Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015.pdf: 1441432 bytes, checksum: a83fe75ef6bcdf6aded59803a162d33a (MD5) Previous issue date: 2008-08-20 / As cisteíno proteases são enzimas proteolíticas que possuem os resíduos de cisteína e histidina em seu sítio catalítico. Essa classe de enzimas está presente na grande maioria dos organismos, desde bactérias, fungos, protozoários, plantas e animais. As propriedades físico-químicas destas proteases têm sido amplamente caracterizadas, entretanto suas funções biológicas ainda não foram completamente elucidadas. Trabalhos com cisteíno proteases de plantas têm sugerido diversas funções biológicas para estas enzimas. O presente estudo tem como objetivo a produção recombinante e a caracterização de uma cisteíno protease (tipo catepsina B) de cana-de-açúcar. A produção recombinante da enzima foi realizada em E. coli nas formas solúvel e insolúvel, sendo que esta última foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. A caracterização da enzima foi realizada pela análise da hidrólise de substratos fluorescentes. Testes de inibição contra a cisteíno protease foram feitos utilizando-se inibidores recombinantes endógenos produzidos em nosso laboratório (CaneCPI-1 e CaneCPI-4), como também o inibidor específico para cisteíno proteases (E64) e o inibidor específico para catepsinas B (CA074). A inibição foi realizada com sucesso com os inibidores endógenos, como também com os inibidores sintéticos específicos. A atividade inibitória do CA074 demonstrada contra a cisteíno protease da cana-de-açúcar sugere que esta enzima seja uma cisteíno protease tipo catepsina B.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2240.pdf: 3981938 bytes, checksum: ce9575f4d9edde7a78432d592db4dd5a (MD5) Previous issue date: 2009-02-10 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work is composed of 4 chapters. In Chapter 1 is a description of the problems addressed here, starting with the characteristics of the protein, its biological and social importance, and the interactions responsible for both its structure and the formation of ligand-protein complexes, there is also a brief description of Te(IV) compounds followed by the presentation of the grounds of the experimental methods used, namely crystallography and docking. In Chapter 2 the objectives of this work are presented. Chapter 3 includes the experimental procedures that were used to determine the crystal and molecular structures, the modeling of the compounds that did not have crystallographic structure, as well as the molecular docking. In Chapter 4 are described and discussed the results. The crystal structures of the telluroxetanes (3E)-2-chloro-3-(chloromethylidene)-2-(4- methoxyphenyl)-1-oxa-2 λ4- telluraspiro[3.6]decane (1) and of (3E)-2-chloro-3-(chloromethylidene)-2-(4- methoxyphenyl)-1-oxa-2 λ4- telluraspiro[3.5]nonane (2) show that the coordination polyhedron around the atom of Te is a pseudo-pentagonal bipyramid. The supramolecular synthon is different in the two cases, in spite that the Te atom makes a secondary interaction with a halide, in both cases. The docking results for all tellurium compounds have shown that these ligands form complexes with Cathepsin B through the formation of a covalent bond between the Te and S of Cys29 of the enzyme. The differences in the values of scores from the docking and the number of interactions are due, mainly, the size of the carbon chain. Finally the conclusions and outlook can be found. / Este trabalho é composto de 4 capítulos. No capítulo 1 encontra-se uma descrição dos problemas abordados aqui, começando com as características da proteína, a sua importância biológica e social, as interações responsáveis tanto pela sua estrutura como pela formação de complexos proteína-ligante; também há uma breve descrição dos compostos de telúrio seguido da apresentação dos fundamentos dos métodos experimentais utilizados, ou seja, cristalografia e docking. No capítulo 2, os objetivos deste trabalho são apresentados. O Capítulo 3 inclui os procedimentos experimentais que foram utilizados para determinar as estruturas cristalinas e moleculares, a modelagem dos compostos que não têm estrutura cristalográficas, bem como do docking molecular. No capítulo 4 são descritos e discutidos os resultados. As estruturas cristalinas das telurooxetanas (3E)-2-cloro-3-(cloromethilidene)-2-(4-metoxifenil)-1-oxa-2λ4- telluraspiro [3,6]decano (1) e de (3E)-2-cloro-3-(clorometilidene)-2 λ4- 4- telluraspiro[3,5]nonano (2), mostram que o poliedro de coordenação ao redor do átomo de Te é uma pseudo-bipirâmide pentagonal. O synthon supramolecular é diferente nos dois casos, apesar de o átomo Te, em ambos os casos, realizar uma interação secundária com um haleto. Os resultados de docking para todos os compostos de telúrio estudados monstraram que estes formam complexos com a catepsina B através da formação de uma ligação covalente entre o Te e S da Cys29 da enzima. As diferenças nos valores dos escores de docking e no número de interações são devidos, principalmente, o tamanho da cadeia de carbono. Finalmente as conclusões e as perspectivas podem ser encontrados.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseASCF.pdf: 1203685 bytes, checksum: 09eb7536fd867598d8ede5a251ba023e (MD5) Previous issue date: 2004-11-26 / Universidade Federal de Minas Gerais / Plants seem to have developed, over a long period of time, defence mechanisms against fungi and insects. One of them is the use of protease inhibitor proteins. Cystatins are proteins that inhibit specifically cysteine proteases. They occur naturally in several vegetable species and it is believed that they work in the defence mechanism from plants against some pathogens. The Canecystatin gene which codifies a protein containing 106 amino acids residues, was identified in sugarcane and bears significant similarity with oryzacystatin, a cystatin from rice. The recombinant protein was expressed in E.coli in the soluble form, which promoted its direct purification by affinity chromatography in nickel column. The purified protein was analysed by Circular Dichroism (CD) and displayed estimated secundary structure similar to oryzacystatin I. Besides that, the protein was submitted to crystallization assay, and it was possible to form protein crystal, which will enable future studies by X-Ray Crystallography. Canecystatin, was used successfully in growth inhibition tests against the filamentous fungus Trichoderma reesei. The protein minimum inhibitory dose were about 50 µg/ml. The recombinant canecystatin was also able to inhibit plant pathogenic fungi including Colletotrichum sp P25, Colletotrichum sp P28, Colletotrichum sp P10, Fusarium moniliforme and Aspergillus niger. The most efficient inhibition was obtained against Colletotrichum sp P10 (32.25µg/ml). In order to obtain cystatin with improved activity direct evolution tests were carried out. A shuffling library was constructed using two diferent cystatins, i.e Canecystatin and Oryzacystatin I. One clone formed by this proteins was selected. This clone was expressed, purified and subjected to activity tests, and the results shown that the activity of mutant protein increased, in particular regarding its inhibit activity of Cathepsin B. Our findings open perspectives of using this protein as a natural fungicide and of developing more resistant varieties of sugarcane . / As plantas parecem ter desenvolvido ao longo da evolução mecanismos naturais de defesa contra fungos e insetos. Entre eles está o uso de inibidores de protease. Cistatinas são proteínas que inibem especificamente cisteíno proteases. Elas ocorrem naturalmente em várias espécies de vegetais e acredita-se que elas estejam envolvidas com mecanismos de defesa da planta contra o ataque de patógenos. O gene da Canacistatina que codifica uma proteína contendo106 resíduos de aminoácidos, foi identificado em cana-de-açúcar e possui significante similaridade de sequência com a Orizacistatina I, uma cistatina de arroz. A proteína recombinante foi expressa em E.coli na forma solúvel, o que possibilitou sua purificação direta por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. A proteína purificada foi analisada por Dicroísmo Circular que apresentou uma estrutura secundária estimada similar a proteína Orizacistatina I. Além disso, a proteína foi submetida a ensaios de cristalização e foi possível a formação de cristais protéicos, os quais serão utilizados para futuros estudos de cristalografia de Raio-X. A canacistatina foi utilizada com sucesso em testes de inibição de crescimento do fungo Trichoderma reesei. A dose mínima inibitória foi em torno de 50 µg/ml. A canacistatina recombinante também foi capaz de inibir o crescimento de fungos patogênicos incluindo Colletotrichum sp P25, Colletotrichum sp P28, Colletotrichum sp P10, Fusarium moniliforme e Aspergillus niger. A inibição mais eficiente foi obtida contra Colletotrichum sp P10 (32.25µg/ml). Para obtenção de uma cistatina com atividade melhorada, ensaios de evolução direta foram realizados. Uma biblioteca de shuffling foi construída utilizando duas cistatinas diferentes, a Canacistatina e a Orizacistatina I. Um clone formado por estas duas proteínas foi selecionado. Este clone foi expresso, purificado e submetido a testes de atividade e os resultados demostraram que a atividade do mutante aumentou e este inibe a atividade da catepsina B. Nossos resultados abrem perspectivas para o uso desta proteína como um fingicida natural e para o desenvolvimento de variedades mais resistentes de cana-de-açúcar.