de tumorigênese em melanomas, ainda não há tratamento eficaz para melanomas metastáticos. Esta ineficácia terapêutica pode estar relacionada com a adaptação e seleção de células de melanoma à indução de estresse de RE. Ultrapassar os níveis sustentados de estresse de RE, interferindo nas vias de adaptação a este estresse, foi o alvo deste estudo na tentativa de propor uma nova estratégia terapêutica para sensibilizar células de melanoma a morte induzida por cisplatina. Mostramos que GADD153, um dos componentes da via de UPR (Unfolded Protein Response) responsável por induzir apoptose em reposta ao estresse de RE, está excluída do núcleo em melanomas primários, metástases ganglionares e viscerais. Este dado sugere que a localização citoplasmática do fator de transcrição GADD153 possa estar envolvida na resposta adaptativa de melanomas ao estresse de RE, uma vez que se sabe que GADD153 se acumula no núcleo em resposta a este estresse. Investigamos se a indução de estresse de RE seria capaz de induzir a translocação de GADD153 para o núcleo e resultar na sensibilização de células de melanoma a morte induzida por cisplatina (CDDP). Realizamos o tratamento de células de melanoma (SbCl2, Mel85, SK-MEL- 29, SK-MEL-28 e SK-MEL-147) com tunicamicina (Tuni), indutor clássico de estresse de RE, previamente ao tratamento com CDDP. Demonstramos que em todas as linhagens exceto em SK-MEL-29, houve um aumento na porcentagem de células hipodiploides (>50%) no tratamento combinado (Tuni>CDDP) comparado ao tratamento com CDDP. As células SK-MEL-147 se mostraram mais sensíveis à indução de estresse de RE e as células SK-MEL-29 mais resistentes. Algumas diferenças entre estas linhagens como a expressão de GRP78 de superfície e presença de oligossacarídeos ?1-6 ligados de superfície podem estar relacionadas com esta resposta diferencial ao estresse de RE. Em todas as linhagens verificamos a acúmulo dos marcadores de UPR, GRP78 e GADD153, após o tratamento com tunicamicina. Além disso, GADD153 foi direcionada para o núcleo em reposta ao tratamento com tunicamicina. O acúmulo de vacúolos acídicos, da proteína autofágica LC3-II e de ROS após o tratamento com Tuni>CDDP, sugerem que tanto a autofagia quanto o estresse oxidativo parecem estar envolvidos na resposta de sensibilização. A inibição de autofagia com cloroquina aumentou a morte induzida por Tuni>CDDP, sugerindo que autofagia desempenha função protetora neste esquema terapêutico. Testamos um segundo agente genotóxico, temozolomida (TMZ), uma droga equivalente à dacarbazina, e a mesma capacidade de sensibilização foi observada pelo prévio tratamento com tunicamicina. A validação deste conceito in vivo foi dificultada pela acentuada toxicidade apresentada por tunicamicina. Avaliamos alguns candidatos a agentes estressores do RE que poderiam apresentar menor toxicidade celular, como swainsonina, atorvastatina, metformina e o composto de cobre [Cu2(apyhist)2(dpam)](ClO4)4. No entanto, não obtivemos resultados promissores com nenhum destes candidatos. Estes resultados mostram que as células tumorais podem ser pré-condicionadas à morte celular se expostas a um prévio estressor de RE, como Tuni, o que leva ao comprometimento da resposta adaptativa a indutores de morte celular como CDDP e TMZ. No entanto, ainda é necessário o estudo de agentes indutores de estresse de RE pouco tóxicos para que esta estratégia terapêutica possa ser utilizada em pacientes com melanoma / Melanoma is among the most aggressive malignancies with increasing worldwide incidence and there is no effective treatment for the metastatic disease. The absence of an effective therapy may be due to adaptation and selection of melanoma cells to endoplasmic reticulum (ER) stress. We showed that GADD153, one of the components of the ER stress-mediated apoptosis pathway, was mostly excluded from the nucleus of primary and metastatic melanoma cells compared to nevus cells. These data suggest that the unexpected GADD153 cellular localization could be involved in melanoma cell adaption to ER stress, since GADD153 accumulates in the nucleus during ER stress. Unfolded protein response (UPR) signaling induced in response to ER stress, is a dual process that induces a protective response to restore ER homeostasis or cell death if ER stress is severe or persistent. We investigated if induction of ER stress was a potential strategy to chemosensitize melanoma cells to a second insult by surpassing the adaptive levels to ER stress. We first treated human melanoma cells (SbCl2, SK-MEL-28, Mel85, SK-MEL-29 and SK-MEL-147) with tunicamycin (Tuni), an ER stress inducer, before cisplatin (CDDP) treatment. CDDP is a low cost chemotherapeutic drug currently used in Brazil as a second line for melanoma treatment, especially in youngsters. All cell lines, except SK-MEL-29, demonstrated an >50% increase in the percentage of hypodiploid cells with Tuni>CDDP treatment when compared to CDDP only. The same results were obtained with temozolomide (TMZ), equivalent drug to the active form of dacarbazine, the first line of cytotoxic treatment of melanomas. UPR markers, GRP78 and nuclear translocation of GADD153 were induced by Tuni. Differences between SK-MEL-29 and SK-MEL-147 as cell surface GRP78 and ?1-6 oligossacharides can be related with the differential ER stress sensitization observed in these cells. One of the cellular mechanisms that are regulated by ER stress is autophagy. Accordingly, we observed an increase in the acidic vesicular organelles and accumulation of LC3II in response to Tuni>CDDP treatment. Autophagy inhibition with chloroquine increased Tuni>CDDP induced-cell death, suggesting that autophagy plays a protective role in this response. Oxidative stress can be involved in this scenario since we demonstrated an accumulation of reactive oxygen species in response to Tuni>CDDP. Tunicamycin was cytotoxic in vivo and we investigated alternatives to this antibiotic as swainsonine, atorvastatin, metformin and [Cu2(apyhist)2(dpam)](ClO4)4 but we did not observed ER stress induction. These results indicate that tumor cells could be preconditioned to cell death if exposed to a first ER stressor, such as Tuni, which would compromise an effective adaptive response to a cell death inducer, as CDDP and TMZ. This combined approach may be a promising strategy for melanoma therapy but further studies are necessary to find noncytotoxic alternatives to tunicamycin

INTRODUÇÃO: Quimiorradioterapia (QRT) concomitante adjuvante aumenta a sobrevida livre de doença (SLD) em pacientes portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECCP) de alto risco operados com intenção curativa, porém está associada a toxicidade não desprezível e seu impacto na sobrevida global (SG) é incerto. ERCC1 (Excision Repair Cross Complementing Group 1) é uma proteína com função crítica no reparo de DNA por excisão de nucleotídeos (NER) e está envolvido na resistência à quimio- e radioterapia. Neste trabalho tivemos como objetivos determinar a expressão da proteína ERCC1, a expressão do RNA mensageiro (mRNA) de ERCC1 e a ocorrência do polimorfismo de nucleotídeo único T19007C de ERCC1 em pacientes portadores de CECCP de alto risco, operados e tratados com QRT adjuvante, bem como o valor prognóstico destes marcadores. MÉTODOS: Trata-se de um estudo retrospectivo em pacientes portadores de CEC de cavidade oral, orofaringe, hipofaringe ou laringe, operados com intenção curativa e portadores de doença de risco alto ou intermediário. Pacientes elegíveis haviam sido tratados com QRT adjuvante: 60-70 Gy e cisplatina concomitante (100 mg/m2, dias 1, 22 e 43), não apresentavam metástases a distância e nem sinais de recidiva após cirurgia. A expressão da proteína ERCC1 foi avaliada por imunohistoquímica, através de um escore H semiquantitativo, obtido pelo produto da intensidade da coloração nuclear (0-3) pelo escore proporcional atribuído à porcentagem estimada de núcleos corados (0;0,1;0,5;1). O método da transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real quantitativo foi utilizado para determinação da expressão do mRNA de ERCC1 em tecido de tumor primário, normalizada em relação à expressão da fração 18S do RNA ribossomal. Genotipagem de ERCC1 (códon 118) foi realizada por PCR - polimorfismo do tamanho do fragmento de restrição a partir de DNA genômico extraído de linfonodos normais destes pacientes, após digestão com BsrDI. RESULTADOS: 69 pacientes com idade mediana de 56a, sendo 81% homens, foram estudados. Em relação à neoplasia, os sítios primários observados foram: cavidade oral (41%), laringe (32%), hipofaringe (16%) e orofaringe (12%), com estadio III 14% e estadio IV 86%, sendo pT3-pT4 78% e pN2-pN3 58%. Quarenta e três pacientes apresentaram-se com pelo menos dois linfonodos positivos, 27 com extravazamento extracapsular da metástase linfonodal e 18 com margens positivas. Achados de alto risco foram detectados em 40 pacientes (58%). No seguimento mediano de 47 meses, observou-se 11 recidivas loco-regionais, sete recidivas a distância, 10 casos com segundo tumor primário (sendo quatro com primário em pulmão e quatro em esôfago) e 30 óbitos (22 pela doença). A taxa de SG em 5 anos foi 40% e a taxa de SLD em 5 anos foi 31%. Escore H superior a 1,5 foi encontrado em 32 pacientes (54%), os quais apresentaram melhor taxa de sobrevida global em 5 anos (50% versus 18%, HR 0,43, 95%CI 0,20-0,90, p=0,026). Quinze pacientes (33%), dos 45 analisados, apresentaram elevada expressão do mRNA de ERCC1 (> 3,1) e estes pacientes tiveram melhor taxa de sobrevida global em 5 anos em comparação com aqueles com baixa expressão (86% versus 31%, HR 0,26, 95%CI 0,14-1,01, p=0,052). A distribuição dos genótipos de ERCC1 no códon 118 em 49 pacientes foi 39% C/T, 37% C/C, e 24% T/T. Não foi encontrada associação significativa entre idade, sexo, estadiamento e achados anatomopatológicos de risco, e os polimorfismos genéticos no códon 118 de ERCC1 ou a expressão do mRNA de ERCC1. Não houve diferença entre os genótipos C/C, C/T e T/T seja em termos taxa de sobrevida global em 5 anos (45%, 46%, 46%; p=0,808), seja em termos de taxa de sobrevida livre de doença em 5 anos (31%, 34%, 20%, p=0,770, respectivamente). O escore H (> 1,5 versus 1,5; HR ajustado 0,20, 95%CI 0,07-0,57, p=0,003) e a expressão normalizada do mRNA de ERCC1 (> 3,1 versus 3,1; HR ajustado 0,12, 95%CI 0,03-0,59, p=0,009), permaneceram significantes do ponto de vista estatístico, como fatores prognósticos na análise multivariada. CONCLUSÕES: Alta expressão imunohistoquímica da proteína ERCC1 e alta expressão do mRNA de ERCC1 conferem melhor prognóstico em pacientes portadores de CECCP operados de alto risco tratados com QRT adjuvante baseada em cisplatina. O polimorfismo genético T19007C de ERCC1 não apresentou valor prognóstico nestes pacientes. / BACKGROUND: Adjuvant concurrent chemoradiation (CRT) improves diseasefree survival (DFS) in patients diagnosed with head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) presenting with high-risk features treated with surgery with curative intent, but treatment-related toxicity is not negligible and its impact on overall survival (OS) is uncertain. ERCC1 (Excision Repair Cross Complementing Group 1) is a protein with a critical role in the nucleotide excision repair (NER) pathway, associated with resistance to chemo- and radiation therapy. We aimed here to study ERCC1 protein expression, ERCC1 messenger RNA (mRNA) expression and the single nucleotide polymorphism T19007C of ERCC1 as prognostic markers in HNSCC patients presenting with high-risk features treated with surgery and adjuvant CRT. METHODS: It is a retrospective study in patients with oral cavity, oropharynx, hypopharynx or larynx SCC submitted to radical surgery with curative intent and presenting with pathologic features of high- or intermediate-risk. Eligible patients were treated with adjuvant CRT: 60-70 Gy and concurrent cisplatin (100 mg/m2, days 1, 22 and 43), with no distant metastasis and no relapsed disease after surgery. ERCC1 protein expression was evaluated by immunohistochemistry, using a semi-quantitative H-score, calculated by multiplying the nuclear staining intensity (0-3) by the proportion score attributed to the percentage of positive tumor nuclei (0;0,1;0,5;1). Quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (PCR) assay was performed to determine ERCC1 mRNA expression in primary tumors tissue specimens. The ERCC1 mRNA expression was normalized using 18S fraction of ribosomal RNA expression as internal reference. ERCC1 (codon 118) genotypes were detected using PCR restriction fragment length polymorphism method carried out in genomic DNA extracted from normal lymph nodes. The PCR products were digested with BsrDI. RESULTS: 69 patients (median age 56 y, 81% male) were studied. Regarding tumor characteristics, primary sites were: oral cavity 41%, larynx 32%, hypopharynx 16%, oropharynx 12%, stage III 14%, stage IV 86%, pT3- pT4 78% and pN2-pN3 58%. Forty-three patients presented with two or more positive lymph nodes, 27 with extracapsular spread of nodal disease and 18 with positive margins. High-risk pathologic features were detected in 40 patients (58%). During the median follow-up of 47 months, we observed 11 locoregional relapses, seven distant relapses, 10 patients were diagnosed with secondary primary tumors (four in lungs and four in esophagus) and 30 deaths (22 disease-related). The 5-year overall survival rate was 40% and the 5-year disease-free survival rate was 31%. High H-score (> 1.5) was seen in 32 patients (54%), who presented better 5-year overall survival rate in comparison to those with lower H-scores (50% versus 18%, HR 0.43, 95%CI 0.20-0.90, p=0.026). Fifteen patients (out of 45, 33%) whose tumors presented normalized ERCC1 expression > 3.1 were classified as having high ERCC1 mRNA expression, and these patients presented better 5-year overall survival rate in comparison to those with lower ERCC1 mRNA expression (86% versus 30%, HR 0.26, 95%CI 0.14-1.01, p=0.052). Genotype distribution at ERCC1 codon 118 in 49 patients was 39% C/T, 37% C/C, and 24% T/T. No significant association was found between age, gender, stage, grading and pathological risk features and ERCC1 codon 118 genotypes or ERCC1 mRNA expression. No difference was detected among C/C, C/T and T/T genotypes, either in terms of 5-year overall survival rates (45%, 46%, 46%; p=0.808), or 5-year diseasefree survival rate (31%, 34%, 20%, p=0.770, respectively). H-score (> 1.5 versus 1.5; adjusted HR 0.20, 95%CI 0.07-0.57, p=0.003) and ERCC1 mRNA normalized expression (> 3.1 versus 3.1; adjusted HR 0.12, 95%CI 0.03-0.59, p=0.009), remained significant as favorable prognostic factors after adjusting for prognostic factors in a multivariate analysis. CONCLUSIONS: High immunohistochemical expression of ERCC1 protein and high ERCC1 mRNA expression, but not the T19007 single nucleotide polymorphism, were associated with better prognosis in HNSCC patients submitted to surgery and adjuvant cisplatin-based chemoradiation.

INTRODUÇÃO: Quimiorradioterapia (QRT) concomitante adjuvante aumenta a sobrevida livre de doença (SLD) em pacientes portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECCP) de alto risco operados com intenção curativa, porém está associada a toxicidade não desprezível e seu impacto na sobrevida global (SG) é incerto. ERCC1 (Excision Repair Cross Complementing Group 1) é uma proteína com função crítica no reparo de DNA por excisão de nucleotídeos (NER) e está envolvido na resistência à quimio- e radioterapia. Neste trabalho tivemos como objetivos determinar a expressão da proteína ERCC1, a expressão do RNA mensageiro (mRNA) de ERCC1 e a ocorrência do polimorfismo de nucleotídeo único T19007C de ERCC1 em pacientes portadores de CECCP de alto risco, operados e tratados com QRT adjuvante, bem como o valor prognóstico destes marcadores. MÉTODOS: Trata-se de um estudo retrospectivo em pacientes portadores de CEC de cavidade oral, orofaringe, hipofaringe ou laringe, operados com intenção curativa e portadores de doença de risco alto ou intermediário. Pacientes elegíveis haviam sido tratados com QRT adjuvante: 60-70 Gy e cisplatina concomitante (100 mg/m2, dias 1, 22 e 43), não apresentavam metástases a distância e nem sinais de recidiva após cirurgia. A expressão da proteína ERCC1 foi avaliada por imunohistoquímica, através de um escore H semiquantitativo, obtido pelo produto da intensidade da coloração nuclear (0-3) pelo escore proporcional atribuído à porcentagem estimada de núcleos corados (0;0,1;0,5;1). O método da transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real quantitativo foi utilizado para determinação da expressão do mRNA de ERCC1 em tecido de tumor primário, normalizada em relação à expressão da fração 18S do RNA ribossomal. Genotipagem de ERCC1 (códon 118) foi realizada por PCR - polimorfismo do tamanho do fragmento de restrição a partir de DNA genômico extraído de linfonodos normais destes pacientes, após digestão com BsrDI. RESULTADOS: 69 pacientes com idade mediana de 56a, sendo 81% homens, foram estudados. Em relação à neoplasia, os sítios primários observados foram: cavidade oral (41%), laringe (32%), hipofaringe (16%) e orofaringe (12%), com estadio III 14% e estadio IV 86%, sendo pT3-pT4 78% e pN2-pN3 58%. Quarenta e três pacientes apresentaram-se com pelo menos dois linfonodos positivos, 27 com extravazamento extracapsular da metástase linfonodal e 18 com margens positivas. Achados de alto risco foram detectados em 40 pacientes (58%). No seguimento mediano de 47 meses, observou-se 11 recidivas loco-regionais, sete recidivas a distância, 10 casos com segundo tumor primário (sendo quatro com primário em pulmão e quatro em esôfago) e 30 óbitos (22 pela doença). A taxa de SG em 5 anos foi 40% e a taxa de SLD em 5 anos foi 31%. Escore H superior a 1,5 foi encontrado em 32 pacientes (54%), os quais apresentaram melhor taxa de sobrevida global em 5 anos (50% versus 18%, HR 0,43, 95%CI 0,20-0,90, p=0,026). Quinze pacientes (33%), dos 45 analisados, apresentaram elevada expressão do mRNA de ERCC1 (> 3,1) e estes pacientes tiveram melhor taxa de sobrevida global em 5 anos em comparação com aqueles com baixa expressão (86% versus 31%, HR 0,26, 95%CI 0,14-1,01, p=0,052). A distribuição dos genótipos de ERCC1 no códon 118 em 49 pacientes foi 39% C/T, 37% C/C, e 24% T/T. Não foi encontrada associação significativa entre idade, sexo, estadiamento e achados anatomopatológicos de risco, e os polimorfismos genéticos no códon 118 de ERCC1 ou a expressão do mRNA de ERCC1. Não houve diferença entre os genótipos C/C, C/T e T/T seja em termos taxa de sobrevida global em 5 anos (45%, 46%, 46%; p=0,808), seja em termos de taxa de sobrevida livre de doença em 5 anos (31%, 34%, 20%, p=0,770, respectivamente). O escore H (> 1,5 versus 1,5; HR ajustado 0,20, 95%CI 0,07-0,57, p=0,003) e a expressão normalizada do mRNA de ERCC1 (> 3,1 versus 3,1; HR ajustado 0,12, 95%CI 0,03-0,59, p=0,009), permaneceram significantes do ponto de vista estatístico, como fatores prognósticos na análise multivariada. CONCLUSÕES: Alta expressão imunohistoquímica da proteína ERCC1 e alta expressão do mRNA de ERCC1 conferem melhor prognóstico em pacientes portadores de CECCP operados de alto risco tratados com QRT adjuvante baseada em cisplatina. O polimorfismo genético T19007C de ERCC1 não apresentou valor prognóstico nestes pacientes. / BACKGROUND: Adjuvant concurrent chemoradiation (CRT) improves diseasefree survival (DFS) in patients diagnosed with head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) presenting with high-risk features treated with surgery with curative intent, but treatment-related toxicity is not negligible and its impact on overall survival (OS) is uncertain. ERCC1 (Excision Repair Cross Complementing Group 1) is a protein with a critical role in the nucleotide excision repair (NER) pathway, associated with resistance to chemo- and radiation therapy. We aimed here to study ERCC1 protein expression, ERCC1 messenger RNA (mRNA) expression and the single nucleotide polymorphism T19007C of ERCC1 as prognostic markers in HNSCC patients presenting with high-risk features treated with surgery and adjuvant CRT. METHODS: It is a retrospective study in patients with oral cavity, oropharynx, hypopharynx or larynx SCC submitted to radical surgery with curative intent and presenting with pathologic features of high- or intermediate-risk. Eligible patients were treated with adjuvant CRT: 60-70 Gy and concurrent cisplatin (100 mg/m2, days 1, 22 and 43), with no distant metastasis and no relapsed disease after surgery. ERCC1 protein expression was evaluated by immunohistochemistry, using a semi-quantitative H-score, calculated by multiplying the nuclear staining intensity (0-3) by the proportion score attributed to the percentage of positive tumor nuclei (0;0,1;0,5;1). Quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (PCR) assay was performed to determine ERCC1 mRNA expression in primary tumors tissue specimens. The ERCC1 mRNA expression was normalized using 18S fraction of ribosomal RNA expression as internal reference. ERCC1 (codon 118) genotypes were detected using PCR restriction fragment length polymorphism method carried out in genomic DNA extracted from normal lymph nodes. The PCR products were digested with BsrDI. RESULTS: 69 patients (median age 56 y, 81% male) were studied. Regarding tumor characteristics, primary sites were: oral cavity 41%, larynx 32%, hypopharynx 16%, oropharynx 12%, stage III 14%, stage IV 86%, pT3- pT4 78% and pN2-pN3 58%. Forty-three patients presented with two or more positive lymph nodes, 27 with extracapsular spread of nodal disease and 18 with positive margins. High-risk pathologic features were detected in 40 patients (58%). During the median follow-up of 47 months, we observed 11 locoregional relapses, seven distant relapses, 10 patients were diagnosed with secondary primary tumors (four in lungs and four in esophagus) and 30 deaths (22 disease-related). The 5-year overall survival rate was 40% and the 5-year disease-free survival rate was 31%. High H-score (> 1.5) was seen in 32 patients (54%), who presented better 5-year overall survival rate in comparison to those with lower H-scores (50% versus 18%, HR 0.43, 95%CI 0.20-0.90, p=0.026). Fifteen patients (out of 45, 33%) whose tumors presented normalized ERCC1 expression > 3.1 were classified as having high ERCC1 mRNA expression, and these patients presented better 5-year overall survival rate in comparison to those with lower ERCC1 mRNA expression (86% versus 30%, HR 0.26, 95%CI 0.14-1.01, p=0.052). Genotype distribution at ERCC1 codon 118 in 49 patients was 39% C/T, 37% C/C, and 24% T/T. No significant association was found between age, gender, stage, grading and pathological risk features and ERCC1 codon 118 genotypes or ERCC1 mRNA expression. No difference was detected among C/C, C/T and T/T genotypes, either in terms of 5-year overall survival rates (45%, 46%, 46%; p=0.808), or 5-year diseasefree survival rate (31%, 34%, 20%, p=0.770, respectively). H-score (> 1.5 versus 1.5; adjusted HR 0.20, 95%CI 0.07-0.57, p=0.003) and ERCC1 mRNA normalized expression (> 3.1 versus 3.1; adjusted HR 0.12, 95%CI 0.03-0.59, p=0.009), remained significant as favorable prognostic factors after adjusting for prognostic factors in a multivariate analysis. CONCLUSIONS: High immunohistochemical expression of ERCC1 protein and high ERCC1 mRNA expression, but not the T19007 single nucleotide polymorphism, were associated with better prognosis in HNSCC patients submitted to surgery and adjuvant cisplatin-based chemoradiation.