El nostre laboratori s'ha centrat des de fa anys en l'estudi del gen que codifica per a la Kidney Androgen-regulated Protein (KAP) al ronyó murí, utilitzant-lo com a model d'estudi dels mecanismes moleculars que controlen la regulació de l'expressió gènica mitjançant andrògens al ronyó. Aquest gen, expressat de manera exclussiva per les cèl·lules epitelials del túbul proximal renal, exhibeix un control multihormonal específic en els diferents segments del mateix, amb participació d'andrògens, estrògens i hormona tiroidal. La comparació de seqüències gèniques i de la proteïna deduïda de KAP amb les dipositades en les bases de dades, no revela cap homologia amb altres gens o proteïnes conegudes. Les anàlisis de predicció de dominis funcionals tampoc suggereixen una possible localització o funció per a la KAP. Malgrat això, la relativa abundància del mRNA de la KAP, la seva localització exclussiva a l'epiteli del túbul proximal renal i l'estricte control multihormonal de la seva expressió, suggereixen que es podria tractar d'una proteïna de rellevància en fisiologia renal, i per això l'objectiu d'aquesta tesi ha estat la identificació i caracterització funcional de la proteïna KAP. La producció d'anticossos monoclonals contra dos pèptids sintètics de la KAP ens ha permès identificar la proteïna endògena per immunohistoquímica i Western blot en ronyó murí. La distribució cel·lular i control androgènic es correspon amb la del mRNA i la seva mida aparent és de 20 KDa. La proteïna també ha estat expressada i caracteritzada en sistèmes heteròlegs tals com bacteris i llevat. Assaigs de dobles híbrids en llevat ens han permès observar que la KAP interacciona de manera específica amb el receptor de CsA, la CyPB, havent-se confirmat aquesta interacció mitjançant GST-Pulldown, co-immunoprecipitació i co-localització per microscopia confocal. Malgrat els beneficis de la CsA com a immunosupressor, evitant el rebuig en pacients trasplantats, el seu ús es veu limitat pels greus efectes tòxics que produeix al ronyó, especialment a les cèl·lules del túbul proximal renal. La interacció de KAP amb CyPB ens ha portat a analitzar els efectes de la CsA sobre la interacció KAP-CyPB i sobre la expressió de la KAP. Observem que la CsA no desplaça la interacció entre KAP i CyPB. Hem demostrat que la administració de CsA a ratolins de la soca C57BL/6, disminueix de manera significativa els nivells de proteïna KAP en extractes crus de ronyó. En línies cel·lulars de túbul proximal murí, la presència de CsA augmenta la secreció de la KAP al medi de cultiu. Tanmateix, la transfecció estable de KAP i la seva sobre-expressió controlada per tetraciclina en un sistema cel·lular de túbul proximal, disminueix de forma significativa la toxicitat per CsA. / For years our laboratory has been focused on the gene that codes for the Kidney Androgen-regulated Protein (KAP) as a model to study the molecular mechanisms involved in the hormonal regulation of gene expression, mediated by androgens in mouse kidney. The KAP gene, expressed exclusively in the epithelial cells of proximal convoluted tubules, exhibits a multihormonal control of its expression in the different segments of proximal tubules, mediated by androgens, estrogens and thyroid hormone. Comparison of KAP nucleotide and amino acid sequences with sequences deposited in public databases has revealed that there is no homology with any known sequences that might indicate a possible function of the KAP protein. The relative abundance of the KAP mRNA and its exclusive localization in the epithelial cells of proximal convoluted tubules have suggested that the KAP protein might have a relevant function in kidney physiology. In this scenario, the main objective of this Thesis is the identification and functional characterization of the KAP protein. Production of monoclonal antibodies against two synthetic peptides of the KAP protein has allowed to identify the protein by Western blot and immunohistochemistry analysis in mouse kidney. The cellular distribution and androgenic control of its expression corresponds with that observed for the KAP mRNA and the protein has an apparent molecular weight of 20 kDa in SDS-PAGE gels. The protein has been also expressed and characterized in heterologous systems such as E. coli and Sacharomycces cerevisiae. By using the two-hybrid system in yeast we have been able to demonstrate that KAP interacts in a specific fashion with the Cyclosporin A (CsA) receptor, CypB. This interaction has been also proven by pulldown assays, co-immunoprecipitation and co-location using confocal microscopy. Although CsA is a potent immunosupressor, preventing the graft versus host disease in organ transplantation, its use has been limited by its deleterious side in the kidney, specially in the proximal tubule cells. The interaction between KAP and CypB pointed us to the study of the effects of CsA treatment on KAP-CyPB interaction, and on KAP expression. In our hands, CsA does not compete with KAP for CyPB interaction. We have shown that administration of CsA to C57BL/6 mice significantly diminishes the KAP protein levels in crude kidney extracts. In a cellular model, CsA treatment increases KAP secretion to the culture media. Also, stable transfection of KAP cDNA in a cellular system of proximal tubule cells has shown that overexpression of the KAP protein diminishes significantly the toxic effects of CsA in these cells.

La Ciclosporina A (CsA) es un fármaco inmunosupresor que ha supuesto una revolución en el trasplante de órganos. A pesar de sus propiedades anti-inflamatorias, su uso se ha visto limitado por los efectos tóxicos que causa en algunos pacientes. La CsA inhibe la trascripción de genes involucrados en el sistema inmune. Se cree que esta inhibición es la causante de los efectos tóxicos producidos por el fármaco. El modo de acción de CsA está mediado por la unión de sus principales receptores intracelulares, las ciclofilinas (Cyps). Las ciclofilinas son proteínas que están conservadas en todas las especies y su principal función está involucrada en el plegamiento correcto de otras proteínas. Se ha descrito que los efectos tóxicos producidos por CsA podían estar mediados directamente por sus receptores las ciclofilinas. A pesar de que se descrito que las ciclofilinas están involucradas en diferentes funciones, no se les atribuye una función específica. En nuestro laboratorio hemos estado interesados en las posibles vías que involucran a las Cyps y si éstas tienen relación con lo efectos causados por CsA. En esta tesis se ha intentado identificar proteínas que interaccionan con CypA, CypB y FKBP12 y su implicación en los efectos tóxicos producidos por CsA. Hemos identificado una serie de interacciones y hemos estudiado más a fondo dos de ellas. Estas interacciones son las ocurridas entre la ciclofilina B y la subunidad beta de la bomba sodio/potasio, la ciclofilina A y la subunidad beta de la bomba sodio/potasio y por último la ciclofilina B y la subunidad b1 de la ATP sintetasa mitocondrial. Una vez identificadas estas interacciones hemos realizado ensayos funcionales con cada una de ellas. Por un lado hemos estudiado si la actividad de la bomba sodio/potasio estaba afectada en células renales humanas tratadas con CsA y células que habían sido silenciadas para la ciclofilina B y ciclofilina A. Por otro lado hemos realizado un estudio de la actividad y expresión de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial en células renales tratadas con CsA y células renales que habían sido silenciadas para los genes CypA y CypB. A parte de las interacciones encontradas, hemos visto que la actividad de la bomba Na/K está disminuida por el fármaco y que en esta disminución estaría involucrada la ciclofilina B, también hemos visto que los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial estarían afectados en células tratadas con CsA y en células interferidas tanto para CypB como para CypA. Como conclusión podríamos sugerir que las ciclofilinas estarían involucradas en los efectos nefrotóxicos que produce la CsA. Estos efectos nefrotóxicos causados por el tratamiento con CsA podrían estar mediados por vias alternativas a la clásicamente descrita, como es la inhibición de la calcineurina. Dichas vías estarían integradas por nuevos efectores tales como Na/K-ATPasa, ATP sintetasa, así como otras putativas dianas que en el futuro serán estudiadas en nuestro laboratorio. / Cyclosporine A is an immunosuppressive drug that has revolutionized organ transplantation. Even though it has anti-inflammatory property, its used has been reduced due to the renal toxic effects caused in some patients. CsA inhibits transcription of genes involved in the immune system. The CsA mode of action involves the binding of its main receptors, the cyclophilins (Cyps). Cyps are proteins conserved in all species and their main function is the correct folding of immature proteins. It has been describes that the main toxic effects caused by CsA could be mediated directly by its receptors, the cyclophilins. Although Cyps are involved in many processes, there is not a specific function for them. In our lab, we have identified a number of proteins that interact with Cyclophilin A (CypA), Cyclophilin B (CypB) and FK-Binding Protein 12 (FKBP12) by yeast two hybrid assays. Some of those novel interactions were confirmed by pull-down and co-immunoprecipitation assays. Finally, we have also carried out functional assays in some of those interactions. As a conclusion, we could suggest that cyclophilins would be involved in the nephrotoxic effects caused by cyclosporine A. Those effects are mediated by alternative pathways. Those pathways would be integrated by novel effectors such as the sodium/potassium ATPase, mitochondrial ATP synthase and also other proteins that will be studied in our lab.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:32:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FernandoJON_TESE.pdf: 1862708 bytes, checksum: c0bcb5ceb1bfbf2e1312b265a0c10350 (MD5) Previous issue date: 2013-09-13 / Periodontal disease is an infectious disease resulting from the immunoinflammatory response of the host to microorganisms present in the dental biofilm which causes tissue destruction. The objective of this study was to evaluate the immunohistochemical expression of cyclophilin A (CYPA), extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN) and matrix metalloproteinase 7 (MMP-7) in human specimens of clinically healthy gingiva (n=32), biofilm-induced gingivitis (n=28), and chronic periodontitis (n=30). Immunopositivity for CYPA, EMMPRIN and MMP-7 differed significantly between the three groups, with higher percentages of staining in chronic periodontitis specimens, followed by chronic gingivitis and healthy gingiva specimens (p < 0.001). Immunoexpression of CYPA and MMP-7 was higher in the intense inflammatory infiltrate observed mainly in cases of periodontitis. Analysis of possible correlations between the immunoexpression of EMMPRIN, MMP-7 and CYPA and between the expression of these proteins and clinical parameters (probing depth and clinical attachment loss) showed a positive correlation of CYPA expression with MMP-7 (r = 0.831; p < 0.001) and EMMPRIN (r = 0.289; p = 0.006). In addition, there was a significant positive correlation between probing depth and expression of MMP-7 (r = 0.726; p < 0.001), EMMPRIN (r = 0.345; p = 0.001), and CYPA (r = 0.803; p < 0.001). These results suggest that CYPA, EMMPRIN and MMP-7 are associated with the pathogenesis and progression of periodontal disease / A doen?a periodontal ? uma entidade infecciosa que resulta da resposta imuno-inflamat?ria do hospedeiro aos microrganismos presentes no biofilme dent?rio, levando ? destrui??o tecidual. O prop?sito do presente estudo foi avaliar a express?o imuno-histoqu?mica da ciclofilina A (CYPA), do indutor de metaloproteinases da matriz extracelular (EMMPRIN) e da metaloproteinase da matriz 7 (MMP-7) em esp?cimes humanos de gengiva clinicamente saud?vel (n=32), gengivite induzida por biofilme dent?rio (n=28) e periodontite cr?nica (n=30). Foram realizadas bi?psias das tr?s condi??es cl?nicas e feita a an?lise imuno-histoqu?mica atrav?s da contagem total do n?mero de c?lulas positivas, correlacionando-a com par?metros cl?nicos. A imunopositividade da CYPA, do EMMPRIN e da MMP-7 revelou diferen?a estatisticamente significativa entre os tr?s grupos, com maiores percentuais de positividade nos esp?cimes de periodontite cr?nica, seguidos pelos esp?cimes de gengivite cr?nica e de gengiva saud?vel (p < 0,001). Foi evidenciada maior express?o de CYPA e MMP-7 nos grupos que tinham infiltrado inflamat?rio mais intenso. Foram observadas correla??es das imunoexpress?es de EMMPRIN, MMP-7 e CYPA, tanto entre si como com par?metros cl?nicos (profundidade de sondagem e perda de inser??o cl?nica). Foram verificadas correla??es positivas entre a express?o de CYPA e as express?es da MMP-7 (r = 0,831; p < 0,001) e do EMMPRIN (r = 0,289; p = 0,006). Al?m disso, a profundidade de sondagem revelou correla??o positiva, estatisticamente significativa, com as express?es de MMP-7 (r = 0,726; p < 0,001), EMMPRIN (r = 0,345; p = 0,001) e CYPA (r = 0,803; p < 0,001). Esses resultados evidenciam que a CYPA, o EMMPRIN e a MMP-7 podem estar associadas ? patog?nese e progress?o da doen?a periodontal

A oxidação do resíduo de cisteína 56 (ANT-cys56) do transportador de nucleotídeos de adenina (ANT) é descrita como evento crítico da Transição de Permeabilidade Mitocondrial (TPM), fenômeno caracterizado pela sensibilidade ao fármaco imunossupressor ciclosporina A (CsA), responsável pela ligação e inibição do componente promotor da abertura do Poro de Transição de Permeabilidade (PTP), a enzima peptidil-prolil-cis trans isomerase (cyp D). Aspectos bioquímico-estruturais do ANT, das cardiolipinas (CDL) que envolvem o transportador e da cyp D na TPM foram avaliados por meio de ensaios turbidimétricos de inchamento mitocondrial e estado conformacional do ANT em mitocôndrias isoladas de fígado de rato, associados a abordagens de química computacional para análises de campos de interação molecular (MIF) e dinâmica molecular (MD), visando a predição de eventos envolvidos na abertura do PTP. As análises computacionais revelaram aumento da mobilidade relativa do ANT-cys56, como resultado da interação preferencial do Ca2+ com a molécula de CDL ligada à hélice 4 do transportador, enquanto que a inversão da configuração do resíduo de prolina do ANT (ANT-pro61) potencializou o efeito induzido por Ca2+. A presença de ADP no interior do ANT preveniu o aumento da mobilidade relativa do ANT-cys56 promovida pelo Ca2+, enquanto que a inversão da configuração do ANT-pro61, de trans para cis, potencializou o efeito promovido pelo Ca2+ na mobilidade relativa do ANT-cys56, de forma insensível ao nucleotídeo. Os ensaios com mitocôndrias isoladas demonstraram que o Ca2+ induz a conformação c do ANT e promove abertura do PTP, de forma sensível à CsA e ADP. A presença de cyp D estabilizou a conformação c do ANT induzida por Ca2+, sendo que Atractilosídeo (ATR) tornou o efeito parcialmente insensível aos inibidores da TPM. Os resultados sugerem que a abertura do PTP induzida por Ca2+ envolve a mudança conformacional do ANT para o estado c, cuja estabilização é obtida pela cyp D na função de inversão do ANT-pro61, com base na avaliação da mobilidade relativa do ANT-cys56 parcialmente sensível ao ADP. / Oxidation of the Adenine Nucleotide Translocase (ANT) cysteine residue 56 (ANT-cys56) is potentially involved in Ca2+-induced Mitochondrial Permeability Transition (MPT), a process which is prevented by cyclosporine A (CsA), due to its inhibition of Permeability Transition Pore (PTP) opener component, the peptidyl-prolyl cis-trans isomerase cyclophylin D (cyp D). The main aspects of ANT, cardiolipins (CDL) and cyp D on Ca2+-induced PTP opening were addressed by employing light scattering techniques in isolated rat liver mitochondria to assess both ANT conformational change and mitochondrial swelling in association with computational chemistry analysis of Molecular Interaction Fields (MIF) and Molecular Dynamics (MD) for PTP events predictions. Computational analysis revealed that Ca2+ interacts preferentially with the ANT surrounding CDL bound to the H4 helix of the carrier and weakens the CDL/ANT interactions accounting for the ADP-sensitive increase of ANT-cys56 relative mobility while ANT-pro61 cis to trans configuration inversion intensified the Ca2+ effect in a ADP-insensitive way. The ANT conformation and mitochondrial swelling analyses demonstrated that Ca2+ induces conformation c of ANT and opens PTP in a CsA- and ADP-sensitive way. Cyp D stabilizes Ca2+-induced ANT conformation c, whereas ATR renders a PTP opening less sensitive to the inhibition by CsA or ADP. The results suggest that Ca2+-induced PTP opening involves ANT conformation c change supported by a cyp D-induced trans to cys ANT-pro61 configuration inversion based on the relative mobility of ANT-cys56, in a ADP-sensitive manner.

A oxidação do resíduo de cisteína 56 (ANT-cys56) do transportador de nucleotídeos de adenina (ANT) é descrita como evento crítico da Transição de Permeabilidade Mitocondrial (TPM), fenômeno caracterizado pela sensibilidade ao fármaco imunossupressor ciclosporina A (CsA), responsável pela ligação e inibição do componente promotor da abertura do Poro de Transição de Permeabilidade (PTP), a enzima peptidil-prolil-cis trans isomerase (cyp D). Aspectos bioquímico-estruturais do ANT, das cardiolipinas (CDL) que envolvem o transportador e da cyp D na TPM foram avaliados por meio de ensaios turbidimétricos de inchamento mitocondrial e estado conformacional do ANT em mitocôndrias isoladas de fígado de rato, associados a abordagens de química computacional para análises de campos de interação molecular (MIF) e dinâmica molecular (MD), visando a predição de eventos envolvidos na abertura do PTP. As análises computacionais revelaram aumento da mobilidade relativa do ANT-cys56, como resultado da interação preferencial do Ca2+ com a molécula de CDL ligada à hélice 4 do transportador, enquanto que a inversão da configuração do resíduo de prolina do ANT (ANT-pro61) potencializou o efeito induzido por Ca2+. A presença de ADP no interior do ANT preveniu o aumento da mobilidade relativa do ANT-cys56 promovida pelo Ca2+, enquanto que a inversão da configuração do ANT-pro61, de trans para cis, potencializou o efeito promovido pelo Ca2+ na mobilidade relativa do ANT-cys56, de forma insensível ao nucleotídeo. Os ensaios com mitocôndrias isoladas demonstraram que o Ca2+ induz a conformação c do ANT e promove abertura do PTP, de forma sensível à CsA e ADP. A presença de cyp D estabilizou a conformação c do ANT induzida por Ca2+, sendo que Atractilosídeo (ATR) tornou o efeito parcialmente insensível aos inibidores da TPM. Os resultados sugerem que a abertura do PTP induzida por Ca2+ envolve a mudança conformacional do ANT para o estado c, cuja estabilização é obtida pela cyp D na função de inversão do ANT-pro61, com base na avaliação da mobilidade relativa do ANT-cys56 parcialmente sensível ao ADP. / Oxidation of the Adenine Nucleotide Translocase (ANT) cysteine residue 56 (ANT-cys56) is potentially involved in Ca2+-induced Mitochondrial Permeability Transition (MPT), a process which is prevented by cyclosporine A (CsA), due to its inhibition of Permeability Transition Pore (PTP) opener component, the peptidyl-prolyl cis-trans isomerase cyclophylin D (cyp D). The main aspects of ANT, cardiolipins (CDL) and cyp D on Ca2+-induced PTP opening were addressed by employing light scattering techniques in isolated rat liver mitochondria to assess both ANT conformational change and mitochondrial swelling in association with computational chemistry analysis of Molecular Interaction Fields (MIF) and Molecular Dynamics (MD) for PTP events predictions. Computational analysis revealed that Ca2+ interacts preferentially with the ANT surrounding CDL bound to the H4 helix of the carrier and weakens the CDL/ANT interactions accounting for the ADP-sensitive increase of ANT-cys56 relative mobility while ANT-pro61 cis to trans configuration inversion intensified the Ca2+ effect in a ADP-insensitive way. The ANT conformation and mitochondrial swelling analyses demonstrated that Ca2+ induces conformation c of ANT and opens PTP in a CsA- and ADP-sensitive way. Cyp D stabilizes Ca2+-induced ANT conformation c, whereas ATR renders a PTP opening less sensitive to the inhibition by CsA or ADP. The results suggest that Ca2+-induced PTP opening involves ANT conformation c change supported by a cyp D-induced trans to cys ANT-pro61 configuration inversion based on the relative mobility of ANT-cys56, in a ADP-sensitive manner.