O melanoma cutâneo é a neoplasia de pele de maior mortalidade. A imprevisibilidade de sua evolução é uma de suas características principais, o tratamento do tumor primário é, atualmente, de pouca morbidade e, na doença disseminada, as opções terapêuticas são pouco eficazes. É fundamental a pesquisa de marcadores tumorais que permitam a previsão da evolução, melhor compreensão da patogênese do melanoma e possibilitem a descoberta de alvos moleculares. Nesse contexto, estudos genéticos mostraram a importância da regulação do ciclo celular, especialmente a passagem da fase G1-S. Importantes fatores envolvidos compõem a cascata da proteína Rb (p16, ciclina D1, CDK4 e pRb) e da proteína p53 (p53 e p21). Objetivo: verificar a frequência da expressão de p16, ciclina D1,CDK4, pRb, p53 e p21 em melanomas cutâneos de cabeça, pescoço e tronco e sua relação com prognóstico. Métodos: Estudo retrospectivo envolvendo 46 pacientes (sendo 67,3% homens, idade média 57,7 ± 15,8 anos) com melanoma cutâneo de cabeça, pescoço e tronco que foram tratados pela mesma equipe com seguimento mínimo de dois anos. Foram estudados fatores clínicos (topografia do tumor primário, tempo de seguimento, ocorrência de metástases e óbito relacionado), histopatológicos (tipo histológico, índice de Clark, índice de Breslow) e análise imuno-histoquímica pela técnica de micro-array para as proteínas reguladoras do ciclo celular p16, ciclina D1, CDK4, pRb, p53 e p21. Resultados: Houve proporção igualitária entre as topografias (23 casos em tronco, 23 em cabeça e pescoço). Treze pacientes com Clark I (29,5%), cinco com II (11,3%), 16 com III (36,5%), 10 com IV (22,7%) e nenhum com Clark V. A média das medidas de Breslow foi 0,96 (DP=1,01). O seguimento médio foi de 77 meses (DP=47). Oito dos 46 pacientes (17,3%) tiveram evolução desfavorável, com seis óbitos relacionados. A idade foi mais elevada no grupo com evolução desfavorável (p=0,04). Houve expressão de p16 em 80%, ciclina D1 em 58,9%, CDK4 em 43,5%, pRb em 58,5%, p53 em 53,6% e p21 em 52,3% dos melanomas. Em análise univariada, a expressão do p21 foi relacionada com evolução desfavorável (p=0,04), o que não foi observado com a expressão dos outros marcadores (p>0,05). Conclusão: A expressão da proteína p21 nos melanomas cutâneos de cabeça, pescoço e tronco foi relacionada com evolução desfavorável, o que não ocorreu com outros fatores envolvidos na regulação do ciclo celular / Melanoma is the most lethal skin cancer. The outcome of melanoma is not predictable in most cases. Although the treatment for the primary tumor is well tolerated, there are no effective therapeutic options in disseminated disease. Efforts are being made in the search for tumoral markers that may predict outcome, increase the comprehension of melanoma pathogenesis, and may also help the search for molecular targets. In this issue, genetic studies concerning the regulation of cell cycle, including the G1-S checkpoint, are important. The retinoblastoma protein (pRb) pathway (p16, cyclin D1, CDK4 and pRb) and the p53 pathway (p53 and p21) are part of this regulation. Objectives: to verify the expression of p16, cyclin D1, CDK4, pRb, p53 and p21 in head, neck and trunk melanomas, and its correlation with prognosis. Method: Retrospective study approved by institution ethics committee. Fourtysix head, neck and trunk melanoma patients (67.3% men, mean age 57.7±15.8) treated by a single surgeon with minimum 2-years follow-up were enrolled. Clinical factors (primary tumor location, follow-up period, metastasis or related deaths), pathologic (histological subtype, Clark and Breslow index) and microarray immunohystochemical analysis of the cell cycle proteins p16, cyclin D1, CDK4, pRb, p53 and p21. Results: Location of the primary tumor was equal for head/neck and trunk (50% each). Thirteen patients were classified as Clark I (29.5%), five as Clark II (11.3%), 16 as Clark III (36.5%), 10 as IV (22.7%), none as Clark V. Mean Breslow measure was 0.96±1.01. Mean follow-up was 77±47 months. Eight patients (17.3%) had bad outcome, with six related deaths. Patients with worse outcome had a higher mean age at diagnosis (p=0,04). Expression of p16 was positive in 80%. Cyclin D1 was positive in 58.9%. CDK4 was positive in 43.5%. pRb was positive in 58.5%. p53 was positive in 53.6%. p21 was positive in 52.3%. Univariated analysis showed that p21 expression was related to worse outcome (p=0,04), while the other markers were not (p>0,05). Conclusion: p21 expression in head, neck and trunk melanomas was related to worse outcome. Expression of the other cell cycle regulators proteins was not

Avaliamos neste estudo as expressões da ciclina D1 e da proteína p21, pela técnica de Imuno-histoquímica, para detectar a presença destas proteínas nos núcleos das células do câncer de mama localmente avançado, com o objetivo de correlacionar a concentração destas proteínas com aresposta preditiva ao tratamento quimioterápico neo-adjuvante, utilizandoo esquema docetaxel associado à epirrubicina. A avaliação foi feita previamente e após a realização da quimioterapia neo-adjuvante. A avaliação pré-quimioterápica teve a finalidade de estabelecer um papel preditivo quanto à resposta ao tratamento primário. A avaliação pós-quimioterápica teve a finalidade de explorar a relação entre a persistência da proteína com intervalo livre de doença e sobrevida global. Foram selecionados 72 casos de 162 tumores localmente avançados de mama atendidos no período de janeiro de 1998 a dezembro de 2005, tratados por quimioterapia primária no Ambulatório de Mastologiado Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto. Conclusão: a ciclina D1 está relacionada com tumores menores, bem diferenciados e hormônio-sensíveis. Já a proteína p21 está relaciona a tumores pequenos, com estádios iniciais menores, de baixo grau histológico e hormônio-sensíveis. A expressão da ciclina D1 no tumor pré-tratamento quimioterápico não foi capaz de predizer resposta à quimioterapia neo-adjuvante. No entanto, a presença da ciclina D1 e no tumor residual e da p21tanto no tumor pré-tratamento quanto no tumor residual, sugerem melhora no intervalo livre de doença e na sobrevida global. / We evaluate in this study the expressions of the cyclin D1 and the protein p21, with the technique of Immunohistochemistry, todetect the presence of these proteins in the cells of the local advanced breast cancer. The objective was correlate the concentration of these proteins with predictive response to the neo-adjuvant chemotherapy, using docetaxel associated with epirrubicina. The evaluation was performed before and after the neo-adjuvant chemotherapy. The evaluation before the neo-adjuvant treatment had the purpose to establish a predictive value of these proteins with primary treatment response. The evaluations after neo-adjuvant treatment had the purpose to explore the relation between the persistence of these proteins with disease-free survival and overall survival. We selected 72 of 162 cases of local advanced breast cancer who had treated for primary chemotherapy in Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto in the period of January of 1998 to December of 2005. Conclusion: Our study concluded that the cyclin D1 is related with small tumors and well differentiated and hormone-sensitive tumors. The protein p21 is relates with small tumors, initial stage tumors, low grade tumors and hormone-sensitive tumors. The expression of cyclin D1 in the tumor before the treatment failed to predict response to the neo-adjuvant chemotherapy. However, the presence of the cyclin D1 in the residual tumor andthe protein p21 before the treatment and in the residual tumors suggest improvement in the disease- free survival and overall survival.

O carcinoma epidermóide por se tratar de uma doença genética, apresenta dificuldades em relação ao seu tratamento. As vias de sinalização celular por controlarem os mecanismos responsáveis pela proliferação e sobrevivência da célula, são de extrema importância nos estudos da biologia do câncer e oncogênese. Aberrações cromossômicas que afetam a estrutura e a expressão de genes e proteínas que regulam componentes das vias de sinalização são diretamente correlacionadas com o desenvolvimento e progressão tumoral. Vários genes e proteínas vêm sendo avaliados na busca de um alvo terapêutico quimioterápico, algo pouco estudado em carcinomas epidermóides bucais. Este trabalho teve como objetivo analisar a influência do quimioterápico 17-AAG e do fator de crescimento epitelial (EGF) nos níveis das proteínas NFkB, Ciclina D1 e Cdk4 nas linhagens de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (HN6 e HN31) e no queratinócito imortalizado (HaCat). Este trabalho destinou-se também a estudar uma possível inter-relação entre as proteínas Metalotioneína e NFkB e suas interações com as proteínas Ciclina D1 e Cdk4 nas linhagens celulares HN6 , HN31 e (HaCat, para uma maior compreensão de seus efeitos nas vias de sinalização celular e conseqüente progressão do câncer). Para análise a respeito da localização e os níveis das proteínas MT, NFkB, Ciclina D1 e Cdk4 foram utilizados ensaios de imunofluorescência e western blot, respectivamente.Os resultados apontaram um melhor perfil apoptótico da linhagem HN31 frente ao tratamento com 17-AAG, apresentando diminuição significante dos níveis de NFkB e Ciclina D1, além de exibir importante decréscimo nos níveis de Cdk4. A proteína MT parece não sofrer ação do NFkB. A indução de proliferação celular realizada por EGF exerceu um aumento dos níveis das proteínas NFkB e Ciclina D1, sugerindo um papel importante das vias de sinalização estimuladas por EGF (Akt, NFkB e Ciclina D1) na progressão tumoral dessas linhagens.Por fim, a ocorrência de estímulo nos níveis da proteína MT por parte do EGF, sugeriram um importante papel do EGF e da MT na resistência a apoptose nas linhagens estudadas. / Squamous cell carcinomas as a genetic diseases, presents certain difficulties in relation to their treatment. The process of cell signaling for overseeing the mechanisms responsible for cellular proliferation and survival are very important in studies of the biology of cancer and development. Chromosomal alterations affecting the structure and expression of genes and proteins that regulate the process of signaling components are directly correlated with the development and tumor progression. Several genes and proteins are being evaluated in the search for a biological marker that could help in the understanding of cancer as well as in its prognosis, and mainly in search of therapeutic target chemotherapy, something little studied in oral squamous cell carcinoma. This study aimed to examine the influence of chemotherapy 17-AAG and the epithelial growth factor (EGF) in the levels of proteins NFkB, Cyclin D1 and Cdk4 in strains of squamous cell carcinoma of the head and neck (HN6 and HN31) and immortalized in keratinocytes(HaCat). This work is also intended to explore a possible inter-relationship between the Metallothionein and NFkB proteins and their interactions with the proteins Cyclin D1 and Cdk4 in cell lines HN6, HN31 and (HaCat, to a greater understanding of its effects on pathways of cellular signaling and consequent progression of cancer. For analysis regarding the location and levels of the protein MT, NFkB, Cyclin D1 and Cdk4 were used tests of immunofluorescence and western blot. Results showed a better apoptotic profile of HN31 treated with 17-AAG, showing decrease levels of NFkB and Cyclin D1, with a important decrease in the levels of Cdk4. The metallothionin protein does not appear to suffer action of NFkB. The induction of cell proliferation conducted by EGF had increased levels of NFkB and Cyclin D1 proteins, suggesting an important role in the process of signaling stimulated by EGF (Akt, NFkB and Ciclina D1) in tumor progression of oral squamous cell carcinoma. The occurrence to stimulate the levels of metallothionein protein by the EGF, suggest an important role of EGF and MT in resistance to apoptosis in the studied cell lines.

O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço é responsável por 90% das neoplasias malignas, nesta região. Molecularmente, inúmeras vias de sinalização, ainda não muito bem compreendidas, são responsáveis pelo seu crescimento e invasão para tecidos vizinhos, além de metástases para órgãos distantes. Este trabalho destinou-se a avaliar o crosstalk entre as vias de sinalização do Wnt e PI3K, quando células de carcinoma epidermóide (HN6 e HN31) e queratinócitos imortalizados (HaCat), foram estimulados com 50nM Wortmannin (metabólito fúngico que mimetiza a função da PTEN) e 10ng/ml EGF (fator de crescimento epitelial). Para isto, proteínas-chave, pertencentes a estas vias, foram localizadas e quantificadas no interior celular: PTEN, ?-catenina, Akt, pAkt e Ciclina D1. As técnicas de imunofluorescência e western blot foram utilizadas, respectivamente, para observar a localização e os níveis destas proteínas, nos diferentes compartimentos celulares. Os resultados mostraram que a ativação da via do PI3K, pelo EGF, promoveu a proliferação celular, independentemente da via de sinalização do Wnt. Quando as células foram tratadas com wortmannin, houve depleção dos níveis citosólicos e totais de pAkt associada ao acúmulo citoplasmático de ciclina D1. Igualmente, não houve alteração nos níveis da proteína ?-catenina. Ademais, detectou-se a presença de PTEN nuclear em todas as linhagens estudadas. Desta forma, estas células de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço, apresentaram mecanismos de bloqueio e de ativação da proliferação celular, predominantemente, por atividade das proteínas PTEN (atividades citoplasmática e nuclear) e Akt, após o tratamento com wortmannin e EGF. / Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) represents 90% of all head and neck malignancies. Cancer growth, invasion and metastasis are due to several signaling pathways that, unfortunately, are not completely understood. The aim of this study was the crosstalk evaluation between PI3K and Wnt signaling pathways in two different HNSCC cell lines (HN6 and HN31) and HaCat cell line (immortalized keratinocytes), treated with 50nM wortmannin and 10ng/ml EGF (epidermal growth factor). Western blot and imunofluorescence were performed in order to analyze Wnt, PTEN and PI3K signaling key target proteins: PTEN, Akt, CyclinD1 and ?-catenin. Results showed that ?-cateninindependent cellular proliferation was promoted by PI3K signaling pathway EGF-dependent activation. After wortmannin treatment, correlation between decreased phospho-Akt levels and cytosolic cyclin D1 accumulation was found. Also, all cell lines exhibited nuclear PTEN activity. Taking these results together, we conclude that the Cyclin D1 positive and negative modulations, after EGF and wortmannin treatments, were due to, respectively, Akt and PTEN proteins.

Quinases dependentes de ciclinas (CDKs) compreendem uma família de proteínas que podem ser subdivididas em dois grupos funcionais majoritários baseados na sua função no ciclo celular e/ou controle transcricional. Já foram identificadas mais de 30 CDKs humanas. A CDK10 é uma proteína quinase dependente de ciclina pertencente ao grupo de quinases relacionadas à Cdc2. CDK10 é essencial na fase G2/M do ciclo celular, possivelmente no progresso dessa fase, monitorando a replicação completa do DNA e permitindo que as células passem desse ponto de restrição. Essa proteína é um importante determinante de resistência à terapia endócrina para câncer de mama. Portanto, é um alvo potencial para o desenvolvimento de inibidores, uma vez que está presente em células cancerosas. O estudo da estrutura e função da CDK10 deverá ser realizado após sua clonagem, expressão e purificação. O cDNA da CDK10 foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR), e posteriormente, o produto foi aplicado em gel de agarose para análise e purificação. O vetor de clonagem recombinante foi obtido, o qual foi clonado em células competentes e sequenciado. A obtenção do plasmídeo recombinante para expressão deu-se pela inserção do DNA nos vetores de expressão pET28a(+) e pET23a(+) (Novagen). A proteína foi expressa em células competentes e analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida. Em seguida, a proteína obtida foi purificada em coluna de afinidade por níquel e em coluna de afinidade por ATP. Com a otimização dos resultados obtidos, será possível, futuramente, caracterizar bioquimicamente a CDK10 e elucidar suas estruturas secundária e terciária. O estudo da CDK10 irá contribuir para o entendimento da sua relação estrutura-função e sua relação com oncogenes e supressores de tumor, e o estudo estrutural para o desenvolvimento de inibidores químicos de baixo peso molecular que possa inibir especificamente a CDK10. / Cyclin-dependent kinases (CDKs) comprise a family of proteins that can be subdivided into two major groups based on their functional role in cell cycle and / or transcriptional control. Over 30 human CDKs have been identifies. CDK10 is a cyclin-dependent kinase protein that belongs to the cdc2-related kinases group. CDK10 is essential in phase G2 / M of the cell cycle, possibly in the progress of this phase, monitoring the complete DNA replication and allowing the cells to pass through this restriction point. This protein is an important determinant of resistance to endocrine therapy for breast cancer. Therefore, it is a potential target for the development of inhibitors, since it is present in cancerous cells. The study of the structure and function of CDK10 must be performed after its cloning, expression and purification. cDNA of CDK10 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and then the product was applied into agarose gel for analysis and purification The cloning vector was obtained, which was cloned into competent cells and sequenced. The obtaining of the recombinant plasmid for expression was due to the insertion of DNA into expression vectors pET28a(+) and pET23a(+) (Novagen). The protein was expressed in competent cells and analyzed by electrophoresis on polyacrylamide gel. Then, the obtained protein was purified by nickel affinity column and ATP affinity column. With the optimization of the results obtained, it will be possible, in the future, to biochemically characterize CDK10 and elucidate its secondary and tertiary structures. The study of CDK10 will contribute to the understanding of its structure-function relationship and its relationship with oncogenes and tumor suppressors, and the structural study for the development of low molecular weight chemical inhibitors that can specifically inhibit CDK10. The structural studies will contribute to the development of chemical inhibitors of low molecular weight that may this and other CDKs.

O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço é responsável por 90% das neoplasias malignas, nesta região. Molecularmente, inúmeras vias de sinalização, ainda não muito bem compreendidas, são responsáveis pelo seu crescimento e invasão para tecidos vizinhos, além de metástases para órgãos distantes. Este trabalho destinou-se a avaliar o crosstalk entre as vias de sinalização do Wnt e PI3K, quando células de carcinoma epidermóide (HN6 e HN31) e queratinócitos imortalizados (HaCat), foram estimulados com 50nM Wortmannin (metabólito fúngico que mimetiza a função da PTEN) e 10ng/ml EGF (fator de crescimento epitelial). Para isto, proteínas-chave, pertencentes a estas vias, foram localizadas e quantificadas no interior celular: PTEN, ?-catenina, Akt, pAkt e Ciclina D1. As técnicas de imunofluorescência e western blot foram utilizadas, respectivamente, para observar a localização e os níveis destas proteínas, nos diferentes compartimentos celulares. Os resultados mostraram que a ativação da via do PI3K, pelo EGF, promoveu a proliferação celular, independentemente da via de sinalização do Wnt. Quando as células foram tratadas com wortmannin, houve depleção dos níveis citosólicos e totais de pAkt associada ao acúmulo citoplasmático de ciclina D1. Igualmente, não houve alteração nos níveis da proteína ?-catenina. Ademais, detectou-se a presença de PTEN nuclear em todas as linhagens estudadas. Desta forma, estas células de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço, apresentaram mecanismos de bloqueio e de ativação da proliferação celular, predominantemente, por atividade das proteínas PTEN (atividades citoplasmática e nuclear) e Akt, após o tratamento com wortmannin e EGF. / Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) represents 90% of all head and neck malignancies. Cancer growth, invasion and metastasis are due to several signaling pathways that, unfortunately, are not completely understood. The aim of this study was the crosstalk evaluation between PI3K and Wnt signaling pathways in two different HNSCC cell lines (HN6 and HN31) and HaCat cell line (immortalized keratinocytes), treated with 50nM wortmannin and 10ng/ml EGF (epidermal growth factor). Western blot and imunofluorescence were performed in order to analyze Wnt, PTEN and PI3K signaling key target proteins: PTEN, Akt, CyclinD1 and ?-catenin. Results showed that ?-cateninindependent cellular proliferation was promoted by PI3K signaling pathway EGF-dependent activation. After wortmannin treatment, correlation between decreased phospho-Akt levels and cytosolic cyclin D1 accumulation was found. Also, all cell lines exhibited nuclear PTEN activity. Taking these results together, we conclude that the Cyclin D1 positive and negative modulations, after EGF and wortmannin treatments, were due to, respectively, Akt and PTEN proteins.

O carcinoma epidermóide por se tratar de uma doença genética, apresenta dificuldades em relação ao seu tratamento. As vias de sinalização celular por controlarem os mecanismos responsáveis pela proliferação e sobrevivência da célula, são de extrema importância nos estudos da biologia do câncer e oncogênese. Aberrações cromossômicas que afetam a estrutura e a expressão de genes e proteínas que regulam componentes das vias de sinalização são diretamente correlacionadas com o desenvolvimento e progressão tumoral. Vários genes e proteínas vêm sendo avaliados na busca de um alvo terapêutico quimioterápico, algo pouco estudado em carcinomas epidermóides bucais. Este trabalho teve como objetivo analisar a influência do quimioterápico 17-AAG e do fator de crescimento epitelial (EGF) nos níveis das proteínas NFkB, Ciclina D1 e Cdk4 nas linhagens de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (HN6 e HN31) e no queratinócito imortalizado (HaCat). Este trabalho destinou-se também a estudar uma possível inter-relação entre as proteínas Metalotioneína e NFkB e suas interações com as proteínas Ciclina D1 e Cdk4 nas linhagens celulares HN6 , HN31 e (HaCat, para uma maior compreensão de seus efeitos nas vias de sinalização celular e conseqüente progressão do câncer). Para análise a respeito da localização e os níveis das proteínas MT, NFkB, Ciclina D1 e Cdk4 foram utilizados ensaios de imunofluorescência e western blot, respectivamente.Os resultados apontaram um melhor perfil apoptótico da linhagem HN31 frente ao tratamento com 17-AAG, apresentando diminuição significante dos níveis de NFkB e Ciclina D1, além de exibir importante decréscimo nos níveis de Cdk4. A proteína MT parece não sofrer ação do NFkB. A indução de proliferação celular realizada por EGF exerceu um aumento dos níveis das proteínas NFkB e Ciclina D1, sugerindo um papel importante das vias de sinalização estimuladas por EGF (Akt, NFkB e Ciclina D1) na progressão tumoral dessas linhagens.Por fim, a ocorrência de estímulo nos níveis da proteína MT por parte do EGF, sugeriram um importante papel do EGF e da MT na resistência a apoptose nas linhagens estudadas. / Squamous cell carcinomas as a genetic diseases, presents certain difficulties in relation to their treatment. The process of cell signaling for overseeing the mechanisms responsible for cellular proliferation and survival are very important in studies of the biology of cancer and development. Chromosomal alterations affecting the structure and expression of genes and proteins that regulate the process of signaling components are directly correlated with the development and tumor progression. Several genes and proteins are being evaluated in the search for a biological marker that could help in the understanding of cancer as well as in its prognosis, and mainly in search of therapeutic target chemotherapy, something little studied in oral squamous cell carcinoma. This study aimed to examine the influence of chemotherapy 17-AAG and the epithelial growth factor (EGF) in the levels of proteins NFkB, Cyclin D1 and Cdk4 in strains of squamous cell carcinoma of the head and neck (HN6 and HN31) and immortalized in keratinocytes(HaCat). This work is also intended to explore a possible inter-relationship between the Metallothionein and NFkB proteins and their interactions with the proteins Cyclin D1 and Cdk4 in cell lines HN6, HN31 and (HaCat, to a greater understanding of its effects on pathways of cellular signaling and consequent progression of cancer. For analysis regarding the location and levels of the protein MT, NFkB, Cyclin D1 and Cdk4 were used tests of immunofluorescence and western blot. Results showed a better apoptotic profile of HN31 treated with 17-AAG, showing decrease levels of NFkB and Cyclin D1, with a important decrease in the levels of Cdk4. The metallothionin protein does not appear to suffer action of NFkB. The induction of cell proliferation conducted by EGF had increased levels of NFkB and Cyclin D1 proteins, suggesting an important role in the process of signaling stimulated by EGF (Akt, NFkB and Ciclina D1) in tumor progression of oral squamous cell carcinoma. The occurrence to stimulate the levels of metallothionein protein by the EGF, suggest an important role of EGF and MT in resistance to apoptosis in the studied cell lines.

Esta tesis doctoral consiste en la caracterización de la ciclina meiótica Rem1, de Schizosaccharomyces pombe. En este trabajo se analizó, inicialmente, el patrón de transcripción y expresión de rem1 durante la meiosis observando que el pico de expresión se produce durante la meiosis I, la actividad quinasa del complejo ciclina-Cdk también coincide con la meiosis I. Seguidamente, se determinó que la transcripción del mRNA maduro de rem1 depende de Mei4 a través de las cajas FLEX del promotor de rem1. También se observó la presencia de un RNA "antisense" que se transcribe durante las primeras horas de la meiosis. A continuación, se estudió la función de Rem1 durante la meiosis determinando una función de esta ciclina en la meiosis I. Se observó la toxicidad de Rem1 expresado durante el ciclo mitótico. Posteriormente, se analizaron posibles interacciones genéticas con otras ciclinas meióticas detectando que Rem1 tiene una función redundante con Cig2 durante la fase S meiótica. También se determinó la necesaria presencia de rem1 para conseguir unos niveles de recombinación meiótica intragénica normales, mientras que se requiere para la recombinación intergénica. / The main goal of this doctoral thesis is the characterization of the meiotic cyclin Rem1, in Schizosaccharomyces pombe. First of all we analized the transcription and expresion profiles of rem1 during meiosis. We observed the maximum of expresion during meiosi I and the kinase activity of the complex cyclin-Cdk had exactly the same profile. Then, we analized the transcription profile of the mature mRNA of rem1, showing that this transcription depends on Mei4 through the FLEX boxes which are loclized in the rem1 promoter. An antisense RNA was also detected at the begining of the meiosis. We next diceded to study the function of this cyclin. Firstly we observed that overexpression of Rem1 is toxic for the cell during mitotic cell growth. Moreover, a function for Rem1 was observed during meiosis I. Rem1 is also required in order to obtain normal levels of meiotic intragenic recombination, but it is not necesary for the intergenic recombination. Finally, we could detect a genetic interaction betwen Rem1 and the meiotic S phase cyclin, Cig2.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-17Bitstream added on 2014-06-13T18:08:59Z : No. of bitstreams: 1 ishii_pl_me_rcla.pdf: 341469 bytes, checksum: 30957c71a427ca667e0c86edb9d40228 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Nutrigenômica é definida como o efeito da dieta na expressão gênica, e a extensão pela qual as diferenças genéticas entre os indivíduos influenciam a resposta a um padrão específico de dieta, à ingestão de alimentos funcionais e à suplementação de micronutrientes, em termos de um resultado para a saúde humana. A α-tomatina é um glicoalcalóide encontrado no tomate (Lycopersicon esculentum) que possui funções biológicas importantes como a redução dos níveis de colesterol LDL, inibição do crescimento de células cancerosas, estimulação do sistema imune e efeito antimetastático. O objetivo deste estudo foi avaliar a citotoxicidade da α-tomatina, os seus efeitos na proliferação celular, na indução de apoptose e expressão de RNAm dos genes APC, Ciclina A2, Catenina, CASP9, BAK, BAX e BCL-XL em células HT29. As células foram cultivadas em meio de cultura DMEM, suplementado com 10% de soro bovino fetal, e tratadas nas concentrações de 0,1, 1 e 10 μg/mL para o ensaio do MTT e proliferação celular. Na análise de apoptose morfológica utilizou-se as concentrações de 0,1, 1 e 2 μg/mL. Já para a avaliação da expressão gênica utilizou-se a concentração de 1 μg/mL. Após 12 horas de tratamento, o RNA das células foi extraído e a expressão dos genes foi avaliada através do método de PCR em tempo real. O gene GPDH foi utilizado como normalizador. A análise estatística foi realizada por ANOVA/Tukey para o ensaio do MTT. Os resultados do ensaio de cinética de proliferação celular, viabilidade celular e avaliação da indução de apoptose foram analisados estatisticamente através de ANOVA/Dunnet, e para a análise da expressão gênica utilizou-se o método de Pfaffl et al. (2002), através do cálculo estimado pelo método ΔΔCt. Os estudos experimentais indicaram que a α-tomatina foi citotóxica apenas na concentração de 10 μg/mL... / Nutrigenomics is defined as the effect of diet on gene expression, and the extent to which genetic differences between individuals influence the response to a specific pattern of diet, intake of functional foods and micronutrient supplementation, in terms of a result for human health. The α- tomatine is highlighted as a glycoalkaloid found in tomato (Lycopersicon esculentum) that has important biological functions such as reducing levels of LDL cholesterol, inhibit cancer cell growth, stimulation of the immune system and antimetastátic effect. In view of these considerations, the objective of this study was to evaluate the cytotoxicity of α-tomatine, their effects on cell proliferation, induction of apoptosis and morphological expression of mRNA of APC gene, Cyclin A2, β-Catenin, CASP9, BAK, BAX and BCL-XL in HT29 cells. The cells were grown in DMEM culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum, and treated at concentrations of 0.1, 1 and 10μg/mL for the MTT assay and cell proliferation. In the morphological analysis of apoptosis, we used concentrations of 0.1, 1 and 2μg/mL. As for the evaluation of gene expression we used a concentration of 1 mg/mL. After 12 hours of treatment, the RNA from cells was extracted and gene expression was evaluated by the method of real-time PCR. The gene GPDH was used as normalizer. Statistical analysis was performed by ANOVA / Tukey test for MTT. The test results of kinetics of cell proliferation, cell viability and assessment of apoptosis were analyzed with ANOVA / Dunnet, and for analysis of gene expression we used the method of Pfaffl et al. (2002), by calculating estimated by ΔΔCt. Experimental studies suggested that α-tomatine was cytotoxic only at concentration of 10μg/mL. In the evaluation of cell proliferation were no significant differences in the treatments with α-tomatine, except that for the concentration... (Complete abstract click electronic access below)

Quinases dependentes de ciclinas (CDKs) compreendem uma família de proteínas que podem ser subdivididas em dois grupos funcionais majoritários baseados na sua função no ciclo celular e/ou controle transcricional. Já foram identificadas mais de 30 CDKs humanas. A CDK10 é uma proteína quinase dependente de ciclina pertencente ao grupo de quinases relacionadas à Cdc2. CDK10 é essencial na fase G2/M do ciclo celular, possivelmente no progresso dessa fase, monitorando a replicação completa do DNA e permitindo que as células passem desse ponto de restrição. Essa proteína é um importante determinante de resistência à terapia endócrina para câncer de mama. Portanto, é um alvo potencial para o desenvolvimento de inibidores, uma vez que está presente em células cancerosas. O estudo da estrutura e função da CDK10 deverá ser realizado após sua clonagem, expressão e purificação. O cDNA da CDK10 foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR), e posteriormente, o produto foi aplicado em gel de agarose para análise e purificação. O vetor de clonagem recombinante foi obtido, o qual foi clonado em células competentes e sequenciado. A obtenção do plasmídeo recombinante para expressão deu-se pela inserção do DNA nos vetores de expressão pET28a(+) e pET23a(+) (Novagen). A proteína foi expressa em células competentes e analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida. Em seguida, a proteína obtida foi purificada em coluna de afinidade por níquel e em coluna de afinidade por ATP. Com a otimização dos resultados obtidos, será possível, futuramente, caracterizar bioquimicamente a CDK10 e elucidar suas estruturas secundária e terciária. O estudo da CDK10 irá contribuir para o entendimento da sua relação estrutura-função e sua relação com oncogenes e supressores de tumor, e o estudo estrutural para o desenvolvimento de inibidores químicos de baixo peso molecular que possa inibir especificamente a CDK10. / Cyclin-dependent kinases (CDKs) comprise a family of proteins that can be subdivided into two major groups based on their functional role in cell cycle and / or transcriptional control. Over 30 human CDKs have been identifies. CDK10 is a cyclin-dependent kinase protein that belongs to the cdc2-related kinases group. CDK10 is essential in phase G2 / M of the cell cycle, possibly in the progress of this phase, monitoring the complete DNA replication and allowing the cells to pass through this restriction point. This protein is an important determinant of resistance to endocrine therapy for breast cancer. Therefore, it is a potential target for the development of inhibitors, since it is present in cancerous cells. The study of the structure and function of CDK10 must be performed after its cloning, expression and purification. cDNA of CDK10 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and then the product was applied into agarose gel for analysis and purification The cloning vector was obtained, which was cloned into competent cells and sequenced. The obtaining of the recombinant plasmid for expression was due to the insertion of DNA into expression vectors pET28a(+) and pET23a(+) (Novagen). The protein was expressed in competent cells and analyzed by electrophoresis on polyacrylamide gel. Then, the obtained protein was purified by nickel affinity column and ATP affinity column. With the optimization of the results obtained, it will be possible, in the future, to biochemically characterize CDK10 and elucidate its secondary and tertiary structures. The study of CDK10 will contribute to the understanding of its structure-function relationship and its relationship with oncogenes and tumor suppressors, and the structural study for the development of low molecular weight chemical inhibitors that can specifically inhibit CDK10. The structural studies will contribute to the development of chemical inhibitors of low molecular weight that may this and other CDKs.