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Introducción: La piel es el órgano más extenso del cuerpo humano. Las heridas cutáneas son producto de la ruptura de la integridad de la piel. Las células mesenquimales (MSCs) están emergiendo como fuertes candidatas para ser usadas como terapia celular en el tratamiento de heridas crónicas, dado su enorme potencial para mejorar la reparación y regeneración de los tejidos posterior a una lesión. Constructos biosintéticos fabricado con la fibroína de la seda celularizados con MSCs de diferentes fuentes han demostrado ser eficaces en la curación de heridas experimentales de la piel. Objetivos: investigar el comportamiento de las células mesenquimales de la gelatina de Wharton del cordón umbilical humano (hWj-MSCs) tanto in vitro como in vivo tras ser sembradas en un constructo electrohilado compuesto de fibroína de la seda y posteriormente implantado en ratones inmunocompetentes. Determinar si las hWj-MSCs aplicadas mediante constructos de fibroína de seda en heridas creadas en el dorso de ratones SKH1 contribuyen a mejorar la cicatrización de la lesión. Metodología: inicialmente hemos puesto a punto el protocolo para el aislamiento y caracterización de las hWj-MSCs. Posteriormente, estas MSCs en combinación con un constructo fabricado a partir de la fibroína de la seda fueron utilizados para probar sus propiedades terapéuticas en un modelo murino experimental de heridas. Resultados: Las hWj-MSCs mostraron una morfología fibroblástica, y presentaron en su superficie la expresión de marcadores mesenquimales que fueron positivos para CD90, CD105, CD73, y sin presencia detectable de marcadores de células hematopoyéticas. Las hWj-MSCs mostraron una capacidad limitada para diferenciarse hacia adipocitos, condrocitos, y osteoblastos. Las hWj-MSCs inhibieron de forma significativa la proliferación de linfocitos T tras ser estimulados con esferas anti-CD3/CD28, así como con células dendríticas maduras alogénicas. Las hWj-MSCs disminuyeron la producción in vitro de la citoquina pro-inflamatoria IFN- por los linfocitos T activados. Este efecto inmunosupresor también estuvo mediado por la producción de los factores anti-inflamatorios TGF-, IDO, y PGE2. Los experimentos con cultivos mixtos de linfocitos en presencia de diferentes inhibidores específicos de la biosíntesis o la señalización de estos factores anti-inflamatorios tales como SB-431542, indometacina (IDM), o 1-metil-triptófano (1-MT) respectivamente, recuperaron casi en su totalidad el nivel de proliferación de las células T estimuladas con células dendríticas maduras. El tratamiento de las heridas de la piel en ratones SKH1 demostró que la combinación de hWj-MSCs y el constructo de fibroína de la seda mejoró significativamente la capacidad de cicatrización de heridas. Conclusiones: Las hWj-MSCs son poco inmunogénicas, no expresan moléculas coestimuladoras, y expresan citoquinas que pueden modular la función inmune. La combinación de hWj-MSCs con los constructos de fibroína de seda contribuyó a la generación de un tejido de granulación de alta calidad, y escasa formación de tejido cicatrizal. La gelatina de Wharton del cordón umbilical humano puede ser una fuente adecuada para la obtención de MSCs para ser utilizadas en la cicatrización de heridas debido a sus diversas ventajas y junto con los beneficios sinérgicos de un constructo pudieran conformar una combinación ideal como apósitos para heridas crónicas de lenta y difícil curación. / Introduction: the skin is the largest organ in the human body. Cutaneous wounds are the result of disrupted skin integrity. Mesenchymal stem cells (MSCs) are emerging as a promising candidate for cell-based therapy for the treatment of chronic wounds because of their enormous potential for enhancing tissue repair and regeneration following injury. Silk fibroin cellularized with MSCs from different sources has been shown to be effective in repairing experimental wounds of the skin. Objectives: to investigate the behavior of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells (Wj-MSCs) both in vitro and in vivo when cultivated on electrospun silk fibroin scaffolds and implanted in immunocompetent mice. To determine whether Wj-MSCs delivered in silk fibroin scaffolds into skin defects in SKH1 mice would contribute to dermal wound healing. Methodology: we have first standardized the protocol for the isolation and characterization of Wj-MSCs. Further, these MSCs along with the combination of silk fibroin scaffolds were used to test their wound healing properties by creating skin wounds in an experimental murine model. Results: Wj-MSCs exhibited a fibroblastic morphology and displayed MSC surface markers positive for CD90, CD105, CD73 with no detectable presence of hematopoietic cells markers. Wj-MSCs were limited on their ability to differentiate into adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts. Wj-MSCs suppressed T cell proliferation after stimulation with anti-CD3/CD28 coated beads and allogeneic mDCs. Wj-MSCs downmodulated the in vitro production of the pro-inflammatory cytokine IFN- by activated T lymphocytes. This immunosuppressive effect was also mediated by the production of the anti-inflammatory cytokines TGF-, IDO, and PGE2. MLCs experiments in the presence of different specific inhibitors of the biosynthesis or signaling of these anti-inflammatory factors such as SB-431542, indomethacin (IDM) or 1-methyl-tryptophan (1-MT), respectively, recovered almost entirely the proliferation rate of mDCs-stimulated T cells. Treatment of skin injury of SKH1 mice model demonstrated that combination of Wj-MSCs and silk fibroin scaffold exhibited significantly better wound-healing capabilities. Conclusions: Wj-MSCs have reduced immunogenicity, did not express costimulatory molecules, and express cytokines that may modulate immune function. Wharton's jelly MSCs combined with silk fibroin scaffolds in the wound bed contributed to the generation of a high-quality, well-vascularized granulation tissue, enhanced re-epithelialization of the wound, and attenuated the formation of fibrotic scar tissue. Wharton's jelly from the human umbilical cord may be an adequate source for obtaining MSCs for wound healing given its several advantages and together with the synergistic benefits of a nanoscaffold they make ideal combinations as wound dressings for slow healing and hard-to-heal chronic wounds.

Antecedentes: La alimentación del recién nacido (RN) sano, prematuro y enfermo con leche materna (LM), mejora su cociente de desarrollo, trasmite factores inmunoprotectores y previene complicaciones como enterocolitis necrotizante y sepsis. Los RN que no disponen leche de su propia madre, la leche materna donada (LMD) es la mejor opción. Por esta razón, la apertura de Bancos de Leche Humana (BLH) continúa en expansión. Hasta el momento en las guías de actuación de los diferentes BLH no existen protocolos que incluyan el cribado de drogas en LMD. La mayoría de las sustancias que inhala o ingiere la madre pasan parcialmente a la leche. Es importante que la LMD sea segura y se encuentre en las mejores condiciones para ser proporcionada a los RN. Los objetivos del presente trabajo son: (1) evaluar la seguridad toxicológica de la LMD; (2) analizar la concentración de tóxicos encontrados en la LMD y su posible repercusión en el neonato; y (3) justificar la realización de un cribado de drogas en la selección de donantes y durante el procesamiento de la leche. Metodología: En una primera fase (febrero a julio de 2009), se incluyeron 63 mujeres donantes del BLH del Hospital 12 de Octubre en Madrid. Se analizaron 400 muestras de leche pasteurizada además de 34 muestras antes y después del proceso de pasteurización. En un segundo período (agosto de 2010 a febrero de 2012), participaron 36 mujeres para el cribado de sustancias de abuso en LM y pelo. En el mismo periodo se analizaron 54 muestras de orina recogida durante la selección de donantes. Se compararon los resultados obtenidos a partir de 3 matrices biológicas con los datos recogidos en el cuestionario de hábitos de vida. Para el estudio bioquímico de leche y orina se utilizó la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) y cromatografía de gases para cabello. Resultados: El 45,3% de las muestras contenían cafeína (CAF) (496 ng/ml). En el análisis de la leche y el pelo de las 36 mujeres se encontró: CAF (272,76 ng/ml) en el 50% de las muestras de leche. En pelo CAF (1.769 ng/mg) en 77,7% de las muestras; nicotina (NIC) (1.805 ng/mg) y su metabolito cotinina (COT) (0,148 ng/mg) en el 33,3%. En el análisis de orina se determinó: CAF (343,70 ng/ml) en el 57,4% de las muestras; COT (0,52 ng/ml) y 3-OH-COT (2,01 ng/ml) en el 35,12%. No se identificaron sustancias de abuso ilegales. El proceso de pasteurización no modificó la concentración de CAF. Discusión: Hasta el momento no existen guías en BLH donde se incluya algún método objetivo para el cribado de sustancias de abuso. Se toma como válida la información declarada mediante un cuestionario de hábitos de vida. Las donantes del BLH están sensibilizadas para evitar el consumo de sustancias de abuso, por lo que los resultados no pueden extrapolarse a la población general. Conclusiones: Los cuestionarios empleados durante la selección de donantes y el proceso de pasteurización no constituyen una medida de seguridad toxicológica absoluta. No obstante, los niveles de CAF encontrados en la LMD no son lo suficientemente altos para ocasionar sintomatología en el RN. Actualmente se cuenta con la tecnología necesaria para el cribado de tóxicos en BLH. Incluir el estudio de orina y pelo durante la selección de donantes y un cribado en la leche acumulada de cada madre previo al proceso de pasteurización y alicuotado puede garantizar que la LM dispensada sea de calidad y libre de tóxicos. / Introduction Breast milk feeding improve developmental quotient, transfers immunoprotective factors and prevent complications such as necrotizing enterocolitis and sepsis. New born (NB) whose their own mother’s milk is not available, donated human milk (DHM) is the best choice. For this reason, the opening human milk banks (HMB) continue to expand. Actually in these HMB there are no protocols for drug screening in DHM. Most of substances consumed or inhaled by mothers partially pass into the breast milk. It is important having DHM safe and in optimal conditions to be provided to NB. The objectives of this work are: (1) Evaluate toxicological safety of DHM; (2) analyze drugs concentration found in DHM and its possible clinical effect in neonates; and (3) justify a drug screening during the donor selection and milk processing. Methodology: In a first stage (February to July 2009), 63 lactating women donors from HMB Hospital 12 de Octubre in Madrid were included in the study. 400 pasteurized milk samples and 34 samples before and after the pasteurization were analyzed. In a second period (August 2010 to February 2012), 36 women who participated in drugs of abuse screening in hair and milk were included. In the same period, 54 urine samples were collected during donor selection process and were analyzed. We compared results obtained from substance abuse determination in 3 different biological matrices with data collected in lifestyle questionnaires. Milk from 3 women cannabis, cocaine and methadone respectively consumers were analyzed as control. Biochemical analysis of milk and urine samples was performed by liquid chromatography tandem mass (LC-MS/MS), a validated method for quantifying simultaneously 18 substances in a single sample. Hair determinations were performed by gas chromatography. Results: Caffeine (CAF) was found in 45,3% of donor milk samples, with a mean concentration of 496 ng/ml. Milk and hair analysis from 36 women indicated: CAF (272,76 ng/ml) in 50% of human milk; CAF (1.769 ng/mg) in 77% of hair samples and nicotine (NIC) (1.805 ng/ml) and its metabolite cotinine (COT)(0,148 ng/mg) were found in 33,33% of the total hair samples. Urinalysis revealed CAF (343,70 ng/ml) in 57,4% of samples; COT (0,52 ng/ml) and 3-OH-COT (2,01 ng/ml) in 35,12% of samples. No illegal drugs were identified in any of 3 biological matrices. Pasteurization had no effect on caffeine concentration measured in milk samples. Discussion: Actually there are no guidelines in HMB which a target DHM target method of screening substances of abuse is included. Information reported in lifestyle questionnaire is considered as valid. HMB donors are sensitized to prevent substance abuse consumption; by this reason results can not be extrapolated to the rest of the population. Conclusion: Lifestyle questionnaire used during donor selection and pasteurization process does not constitute a measure of toxicological safety. However CAF levels found in DHM are not high enough to produce /cause symptoms in the NB. Nowadays necessary technology exists for toxic screening in HMB. Including urine and hair analysis for donor selection and screening drugs in milk pool before pasteurization and aliquoted process may guarantee dispensing breast milk without drugs.

OBJETIVOS: El objetivo principal fue determinar la prevalencia de hiperparatiroidismo secundario (sHPT) y de déficit de vitamina D (DVD) en pacientes con insuficiencia cardíaca (IC) estable. Otros objetivos fueron: analizar la relación entre sHPT/DVD y los tratamientos de la IC, evaluar su relación con datos ecocardiográficos, clínicos y analíticos, la relación con otros biomarcadores y con la morbimortalidad, así como determinar los pacientes candidatos a realizar tratamiento del sHPT. MATERIAL Y MÉTODOS: Estudio prospectivo y observacional de una cohorte de pacientes con IC estable en el Hospital Vall d'Hebrón. Se incluyeron pacientes diagnosticados de IC en fase estable, sin diagnóstico previo de hiperparatiroidismo primario, con filtrado glomerular (eGFR) >30mL/min/1,73m² y que no estuvieran bajo tratamiento con suplementos de VD o quelantes del fósforo. Se evaluaron las características demográficas, clínicas, analíticas, ecocardiográficas y el tratamiento administrado. Se analizaron la mortalidad, ingresos y visitas a urgencias tras un año de seguimiento. Se ha realizado un análisis descriptivo de los resultados.Para comparar la media de una variable entre 2 o más grupos, se utilizaron respectivamente el test t de Student o el test ANOVA. Para las variables categóricas se utilizó el test chi-cuadrado o el exacto de Fisher. Con las variables significativas se realizó un modelo de regresión lineal múltiple. Se consideró significativo un valor de p<0,05. RESULTADOS: Entre febrero 2013 y marzo 2014 se incluyeron 260 pacientes. El 71% fueron varones con una edad media de 71±11 años. La etiología más frecuente de IC fue la isquémica (40%). Las comorbilidades más frecuentes fueron: dislipemia (78%), hipertensión (62,7%) y obesidad (41%). El 82% tomaba betabloqueantes, el 95% inhibidores del enzima conversor de la angiotensina o antagonistas del receptor de la angiotensina II y el 47% antagonistas de la aldosterona. El 61% tenía una función sistólica reducida. La prevalencia de sHPT fue del 69,2% y los niveles de VD fueron subóptimos en el 97,7%. Calcemia y fosfatemia fueron normales. El sHPT se relacionó con los niveles de NT-proBNP (p<0,005), sin encontrar relación entre sPTH con los valores de renina y aldosterona, aunque sí con el tratamiento a dosis bajas de antialdosterónicos. Las dosis elevadas de diuréticos y el eGFR se relacionaron con el sHPT (p<0,005). La supervivencia fue del 95%. La causa de la muerte fue cardiovascular en el 86%. El 89,2% de los pacientes no eran tributarios de tratamiento sustitutivo. DISCUSIÓN: La prevalencia de sHPT fue superior a la esperada. La activación de la PTH en respuesta a la hipocalcemia secundaria al déficit de calcitriol y al tratamiento farmacológico logró mantener la calcemia y la fosfatemia dentro de la normalidad. La hipovitaminosis D fue casi universal a pesar de vivir en un país soleado, debido probablemente a un insuficiente aporte vitamínico en la dieta y a la inmovilización en el contexto de la IC. Hemos hallado una relación entre la insuficiencia renal y marcadores pronósticos como el NT-proBNP en aquellos pacientes con PTH elevada, destacando la asociación con la elevada dosis de diuréticos y baja de antialdosterónicos. La elevada supervivencia no permite identificar la presencia de factores pronósticos a medio plazo en esta población. CONCLUSIONES: 1.- La prevalencia de sHPT y déficit de VD en pacientes con IC estable es superior a la descrita en otras poblaciones. 2.- Existe una relación entre sHPT con dosis altas de diuréticos y bajas de antialdosterónicos. 3.- No existe una relación entre sHPT ni hipovitaminosis con el pronóstico. 4. Sólo un 10% de los pacientes precisarían tratamiento sustitutivo. / AIMS: The aim of the study was to determine the prevalence of secondary hyperparathyroidism (sHPT) and vitamin D deficiency (VDD) in patients with stable chronic heart failure (HF). Secondary endpoints included the relationship between both sHPT and VDD with clinical, analytical and echocardiographic features, their association to other biomarkers, survival rate, and the identification of at-risk individuals who would benefit from sHPT treatment. METHODS: Prospective cohort study of consecutive patients diagnosed with stable heart failure between February 2013 and March 2014 from the Heart Failure Unit at Vall d’Hebron Hospital (Barcelona). Only patients with a glomerular filtration rate (eGFR) >30mL/min/1,73m² who were not under treatment with VD supplements, calcium or phosphate binders, and with no previous history of primary hyperparathyroidism, were included. Baseline data (demographic, clinical, echocardiographic and laboratory, as well as current treatment) were recorded in case report forms upon recruitment. After a 12-month period of follow-up, survival, number of hospital admissions and Emergency Department visit requirements were collected. Statistical analysis: For categorical variables the chi-square test or the Fischer test when appropriate, were used. The mean of variables for 2 or more groups were compared using the Student's t-test or the ANOVA test. A multiple linear regression model was built. The level of significance was established at p<0.05 RESULTS: 260 patients were included. 71% were men and their mean age was 71 (SD 11) years-old. Coronary artery disease was the most common cause of heart failure (40%). Reduced systolic function was detected in 61%. Associated comorbidities included dyslipidemia (78%), hypertension (62.7%) and obesity (41%). Treatment regimens comprised β-Blockers (82%), ACE-inhibitors or angiotensin receptor blockers (95%) and aldosterone antagonists (47%). The prevalence of sHPT and VDD was 69.2 and 97.7% respectively, with normal levels of calcium and phosphate in almost all patients. sHPT was directly related to NT-proBNP levels (p<0.005). No significant association was found between sHPT and renin-aldosterone levels but there existed an association between sHPT and the subgroup of patients under low doses of aldosterone antagonists and high-doses of diuretics. eGFR was also related to sHPT (p<0.005). Only 10% of the cohort would benefit from substitutive treatment. After one year follow-up, there was a 95% survival rate, 84% of death due to cardiovascular disease. DISCUSSION: Prevalence of sHPT was higher than expected. The activation of parathyroid hormone (PTH) in response to secondary hypocalcemia, due to calcitriol-deficiency together with therapeutic drugs, could keep calcemia and phosphatemia under normal values. Despite living in a sunny environment, hypovitaminosis D was nearly universal, probably because of both insufficient intake and HF-related immobilisation. A direct relation between renal impairment and prognostic markers like NT-proBNP was found in patients with high PTH levels, particularly in those taking high-dose diuretics and low-dose aldosterone antagonists. The high survival rate precluded the identification of prognostic factors in the medium-term. CONCLUSIONS: 1. The prevalence of sHPT and VDD in patients with stable HF is higher than in other populations. 2. There is a direct relation between sHPT and high-dose diuretics and low-dose aldosterone antagonists. 3. No relation between sHPT/VDD and prognosis has been found. 4. Only 10% of patients would require substitutive treatment.

La hernia incisional (HI) es una complicación potencialmente grave y de elevada incidencia de las laparotomías. Se caracteriza por la pérdida de estructura y de función miofasciales y la eventual ruptura del tejido. De progresión lenta, conlleva una morbilidad importante y su reparación quirúrgica usando biomateriales es un desafío. Aunque se han identificado diversos factores de riesgo (dependientes de la técnica o del paciente), la etiología fundamental de la HI es desconocida. Por el momento, no hay modelos experimentales apropiados para el estudio los mecanismos iniciales de la enfermedad y así extrapolar hallazgos preclínicos. Debido a su coste socio-sanitario, y la posible mejora en su prevención, diagnóstico y tratamiento, tiene sentido desarrollar estudios descriptivos con los que poder generar nuevas hipótesis y habilitar una nueva medicina de precisión más basada en la evidencia. En esta tesis nos hemos centrado en el estudio del nicho conectivo local, comparando muestras humanas peroperatorias derivadas de tejidos de la pared abdominal (fascia y músculo esquelético) de pacientes con historia de HI y pacientes control. El objetivo primordial del trabajo es avanzar en la comprensión de los mecanismos efectores (celulares y moleculares) implicados, y así poder contribuir a reducir el rango de variables candidatas asociadas al desarrollo y/o la predicción de la HI. Planteamos una investigación de tipo clínico orientada al paciente. De manera específica nos hemos centrado en tres ejes principales: 1.- Caracterización tisular, 2.- Caracterización de fibroblastos primarios in vitro; y, 3.- Evaluación de la respuesta fenotípica y funcional de dichos fibroblastos en sustratos de cultivo con propiedades mecánicas (rigidez) reguladas, con la intención de modelar in vitro las condiciones mecánicas del tejido humano afectado. En el análisis de la caracterización tisular, demostramos alteraciones al nivel de la matriz extracelular (MEC) local (específicas de tejido), que en última instancia podrían ser las responsables de la pérdida tisular y de la eventual ruptura. Destaca la presencia de señales diversas de muerte celular en los tejidos de pacientes con HI, que probablemente podrían provocar la destrucción progresiva de los fibroblastos locales. Bajo un segundo objetivo hemos caracterizado fibroblastos primarios in vitro, identificando un funcionamiento alterado en los derivados de HI (HIFs). Demostramos que los HIFs adquieren in vivo un fenotipo diferencial que se mantiene en cultivo a lo largo de diferentes pases, y que afecta a procesos celulares fundamentales. Finalmente, sobre la base de este progreso y para obtener una imagen más completa de estos eventos, sabiendo que la patología local puede generar también cambios en las tensiones mecánicas de los tejidos, bajo un tercer objetivo y utilizando sustratos de propiedades mecánicas reguladas, hemos podido demostrar que cambios en la rigidez del sustrato son suficientes para provocar alteraciones fenotípicas y funcionales en los fibroblastos primarios estudiados. La respuesta difiere entre fibroblastos primarios derivados de pacientes con HI y fibroblastos derivados de pacientes control. Estos resultados confirman que la modulación de la rigidez del sustrato permite una aproximación in vitro al estudio de determinados aspectos de la fisiología de fibroblasto en respuesta a cambios de rigidez del tejido conectivo (i.e., presentes en la HI). En conclusión, nuestros datos aportan evidencias indirectas pero convincentes de que el microentorno de la MEC local puede influenciar el desarrollo de la HI, actuando de una manera específica para cada tejido. Estos hallazgos pueden ser relevantes ayudando a identificar nuevos actores en el proceso HI, tal y como sucederían in vivo, y aportan información para poder definir nuevas dianas que podrían ayudar a diferentes niveles: a) mejor identificación y estratificación de paciente, b) mejora de resultados clínicos, c) contribuir a adaptar el diseño de biomateriales para mejorar el rendimiento clínico. / The incisional hernia (IH) is a potentially serious and high incidence complication of laparotomy. It is characterized by the loss of structure and function and eventual myofascial tissue breakdown. HI is a slowly progressive pathology, leading to significant morbidity, and surgical repair using biomaterials is a challenge. Even thought it has described several risks factors (technique or patient dependent), the primary aetiology for IH is unknown. At this time, no appropriate experimental models have been developed to study the initial mechanisms of disease, and then extrapolate the preclinical findings. Due to its social and health costs, and the possibility to improve the prevention, diagnosis and treatment of HI, it would be reasonable to develop descriptive studies to generate new hypotheses and enable a new precision medicine based on evidence. In this thesis, we focused on the study of the local connective niche, comparing perioperative human samples derived from the abdominal wall tissue (fascia and skeletal muscle) in patients with a history of HI and control patients. The primary objective of this work is to advance the understanding of the effector mechanisms (cellular and molecular) involved in HI, and thus contributing to efforts to narrow the range of candidate variables associated with the development and / or prediction of the HI. We propose a patient-oriented clinical type research. Particularly, we have focused on three main subjects: 1. - Tissue characterization, 2. - Characterization of primary fibroblasts in vitro; and 3. - evaluation of phenotypic and functional response of before mentioned fibroblasts in culture substrates with mechanical regulated properties (stiffness), with the aim of modelling the in vitro mechanical conditions of the human tissue affected. In the analysis of tissue characterization we showed alterations at local extracellular matrix (ECM) level, (tissue-specific), which ultimately may lead to tissue loss and eventual rupture. The presence of various signs of cell death in tissues of patients with IH is particularly noteworthy, which could probably lead to progressive destruction of local fibroblasts. We achieved the second goal of characterizing primary fibroblasts in vitro, identifying an altered function in IH derived fibroblast (IHFs). We show that IHFs acquire a differential phenotype in vivo which is maintained in culture over different passages, affecting fundamental cellular processes. Finally, based on these evidences and to obtain a more complete picture of these events, knowing that local pathology can also cause changes in the mechanical tension of tissue, and using substrates with mechanical properties regulated, we have demonstrate that changes in substrate stiffness are sufficient to cause phenotypic and functional alterations in primary fibroblasts studied. The response differs between primary fibroblasts derived from patients with IH and fibroblasts derived from control patients. These results confirm that modulating substrate stiffness allows an in vitro approach to the study of certain aspects of fibroblast physiology in response to changes in rigidity of the connective tissue (i.e, present in HI). In conclusion, our data provide indirect but convincing evidence that local ECM microenvironment can influence in the development of IH, acting in a specific manner for each tissue. These findings may be relevant by helping to identify new agents in the IH process, as would occurs in vivo, providing information to define new targets that could help different aspects of pathology: a) better identification and stratification of patients, b) improvement of clinical outcomes, c) contribute to adapt the design of the biomaterials to improve clinical performance.

La desnutrición extrauterina es un hecho frecuente entre la población de recién nacidos prematuros y no está claro si ésta acarrea un mayor riesgo de complicaciones metabólicas futuras. OBJETIVOS: Evaluar si existen diferencias en las concentraciones de adiponectina y leptina a los 2 años de edad corregida (EC) entre recién nacidos prematuros (RNPT) de 32 semanas o menos que nacen con un peso adecuado a la edad gestacional (AEG) y sufren una restricción del crecimiento extrauterino (RCEU) a las 36 semanas de edad postmenstrual (EPM) y aquellos que no la sufren. Y entre ambos grupos y una población de recién nacidos a término (RNT), de peso adecuado a la edad gestacional. Se analizó también la relación con el perfil lipídico, la adiposidad, la nutrición intrahospitalaria y extrahospitalaria y otras variables de interés. METODOLOGÍA: Se realizó un estudio observacional prospectivo y longitudinal, a dos años de seguimiento, en el que se incluyeron RNPT con edad gestacional (EG) entre 24 y 32+6 semanas y peso al nacimiento AEG, que ingresan en la Unidad Neonatal del Hospital General de Alicante con menos de 12 horas de vida. A las 36 semanas de EPM o al alta de nuestra Unidad, se dividió la muestra en dos grupos según su peso fuera adecuado o no a la edad gestacional en ese momento. Además se analizó un tercer grupo de RNT sanos procedente de la maternidad de nuestro hospital. De cada uno de los sujetos incluidos en el estudio se recogieron antecedentes familiares y perinatales, variables nutricionales (durante el ingreso y tras el alta), variables analíticas (perfil lipídico al año y los dos años de EC y leptina y adiponectina a los 2 años de EC) y variables antropométricas. En el caso de los RNPT se recogieron también variables de gravedad durante el ingreso. RESULTADOS: El porcentaje de desnutrición extrauterina fue del 14.6%. Dicha desnutrición se relacionó de manera independiente con el z-score de peso al nacimiento y con la escala de gravedad clínica durante el ingreso. Los RNPT considerados “adecuadamente nutridos” también sufrieron cierto grado de desnutrición. A los 24 meses de EC nuestros RNPT en conjunto todavía no habían alcanzado en peso e IMC a los RNT sanos. Los RNPT sin RCEU presentaron cifras de leptina significativamente menores que los RNT. Tras realizar un análisis multivariante, solamente el aporte proteico medio durante el ingreso y el z-score de IMC a los 24 meses de EC se relacionaron de manera independiente con las cifras de leptina. La adiponectina se correlacionó positivamente con las cifras de colesterol total y LDL a los 24 meses de EC. Queda al límite de la significación la correlación entre la leptina y la adiponectina. CONCLUSIONES: Los factores de riesgo para desarrollar RCEU fueron el estado nutricional en el momento del nacimiento y la gravedad clínica durante el ingreso. A los 2 años de EC, los RNPT mantuvieron un retraso ponderoestatural con respecto a los RNT sanos. Los triglicéridos resultaron más elevados en los niños con RCEU, lo que puede suponer el primer dato analítico de síndrome metabólico. Las cifras de leptina se relacionaron con la adiposidad del niño y con el aporte proteico medio recibido durante el ingreso. A los 2 años de EC puede estar comenzando un estado de resistencia a la leptina en los niños que han sufrido un RCEU. Los niveles de adiponectina no se vieron afectados por el estado de nutrición de los prematuros. / La desnutrición extrauterina es un hecho frecuente entre la población de recién nacidos prematuros y no está claro si ésta acarrea un mayor riesgo de complicaciones metabólicas futuras. OBJETIVOS: Evaluar si existen diferencias en las concentraciones de adiponectina y leptina a los 2 años de edad corregida (EC) entre recién nacidos prematuros (RNPT) de 32 semanas o menos que nacen con un peso adecuado a la edad gestacional (AEG) y sufren una restricción del crecimiento extrauterino (RCEU) a las 36 semanas de edad postmenstrual (EPM) y aquellos que no la sufren. Y entre ambos grupos y una población de recién nacidos a término (RNT), de peso adecuado a la edad gestacional. Se analizó también la relación con el perfil lipídico, la adiposidad, la nutrición intrahospitalaria y extrahospitalaria y otras variables de interés. METODOLOGÍA: Se realizó un estudio observacional prospectivo y longitudinal, a dos años de seguimiento, en el que se incluyeron RNPT con edad gestacional (EG) entre 24 y 32+6 semanas y peso al nacimiento AEG, que ingresan en la Unidad Neonatal del Hospital General de Alicante con menos de 12 horas de vida. A las 36 semanas de EPM o al alta de nuestra Unidad, se dividió la muestra en dos grupos según su peso fuera adecuado o no a la edad gestacional en ese momento. Además se analizó un tercer grupo de RNT sanos procedente de la maternidad de nuestro hospital. De cada uno de los sujetos incluidos en el estudio se recogieron antecedentes familiares y perinatales, variables nutricionales (durante el ingreso y tras el alta), variables analíticas (perfil lipídico al año y los dos años de EC y leptina y adiponectina a los 2 años de EC) y variables antropométricas. En el caso de los RNPT se recogieron también variables de gravedad durante el ingreso. RESULTADOS: El porcentaje de desnutrición extrauterina fue del 14.6%. Dicha desnutrición se relacionó de manera independiente con el z-score de peso al nacimiento y con la escala de gravedad clínica durante el ingreso. Los RNPT considerados “adecuadamente nutridos” también sufrieron cierto grado de desnutrición. A los 24 meses de EC nuestros RNPT en conjunto todavía no habían alcanzado en peso e IMC a los RNT sanos. Los RNPT sin RCEU presentaron cifras de leptina significativamente menores que los RNT. Tras realizar un análisis multivariante, solamente el aporte proteico medio durante el ingreso y el z-score de IMC a los 24 meses de EC se relacionaron de manera independiente con las cifras de leptina. La adiponectina se correlacionó positivamente con las cifras de colesterol total y LDL a los 24 meses de EC. Queda al límite de la significación la correlación entre la leptina y la adiponectina. CONCLUSIONES: Los factores de riesgo para desarrollar RCEU fueron el estado nutricional en el momento del nacimiento y la gravedad clínica durante el ingreso. A los 2 años de EC, los RNPT mantuvieron un retraso ponderoestatural con respecto a los RNT sanos. Los triglicéridos resultaron más elevados en los niños con RCEU, lo que puede suponer el primer dato analítico de síndrome metabólico. Las cifras de leptina se relacionaron con la adiposidad del niño y con el aporte proteico medio recibido durante el ingreso. A los 2 años de EC puede estar comenzando un estado de resistencia a la leptina en los niños que han sufrido un RCEU. Los niveles de adiponectina no se vieron afectados por el estado de nutrición de los prematuros. TÉRMINOS TESAURO: 320110 Pediatría, 320502 Endocrinología, 320704 Patología Cardiovascular, 230218 Lípidos, 320000 Ciencias médicas, 320600 Ciencias de la nutrición. CÓDIGOS UNESCO: 3201.10 Pediatría, 3205.02 Endocrinología, 3207.04 Patología cardiovascular, 3206 Ciencias de la nutrición. / Extrauterine growth retardation in preterm newborns and its relationship with cardiovascular risk factors at 2 years of corrected age. Role of leptin, adiponectin, lipid profile and adiposity. Dña. Miriam Salvador Iglesias Extrauterine malnutrition occurs frequently among the preterm newborn population, and it is not clear whether it confers a higher risk of future metabolic complications. OBJECTIVES: To evaluate the differences in adiponectin and leptin concentration at 2 years of corrected age between preterm newborns less than 32 weeks of gestational age born with adequate weight for gestational age and who develop extrauterine growth retardation at 36 weeks of postmenstrual age and those who do not, and among these 2 groups and a population of term newborns with adequate weight for gestational age. A possible association with lipid profile, adiposity, in-hospital and extra-hospital nutrition, and other variables was also examined. METHODS: Prospective longitudinal observational study with 2 years of follow-up. We included preterm newborns with gestational age between 24 and 32+6 weeks of gestational age and adequate weight for gestational age admitted to the Neonatal Unit at Hospital General Universitario de Alicante at less than 12 hours of age. At 36 weeks of postmenstrual age or at the time of discharge, the sample was divided into 2 groups according to whether their weight was adequate for gestational age or not. A further group of healthy term newborns from the maternity ward was also analysed. We collected information on family history, perinatal variables, nutritional variables (during admission and after discharge), biochemical variables (lipid profile at one and two years of corrected age and leptin and adiponectin at two years of corrected age), and anthropometric variables for each subject included in the study. For the preterm babies, information on severity of complications during admission was also collected. RESULTS: The percentage of extrauterine malnutrition was 14.6%. Malnutrition was independently associated with the birth weight z-score and with severity of complications during admission. Preterm babies considered “adequately nourished” also suffered some degree of malnutrition. At 24 months of corrected age, preterm babies as a group still had inferior weight and BMI compared to healthy term babies. Preterm babies without extrauterine growth retardation had lower leptin levels than term babies. In multivariable analysis, only average protein intake during admission and z-score for BMI at 24 months of corrected age were independently associated with leptin levels. Adiponectin was positively associated with total cholesterol and LDL levels at 24 months of corrected age. Correlation between leptin and adiponectin was borderline significant. DISCUSSION: Nutritional status at birth and severity during admission were risk factors for the development of extrauterine growth retardation. At 2 years of corrected age preterm babies’ weight and height remained lower than term babies’. Triglycerides were higher in children with extrauterine growth retardation, which could indicate a first hint of metabolic syndrome. Leptin levels were associated with the child’s adiposity and average protein intake during admission. At 2 years of corrected age, resistence to leptin may be developing among children who suffered extrauterine growth retardation. Adiponectin levels were not affected by the preterm babies’ nutritional status. TESAURUS: 320110 Pediatrics, 320502 Endocrinology, 320704 Cardiovascular disease, 230218 Lipids, 320000 Medical sciences, 320600 Nutritional sciences. UNESCO CODES: 3201.10 Pediatrics, 3205.02 Endocrinology, 3207.04 Cardiovascular disease, 3206 Nutritional sciences.

La obesidad infantil ha alcanzado niveles de pandemia global convirtiéndose en uno de los problemas de salud pública del siglo XXI, siendo llamativo el fuerte incremento a nivel mundial que se ha producido en lactantes y niños desde el año 1990 al 2013 (OMS, 2014b). Sin intervención, es muy probable que estos lactantes y niños sigan siendo obesos durante la infancia, adolescencia y edad adulta, y sufrirán las consecuencias físicas, psicológicas y sociales que provoca esta enfermedad. El objetivo de este trabajo es estudiar, durante la niñez temprana (4 y 7 años de edad), características psicológicas asociadas al sobrepeso y la obesidad. En concreto, se analizan las diferencias entre niños con sobrepeso/obesidad y niños con normopeso en temperamento y percepción de ajuste personal y social por parte de los padres, maestros y los propios niños. También se estudió la influencia de la conducta alimentaria en el entorno familiar asociada a la obesidad infantil. La muestra está compuesta por 123 niños y niñas de 4 y 7 años con y sin obesidad/sobrepeso de diferentes centros educativos de la ciudad de Cartagena (Murcia). Se pesó y midió a los participantes para calcular el IMC y clasificarlos en normopeso, sobrepeso y obesidad. Los padres cumplimentaron el Cuestionario sobre Conducta Infantil (CBQ) para conocer el temperamento de sus hijos. Para evaluar el ajuste personal y social de los niños, se utilizó el BASC (Behavior Assessment System for Children de Reynolds y Kamphaus, 1992; Silva y Martorell, 2001) en su variante para padres (BASC-P), para tutores (BASC-T) y el autoinforme (BASC–S) aplicado a los niños de 7 años. Además, se administró el Cuestionario de Conducta Alimentaria, que fue completado por los padres de los niños. Los resultados de este trabajo muestran que hay diferencias entre niños con y sin sobrepeso/obesidad en variables temperamentales relacionadas con la emocionalidad negativa (en concreto, ira, malestar, miedo y tristeza) y el placer de baja intensidad. En cuanto a ajuste personal y social, la percepción varía enormemente en función del informante: mientras que los niños de 7 años no indican diferencias según el IMC, padres y, sobre todo, tutores informan de problemas de ajuste personal y social. Los padres de niños con sobrepeso/obesidad indican mayores problemas en habilidades adaptativas y adaptabilidad. Los tutores señalan que los niños con sobrepeso/obesidad tienen más problemas externalizantes (agresividad, hiperactividad) e internalizantes (depresión), así como menos habilidades sociales, habilidades adaptativas y adaptabilidad. Respecto a la conducta alimentaria, los resultados muestran diferencias significativas desde los cuatro años en los niños con sobrepeso/obesidad. Así, los padres de niños con sobrepeso/obesidad utilizan más la comida para regular a sus hijos y los propios niños se autorregulan emocionalmente más con la alimentación. Además, sus preferencias alimentarias son menos sanas, tienen más dificultades para percibir la saciedad y tienen peores hábitos alimentarios. Las conclusiones apuntan a las complejas relaciones de factores que intervienen en el desarrollo y mantenimiento de la obesidad: una alta emocionalidad negativa que combinada con formas de regulación por parte de los padres basadas en la comida pueden originar la tendencia a la alimentación emocional y la preferencia por alimentos hipercalóricos y, en consecuencia, el sobrepeso. Éste a su vez provoca problemas de ajuste personal y social que pueden, en un círculo vicioso, agravar el problema de obesidad al recurrir a la alimentación emocional como consuelo. Se indican también las consecuencias de una estigmatización temprana del niño con sobrepeso/obesidad en el entorno escolar. / ABSTRACT Child obesity is considered a global pandemic and has become one of the public health problems of the XXIst Century. There was an impressive worldwide growth among infants and children from 1990 to 2013 (OMS, 2014b). Without intervention, these infants and children will probably be obese/overweight during childhood, adolescence and adult age, and will suffer the physical, psychological and social consequences of this illness. This investigation aims to study psychological characteristics associated to overweight and obesity during early childhood (4 and 7 years of age). Specifically, differences between children with and without overweight/obesity in temperament and perception of social and personal adjustment are analysed. Parents’, teachers’ and children’s perceptions were compared. The influence of eating behaviour in the family environment associated to child obesity was also considered. The sample consisted of 123 children of 4 and 7 years of age with and without obesity/overweight from different schools in Cartagena (Murcia). Children were weighted and measured to calculate their BMI index and classify them in obese, overweight or standard. Parents filled out the CBQ questionnaire about their children temperament. To evaluate the social and personal adjustment, the BASC (Behavior Assessment System for Children by Reynolds and Kamphaus, 1992; Silva y Martorell, 2001) was used. Parent Scales (BASC-P), teacher Scales (BASC-T) and the self-report (BASC-S) for 7-year-olds were applied. Parents also completed the Eating Behavior Questionnaire. Results show that there are significant differences in children with and without overweight/obesity in temperamental variables related to negative emotionality (specifically, anger, distress, fear and sadness) as well as low intensity pleasure. As to personal and social adjustment, perceptions greatly differ depending on who reports: 7- year-old children did not differ depending on BMI, but parents and teachers report some problems in personal and social adjustment. Parents of overweigth/obese children report more problems in adaptability and adaptive abilities. Teachers indicate that overweight/obese children have more externalizing (agressiveness, hyperactivity) and internalizing (depression) problems, as well as less social abilities, adaptive abilities and adaptability. In relation to eating behavior, results show significant differences from four years of age. Thus, parents of overweight/obese children more frequently use food to regulate their children’s behavior and these children also self-regulate themselves through food. Their food preferences as well as their food habits were worse and they have difficulties to perceive satiety. Conclusions point to the complex relations between factors that influence the development and maintenance of obesity: a high negative emotionality combined with forms of regulation based on food used by parents can originate the trend towards emotional eating and the preference for unhealthy food. This will end in overweight that, in turn, will create problems in social and personal adjustment; and these problems, in a vicious circle, can increase obesity when emotional food is used to find comfort. The consequences of an early stigmatization of overweight/obese children in the school setting are also discussed.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Salut Internacional de Barcelona (CRESIB) - Hospital Clínic / INTRODUCCIÓN Cada año mueren en el mundo más de 6 millones de niños menores de 5 años. Cerca del 50% en África subsahariana. Mejorar el conocimiento de patologías como la anemia y la exposición perinatal al VIH, que tienen un peso relevante pero poco reconocido en la mortalidad infantil, podría ayudar a reducir estas muertes. MATERIAL Y MÉTODOS Para determinar la etiología de anemia en Mozambique, profundizar en la etiopatogenia de la anemia asociada a malaria y determinar el mejor marcador serológico para el diagnóstico de ferropenia, se llevó a cabo un estudio de casos y controles, siendo los casos 443 niños preescolares hospitalizados con anemia (concentración de Hb < 11gr/dl) y los controles comunitarios 289 niños sin anemia. Para evaluar el impacto de la exposición perinatal al VIH sobre la morbilidad y los parámetros hematológicos e inmunológicos de los niños mozambiqueños expuestos pero no infectados (ENI) se realizó un estudio de cohortes prospectivo en el que se evaluaron 158 lactantes (menores de 1 año) ENI y 160 lactantes no expuestos al VIH a los 1, 3, 9 y 12 meses después del nacimiento. Además se registraron todas las visitas al servicio de emergencia y los ingresos. Los niños ENI recibieron cotrimoxazol profiláctico. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La desnutrición, la malaria, la infección por VIH y la deficiencia de hierro fueron los principales factores asociados a anemia en esta población, y a los que deberían ir dirigidas las políticas de prevención de anemia. La hemozoína en la médula ósea puede tener un papel en la patogénesis de la anemia asociada a la malaria mediante una eritropoyesis ineficaz, lo que debería tenerse en cuenta en el desarrollo de fármacos para prevenir y tratar la anemia asociada a malaria. La anemia grave y la diseritropoyesis se asociaron con una mayor presencia de gametocitos maduros en médula ósea. Los niños anémicos infectados por P. falciparum presentaron una alta prevalencia de gametocitos inmaduros en médula ósea, lo que debería tenerse en cuenta al desarrollar estrategias de prevención de la malaria basadas en la erradicación de portadores de gametocitos. Utilizando los depósitos de hierro en la médula ósea de los niños anémicos como gold standard se identificó que el índice de receptor de transferrina-ferritina ajustado por la proteína C reactiva era el mejor marcador sérico para el diagnóstico de ferropenia en la población de estudio, aunque se confirma la necesidad de marcadores más precisos, especialmente en poblaciones con alta prevalencia de infecciones. Los niños ENI presentaron más anemia, menor %CD4 y mayor %CD8 comparado con los niños no expuestos. Ambos grupos presentaron medias similares de células T-CD8 y CD4 naive, memoria y activadas al mes de vida. Los niños ENI nacidos de madres con cargas virales >5 log10 copias/ml tuvieron menor %CD8 naive y mayor %CD8 memoria. Esto sugiere que la exposición a una carga viral materna alta aumenta el riesgo de los niños de tener alteraciones en las poblaciones de células T. Los niños ENI presentaron menor número de consultas al servicio de emergencias, seguramente por el uso rutinario de cotrimoxazol profiláctico, lo que apoya la continuación de esta profilaxis en este grupo. CONCLUSIONES La anemia y la exposición perinatal al VIH son patologías relevantes en Mozambique en niños pequeños. La prevención de las principales etiologías de la anemia identificadas en este trabajo podría disminuir la anemia y la morbi-mortalidad asociada a la misma. La mejora en las políticas de prevención de la trasmisión vertical del VIH podría disminuir las consecuencias del VIH materno en los niños ENI, y la continuación del uso de cotrimoxazol profiláctico en estos niños podría disminuir su morbilidad. / More than 6 million of children under 5 years die worldwide each year. Almost 50% are in sub-Saharan Africa. Improve the knowledge of pathologies as anemia and perinatal exposure to HIV, which are important but neglected, could be a way to reduce these deaths. In order to evaluate the main etiologies of anemia, improve the knowledge of the physiopathology of malarial-anemia and determine the best serological biomarker of iron deficiency, a case-control study of 443 preschool hospitalized children with anemia (hemoglobin concentration <11g/dl) and 289 community controls without anemia in Mozambique was performed. To evaluate the impact of the HIV exposure in the morbidity and hematological and immunological profiles of children HIV exposed uninfected (HEU), 158 HEU and 160 unexposed Mozambican infants were evaluated at 1, 3, 9, and 12 months post-delivery. Undernutrition, iron deficiency, malaria, and HIV are main etiologies related to anemia in Mozambican preschool children. Effective programs for the prevention of these conditions need to be reinforced. Hemozoin in the bone marrow has a role in the pathogenesis of malarial-anemia through ineffective erythropoiesis. Severe anemia and dyserythropoiesis were independently associated with a higher prevalence of mature gametocytes in bone marrow. Transferrin-ferritin index ratio adjusted by C-reactive protein was the best serological iron deficiency biomarker. HEU children were more frequently anemic, had poorer nutritional status, and alterations in some immunological profiles compared with unexposed children. Infant naïve and activated CD8 T-cells were associated with high maternal HIV-RNA load at delivery, so exposure to elevated maternal HIV-RNA puts the infant at higher risk of having early T-cell abnormalities. HEU infants had reduced incidence of outpatient visits. Prophylactic cotrimoxazol used in a routine way in HEU infants may explain their reduced morbidity. These findings reinforce continuation of cotrimoxazol prophylaxis. Anemia and perinatal HIV exposure are important pathologies in preschool children in Mozambique. Prevention of the main causes of anemia identified in this thesis should reduce anemia and the morbidity and mortality related to it. Similarly, improvement of HIV prevention mother-to-child-transmission programs would reduce the negative health impact of HIV exposure in HEU children. Cotrimoxazol prophylaxis could improve these children’s health.

El melanoma cutáneo es una neoplasia maligna de los melanocitos que se caracteriza por un curso clínico a menudo indeseable. Aunque actualmente la detección precoz y la cirugía ofrecen una alta tasa de curación, este tumor puede eludir la vigilancia inmunológica del huésped favoreciendo su evolución. Esto puede deberse ciertas interacciones entre los antígenos leucocitarios humanos (HLA) y células T citolíticas específicas de antígeno (CTL) o las células asesinas naturales (NK), las cuales son importantes por su acción anti-tumoral frente al melanoma. En contraste con otras células tumorales, las células de melanoma se consideran altamente inmunogénicas debido a que expresan antígenos que pueden desempeñar un papel decisivo en el reconocimiento de células tumorales y el rechazo por el sistema inmunológico del huésped. OBJETIVOS: Hasta la fecha no han sido completamente dilucidados los mecanismos inmunológicos implicados en el melanoma cutáneo. Se han hecho esfuerzos para encontrar marcadores de susceptibilidad o pronóstico y posibles dianas para las terapias inmunológicas, pero no han dado frutos aún. Por lo tanto, los objetivos de este estudio han sido investigar si: 1. La susceptibilidad o evolución del melanoma están influenciadas o no por los loci HLA A, HLA B, HLA C, HLA E, HLA-DRB1 o HLA-DQB1. 2. Si los cambios tempranos de las células T CD8+ y CD56+ NK que expresan receptores NK participan en la susceptibilidad o curso del melanoma en diferentes grupos de pacientes definidos por su dimorfismo HLA-C (Lys80/Asn80). DISEÑO EXPERIMENTAL: 1. El tipaje de HLA-A y HLA-B con el método de microlinfocitotoxicidad estándar. El tipaje HLA C para analizar el dimorfismo en la posición 80 de la hélice α1 (Asn80/Lys80) capaz de mediar con las células que expresan KIR, se realizó PCR-SSO. 2. El tipaje HLA-DRB1 y HLA-DQB1 y las confirmaciones de HLA de clase I se realizó mediante PCR-SSP. 3. Las células T CD8+ y CD56+ NK de pacientes y controles con diferentes genotipos HLA-C (Asn80/Lys80) se analizaron por citometría de flujo. RESULTADOS: 1. En este estudio, no se ha encontrado una asociación negativa o positiva de los alelos HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1, HLA-DQB1 y HLA E con la susceptibilidad o evolución del melanoma melanoma. 2. Este estudio demuestra, por primera vez, que la presencia del epítopo Asn80 podría contribuir a la protección de la enfermedad, en particular el alelo HLA C*07. 3. Este estudio muestra, también por primera vez, que la presencia de HLA-C portadores de Lys80 en homocigosis puede ser considerado como un factor predisponente para el desarrollo de metástasis linfáticas tempranas. 4. Según nuestro conocimiento, describimos por primera vez, una evidencia “in vivo” de la existencia de un estado de activación en pacientes con melanoma en etapas no metastásicas de la enfermedad, determinada por un aumento del número absoluto de linfocitos T de sangre periférica con fenotipo CD8+CD28+DR+ o CD8+CD28-CD161+, que podría estar asociada con una estimulación de la respuesta inmune en las primeras etapas de melanoma cutáneo. 5. Se detecta, por primera vez también, una expansión selectiva de una subpoblación de células T que expresan receptores KIR2DL1/S1 (CD8+CD28CD158a+) junto con un aumento de las células CD56+ NK KIR2DL1/S1 en pacientes de melanoma, mucho más pronunciado en los pacientes portadores del ligando HLA-CLys80 en homocigosis, lo que indica un particular papel regulador inmunológico de las células que expresan receptores KIR2DL1/S1 en el melanoma. 6. Por lo tanto, es tentador especular sobre la posibilidad de la apertura de nuevas vías terapéuticas para el control de la progresión del melanoma, tomando en consideración a estas células como posibles dianas para la intervención inmunológica mediante el bloqueo o la estimulación de sus receptores inhibidores/activadores. / Cutaneous melanoma is a malignant neoplasm of melanocytes characterized by an often undesirable clinical outcome. Although current early detection and surgery offer a high cure rate, this tumor can be elusive for the host immune surveillance, especially if a state of tolerance against tumor is induced. The clinical outcome may be influenced by complex interactions that take place between the different human leukocyte antigens (HLA) and antigen-specific cytolytic T cells (CTL) or natural killer (NK) cells, which are believed to be important in eliciting an effective immune protection against melanoma. Nonetheless, in contrast to other tumor cells, melanoma cells are usually considered highly immunogenic because of the expression of antigens that may play a decisive role in tumor cell recognition and rejection by the host immune system. PURPOSE: To date, immune mechanisms involved in cutaneous melanoma have not been fully elucidated. Efforts have been made to find susceptibility or prognosis markers and potential targets for immune therapies, but they have not been entirely fruitful so far. Therefore, the goals of this study were to investigate: 1. If the susceptibility or outcome of the melanoma is influenced by HLA A, HLA B, HLA C, HLA E, HLA-DRB1 or HLA-DQB1 loci. 2. The influence of early changes in CD8 T and CD56 NK cells expressing NK receptors in different HLA-C dimorphism (Lys80/Asn80) groups in the susceptibility or outcome of the melanoma. EXPERIMENTAL DESIGN: All experiments were made in patients and sex- and age-matched controls. 1. HLA-A and HLA-B typing were performed by the standard microlymphocytotoxicity test. 2. Typing of HLA C dimorphism (Lys/Asn) at position 80 in the α1 helix to examine whether it could mediate in the emergence of cells expressing killer-cell immunoglobulin-like receptors was tested by PCR-SSO. 3. HLA class II typing HLA-DRB1 and HLA-DQB1 typing and resolution of HLA class I ambiguities were performed by PCR-SSP 4. CD8 T and CD56 NK cells were analyzed in patients and sex- and age-matched controls with different HLA-C genotypes (Asn80/Lys80) by flow cytometry. RESULTS: 1. In this study, none of the HLA class I antigens (HLA-A and HLA-B), HLA class II alleles (HLA-DRB1 and HLA-DQB1) and HLA E showed positive or negative association with the overall population of melanoma patients. 2. This study shows, for the first time, that the presence of the Asn80 epitope could contribute to the protection against the disease, particularly the HLA-Cw*07 allele. 3. This study shows, also for the first time, that the presence of Lys80 epitope of the HLA-C molecules in homozygosis may be considered as a predictive factor for the development of early LN metastasis. 4. To our knowledge, we have described for the first time an in vivo evidence of the existence of a status of activation in melanoma patients at the nonmetastatic stages of the disease, determined by an increase of the absolute number of T lymphocytes from peripheral blood with phenotype CD8+CD28+DR+ or CD8+CD28-CD161+, which could be associated with a stimulation of the immune response at the early stages of cutaneous melanoma. 5. We have detected, for the first time too, a selective expansion of T cells subpopulation expressing KIR2DL1/S1 (CD8+CD28-CD158a+) together with an increase of CD56+ NK KIR2DL1/S1 cells in patients of melanoma, much more pronounced in patients carrying the corresponding HLA-CLys80 ligand in homozygosis, which point to a particular immune regulatory role of cells expressing KIR2DL1/S1 in melanoma. 6. Thus, it is tempting to speculate about the possibility of opening new therapeutic ways for the control of melanoma progression, taking into consideration these cells as a target for immune intervention by blocking or enhancing their inhibitory/activatory receptors.

Los carcinomas uroteliales de vejiga, al igual que la mayoría de tumores sólidos, se caracterizan por la acumulación de múltiples desequilibrios genéticos. Con el fin de contribuir al conocimiento de las bases genéticas de la tumorogénesis urotelial, se estudió una serie de 180 tumores de vejiga mediante CGH convencional, observando que estos tumores mantienen un perfil característico de desequilibrios genómicos con ganancias en 1q, 8q, 11q, 16p, 17q, 18p, 19, 20q, Xq y pérdidas en 4q, 8p, 9p, 9q, 11p, 11q, 13q, 18q e Y. Las ganancias en 5p, 6p, 10p y las pérdidas en 5q, 6q aumentan su frecuencia de forma significativa a lo largo de la progresión tumoral. Estos resultados se confirmaron mediante la técnica de CGH array. Demostrando además, que los tumores músculo infiltrantes con desequilibrios en el cromosoma 5 muestran frecuentes amplificaciones en 1q, 5p, 6p y 19q, afectando entre otros a los genes CKS1, SKP2, E2F3 y CCNE1, que participan en la misma ruta de control del ciclo celular. La amplificación y sobreexpresión de CKS1 y SKP2 es una característica común de los tumores músculo infiltrantes, junto con la infraexpresión de p27. La amplificación de E2F3 junto con la inactivación de pRB se observó frecuentemente en nuestro grupo de estudio. La inestabilidad cromosómica es la fuerza motriz que origina los desequilibrios genómicos y que puede estar en el origen del proceso tumoral. Por ello, nos propusimos analizar muestras tumorales incluidas en parafina mediante FISH e inmunofluorescencia con el fin de estudiar las alteraciones del centrosoma y la amplificación del oncogén CCND1, respectivamente. Puesto que estas alteraciones están asociadas a la inestabilidad cromosómica numérica y estructural. Este estudio ha permitido describir el comportamiento in vivo de la amplificación de CCND1 dentro de los tumores de vejiga T1 con inestabilidad cromosómica. Se ha descrito por primera vez en la literatura la amplificación de CCND1 en forma de diminutos dobles y su posible origen en la fragmentación de las regiones de tinción homogénea. También, hemos demostrado que el agrupamiento de centrosomas supernumerarios asociado a la formación de husos mitóticos bipolares es una característica frecuente en estos tumores. El 80% de los tumores con inestabilidad cromosómica presentaron centrosomas supernumerarios. El comportamiento de los tumores uroteliales no músculo infiltrantes se caracteriza por una elevada tasa de recurrencia, lo que condiciona su seguimiento clínico. La identificación de las alteraciones moleculares críticas para la recurrencia y progresión tumoral podrían ayudar a predecir el comportamiento clínico del tumor. Por ello nos propusimos analizar la asociación entre alteraciones de la dosis génica de EGFR, CMYC, CCND1 y 9p21 con los parámetros clínicos en pacientes con cáncer de vejiga no músculo infiltrante. Este estudio se llevó a cabo en un array de 152 tumores. Nuestros resultados indican que la ganancia de EGFR asociada a polisomía del cromosoma 7 es marcador independiente de recurrencia en tumores Ta. La ganancia de 9p21 asociada a alta polisomía del cromosoma 9 y la alta ganancia de CMYC son marcadores independientes de progresión en tumores T1. El comportamiento clínico de los tumores de vejiga no músculo infiltrante comporta un control de los pacientes durante periodos de tiempo prolongados, que en algunos casos conduce a la aparición de un segundo tumor primario. Nos propusimos estudiar la incidencia de un segundo tumor primario en 231 pacientes con cáncer de vejiga no músculo infiltrante, en este grupo de pacientes se observó una incidencia de cáncer de pulmón 10,27 veces superior a la población general. Por lo que consideramos que se debería incluir una revisión anual para la detección y prevención del cáncer de pulmón, en los pacientes aquejados de cáncer de vejiga. Esta propuesta se ve reforzada por el hecho de que en el grupo de pacientes con ambas neoplasias, la muerte se produjo siempre a causa del tumor de pulmón. / Bladder cancer, along with most solid tumours, is characterized by multiple numerical and structural chromosome aberrations which generate genomic imbalances. The first objective of the present study was to analyse a series of 180 urothelial bladder tumours by Comparative Genomic Hybridization in metaphase chromosomes. Our results showed a characteristic profile of genomic imbalances with gains on 1q, 8q, 11q, 16p, 17q, 18p, 19, 20q, Xq and losses on 4q, 8p, 9p, 9q, 11p, 11q, 13q 18q and Y. Gains on 5p, 6p, 10p and losses on 5q, 6q increase their frequency significantly during tumour progression. These results were subsequently confirmed by CGH array also demonstrating that muscle invasive tumours with 5p chromosome imbalances also showed amplifications at 1q, 5p, 6p and 19q affecting CKS1, SKP2, E2F3 and CCNE1 genes all of them participating in the same way of cell cycle control. We also found that amplification and over expression of CKS1 and SKP2 are characteristic of muscle invasive tumours. Amplification of E2F3 associated to pRB inactivation was frequently observed in our series. Tacking into account that chromosome instability (CIN) originates the genomic imbalances observed in bladder tumours, our second objective was to study numerical and structural chromosome instability by applying FISH, and inmunofluorescent techniques to analyse CIN index, CCND1 amplification and centrosome abnormalities in a series of 21 paraffin-embedded bladder tumours. Our results allowed describing the in vivo behaviour of CCND1 amplification in chromosomal unstable T1 bladder tumours. Our study is the first report regarding the simultaneous CCND1 amplification in DM and HSR and the possible origin of DM from HSR fragmentation. We also demonstrated that centrosome coalescence is a common event in bladder tumours being present in 80% of the most unstable tumours analyzed. The clinical behaviour of superficial bladder tumours is characterized by recurrence, which directs their clinical management. Identification of the molecular alterations critical for tumour recurrence and progression would outcome prediction and treatment selection. Our third objective was to asses the association between alterations in gene dosage and deregulation of protein expression with clinical parameters in patients with non-muscle invasive bladder carcinoma (NMIBC). To achieve this goal, the CCND1, CMYC and EGFR genes and the 9p21 locus were analyzed by fluorescent in situ hybridization and Cyclin D1, p53, p21 and p16 proteins by immunochemistry in a bladder cancer tissue microarray composed of 152 Ta and T1 tumours. Our results showed that polysomy 7 with high gain of EGFR constitute an independent prognostic factor for recurrence in NMIBC. Gain of 9p21 is an independent prognostic factor of progression in T1G3 bladder tumours. The clinical behaviour of low-risk NMIBC enables patients to be controlled for a long period, which in some cases leads to the development of a second primary tumour. We studied the second tumour incidence in a series of 231 patients with non muscle invasive bladder cancer. Our results showed that the risk of lung cancer was10.27-fold higher in patients with NMIBC as compared with the general population of Catalonia. According to these results, we consider that an annual examination for the detection and prevention of lung cancer must be included in clinical guides for patients with NMIBC. This proposal is reinforced by the finding that death in our group of patients with both tumours was always derived from lung cancer and not from bladder cancer.