cobreixen els darrers 2000 anys a alta resolució són escasses. Obtenir noves reconstruccions climàtiques a l’Atlàntic Nord a alta resolució és rellevant per tal d’entendre millor com funciona el sistema climàtic. En base a aquestes reconstruccions, es pot conèixer com ha variat el clima durant els darrers mil·lenis, encabir l’actual escalfament global en un context més ampli i investigar si els modes de variabilitat climàtica natural que s’han definit a través d’observacions instrumentals recents també afectaren el clima en el passat. Aquesta Tesi Doctoral té per objectiu generar noves reconstruccions de variabilitat climàtica a escala multidecadal a la regió de l’Oceà Atlàntic Nord pels darrers 2000 – 4400 anys, analitzant proxies geoquímiques orgàniques (biomarcadors) en registres sedimentaris marins. S’ha reconstruït la variabilitat climàtica en les dues entrades principals de la corrent de l’Atlàntic Nord a l’Oceà Àrtic – l’est de l’Estret de Fram i el mar de Barents – i també en una regió especialment sensible als canvis en els modes de variabilitat climàtica natural i a la interacció entre l’Oceà Atlàntic Nord i el clima continental Europeu – el Skagerrak -. S’han utilitzat tant proxies orgàniques ben establertes (i.e. alquenones) com proxies climàtiques desenvolupades recentment (IP25 i proxies basades en GDGTs), per tal de produïr reconstruccions basades no només en SST però també en paràmetres climàtics adicionals tals com la variabilitat en la coberta de gel marí, la temperatura de l’aire i la productivitat marina exportada. A més, s’ha estudiat l’aplicabilitat de les noves proxies basades en GDGTs en el registre marí del Skagerrak i en sòls localitzats al sud de Noruega i als Pirineus. Les SST estimades amb el proxy TEX86 mostren valors similars a la temperatura mitjana anual de la zona mentre que les temperatures de l’aire reconstruïdes amb el MBT/CBT s’apropen als valors instrumentals de l’estiu per a aquesta regió. Aquest esbiaixament no és degut a canvis en la síntesi dels GDGTs en els sòls durant un cicle annual, ni a un transport preferent dels lípids amb el Riu Glomma durant aquest període. Probablement, al Skagerrak, els GDGTs són una mescla entre lípids transportats des de latituds més baixes i producció in situ en aquesta zona. Suggerim que per a obtenir reconstruccions acurades utilitzant aquestes proxies al Skagerrak, caldria primer investigar-ne el seu origen. Dels registres climàtics generats a l’est de l’Estret de Fram i al mar de Barents, interpretem que hi va haver un increment progressiu en la temperatura o en el transport de calor de la Corrent de l’Atlàntic Nord cap a l’Àrtic. Aquesta tendència va començar als anys ~1000 – 1300 AD però s’accentuà des de ~1500 - 1600 AD fins al present. Al Skagerrak, una zona influenciada per un 90% de massa d’aigua procedent de l’Atlàntic Nord, hi va haver un refredament de la SST fins a 1300 AD que es va veure revertit per un escalfament des de 1600 AD tot i que la insolació va continuar decreixent. Suggerim que les tendències d’escalfament observades en els tres registres durant els últims ~400 anys podrien estar causades per canvis en modes de variabilitat climàtica tals com un increment en la freqüència mitjana de fases positives de la Variabilitat Multidecadal de l’Àrtic, la Oscil·lació de l’Atàntic Nord o la Oscil·lació Multidecadal de l’Atlàntic. L’impacte antropogènic sobre el clima estaria sobreposat a una tendència climàtica d’escalfament que hauria afectat de forma progressiva les zones d’estudi durant els darrers ~400 anys. / The North Atlantic and Arctic Oceans play an important role in modulating European climate variability. Oceanic records of sea surface temperature (SST) variability covering the last 2000 years at high resolution in this region are scarce. Obtaining new high resolution reconstructions in this area is necessary to increase the level of understanding on how the climate system has varied during the last millennia, to put the recent warming into a wide context and to investigate if the natural modes of climate variability observed from instrumental records can be projected to the past. This PhD thesis focuses on generating new records of multidecadal climate variability in the North Atlantic Ocean, analyzing organic proxies (biomarkers) in marine sedimentary cores that cover the last 2000 – 4400 years. We generated new climate reconstructions in the two main paths where the northward flowing North Atlantic current meet the Arctic Ocean - the eastern Fram Strait and the Barents Sea - and also in a highly sensitive area to changes in the internal modes of climate variability and the interaction between the North Atlantic Ocean and European climate - the Skagerrak -. We used well established organic proxies (i.e. alkenones) but also recently developed ones (IP25, GDGT based proxies) to produce reconstructions based on SST but also on additional climate parameters such as sea ice cover variability, mean air temperature and export productivity. In addition, we tested the applicability of the relatively new proxies based on GDGTs in a marine sedimentary core from the Skagerrak and in soils from southern Norway and the Pyrenees. The TEX86 gave SST estimates that were similar to regional annual means in the Skagerrak but the MBT/CBT air temperature estimates were closer to summer temperatures. This bias towards a specific season was not due to changes in the synthesis of GDGTs in soils through an entire annual cycle or to an enhanced transport of the lipids to the Skagerrak with the Glomma River during this period. We suggest that the GDGTs in the Skagerrak might be a result of a mixture between lipids transported from southernmost locations and in situ production. The origin of these lipids in the Skagerrak should be addressed before applying these proxies in this area with reliability. From the records located in the eastern Fram Strait and the Barents Sea, positioned in the two main paths where the northward flowing North Atlantic Current meet the Arctic, we interpret there was a progressive increase in temperature probably due to a warming in or an enhancement of the North Atlantic Current. This trend started at ~1000 – 1300 AD but was accentuated from ~1500 - 1600 AD until the most recent part of the records. In the Skagerrak, an area influenced by 90% North Atlantic water, a long term cooling that lasted until AD 1300 was reversed by a progressive warming since AD 1600 until present even though insolation continued to decrease. We suggest that the warming trends observed in the three records during the last ~400 years were caused by changes in internal modes of climate variability such as more frequent predominantly positive phases of the Arctic Multidecadal Variability, the North Atlantic Oscillation or the Atlantic Multidecadal Oscillation. The impact of human activity on climate might be superimposed on a longer term warming trend caused by changes in natural modes of climate variability that progressively affected the study areas during the last ~400 years.

Tesi realitzada a l'Institut de Ciències del Mar (ICM - CSIC) / The Mediterranean Sea can be considered an excellent natural laboratory for benthic ecologists, due to its peculiar environmental conditions, its broad-scale gradients, and its deep-sea fauna. Primary production levels in the Mediterranean follow a longitudinal gradient, decreasing from west to east. The present thesis focused on the fine-mud benthos habitat of the Mediterranean Sea, on its bathyal and abyssal zones, and the compartment considered was demersal megafauna. The main objective of the present thesis was to describe and characterize the deep habitats of the Mediterranean Sea, relating their biodiversity and ecosystem functioning with the varying environmental conditions along the geographic, bathymetric, and temporal axes. The work was divided into four parts. In the first part, the patterns of distribution, biomass and abundance of bathyal and abyssal megafauna were studied, in relation with environmental variables, along longitudinal and bathymetric gradients. This was a large geographic scale study, across the three basins of the Mediterranean at depths of 1200-3000 m. Benthic biomass strongly decreased with depth and longitude (west-to-east). Results showed a significant correlation between the dynamics of surface layers, the amount of food available on the bottom, and the composition of benthos. In the second part, the seasonal fluctuations of benthic communities in the Catalan continental margin were observed. A highly replicated, multi-period study was conducted at depths of 900-1500 m. Total biomass followed an inverted U-shaped pattern, peaking at depths of 1050-1350 m. Range-related ecological forcings between shallower and deeper species may have caused this biomass accumulation at intermediate slope depths. The arrival of a new water mass from the deep basin to the slope in spring may have also driven an accumulation of biomass at 900-1050 m depth over the same period. An adjacent submarine canyon was also studied, comparing communities between the canyon and the open slope area. Analyses revealed higher diversity, but not biomass, inside the canyon than in the adjacent open slope, and a significantly different assemblage between the habitats. These results strengthen the concept of submarine canyons as hotspots of biodiversity and underline the importance of their conservation as diversity repositories. The third part is a study on trophic relations of deep-sea fauna, over the same large spatial transects considered in the first part, by means of natural-abundances stable isotopes analyses and the use of novel statistical methods to analyse heavy datasets all in once. Bulk-tissue d13C and d15N isotope ratios were analysed for benthic megafauna and associated surface and mesopelagic components from the 3 basins of the Mediterranean Sea. The trophic niche width and the amplitude of primary carbon sources were positively correlated with both primary and secondary surface production indicators. Moreover, mesopelagic organic matter utilization processes showed an intermediate position between surface and deep benthic components. Thus, both primary and secondary production processes taking place at surface layers are key drivers of deep-sea food web structuring. Finally, the fourth part integrates the whole collected dataset into the first ecotrophic model of a deep-water ecosystem in the Mediterranean Sea, evaluating the general ecosystem functioning as well as the degree of vulnerability of these ecosystems. The Ecopath with Ecosim approach was used to model the flows and biomasses of the Catalan Sea continental slope ecosystem at depths of 1000-1400 m. Network analysis identified low levels of consumer biomass cycling and low system omnivory index when compared with expected values of marine ecosystems, and higher cycling and omnivory when compared with available models of shallower areas of the Mediterranean. A simulation of the possible expansion of the red-shrimp benthic trawl fishery that currently operates at shallower depths, showed reductions in fish biomass and that the state of the deep continental slope ecosystem seems to be result of a long-term succession process, which has reached ecological stability, and is particularly vulnerable to human impact and, specifically, to fisheries exploitation. / En la presente tesis se han estudiado los patrones de biodiversidad, funcionamiento trófico y ecosistémico de los sistemas bentónicos de gran profundidad en el Mar Mediterráneo. El objetivo principal fue de describir y caracterizar los hábitats profundos, relacionando su biodiversidad y sus procesos de funcionamiento con los gradientes ambientales a lo largo de los ejes longitudinal, batimétrico y estacional. El estudio de la composición de comunidades y la respectiva recogida de muestras para los análisis tróficos se han realizado a través de arrastres profundos. Los resultados de análisis de composición de comunidades hallaron una correlación significativa entre las dinámicas de las capas oceánicas de superficie, la cantidad de alimento disponible en el fondo marino, y la composición de la megafauna estudiada. A escala reducida y considerando las variaciones estacionales, la biomasa bentónica mostró un patrón a U-invertida, con un pico a profundidades de 1000-1400 m. Una posible explicación de este fenómeno podría ser la combinación de forzajes ecológicos ligados a las diferentes distribuciones batimétricas de las especies. Para estudiar las relaciones tróficas en los ejes batimétricos y geográficos de gran escala, se utilizó el análisis de isotopos estables de las componentes bentónicas, de superficie, y de capas pelágicas intermedias. El amplitud de los nichos tróficos de las comunidades bentónicas se encontraron relacionados con indicadores de productividad de superficie, tanto primaria como secundaria. Asimismo, los procesos de utilización mesopelágica del carbono orgánico se hallaron en posición intermedia entre los de superficie y los del bentos profundo. Finalmente, un análisis ecosistémico a través de “Ecopath with Ecosim”, reveló que los ecosistemas de los taludes continentales del Mediterráneo son el resultado de un largo proceso de sucesión ecológica, han alcanzado un estado de estabilidad, y son particularmente vulnerables a factores de impacto humano, entre ellos, la explotación pesquera.