La presente tesis se ha centrado en la identificación, purificación y caracterización bioquímica de las xilanasas Xyn10A, Xyn30D y Xyn11E de Paenibacillus barcinonensis. Conjuntamente se ha realizado la aplicación de estas enzimas en procesos de modificación de fibras papeleras, con el fin de evaluar su potencial uso en la industria del papel. Las xilanasas son enzimas que catalizan la hidrólisis del xilano, uno de los biopolímeros más abundantes que se ubica en la pared celular vegetal. Actualmente, las xilanasas han adquirido un gran interés comercial en procedimientos que degradan la pared vegetal ya que presentan, frente a los catalizadores químicos, las ventajas de ser biocatalizadores altamente selectivos y no contaminantes, características que las convierten en herramientas útiles para el desarrollo de tecnologías limpias. El trabajo de investigación realizado se enmarca dentro de otro proyecto de mayor envergadura enfocado a la búsqueda, identificación y caracterización de nuevas enzimas capaces de mejorar las propiedades de las fibras papeleras y obtener productos de valor añadido a partir de materiales lignocelulósicos. La xilanasa Xyn10A de P. barcinonensis pertenece a la familia 10 de las glicosil hidrolasas, GH10. Presenta máxima actividad sobre xilanos de maderas duras (haya y abedul) y un alto potencial para la producción de oligosacáridos derivados del xilano. La xilanasa Xyn30D fue identificada mediante el análisis del secretoma de P. barcinonensis. Esta enzima es el primer ejemplo de xilanasa modular de la familia GH30 descrito hasta la fecha. Tiene una estructura bimodular, consistente en el módulo catalítico unido a un módulo de unión a carbohidratos de la familia CBM35. La xilanasa Xyn30D, al igual que su módulo catalítico presenta actividad exclusivamente sobre glucuronoxilanos. Adicionalmente, el módulo catalítico de la xilanasa Xyn30D presenta la estructura lateral β9 característica de las xilanasas de la familia GH30 y la deleción de dicha estructura causa la pérdida de la actividad enzimática. Este resultado es la primera evidencia experimental del requerimiento de la estructura lateral β9 para la actividad de las xilanasas de la familia GH30. El módulo de unión a carbohidratos CBM35 de la xilanasa Xyn30D puede comportarse como una unidad funcional independiente y es capaz de unir las fracciones soluble e insoluble del glucuronoxilano, además de ácido glucurónico. Esta última unión es dependiente de calcio. La xilanasa Xyn11E es una xilanasa homóloga a las del subgrupo de xilanasas de punto isoeléctrico alcalino y bajo peso molecular de la familia GH11, y presenta máxima actividad sobre glucuronoxilanos. La xilanasa Xyn11E requiere de la coexpresión de la chaperona LppX para ser expresada heterólogamente en forma activa y soluble. La aplicación de xilanasas de P. barcinonensis en el blanqueo de pastas papeleras de sisal, especialmente de la xilanasa Xyn10A, permite obtener mejoras importantes tanto en el grado de deslignificación como en la disminución del contenido en ácidos hexenurónicos de las pastas. Existe una correlación positiva entre la capacidad de las xilanasas de liberar azúcares reductores de las pastas papeleras, durante la etapa enzimática previa a la secuencia de blanqueo, y la efectividad de las enzimas en disminuir el contenido en lignina y ácidos hexenurónicos. La aplicación del sobrenadantes crudos de P. barcinonensis como agente blanqueador de pastas de papel puede ser una alternativa de bajo coste para este proceso. Nuestros resultados sugieren que es muy difícil generalizar sobre la efectividad de una familia particular de glicosil hidrolasas para una determinada aplicación industrial, por lo que la idoneidad de una enzima para un proceso debe ser evaluada de forma individual. La utilización de cócteles enzimáticos que contengan varias enzimas puede ser conveniente en determinados procesos industriales para aumentar la eficiencia de los tratamientos. / This thesis has focused on the identification and characterization of xylanases from Paenibacillus barcinonensis with industrial applications. Xylanases are enzymes which catalyze the hydrolysis of xylan, one of the most abundant biopolymer in nature which is located in the plant cell wall. Currently, xylanases have acquired a strong commercial interest in procedures that degrade the plant cell wall, since they have, compared to chemical catalysts, the advantages of being highly selective biocatalysts and nonpolluting, characteristics that make them useful tools for developing of clean technologies. The research work is part of another bigger project focused on the search, identification and characterization of novel enzymes capable of improving the properties of papermaking fibers and get value added products from lignocellulosic materials. The research has focused on the identification of three xylanases Xyn10A, Xyn11E and Xyn30D from the family GH10, GH11 and GH30 respectively. They all have been cloned, heterologously overexpressed in Escherichia coli, purified and biochemically characterized. We had also performed the application of these enzymes in processes of papermaking fibers modification, in order to evaluate its potential use in the paper industry. Our results suggest that it is very difficult to generalize about the effectiveness of a particular family of glycosyl hydrolases for a particular industrial application, so that the suitability of an enzyme to a process must be evaluated individually. The use of enzyme cocktails containing multiple enzymes may be advantageous in certain industrial processes to increase the efficiency of the treatments.

Structural, petrological, microstructural and geochronological studies were combined with pseudosection modeling in the Roc de Frausa Massif (Eastern Pyrenees). The massif is constituted by Upper Proterozoic–Early Cambrian rocks and represents a mid crustal section intruded by igneous rocks. The aim is to compare the thermal evolution of different crustal levels in a single orogenic event. The rocks constituting the massif were part of the northern margin of Gondwana and were involved in the Variscan orogeny when Gondwana collided with Laurentia-Baltica. Two main Variscan deformation events are distinguished. D1 is marked by tight to isoclinal small-scale folds and a sub-horizontal foliation. D2 structures are tight upright folds facing to the NW with steep NE–SW axial planes. In the high-grade metamorphic domains it transposes S1 foliation by a sub-vertical S2 foliation. D3 structures are characterized by NW–SE folds compatible with steep dextral shear zones that retrograde the pre-Variscan rocks and the Variscan intrusives to greenschist facies. N and S of the studied area F3 folds involve Mesozoic rocks, and therefore it can be attributed to the Alpine orogeny. In the micaschists of the Upper crustal levels, andalusite porphyroblasts with S1 inclusion trails and sillimanite in S1 pressure shadows indicate heating from 580 °C to 640 °C. Cordierite includes the former minerals and does not exhibit pressure shadows pointing to isothermal decompression from 3.4 to 2.6 kbar. A calc-alkaline granitoid intruded on top of this level interkinematically between D1 and D2 (314–311 Ma). Intermediate crustal levels are dominated by schists with sillimanite−biotite−muscovite in the S1 fabric overgrown by cordierite and K-feldspar with no pressure shadows. These assemblages point to decompression from 5 to 3 kbar at 640−660 °C. A gabbro-diorite stock intruded in this level coeval with the D2 in two magmatic pulses (312 and 307 Ma). In the inner aureole four types of migmatites have been characterized, with different textures, mineral assemblages, mineral chemistry and whole-rock compositions. The biotite−sillimanite−K-feldspar−garnet assemblage together with garnet zoning is compatible with heating within the S1 fabric at peak-pressure of 7 kbar and 730 °C. F2 folds with subvertical melt-filled S2 foliation were overgrown by cordierite indicating mainly syn-D2 decompression to 4.5 kbar. The different whole-rock and mineral compositions and the preservation of the mineral assemblages of migmatitic rocks can be explained by different episodes of melt-loss and fluid infiltration in the metasediments at 790 °C and 5.5 kbar and incorporation of the fluids into the melt. The fluids would be released by the crystallizing gabbro-diorite. Lower crustal levels are dominated by fold-structured migmatites occurred in the interval 320–315 Ma. They present a biotite−cordierite composite S1-S2 biotite-bearing fabric with relic garnet embedded in plagioclase, thus precluding deciphering the early metamorphic evolution. Cordierite overgrowing both S1 and S2 fabric points to late equilibration at 3 kbar and 700 °C. The early metamorphic history associated with the S1 fabric is interpreted as a result of lower crustal horizontal flow and could be related to moderate crustal thickening. D2 event is characterized by decompression associated to highly heterogeneous exhumation of the metamorphic complex during the last stages of the Variscan evolution. / Se ha realizado un estudio estructural, petrológico, geoquímico, geocronológico y de modelización térmica en rocas pelíticas e ígneas del macizo de Roc de Frausa (Pirineo oriental) con la finalidad de comparar la evolución térmica de diferentes niveles de la corteza terrestre en un mismo evento orogénico. Las rocas que conforman el macizo formaban parte del margen norte de Gondwana y quedaron involucradas en la orogenia varisca al colisionar Gondwana con Laurentia-Baltica. Las rocas constituyen una serie Proterozoica superior a Paleozoica inferior afectadas por tres episodios deformativos, los dos primeros de edad varisca y el tercero alpina. En los micaesquistos con andalucita–sillimanita del nivel cortical superior, la andalucita y la sillimanita indican un incremento de temperatura de 580 °C a 640 °C coetáneo a la fábrica S1. La cordierita indica una descompresión isotérmica de 3.4 kbar a 2.6 kbar. Por encima de este nivel se emplazó un granitoide calco-alcalino intercinemáticamente entre D1 y D2 (314–311 Ma). Los niveles corticales medios están formados por esquistos con sillimanita-biotita-moscovita sin-S1 sobrecrecidos por cordierita y feldespato potásico post-S1. Estas asociaciones señalan una descompresión desde 5 a 3 kbar a 640–660 °C. Un stock gabro-diorítico intruyó sincrónico a D2 en dos pulsos magmáticos (312 y 307 Ma). En la aureola de contacto se distinguen cuatro tipos de migmatitas con diferentes texturas, asociaciones minerales y composiciones de roca y mineral que se explican mediante un modelo de perdida de fundido alternando con episodios de infiltración de fluido. Las asociaciones minerales indican condiciones PT de 7 kbar y 730 °C sin-D1 y una descompresión sin-D2 a 4.5 kbar. Los niveles corticales inferiores están formados por migmatitas cristalizadas entre 320–315 Ma. La cordierita sobrecrece las fábricas S1 y S2 ricas en biotita y con granate relicto incluido en plagioclasa e indica un equilibrio tardío a 3 kbar y 700 °C. D1 se interpreta como el resultado de un flujo horizontal de la corteza inferior, que podría relacionarse con un engrosamiento cortical moderado. D2 se caracteriza por una descompresión isotérmica que puede explicarse por una exhumación varisca tardía de los complejos metamórficos.

La toxina Cdt (“Cytolethal Distending Toxin”) fue descrita por primera vez en 1987 por Johnson y Lior como una nueva toxina producida por Escherichia coli. Es una toxina de tipo AB2 que bloquea el ciclo celular eucariota en las fases G2/M de la mitosis, cosa que provoca una distensión celular de hasta 5 veces el tamaño normal, y finalmente se produce la apoptosis. En la actualidad, la Cdt ha sido descrita en un gran número de bacterias Gram negativas como Vibrio, Helicobacter, o Campylobacter, entre otros. Está codificada por tres genes adyacentes (cdtA, cdtB y cdtC) que muestran diferentes grados de similitud entre géneros, siendo CdtB la subunidad catalítica que actúa como una ADNasa de tipo I, y CdtA y CdtC las subunidades que transportan a CdtB al núcleo. En E. coli han sido descritas 5 variantes, localizadas en el cromosoma (Cdt-II), en el plásmido pVir (Cdt-III) o rodeadas de secuencias homólogas a genes de fagos de tipo lambda o P2 (Cdt-I, Cdt-IV y Cdt-V). El hecho de que cdt se encuentre en diferentes géneros bacterianos con secuencias adyacentes homólogas a genes de fagos, así como que no aparezca asociado significativamente a otros factores de virulencia, sugiere que estos genes cdt son adquiridos por transferencia horizontal a través de fagos. Estos fagos Cdt pueden ser inducidos a partir de la cepa huésped y transmitir el gen de la toxina a otras cepas, causando la aparición de nuevas cepas virulentas. Además de en ambientes clínicos, se han encontrado fagos Cdt en agua residual y, tal como veremos en este estudio, también en agua de río, hecho que refuerza su potencial papel como transmisores de la toxina en el medio ambiente. Por tanto, un aspecto importante a tener en cuenta es la persistencia y la estabilidad de estos fagos en las diferentes condiciones ambientales. Por ello, en este trabajo, se ha estudiado la estabilidad de los fagos Cdt bajo diferentes condiciones de temperatura (4ºC, 22ºC y 37ºC) y pH (3, 7 y 9), y bajo diferentes tratamientos de inactivación: calor (60ºC y 70ºC, 30 y 60 min), luz UV (1, 5, 10 y 30 min), cloración (1, 3, 5, 10, 20 y 30 min) e inactivación natural. Para ello se han aislado dos fagos Cdt-V de muestras ambientales, y se han monitorizado mediante ensayos de infectividad (ufp/ml) y mediante cuantificación de copias genómicas por qPCR en cada una de las condiciones ensayadas. Además, se han comparado los resultados obtenidos con la estabilidad de fagos Stx, también de elevada persistencia ambiental, bajo las mismas condiciones. Por su propia naturaleza, y tal y como se ha visto en este trabajo y en estudios anteriores, los fagos son mucho más resistentes a ciertos tratamientos de desinfección e inactivación natural que las bacterias huésped, reafirmando su papel como reservorios de genes de virulencia en el medio ambiente. Además, se han descrito ciertas morfologías de fagos que permitirían una mayor persistencia a dichos tratamientos. Si los fagos consiguen sobrevivir a los tratamientos comúnmente utilizados en la eliminación de las bacterias, podrían transducir el gen de la toxina a otras cepas. Por tanto, no se puede descartar su potencial en la generación de nuevas cepas patógenas emergentes. Además de la persistencia de los fagos Cdt-V, también se ha estudiado su capacidad de inducción y de generación de lisógenos, así como su morfología y su estructura genética. Gracias a ello, se ha podido determinar a qué familia pertenecen y observar su capacidad de evolución y adaptación al lisogenizar a un nuevo huésped. / Cdt toxin (“Cytolethal Distending Toxin”) was first described by Johnson and Lior in 1987. It is an AB5 toxin that blocks the eukariotic cell cycle between G2 and M phases, which distends the cells, since cell division ceases but growth continues. Cdt is produced by different Gram negative pathogenic microorganisms, including Escherichia coli, Vibrio, Campylobacter and Helicobacter, among others. It consists of three subunits (CdtA, CdtB, and CdtC) that are encoded by three adjacent genes. The catalytic subunit CdtB is homologous to DNase I and it is the most conserved gene, and the other subunits act as binding proteins that deliver CdtB into target cells. Five variants of the toxin have been reported in E. coli, located in the chromosome (Cdt-II), in the conjugative plasmid pVir (Cdt-III) or flanked by lambda-like or P2 bacteriophage genes (Cdt-I, Cdt-IV and Cdt-V). The fact that Cdt is present in different microorganisms and, in some cases flanked by bacteriophage genes, and not significantly associated to other virulence factors, suggest that cdt genes are acquired by horizontal transfer by means of bacteriophages. These Cdt phages could be induced from the host and transduce the toxin to other strains, causing the emergence of new virulent strains. Cdt phages have not only been isolated from clinical samples, but also from environmental samples. For the potential role of these phages in cdt transduction, it is important to consider and study the persistence of Cdt phages in different environmental conditions. In this work, it has been studied the stability of two Cdt phages isolated from the environment under different conditions and inactivation treatments (temperature, pH, heat treatment, UV treatment, chlorination and natural inactivation). Moreover, the results were compared with Stx phages stability (that also have a significantly environmental prevalence) under the same conditions. The fact that Cdt and Stx phages and, in general, all phages, are more resistent to all the treatments and conditions than their natural hosts, reinforces their potential role as a reservoir of virulence genes in the environment. We have also characterized Cdt phages: its capacity of induction and lisogenization, morphology and genetic structure, to understand better the performance of these phages.

Esta tesis doctoral resume el trabajo realizado en el Departamento de Electrónica de la Facultad de Física, en la Universidad de Barcelona. El objetivo de la misma se centra en el diseño y fabricación de un microsistema óptico basado en la integración híbrida de componentes comerciales y procesos de micromecanizado en silicio, destinado a la detección óptica de micropartículas en chips de microfluídica. Todo ello teniendo como principales metas la miniaturización y la integración de todos los componentes para obtener un sistema robusto, portátil, orientado a aplicaciones “Point of care”. El sistema de detección óptica de partículas incluye dos elementos comerciales. Por una parte, las fuentes de luz escogidas, láseres VCSEL en formato “die” de la empresa ULM Photonics, y por otra, una matriz de microlentes fabricada por SUSS microOptics. La matriz de microlentes se adapta al pitch que existe entre láseres es de 250 micras, cosa que la hace totalmente compatible en términos de alineación óptica. Para determinar las posiciones óptimas de estos componentes, se realiza el estudio de dos escenarios mediante el uso de un simulador de trazado de rayos (ZEMAX Radiance ®): el primero, basado en la obtención de haces de luz colimados; el segundo, basado en la obtención de haces de luz focalizados. Los componentes comerciales se ensamblan en una estructura robusta, formada por dos piezas de silicio (base y separador óptico), y con alienación pasiva de las microlentes. Las piezas de silicio se fabrican en obleas siguiendo procesos de Sala Blanca. Mediante técnicas de soft lithography se diseñan y fabrican diversos chips para el bloque de microfluídica: canales con focalización pasiva del flujo y canales con sistemas de focalización activa. Dichos chips contienen los canales de microfluídica por donde circularán las partículas que se pretende detectar, en suspensión líquida. El sistema de detección óptica de partículas requiere de un sensor óptico encargado de detectar las variaciones en los niveles de intensidad luminosa causadas por la circulación de partículas. En esta tesis se plantea un sensor de imagen basado en tecnología CMOS, con un diseño full-custom. El sensor contiene una estructura en doble array lineal con 256 pixels. Para validar la funcionalidad del sistema fabricado, se realizó una batería de pruebas. Se prepararon diversas suspensiones acuosas en agua desionizada e isopropanol con partículas de diferentes tamaños (diámetros), materiales y fabricantes en un rango de 10 a 90micras de diámetro. Los resultados fueron satisfactorios en todos los casos. / This thesis summarizes the work developed in the Department of Electronics, Faculty of Physics, at the University of Barcelona. This work is focused on the design and fabrication of an optical microsystem based on hybrid integration of commercial components and silicon micromachining processes, in order to the optical detection of microparticles in microfluidic chips. Main goals are the miniaturization and integration of all components to obtain a robust system, portable, and oriented to "Point of care" applications. The optical detection system includes two commercial components. First, the chosen light sources, VCSEL lasers in "die " format from ULM Photonics, and second, an array of microlenses manufactured by SUSS microoptics. The microlens array fits the existing pitch between lasers (250 microns), therefore it is fully compatible in terms of optical alignment. To determine the optimal positions of these components, two scenarios are analyzed by using a ray tracing simulator (ZEMAX Radiance ®): the first, based on collimated light beams, the second based on obtaining focused light beams. The commercial components are assembled in a robust structure, consisting of two pieces of silicon (base and optical spacer), and passive alignment of the microlenses. The pieces of silicon are fabricated in wafers at the clean room of the IBM-CNM, according to the defined processes. Using soft lithography techniques, various chips for the microfluidic block are designed and fabricated: passive focusing channels and channels with hydrodynamic focusing. These chips contain microfluidic channels where particles to be detected will flow in liquid suspension. The optical detection system requires an optical sensor to detect the variations in the levels of light intensity caused by the particles circulation. In this thesis, an image sensor based on CMOS technology and a full-custom design is presented. The sensor includes a double linear array structure with 256 pixels and other electronics. To validate the functionality of the proposed system, we performed a battery of tests. Several aqueous suspensions were prepared in deionized water and isopropanol with particles of different sizes (diameters) materials and manufacturers in the range of 10 to 90micras diameter. The results were satisfactory in all cases.

The objective of this thesis is to present a proposal for the analogue signal processing chain needed for the LHCb calorimeter upgrade improving the design used originally. The design contains several novelties: the system was designed with low noise in mind from the beginning, it is made to have good immunity to interferences stressing the fact that the board will be shared with large digital circuits, differential operational amplifiers are used in a non-standard way as a mean to obtain opposite polarity signals for the signal treatment and a way to increase the available signal in the front end electronics is proposed. The thesis starts with a brief introduction to the detector and its environment. This is followed by an explanation of the use of shapers in high energy physics detectors and the constraints that the shaper must address in the LHCb calorimeter. This leads to a chapter where the circuit design is explained starting from the analysis of the original circuit and its flaws. Once the original circuit and the restrictions are understood the different parts of the circuit are explained showing the key points of each one. The explanation always starts as theoretic calculations, followed by practical problems and its solution until a fine tuning is obtained. Once the functional circuit is designed a chapter of electromagnetic considerations explains all the measures taken during the PCB design to prevent noise from leaking into the system. Stability and noise issues are discussed in depth in the last theoretic chapters. After that the different measurement procedures and results are exposed followed by the conclusions. / La presente tesis doctoral versa sobre una propuesta para la actualización del sistema de tratamiento analógico de la señal procedente del calorímetro de LHCb. El esquema propuesto incluye diversos elementos diferenciadores: ha sido diseñado específicamente para minimizar el ruido electrónico y coexistir en la misma placa de circuito impreso que la lógica digital minimizando la contaminación por el ruido que esta genera; utiliza amplificadores operacionales de un modo no convencional para conseguir señales de polaridades opuestas con gran precisión y propone un método para maximizar la carga entregada a la electrónica en el caso particular del calorímetro de LHCb. El documento arranca con una introducción al experimento, los denominados shapers y su utilización el física de altas energías para luego describir en detalle las fases de diseño, prototipado y medición de resultados haciendo especial hincapié en la compatibilidad electromagnética, la integridad de señal y la minimización del ruido.

Este estudio analiza el desarrollo postnatal del femur y la tibia de una muestra de individuos vivos de principios del siglo XXI de Barcelona. El material utilizado han sido 1140 telemetrias (radiografías de la extremidad inferior) de 570 chicos y 570 chicas cedidas por el Hospital Sant Joan de Deu de Barcelona. Las edades de estos 1140 individuos estan comprendidas entre los 0 y los 18 años. Se ha analizado la muestra mediante diferentes técnicas con el objetivo de: 1) analizar el desarrollo postnatal de fémur y tibia, tanto en individuos masculinos como femeninos, desde el nacimiento hasta el final del brote puberal; 2) estudiar los patrones diferenciales de los cambios en forma y tamaño entre chicos y chicas mediante morfometría geométrica; 3) aportar información del fémur y la tibia para la estimación de la edad de individuos actuales vivos de la población mediterránea, especialmente de la población española; 4) comprobar la utilidad de las técnicas de morfometría geométrica para el estudio de los cambios de forma durante el crecimiento de un hueso largo como es el fémur, mediante la aplicación de hitos (landmarks) en determinadas regiones del hueso. Primero se analizó el desarrollo del fémur durante el brote puberal tanto en niños como en niñas mediante morfometría geométrica. Para ello se han utilizado un total de 22 hitos (landmarks) ubicados en la totalidad del femur para observar su desarrollo. En el caso de las niñas se ha estudiado la franja de edad comprendida entre los 9 y los 14 años, con un total de 184 individuos. En el caso de los niños se ha analizado un total de 240 individuos comprendidos entre los 9 y los 16 años. Estas franjas se han seleccionado por ser las edades en las que esta comprendido el brote puberal para cada sexo. Se observaron en ambos sexos importantes cambios tanto en tamaño como en forma relacionados con la edad. Se observa tanto un aumento de la robustez (más marcada en chicos) como cambios en ambas epífisis. Durante el crecimiento del femur se da el fenómeno de la remodelación angular de este elemento esquelético, que implica la variación del ángulo cuello-diafisario así como del ángulo bicondilar. Este fenómeno de angulación se da como respuesta a la adaptación de la locomoción. Además, en las chicas también esta relacionado con el ensanchamiento de la pelvis, y por eso la angulación del fémur es más marcado en ellas, presentando una disminución mayor del ángulo cuello—diafisario así como un aumento mayor del ángulo bicondilar respecto a los chicos. Estos cambios se dan en chicas hasta los 13 años y hasta los 16 en chicos, coincidiendo con el fin del brote puberal en ambos sexos. También se ha estudiado en el total de la muestra (1140 individuos) el desarrollo de 6 variables métricas del fémur, 4 de la tibia así como el proceso de fusión de las epífisis de ambos huesos para estudiar la importancia y la capacidad de dichas variables para la determinación de la edad y el sexo en individuos tanto vivos como muertos de población de la Península. El crecimiento del fémur es más complejo mostrando algunas de las variables un estancamiento justo antes del brote puberal, en cambio la tibia presenta un desarrollo mucho más lineal tanto en la niñez como durante la pubertad. La fusión de las epífisis de ambos huesos parece adelantarse un año respecto a poblaciones de la península de mediados de siglo, lo que podría estar mostrando un efecto secular en la población actual. Los resultados así como las fórmulas obtenidas a partir de las variables analizadas son herramientas útiles para el diagnóstico de edad y sexo en el campo de la antropología forense, cuando se tenga que aplicar en población de la Península. / A sample of live individuals from the beginning of the 21st century from the Iberian Peninsula from Hospital Sant Joan de Deu has been studied through the database created for this thesis based on a total of 1140 telemetries (x-rays of the lower limb), 570 boys and 570 girls aged between 0 and 18, using geometric morphometric techniques and the analysis of metrical and qualitative variables. The objectives were: 1) To test the usefulness of geometric morphometric techniques for the study of shape changes during femoral development and developing specific landmarks for this type of studies; 2) to analyse the postnatal development of the femur and tibia, in males and females, from birth until the end of puberty and 3) provide information on the femur and tibia to estimate the age of current living individuals in the Mediterranean population, especially the Spanish population. Results showed that geometric morphometrics has proved to be very useful for the study of postnatal development. Our observations indicate. that femur varies widely in size and shape during growth, with a significant increase in the robustness especially in male individuals. The phenomenon of angular remodeling that involves the neck-shaft angle and the bicondylar angle take place until the end of puberty (13 years in girls, 16 years boys), with a decreasing neck-shaft angle and an increasing bicondylar angle, more relyable in girls due to the widening of the pelvis. Furthermore the development of the femur and tibia from birth until the end of growth shows a differential pattern between the two bones. The tibia shows a more lineal growth behaviour than femur when metrical measurements are analysed. In the femur, sex differences appear because of the male growth spurt. Contrarily, tibial sex differences are mainly due to the female cesation growth at 13 years of age and the fact that boys continue growing until 17 years of age..The study provides useful tools and formulae for diagnosis of age and sex in forensic tasks of remains and living individuals of Spanish origin.

Degut a la necessitat d’estudis sistemàtics per a l’establiment de mètodes eficaços per a la determinació d’espècies de mercuri en matrius ambientals i biològiques complexes, que assegurin la inalterabilitat de les mateixes durant la seva manipulació, aspectes que són avui dia els punts més febles en l’especiació analítica, l’objectiu de la present Tesi es basa en l’optimització de mètodes analítics per a estudiar l’especiació de mercuri en mostres del medi aquàtic mitjançant la tècnica acoblada HPLC-UV-CV-AFS. Dins d’aquest marc, la Tesi aborda uns objectius específics que es descriuen a continuació: - Optimització de totes les condicions experimentals implicades en la determinació de mercuri inorgànic i metilmercuri mitjançant CV-AFS establint, en primer lloc, les condiciones òptimes de detecció i, a continuació, estudiant la separació de les espècies mitjançant cromatografia de líquids en fase inversa; tot establint els paràmetres de qualitat per al mètode analític proposat. - Modificació i/o optimització del mètode analític per tal de determinar altres espècies de mercuri que de manera poc habitual es puguin trobar en mostres ambientals i/o biològiques. - Desenvolupament d’un mètode de preconcentració on-line per a l’especiació de mercuri en aigües. - Establiment dels efectes de pretractament en la determinació de mercuri en mostres de sediments. - Aplicació de la metodologia analítica desenvolupada a mostres ambientals i biològiques (aigües, sediments i biota) prèviament estudiant diferents mètodes d’extracció d’espècies emprant materials de referència. Els resultats obtinguts dins del tres primers objectius es mostren i es discuteixen al Capítol 3 de la present memòria; els estudis realitzats per a l’avaluació dels efectes de pretractament de mostra en sediments es descriuen al Capítol 4, i l’últim capítol descriu l’aplicació a mostres ambientals i biològiques del medi aquàtic. Als annexos I i II s’inclouen els articles científics publicats fins al moment. L’Annex I consta d’un article sobre la determinació de Hg2+ i MeHg+ en aigües contaminades mitjançant HPLC-UV-CV-AFS, mentre que a l’Annex II es troba un review sobre materials de referència certificats per a l’especiació de mercuri en matrius biològiques i ambientals. / In the present thesis, analytical methodology has been developed for mercury speciation in aquatic samples. The first part of the work consists of the optimization of the method for the separation of the species by the technique HPLC-UV-CV-AFS, another part focuses on the effects of sample pretreatment for the determination of total mercury and its species in sediments, and finally the last part consists of the application of the developed methodology to environmental and biological aquatic matrices (water, sediment and biota). Obtained results in the first part of the work are shown and discussed in Chapter 3; studies about sample pretreatment in sediments are described in Chapter 4; and the last part of the work is described in Chapter 5. Appendix I includes an article about the determination of Hg2+ and MeHg+ in polluted waters by HPLC-UV-CV-AFS, while Appendix II includes a review of certified reference materials for mercury speciation in environmental and biological matrices.

El treball que es presenta es basa en la síntesi i estudi estructural i magnètic de compostos polinuclears de coure i manganès amb lligands de tipus oxima. L’objectiu dels compostos de coure és l’estudi magnètic a baixa temperatura de sistemes de diverses nuclearitats basats en el triangle Cu3. En el cas dels compostos de manganès, l’objectiu és la síntesi de sistemes que presentin comportament d’imant unimolecular (o SMM). En aquest treball s’han emprat majoritàriament lligands tipus oxima, en les seves formes piridil, pirazil i saliciloxima. Tant per al manganès com per al coure, els compostos obtinguts tenen forma majoritàriament triangular. En la majoria dels casos els lligands oxima ocupen posicions equatorials del triangle, tant per al coure com per al manganès. S’han obtingut nombrosos compostos basats Cu3 amb diferents nuclearitats (Cu3, Cu6) i dimensionalitats (compostos mono, bi i tridimensionals). S’ha realitzat un anàlisi magnètic de 2-300 K trobant una relació magneto-estructural que determina que com més petita sigui la distància entre el pla Cu3 i l’oxigen central, més antiferromagnètic serà el valor de l’acoblament magnètic (J). Tanmateix, també s’ha comprovat com es pot tenir cert control sobre la dimensionalitat dels sistemes segons el nombre i la posició dels àtoms donadors de densitat electrònica del lligand utilitzat a la síntesi. Cal destacar sobretot el paper del lligand pirazina ja que la presència d’un segon nitrogen a l’anell aromàtic possibilita la coordinació amb una molècula contigua. D’aquesta manera s’aconsegueixen sistemes de dimensionalitat més elevada. Un dels sistemes obtinguts consta d’una xarxa de dinuclears de coure formats al voltant d’un triangle de coure que fa de plantilla. L’estudi magnètic d’aquests compostos inclou les anomenades Interaccions Antisimètriques, emprant una equació exposada recentment i que permet ajustar amb èxit la susceptibilitat magnètica a baixa temperatura. També s’observa com aquesta interacció també té incidència en la mesura d’EPR on s’observa l’aparició de noves bandes que obliguen a distingir entre una g paral•lela i un altra g perpendicular. Sis dels compostos de manganès obtinguts compleixen tots els requisits necessaris per a presentar comportament d’imant unimolecular; espín elevat, anisotropia magnètica i absència d’interaccions intermoleculars. Aquests paràmetres seran també els que determinin la força del caràcter SMM, encara que no és possible sistematitzar el seu comportament. L’estructura de tots sis compostos es basa en un triangle de manganesos (III) que tenen els eixos Jahn-Teller paral•lels. Això determina la nuclearitat dels compostos segons si contenen un, dos o quatre triangles. La interacció entre els triangles és ferromagnètica, el que determinarà que l’estat fonamental de l’espín sigui elevat. Els compostos amb estats fonamentals petits (S=2) no presenten comportament de SMM. Per altra banda, altres compostos amb estats fonamentals superiors (S=4 i S=11 respectivament) tampoc no es comporten com a imants unimoleculars. Això és degut a l’existència d’interaccions intermoleculars fortes i a la combinació d’aquestes interaccions amb el fet que els eixos Jahn-Teller no es trobin ben alineats, cancel•lant d’aquesta manera els moments magnètics i l’anisotropia magnètica uniaxial de la molècula. Dins els compostos que sí que presenten comportament d’SMM també podem trobar comportaments diferents. El caràcter SMM més marcat el trobem en el compost format per quatre triangles de manganès (Mn12), amb un estat fonamental elevat (S=8), una D considerable i interaccions intermoleculars no gaire significatives. També s’hi troben compostos que encara que tenen un estat fonamental elevat, es comporten com a imants febles degut a la presència d’interaccions intermoleculars, eixos Jahn-Teller no paral•lels o els dos factors al mateix temps. Per últim i de manera residual també s’han obtingut altre tipus de compostos emprant el lligand pentaeritritol, amb el qual s’ha obtingut un Mn12 que presenta caràcter SMM, i lligands carboxilat. / This work is based in the synthesis of polynuclear copper and manganese compounds and their structural and magnetic study. The ligands used are of the oxime type (pyridyl, pyrazil and salicyl oxime). The majority of the obtained compounds show a triangle shape in which the ligands occupy the equatorial positions. Copper compounds based on the Cu3 with different nuclearities were obtained (Cu3, Cu6). Also it was possible to tune the dimensionality of the complexes depending on the ligand. The pyrazyne ligand possesses a second N in the aromatic ring that coordinates to a copper from a neighboring molecule. A magnetic study was carried out signaling that the closer the central O was to the Cu3 the more antiferromagnetic J value will be. These systems present antisymetric interactions which affect susceptibility and EPR measurements at low temperatures. Six of the manganese compounds present the characteristics typically observed in SMMs (Single Molecule Magnets); high spin and magnetic anisotropy and the absence or intermolecular interactions. They are all based in a manganese (III) triangle with parallel Jahn‐Teller axes and contain from one to four triangles (nuclearities are Mn3, Mn6 and Mn12). The interaction between triangles is ferromagnetic which makes possible a higher spin state. Compounds with a S=2 do not show SMM response. Others with higher values such as S=4, 11 do not behave like magnets due to the existence of strong intermolecular interactions combined with the fact that the Jahn‐Teller axes of the manganese ions are not well aligned. Among the complexes that present SMM response different behaviors are observed. A Mn12 compound presents the higher magnetic reversal barrier with a S=8 and an also significant D value an no interactions between molecules. Other compounds have a weak SMM behavior due to intermolecular interactions or Jahn‐Teller axes not fully aligned. A few compounds were also obtained from carboxylates and the pentaeritritol ligand (also showing SMM response).

La tesi està dividida en tres parts diferenciades: una primera part on es desenvolupa un nou mètode cromatogràfic per determinar el coeficient de partició 1-octanol/aigua (log Po/w) de fàrmacs, una segona part on s’avaluen diversos descriptors de l’acidesa de l’enllaç d’hidrogen del solut per estimar el log Po/w i, finalment, una tercera part que descriu l’avaluació de la partició de fàrmacs en liposomes. En la primera part s’ha establert un mètode cromatogràfic per determinar el log Po/w de substàncies d’interès farmacèutic. En primer lloc, s’han optimitzat les condicions experimentals (columna, tipus i fracció de modificador orgànic a la fase mòbil) utilitzant substàncies d’estructura senzilla. S’ha demostrar que qualsevol columna amb fase estacionària C18 és apta i que les fases mòbils que contenen un 40-50% d’acetonitril proporcionen els resultats més acurats. El mètode s’ha validat per comparació entre els valors determinats i els valors de referència. Un cop fet això, s’ha estudiat la lipofilicitat de compostos bàsics demostrant la validesa del mètode per determinar el seu log Po/w si es treballa amb els tampons i columnes adients. En un tercer estadi s’ha avaluat la capacitat del mètode per determinar el log Po/w de fàrmacs d’estructura complexa. Els compostos han estat cedits per l’empresa Laboratoris Dr. Esteve S.A., que va mostrar interès en un mètode cromatogràfic robust per aplicar-lo en els seus procediments interns. Els compostos estudiats presenten una major complexitat estructural i provenen d’una selecció representativa de la biblioteca de compostos d’Esteve S.A.. Els resultats obtinguts demostren la capacitat del mètode per determinar el log Po/w de fàrmacs d’estructures molt diverses i la seva aplicabilitat per procediments de rutina en la indústria farmacèutica. Un cop s’ha establert el mètode cromatogràfic, s’ha seguit amb l’avaluació de diversos descriptors de l’acidesa de l’enllaç d’hidrogen dels soluts, atès que els descriptors utilitzats en la part anterior es calculen amb un programa, CODESSA, que no està a l’abast de la indústria farmacèutica ja que té un ús estrictament acadèmic. S’han considerat quatre descriptors, tres d’ells calculats a partir de la representació tridimensional de la molècula i el restant a partir de l’estructura en 2D. Els models generats a partir dels descriptors 3D depenen de la esteroisomeria i de la conformació de la molècula, i per tant, el descriptor 2D presenta una major simplicitat. Això fa que el seu ús sigui recomanable, doncs els resultats obtinguts en tots els casos són molt similars. La darrera part de la tesi ha servit per estudiar la lipofilicitat anisotròpica, mesurada com el coeficient de partició en liposomes/aigua per fàrmacs fluorescents. S’ha aplicat un nou mètode, basat en la polarització de la radiació fluorescent. Aquesta polarització depèn de la fracció de fàrmac que s’ha incorporat als liposomes, i permet calcular el coeficient de partició a partir de mesures de la polarització o anisotropia en solucions amb concentracions creixents de liposomes mantenint la concentració de fàrmac constant. Els resultats obtinguts s’han comparat amb els valors determinats aplicant les tècniques de referència (diàlisi en equilibri i potenciometria) i s’han observat algunes desviacions, possiblement degudes a la dispersió de la radiació per la presència dels liposomes en la solució. Malgrat aquests inconvenients, el procediment pot ser útil en el cas de compostos fluorescents que no es puguin estudiar amb les tècniques de referència. / Evaluation of the Lipophilicity of Drugs The study is focused to the lipophilicity assessment of drugs with diverse structures, functionalities and acid-base properties. The chromatographic method is based on a quantitative structure-property relationship method (QSPR), which permits the estimation of the log Po/w from the chromatographic retention complemented with several molecular descriptors calculated from the structure of the compound. The method was set up with a collection of ben-zene, phenol and aniline derivates and then, the experimental conditions of the chromatographic measurement were optimized. Later, the performance of the method was extended with the study of basic compounds, including several commercial drugs. This involved the use of alkaline mobile phases and, hence, columns prepared for working with them. Finally, the proposed method was used to assess the lipophilicity of drugs which showed a very complex structure and the structural descriptors were again evaluated because these drugs showed significantly different descriptor values compared to those from the substances used to establish the method. The performance of the new UHPLC systems to obtain the chromatographic data was also considered. As a consequence of the study of the structural descriptors involved in the proposed chromatographic method, the ability of several hydrogen bond acidity descriptors to complement the chromatographic retention in order to predict the log Po/w is studied. Four QSPR models are proposed, which are based on the chromatographic retention and a hydrogen bond descriptor. The four proposed models show similar statistical parameters among them, although the model which is based on the calculated Abraham hydrogen bond acidity parameter shows some advantages. This is because this parameter is easier to calculate. In the third part of the Dissertation, the evaluation of lipophilicity in liposomal systems is assessed. First, the lipophilicity of several drugs is determined by means of the reference techniques and, in a second part, a new approach is established, based on the measurement of the fluorescent anisotropy of drug-liposome solutions.

L’hepatitis B és una infecció hepàtica potencialment mortal causada pel virus de l’hepatitis B. Es tracta d’una malaltia infecciosa caracteritzada per necrosi hepatocel•lular. L’hepatitis B pot esdevenir en un procés agut i posteriorment en un procés crònic, el qual pot acabar en cirrosi del fetge, càncer de fetge, insuficiència hepàtica i mort del pacient. L’hepatitis B és la infecció més comú en tot el món. Tot i l’existència d’una vacuna preventiva de gran eficàcia des de 1982, es calcula que al món hi ha 2000 milions de persones infectades i més de 350 milions de persones amb infecció hepàtica crònica desenvolupada. La probabilitat que la infecció es torni crònica depèn de l’edat a la que es produeix el contagi, sent de major risc el contagi en nens petits. Aproximadament un 90% dels lactants infectats durant el primer any de vida pateixen infecció crònica a posteriori, al igual que entre el 30 – 50% dels nens infectats entre 1 – 4 anys d’edat. Aproximadament un 25% dels adults amb infecció crònica adquirida durant la infància moren de cirrosi o càncer hepàtic relacionats amb el virus de l’hepatitis B (VHB). En canvi, el 90% dels adults sans que son infectats pel VHB es recuperen i queden totalment lliures del virus en uns 6 mesos aproximadament. Actualment existeixen set medicaments autoritzats pel tractament de l’hepatitis B. Aquests inclouen medicaments antivirals i moduladors del sistema immunitari. L'objectiu principal del present treball ha estat el desenvolupament industrial d'una nova síntesi de la 2-amino-9-[(1S,3R,4S)-4-hidroxi-3-(hidroximetil)-2-metileniciclopentil]-1H-purin-6(9H)-ona, un carbanucleòsid que presenta una elevada activitat antiviral enfront el VHB. En l’actualitat és el fàrmac que presenta menor resistència al virus i aquest fet és de gran importància donat que l’hepatitis B crònica no té cura i el malalt s’ha de medicar de manera indefinida. Degut a la seva elevada eficàcia i el seu gran valor afegit, la 2-amino-9-[(1S,3R,4S)-4-hidroxi-3-(hidroximetil)-2-metileniciclopentil]-1H-purin-6(9H)-ona representa un fine chemical d’interès per a la indústria farmacèutica. Cal afegir que la patent original caduca en 2015 i passa a ser un fàrmac genèric. En el present treball s’han estudiat diferents aproximacions sintètiques al fàrmac amb l’objectiu de desenvolupar industrialment una nova via que sigui industrialitzable i que presenti millores sobre les rutes sintètiques existents. Així, en el capítol 1 del present treball s’ha abordat l’exploració de diferents rutes sintètiques i l’establiment d’un primera via sintètica al fàrmac. En concret, es discuteixen dues aproximacions, una basada en la preparació de l’API a partir d’anells ciclopentànics i l’altra basada en la construcció a partir d’estructures acícliques. En el capítol 2, s’ha resumit la feina de desenvolupament realitzada sobre la ruta escollida, on es detalla acuradament la introducció de millores e inventiva. Finalment, en el capítol 3 s’ha abordat el desenvolupament industrial, l’escalat de la ruta i l’obtenció del producte final amb qualitat farmacèutica. En resum, el procediment sintètic desenvolupat consta d’onze etapes. L’esquelet ciclopentànic es preparat a partir de precursors acíclics on les etapes clau són una reacció aldòlica estereoselectiva i una ciclació catalítica de Ti(III) entre un epòxid i un alquí. La introducció de la purina sobre el carbocicle mitjançant una reacció de Mitsunobu permet completar la síntesi. Cal destacar que l’ús del grup p-nitrobenzoïl a les etapes finals permet purificar els intermedis per cristal•lització evitant així la cromatografia i fent la síntesi escalable. La hidròlisi selectiva de la posició 6-cloro de la purina amb àcid fòrmic és també essencial per tal d’obtenir el producte final per cristal•lització. / B-type hepatitis is a global disease. It is one of the most common viral infections worldwide despite an efficient vaccine being available since 1982. According to the World Health Organization (WHO), about two billion people are infected worldwide and 600 000 die every year due to consequences such as cirrhosis of the liver or liver cancer. Hepatitis B can manifest itself in both acute and chronic forms and is especially dangerous in children. About 90% of infants infected during the first year of life develop chronic infections, although this ratio drops to 30 − 50% in children infected between the ages of one and four. About 25% of adults who become chronically infected during childhood will die from hepatitis B-related liver cancer or cirrhosis while about 90% of people who become infected during adulthood will recover and be completely free of the virus within six months. About 350 million people are thought to be chronically infected with the disease worldwide. Nowadays, 2-amino-9-((1S,3R,4S)-4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-methylenecyclo-pentyl)-1H-purin-6(9H)-one is considered one of the best choices for the treatment of chronic patients due to its lack of significant adverse effects and the low risk of inducing long-term resistance to the drug. In this research, a straightforward synthesis of 2-amino-9-((1S,3R,4S)-4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-methylenecyclopentyl)-1H-purin-6(9H)-one was achieved in 11 steps from commercially available starting materials. The cyclopentane skeleton was prepared from acyclic precursors by a boron-aldol reaction and a Ti(III)-catalyzed cyclization of an epoxide to an alkyne as key steps. The carbocylic structure obtained in this way was attached to a purine moiety by a Mitsunobu reaction. It is worth mentioning that the use of the p-nitrobenzoyl group in the final steps allows purification by crystallization thus avoiding chromatography and making the synthesis amenable to scale-up. The selective hydrolysis of the 6-chloropurine unit with formic acid is also essential in order to facilitate the crystallization of the final product.