I denna uppsats kommer vi dokumentera vidareutvecklingen av Softwerk AB’s Content Management System kallat AppCMS. I dagsläget innefattar AppCMS plattformarna iOS, Android och Windows Phone. Kunderna till Softwerk AB har dock uttryckt ett behov av att även kunna nå ut till sina användare med en webbaserad samt en utskrivningsbar lösning. AppCMS’s exportformat har därför analyserats för att undersöka möjligheten till att återanvända det existerande exportformatet från AppCMS  även för dessa plattformarna. Undersökningen gav klartecken för att påbörja implementationen av de olika lösningarna. Resultatet av arbetet blev ett tillskott till AppCMS i form av en webb- samt en utskrivningsbar version. I uppsatsen beskrivs de problem vi stött på, hur vi hanterat dessa samt vilka beslut som har tagits. / In this essay we will follow the continuous development of the company Softwerk´s Content Management System (CMS) called AppCMS. AppCMS currently includes the following platforms, iOS, Android and Windows Phone. The customers of Softwerk have expressed the need of also being able to reach their customers with a web based as well as a pdf version. AppCMS’s export format have therefore been analyzed to evaluate the possibility of reusing the existing format from AppCMS for these platforms as well. The examination confirmed that the existing format could be reused for the new solutions and that the implementation phase could begin. This work resulted in an addition to AppCMS in the shape of a web and pdf based version. The essay describes the problem we encountered, how we handled them as well as the decisions taken in the process.

L'ADN mitochondrial des plantes est dynamique et son expression est complexe. Par la voie naturelle d'import d'ARN de transfert codés par le noyau, nous avons adressé dans les mitochondries d'Arabidopsis l'ARN orf77 caractéristique de la S-CMS du maïs et nous avons analysé les effets sur le transcriptome mitochondrial. Celui-ci s'est avéré strictement régulé durant le développement et fortement tamponné aux stades précoces. L'adressage mitochondrial de l'orf77 a aussi promu un cross-talk avec le noyau. D'autre part, la réplication et la réparation de l'ADN dans les mitochondries de plante impliquent une recombinaison active contrôlée par des facteurs codés par le noyau. Nous avons identifié l'exonucléase 5'-3' potentiellement responsable de la résection des extrémités de l'ADN dans la réparation par recombinaison des cassures double-brin. Nos résultats ouvrent des perspectives pour la génération de diversité génétique mitochondriale et la création de lignées CMS d'intérêt agronomique. / The mitochondrial DNA of plants is dynamic and its expression is complex. Using a strategy based on the natural import of nuclear-encoded transfer RNAs from the cytosol, we targeted to mitochondria in Arabidopsis thaliana the orf77 RNA characteristic for S-CMS in maize and we analyzed the effects on the transcriptome. The results showed that the mitochondrial transcriptome is tighly regulated during plant development and is strongly buffered at early stages. Mitochondrial targeting of orf77 also triggered a cross-talk with the nucleus. On the other hand, DNA replication and repair in plant mitochondria involve active recombination controled by nuclear-encoded factors. We identified a new member of this set of factors, the 5'-3' exonuclease potentially responsible for the resection of DNA ends in recombination-mediated repair of double-strand breaks. As a whole, the results open prospects for generating mitochondrial genetic diversity and creating CMS lines with agronomical interest.

Cette thèse présente une étude détaillée de l'état final avec un boson Z se désintégrant en deux leptons, produit dans le détecteur CMS au LHC. Pour identifier cette topologie, des algorithmes sophistiqués d'étiquetage des jets b ont été utilisés, et la calibration de l'un d'entre eux, Jet Probability, est exposée. Une étude de la dégradation de cet algorithme à hautes énergies a été menée et une amélioration des performances a pu être notée. Cette étude est suivie par une recherche du boson de Higgs du modèle standard (MS) se désintégrant en deux quarks b, et produit en association avec un boson Z (canal ZH), à l'aide de la Méthode des Éléments de Matrice (MEM) et deux algorithmes d'étiquetage des jets b: JP et Combined Secondary Vertex (CSV). La MEM est un outil perfectionné qui produit une variable discriminante par événement, appelée poids. Pour l'appliquer, plusieurs lots de fonctions de transfert ont été produits. Le résultat final renvoie une limite observée sur le taux de production de ZH avec le rapport d'embranchement H → bb de 5.46xσMS en utilisant CSV et de 4.89xσMS en faisant usage de JP : un léger excès de données est observé seulement pour CSV. Enfin, à partir de l'analyse précédente, une recherche de nouvelle physique modèle-indépendante a été faite. Le but était de discriminer entre eux les processus du MS afin de catégoriser l'espace de phase Zbb, à l'aide d'une méthode récursive basée sur les poids de la MEM. Des paramètres libres ont été ajustés pour obtenir la meilleure limite d'exclusion pour le signal ZH. En utilisant la meilleure configuration trouvée, la limite calculée est de 3.58xσMS, proche de celle obtenue avec l'analyse précédente. / This thesis presents a detailed study of the final state with the Z boson decaying into two leptons, produced in the CMS detector at the LHC. In order to tag this topology, sophisticated b jet tagging algorithms have been used, and the calibration of one of them, the Jet Probability (JP) tagger is exposed. A study of the tagger degradation at high energy has been done and led to a small gain of performance. This investigation is followed by the search for the associated production of the standard model (SM) Higgs boson with a Z boson and decaying into two b quarks (ZH channel), using the Matrix Element Method (MEM) and two b-taggers: JP and Combined Secondary Vertex (CSV). The MEM is an advanced tool that produces an event-by-event discriminating variable, called weight. To apply it, several sets of transfer function have been produced. The final results give an observed limit on the ZH production cross section with the H → bb branching ratio of 5.46xσSM when using the CSV tagger and 4.89xσSM when using the JP algorithm: a small excess of data is observed only for CSV. Finally, based on the previous analysis, a model-independent search of new physics has been performed. The goal was to discriminate all the SM processes to categorize the Zbb phase space, with a recursive approach using the MEM weights. Free parameters had to be tuned in order to find the best exclusion limit on the ZH signal strength. For the best configuration, the computed limit was 3.58xσSM, close to the one obtained with the dedicated search.

Le spectromètre à muons de CMS doit permettre l'identification rapide et efficace des muons produits lors des collisions proton-proton au LHC. Cependant, à cause d'un environnement de détection extrême, seules les chambres à pistes cathodiques équipent actuellement les bouchons de CMS. Cette faiblesse dans le système de détection pourrait devenir problématique après l'amélioration du LHC. L'augmentation du taux de particules dans les bouchons va dégrader les performances du système de déclenchement L1 ainsi que l'efficacité de sélection des phénomènes physiques intéressants. Le but du programme d'amélioration de CMS est de maintenir le taux de déclenchement L1 tout en gardant une efficacité de sélection maximale. La collaboration CMS GEM propose d'équiper les régions vacantes des bouchons avec des détecteurs basés sur la technologie d'amplification des électrons dans un gaz (GEM), appelés GE1/1. Le sujet de thèse proposé par la collaboration CMS GEM a pour but de justifier le choix de la technologie GEM pour l'amélioration de CMS. Trois projets ont été suivis pendant la thèse. La première partie du projet de thèse consistait à mesurer précisément les caractéristiques fondamentales et les performances de détection des détecteurs triple-GEM produit par la technique simple-masque. Ces éléments sont essentiels pour s'assurer que les détecteurs GE1/1 pourront fonctionner en toute sécurité dans l'environnement des bouchons de CMS. Le deuxième projet consistait à prouver que les excellentes performances des détecteurs GE1/1 ne vont pas se dégrader pendant leur utilisation dans CMS. Cette étape comprend l'étude du fonctionnement à long terme des détecteurs GE1/1, en particulier le phénomène de vieillissement, qui inclue tous les processus physiques et chimiques qui provoquent la dégradation graduelle et permanente des performances de détection. Plusieurs tests de vieillissement ont été menés dans des zones d'irradiations spécifiques au CERN pour reproduire un minimum de 10 ans de fonctionnement réel dans l'environnement de CMS après la montée en puissance du LHC. Enfin, les excellentes propriétés mesurées lors de la phase de R&D ont permis de valider la technologie triple-GEM, qui fut ensuite approuvée par la collaboration CMS et le comité du LHC. La production de 144 grands détecteurs GE1/1 sera partagée entre différents sites de production à travers le monde. Le troisième projet de thèse fut donc le développement des principales étapes du contrôle qualité nécessaire pour assurer une production uniforme et une même qualité pour tous les détecteurs GE1/1. / The muon system of CMS aims to provide an efficient and fast identification of the muons produced in the proton-proton collisions. However, the forward region of the end-caps is only instrumented with Cathode Strip Chambers. This lack of redundancy will be problematic after the high-luminosity upgrade of the LHC (HL-LHC), for which the increase of the background rate would degrade the Level-1 trigger performance and thus the selection of interesting physics channels. The goal of the CMS muon upgrade is to maintain the L1 trigger rate with maximum selection efficiency in order to fully exploit the HL-LHC. The CMS GEM Collaboration has proposed to instrument the vacant highetaregion of the muon end-caps with Gas Electron Multiplier (GEM) detectors, called GE1/1chambers.The Ph.D. subject proposed by the CMS GEM Collaboration aims to demonstrate that the GE1/1technology is the most suitable choice for the upgrade of the muon end-caps. Three main researchprojects were conducted in this context. The first project included the precise measurement of the fundamental characteristics and the detection performance of the triple-GEM detectors produced with the single-mask technique. Those characteristics are essential to ensure that the detectors can operate in the forward region of CMS. The second project was focused on the long-term operation of GE1/1 detectors, in particular the study of the aging phenomenon, which includes all the processes that lead to a significant and permanent degradation of the performance of the detectors. Several aging tests were performed at the CERN irradiation facilities to prove that the GE1/1 chambers can operate during at least 10 yearsat HL-LHC without suffering from performance losses. The excellent properties measured during the R&D phase led to the approval of the GE1/1 project by the CMS Collaboration. The third project, conducted in the framework of the mass production,consisted of developing of the main steps of the Quality Control of the GE1/1 chambers.

Orientador: José Augusto Chinellato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-08-24T07:17:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moreno_ThiagoVictor_M.pdf: 9704369 bytes, checksum: 4998048904230625e6cb929460a8f975 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Neste trabalho o programa CORSIKA foi utilizado para gerar eventos de colisão próton-próton e chuveiros atmosféricos extensos com partícula primária sendo próton ou ferro. Como modelo de interações hadrônicas usou-se o EPOS LHC, QGSJET 01c, QGSJET II-4 e SIBYLL 2,1. As colisões p-p foram simuladas com energia igual a 7 TeV no referencial centro de momenta e foi estudada a distribuição de multiplicidade de hádrons carregados e a densidade em pseudorapidez. Comparando estes observáveis com dados do CMS escolheu-se os modelos que melhor reproduzissem os dados para posteriormente, simular chuveiros atmosféricos extensos. Estes chuveiros foram gerados com partícula primária de energia igual a 1019eV no referencial do laboratório. Observou-se a densidade de múons na altitude do Detetor de Superfície do Observatório de raios cósmicos Pierre Auger. O objetivo é estudar a possibilidade de usar esta densidade para sondar modelos de interações hadrônicas e identificar a partícula primária dos eventos detetados pelo Observatório Pierre Auger / Abstract: In this work CORSIKA program was used to generate events from proton-proton collision and extensive air showers with primary particle being proton or iron. The hadronic interaction models used was EPOS LHC, QGSJET 01c, QGSJET II-4 and SIBYLL 2,1. The p-p collisions were simulated with energy equal to 7 TeV in the center of momenta reference system and the charged hadron multiplicity and the pseudorapidity density was studied. Comparing this with data collected by the CMS detector at the LHC it was chosen the best models to generate air showers. The extensive air showers were generated with primary particle energy equal to 1019 eV in the laboratory frame. It was observed the muon density in the altitude of the Surface Detector of the Pierre Auger Observatory. The objective is to study the possibility of using this density to probe the model and the primary particle of the events detected by the Pierre Auger Observatory / Mestrado / Física / Mestre em Física

Dans ce document deux analyses des propriétés du boson de Higgs se désintégrant en 2 photons dans l'expérience CMS située auprès du LHC (Large Hadron Collider) sont présentées.Le document commence par une introduction théorique sur le Modèle Standard et sur la physique du boson de Higgs, suivie par une description détaillée de l'expérience CMS. En deuxième lieu, les algorithmes de réconstruction et identification des photons sont présentés, avec une attention particulière aux différences entre le premier et le deuxième run du LHC, le premier run (Run1) ayant été pris entre 2010 et 2012 avec une énergie dans le centre de masse de 7 puis 8 TeV, le deuxième (Run2) ayant commencé en 2015 avec une énergie dans le centre de masse de 13 TeV. Les performances des reconstructions du Run 1 et du Run 2 en ce qui concerne l'identification des photons sont comparées. Ensuite l'algorithme d’identification des photons pour l'analyse H->γγ et optimisé pour le Run2 est présenté. Pour ce faire une méthode d'analyse multivariée est utilisée. Les performances de l'identification des photons à 13 TeV sont enfin étudiées et une validation donnée-simulation est effectuée.Ensuite l'analyse H->γγ avec les premières données du Run2 est présentée. Les données utilisées correspondent à une luminosité intégrée de 12.9 fb⁻¹. Une catégorisation des événements est faite, afin de rendre maximale la signification statistique du signal et d’étudier les différents modes de production du boson de Higgs. La signification statistique observée pour le boson de Higgs du Modèle Standard est 1.7 sigma, pour une signification attendue de 2.7 sigma.Enfin une étude de faisabilité ayant pour but de contraindre les couplages anomaux du boson de Higgs aux bosons de jauges est présentée. Pour cette analyse les données à 8 TeV collectées pendant le Run 1 du LHC, correspondant a' une luminosité intégrée de 19.5/fb sont utilisées. Cette analyse exploite la production du boson de Higgs par fusion de bosons-vecteurs (VBF), avec le Higgs se désintégrant ensuite en 2 photons. Les distributions cinématiques des jets et des photons, qui dépendent de l'hypothèse de spin-parité, sont utilisées pour construire des discriminants capables de séparer les différentes hypothèses de spin-parité. Ces discriminants permettent de définir différentes régions de l'espace des phases enrichies en signal de différentes spin-parité. Les différents nombres d’événements de signal sont extraits dans chaque région par un ajustement de la masse invariante diphoton, permettant de déterminer les contributions respectives des différents signaux et permettant ainsi de contraindre la production de boson de Higgs pseudo-scalaire (spin-parité 0-). / In this document two analyses of the properties of the Higgs boson in the diphoton decay channel with the CMS experiment at the LHC (Large Hadron Collider) are presented.The document starts with a theoretical introduction of the Standard Model and the Higgs boson physics, followed by a detailed description of the CMS detector.Then, photon reconstruction and identification algorithms are presented, with a particular focus on the differences between the first and the second run of the LHC, the first run (Run1) took place from 2010 to 2012 with a centre-of-mass energy of 7 and then 8 TeV, while the second run (Run2) started in 2015 with a centre-of-mass energy of 13 TeV. Performances of Run1 and Run2 reconstructions from the photon identification point of view are compared. Then the photon identification algorithm for the H->γγ analysis optimised for Run2 is presented. To do that a multivariate analysis method is used. Performances of the photon identification at 13 TeV are finally studied and a data-simulation validation is performed.Afterwards, the H->γγ analysis using the first Run2 data is presented. The analysis is performed with a dataset corresponding to an integrated luminosity of 2.7/fb. An event classification is performed to maximize signal significance and to studyspecific Higgs boson production modes. The observed significance for the standard model Higgs boson is 1.7 sigma, while a significance of 2.7 sigma is expected.Finally a feasibility study, having the aim of constraining the anomalous couplings of the Higgs boson to the vector bosons, is presented. This analysis is performed using the data collected at 8 TeV during Run1 at the LHC, corresponding to an integrated luminosity of 19.5/fb. This analysis exploits the production of the Higgs boson through vector boson fusion (VBF), with the Higgs decaying to 2 photons. The kinematic distributions of the dijet and diphoton systems, which depend from the spin-parity hypothesis, are used to build some discriminants able to discriminate between different spin-parity hypotheses. These discriminants allow to define different regions of the phase-space enriched with a certain spin-parity process. The Higgs boson signal yield is extracted in each region from a fit to the diphoton mass, allowing to determine the contributions of the different processes and then constrain the production of a pseudo-scalar (spin-parity 0-) Higgs boson.

Dans cette thèse, la mesure des propriétés du boson de Higgs dans le canal de désintégration en deux photons avec l'expérience CMS au Grand Collisionneur de Hadrons (LHC) est présentée. L'objectif de ce travail est l’étude du mode de production associé à une paire de quark top (tṫH). Ce mode représente le seul accès direct au couplage de Yukawa du quark top, un paramètre fondamental du Modèle Standard. Le mode de production tṫH est un processus très rare. Il est de l'ordre de deux ordres de grandeur plus petits que la production principale du boson de Higgs par fusion de gluons. À 13 TeV, le mode de production ttH est environ 4 fois plus grand qu'à 8 TeV. Cette thèse reprend les études réalisées à 8 TeV, où l’échantillon de données ne suffisait pas pour établir une observation de ce mode de production. Bien que le canal en deux photons ne soit pas celui qui présente le plus grand rapport de branchement (seulement 0,2%), il est très prometteur en raison de son excellente résolution en masse (1%). De plus, sa signature est très propre dans le détecteur. Le canal de désintégration en deux photons est particulièrement intéressant puisqu'il s'agit du seul canal permettant l'étude de tous les modes de production : la fusion de gluons, la fusion de bosons vecteurs, les productions associées avec des bosons W ou Z ou avec une paire de quarks top. Le document commence par une introduction théorique du Modèle Standard et la physique du boson de Higgs au LHC, suivie d'une description du détecteur CMS. Pour obtenir une excellente résolution de masse dans le canal de désintégration en deux photons , le calorimètre électromagnétique doit être calibré. Le système de monitorage de la transparence des cristaux du calorimètre électromagnétique de CMS par le système laser joue un rôle important dans la chaîne d'étalonnage et est décrit en détail. Sur le long terme, le système de monitorage laser devra être amélioré car le niveau de rayonnement influence son électronique. Je présente mon travail sur l'amélioration possible du système de monitorage laser, ainsi que l'étude de sa précision possible. L'analyse inclusive H → ᵞᵞ a eu plusieurs itérations pour les conférences en 2016 et 2017. La stratégie pour 2017 est décrite dans ce document. Une classification des événement sert à maximiser la significance du signal et à étudier les modes spécifiques de production du boson de Higgs. Mes contributions à l'analyse H → ᵞᵞ consistent en l'identification du vertex primaire, l'identification du photon et l'étude du mode de production tṫH. Chaque contribution est décrite en détail dans des chapitres dédiés. L'analyse tṫH, H → ᵞᵞ est présentée pour deux itérations en 2016 et 2017, en mettant l'accent sur les améliorations dans l'analyse de 2017. Enfin, les résultats de l'analyse inclusive et tṫH, H → ᵞᵞ, en utilisant l'ensemble complet de données 2016 correspondant à une luminosité intégrée de 35,9 fb-1, sont présentés. / In this thesis, the measurement of the Higgs boson properties in the diphoton decay channel with the CMS experiment at the Large Hadron Collider (LHC) is presented. The focus of this work is the tṫH production mode, as it is the only direct access to the top quark Yukawa coupling, a fundamental parameter of the Standard Model. tṫH is a very rare process, two orders of magnitude smaller than the dominant Higgs boson production by gluon fusion. At 13 TeV, ttH production is about 4 times larger than at 8 TeV. This thesis takes over the studies performed at 8 TeV, where the statistics was not enough for an observation of ttH. Despite a very small branching ratio (only about 0.2%), the two photons decay channel of the Higgs boson is very promising, because of its excellent mass resolution (about 1%). Moreover, its signature in the detector is very clear. The diphoton decay channel is also of particular interest as it is the only channel allowing the study of all production modes: gluon fusion, vector boson fusion, associated productions with a W or a Z bosons, or with a top quark pair.The document starts with a theoretical introduction about the Standard Model and Higgs boson physics at LHC, followed by a description of the CMS detector. To achieve an excellent mass resolution in the H → ᵞᵞ channel, the electromagnetic calorimeter has to be calibrated. The laser monitoring system plays an important role in the calibration chain and it is described in details. On the long term, the laser monitoring system will have to be upgraded as level of radiation influences its electronics. I present my work on the possible upgrade of the laser monitoring system, along with the study of its possible precision.H → ᵞᵞ inclusive analysis had several iterations for conferences in 2016 and 2017. The strategy for 2017 is described in this document. An event classification is used to maximize the signal significance and to study specific Higgs boson production modes. My contributions to the H → ᵞᵞ analysis are primary vertex identification, photon identification and the study of the tṫH production mode. Each contribution is described in details in dedicated chapters. The tṫH, H → ᵞᵞ analysis is shown for two iterations in 2016 and 2017, with the emphasis on improvements in 2017 analysis. Finally, the results of the inclusive and tṫH, H → ᵞᵞ analysis, using the full 2016 dataset corresponding to an integrated luminosity of 35.9 fb-1, are shown.

This masters thesis deals with the Semantic Web, its link to existing Web and the technologies, that produce it. It also deals with its current use in practice, further examines the deployment in web content management systems and proposes semantic extensions for the Kentico CMS.

En difficulté dans un système économique et managérial qui ne leur convient plus, certains cadres choisissent de quitter leur organisation pour devenir coach. Par-delà la normativité des transitions de carrière en sciences de gestion, nous montrons qu’il s’agit d’une bifurcation. Au sein du courant des Critical Management Studies et à partir d’une perspective foucaldienne du pouvoir, nous interprétons la bifurcation comme un processus de saturation lié aux effets de subjectivation de la gouvernementalité managériale. La bifurcation constitue une distanciation critique, notamment chez les jeunes managers et les managers à mi-vie, et amorce une microémancipation vers et par le coaching, via une réappropriation subjective de techniques de souci de soi. Cette recherche est basée sur un protocole de Grounded Theory et sur la méthode des récits de vie. L’attitude analytique mobilise des énoncés phénoménologiques, une thématisation a posteriori et une analyse critique de discours. Notre modèle théorique repose sur une population de 25 cadres devenus coachs et met en évidence un processus générique qui s’exprime différemment selon l’âge lors de la transition, selon le vécu de l’expérience professionnelle, le sexe ou encore le poste avant la transition (manager, consultant). / Some executives, facing an economical and managerial system that doesn’t suit them anymore, chose to leave their position in a structure to become coaches. Beyond the managerial norms of career change, we explain that it is a turning point. This change of career, within the Critical Management Studies movement, and with a Foucauldian power perspective, is interpreted here as them reaching saturation point, due to the effects of subjectivation related to managerial governmentality. Those former executives, especially young and middle-aged managers, find themselves gaining a critical detachment. Furthermore, we notice a phenomenon of microemancipation through being coached … in the training of becoming a coach, by reappropriating the techniques of the care of the self. This research process involves Grounded Theory and life narratives. Firstly, we worked on phenomenological texts, then on an a posteriori coding by themes, and finally on a critical discourse analysis. Our resulting theoretical framework is anchored on a population of 25 former executives who have become coaches. It underlines a generic process with differences related to criteria such as gender, age when the career change happens, previous professional experience and position (manager or consultant).

In adult CMs, ryanodine receptor 2 (RYR2) is an indispensable Ca2+ release channel that ensures the integrity of excitation-contraction (E-C) coupling, which is fundamental for every heartbeat. However, the role and importance of RYR2 during human embryonic cardiac development are still poorly understood. In this study, after the knockout of RYR2 gene (RYR2–/–), induced pluripotent stem cells (iPSCs) were able to differentiate into cardiomyocytes (CMs) with an efficiency similar to control iPSCs (Ctrl-iPSCs); however, the survival of iPSC-CMs was markedly affected by the lack of functional RYR2. While Ctrl-iPSC-CMs exhibited regular Ca2+ handling, significantly reduced frequency and intense abnormalities of Ca2+ transients were observed in RYR2–/–-iPSC-CMs. Ctrl-iPSC-CMs displayed sensitivity to extracellular calcium ([Ca2+]o) and caffeine in a concentration-dependent manner, while RYR2–/–-iPSC-CMs showed inconsistent reactions to [Ca2+]o and were insensitive to caffeine, indicating there is no RYR2-mediated Ca2+ release from the sarcoplasmic reticulum (SR). Instead, the compensatory mechanism for Ca2+ handling in RYR2–/–-iPSC-CMs is partially mediated by the Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP3R). Similar to Ctrl-iPSC-CMs, SR Ca2+ refilling in RYR2–/–-iPSC-CMs is mediated by sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA). Additionally, RYR2–/–-iPSC-CMs showed a decreased beating rate and a reduced L-type Ca2+ current (ICaL) density. These findings demonstrate that RYR2 is not required for CM lineage commitment but is important for CM survival and contractile function. IP3R-mediated Ca2+ release is one of the major compensatory mechanisms for Ca2+ cycling in human CMs with the RYR2 deficiency. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) is a life-threatening inherited arrhythmogenic disorder. RYR2 mutations are the genetic cause of CPVT Type 1. So far, the pathogenic mechanism of how RYR2 mutations remodel cardiac rhythm remains controversial, because all existing hypotheses cannot independently and universally represent the mechanism behind CPVT. Patient-specific iPSCs offer a unique opportunity for CPVT modeling and investigation in vitro. In this study, the effects of four different RYR2 mutations (R420W, A2254C, E4076K, and H4742Y) on cardiac Ca2+ handling were examined individually. The R420W mutation in CPVTa-iPSC-CMs showed no effect on the amplitude of paced Ca2+ transients but led to an increased Ca2+ leak and a decreased SR Ca2+ content. Moreover, CPVTa-iPSC-CMs presented an enhanced sensitivity to [Ca2+]o and caffeine but a lower ICaL density. Compared to Ctrl cells, CPVTb-iPSC-CMs carrying the A2254V mutation displayed Ca2+ transients with smaller amplitude and higher frequency. More importantly, CPVTb-iPSC-CMs showed remarkably severe Ca2+ leak and unaltered SR Ca2+ content. The A2254V mutation also enhanced the sensitivity of iPSC-CMs to [Ca2+]o and caffeine. Interestingly, the ICaL density was found higher in CPVTb-iPSC-CMs. As for the E4076K mutation, it caused a reduction in both amplitude and frequency of Ca2+ transients in CPVTc-iPSC-CMs. In addition, the sensitivity to [Ca2+]o was diminished in CPVTc-iPSC-CMs, while the caffeine sensitivity and ICaL density were not changed. Regarding the H4742Y mutation, it led to a reduction of Ca2+ transient amplitude. In addition, CPVTd-iPSC-CMs manifested unique SR Ca2+ leak, which was resistant to tetracaine, suggesting a conformational remodeling of the H4742Y-mutated RYR2. Furthermore, CPVTd-iPSC-CMs also showed enhanced sensitivity to [Ca2+]o and caffeine, although the ICaL density was comparable to Ctrl-iPSC-CMs. In summary, the A2254V variation presented a typical gain-of-function mutation, rendering the RYR2 hyperactive, while the E4076K variation was identified as a loss-of-function mutation, leading to hypoactive RYR2. R420W and H4742Y mutations did not enhance or suppress the activity of RYR2. However, by destabilizing the N-terminal domain (NTD) of RYR2, the R420W mutation caused Ca2+ leak via the mutant channel, which could be blocked by RYR2 inhibitor. As for the H4742Y mutation, it led to a consistent and inhibitor-resistant Ca2+ leak via RYR2, suggesting a structural remodeling of RYR2 that disturbs complete closure of the channel. These results confirmed the importance of RYR2 on the maintenance of Ca2+ handling and gained evidence for the theory that the underlying mechanisms of CPVT caused by mutations in RYR2 should be mutation-specific rather than unified. This study suggests hiPSC-CMs as a suitable platform for modeling cardiac arrhythmogenic disease, interpreting potential molecular and pathophysiological mechanisms, testing new therapeutic compounds, and guiding mechanism-specific therapy.:Abbreviations V List of figures VIII List of tables X 1 Introduction 1 1.1 Human induced pluripotent stem cells 1 1.1.1 Generation and characteristics of human induced pluripotent stem cells 1 1.1.2 Differentiation of hiPSCs into cardiomyocytes 3 1.1.3 Modeling of inherited cardiac disease with hiPSCs 4 1.2 Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia 7 1.2.1 Clinical characteristics and diagnosis of CPVT 7 1.2.2 Genetic background of CPVT 8 1.2.3 Clinical descriptions of CPVT patients recruited in this study 10 1.2.4 Patient-specific iPSC-CMs recapitulate the phenotypes of CPVT in vitro 10 1.3 Cardiac excitation-contraction coupling 11 1.3.1 Cardiac action potential 12 1.3.2 Ca2+ homeostasis in cardiomyocytes 14 1.3.2.1 Ca2+ influx via L-type Ca2+ channel 14 1.3.2.2 Initiation and termination of SR Ca2+ release 15 1.3.2.3 Ca2+ removal from cytosol 17 1.3.3 Cardiomyocyte contraction 20 1.4 Cardiac ryanodine receptor 21 1.4.1 Distribution and classification of RYRs 22 1.4.2 Regulation of RYR2 23 1.4.2.1 Cytosolic Ca2+ 23 1.4.2.2 Luminal Ca2+ 24 1.4.2.3 Phosphorylation by PKA and CaMKII 25 1.4.2.4 Calmodulin 27 1.4.2.5 Caffeine 27 1.4.3 Pathophysiological mechanisms of CPVT associated with RYR2 mutations 28 2 Aims of this study 33 3 Materials and methods 34 3.1 Materials 34 3.1.1 Cells 34 3.1.2 Laboratory devices and experimental hardware 34 3.1.3 Disposable items 36 3.1.4 Chemicals, solutions, and buffers for physiological and molecular experiment 36 3.1.5 Antibodies 40 3.1.6 Primers 41 3.1.7 Chemicals, media and solutions used for cell culture 42 3.1.8 Software 44 3.2 Methods 44 3.2.1 Cell culture 44 3.2.1.1 Preparation of glass coverslips for cell culture 44 3.2.1.2 Coating of plates and dishes 44 3.2.1.3 Cultivation of iPSCs with feeder-free method 45 3.2.1.4 Cryopreservation and thawing of iPSCs 45 3.2.1.5 Spontaneous differentiation of iPSCs in vitro 45 3.2.1.6 Directed differentiation of iPSCs into cardiomyocytes 46 3.2.1.7 First digestion of iPSC-CMs 46 3.2.1.8 Cryopreservation and thawing of iPSC-CMs 46 3.2.1.9 Time-dependent proliferation analysis of iPSC-CMs 47 3.2.1.10 Second digestion of iPSC-CMs 47 3.2.1.11 Collection of cell pellets for molecular experiment 47 3.2.2 Cell viability assay 48 3.2.3 Gene expression analyses 48 3.2.3.1 RNA isolation 48 3.2.3.2 Reverse transcription reaction 48 3.2.3.3 Polymerase chain reaction 49 3.2.3.4 Agarose gel electrophoresis 49 3.2.4 Protein expression analyses 49 3.2.4.1 Western blot 49 3.2.4.1.1 Lysis of cultured cells 49 3.2.4.1.2 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 50 3.2.4.1.3 Transfer and detection of proteins 50 3.2.4.2 Flow cytometry 51 3.2.4.3 Immunofluorescence staining 51 3.2.5 Calcium imaging 51 3.2.5.1 Measurement of spontaneous Ca2+ transients 52 3.2.5.2 Evaluation of diastolic SR Ca2+ leak and SR Ca2+ content 52 3.2.5.3 Assessment of iPSC-CM sensitivity to [Ca2+]o 53 3.2.5.4 Quantification of iPSC-CM response to caffeine 53 3.2.6 Patch-clamp 53 3.2.6.1 Preparation of agar salt bridge 53 3.2.6.2 Assessment of liquid junction 53 3.2.6.3 Measurement of action potential and L-type calcium current 54 3.2.7 Statistical analysis 54 4 Results 55 4.1 IP3R-mediated SR Ca2+ release partially restores the impaired Ca2+ handling in iPSC-CMs with RYR2 deficiency 55 4.1.1 Loss of RYR2 does not alter the pluripotency of RYR2–/–-iPSCs 55 4.1.2 Loss of RYR2 leads to increased death of RYR2–/–-iPSC-CMs 56 4.1.3 Loss of RYR2 does not affect the expression of IP3R in iPSC-CMs 58 4.1.4 RYR2–/–-iPSC-CMs show abnormal Ca2+ transients 60 4.1.5 The sensitivity of RYR2–/–-iPSC-CMs to [Ca2+]o and caffeine is changed 62 4.1.6 IP3R is critical for the generation Ca2+ transients in RYR2–/–-iPSC-CMs 63 4.1.7 SERCA-mediated SR Ca2+ uptake is crucial for the Ca2+ handling in both Ctrl- and RYR2–/–-iPSC-CMs 65 4.1.8 RYR2–/–-iPSC-CMs display abnormal action potentials 66 4.2 Investigation of the impaired function of RYR2 in CPVTa-iPSC-CMs 69 4.2.1 The R420W mutation leads to increased SR Ca2+ leak and decreased SR Ca2+ content 69 4.2.2 The R420W mutation leads to an enhanced sensitivity of iPSC-CMs to [Ca2+]o 70 4.2.3 CPVTa-iPSC-CMs shows increased sensitivity to caffeine 71 4.2.4 CPVTa-iPSC-CMs show reduced ICaL density 72 4.3 Investigation of the impaired function of RYR2 in CPVTb-iPSC-CMs 74 4.3.1 CPVTb-iPSC-CMs show abnormal Ca2+ transients 74 4.3.2 The A2254V mutation intensifies the SR Ca2+ leak in iPSC-CMs 75 4.3.3 The A2254V mutation enhances the sensitivity of iPSC-CMs to [Ca2+]o 76 4.3.4 The A2254V mutation increases the sensitivity of iPSC-CMs to caffeine 78 4.3.5 CPVTb-iPSC-CMs show increased ICaL density 78 4.4 Investigation of the impaired function of RYR2 in CPVTc-iPSC-CMs 79 4.4.1 CPVTc-iPSC-CMs show abnormal Ca2+ transients 79 4.4.2 The E4076K mutation shows no effect on the SR Ca2+ leak and content 80 4.4.3 The E4076K mutation diminishes the sensitivity of iPSC-CMs to [Ca2+]o 81 4.4.4 The E4076K mutation shows almost no effect on the response of iPSC-CMs to caffeine 82 4.4.5 The E4076K mutation does not alter the ICaL density in iPSC-CMs 83 4.5 Investigation of the impaired function of RYR2 in CPVTd-iPSC-CMs 84 4.5.1 CPVTd-iPSC-CMs show abnormal Ca2+ transients 84 4.5.2 The H4742Y mutation leads to a tetracaine-resistant Ca2+ leak in iPSC-CMs 84 4.5.3 The H4742Y mutation improves the sensitivity of iPSC-CMs to [Ca2+]o 86 4.5.4 The H4742Y mutation enhances the response of iPSC-CMs to caffeine 87 4.5.5 The H4742Y mutation alters the gating properties of LTCC in iPSC-CMs 88 5 Discussion 90 5.1 IP3R-mediated compensatory mechanism for Ca2+ handling in iPSC-CMs with RYR2 deficiency 90 5.2 Pathophysiological mechanisms of RYR2 mutation-related CPVT are mutation-specific 93 5.2.1 Dysfunctional Ca2+ handling caused by RYR2-R420W mutation 94 5.2.2 Dysfunctional Ca2+ handling caused by RYR2-A2254V mutation 96 5.2.3 Dysfunctional Ca2+ handling caused by RYR2-E4076K mutation 99 5.2.4 Dysfunctional Ca2+ handling caused by RYR2-H4742Y mutation 101 5.3 Conclusions and future perspectives 104 6 Summary 106 7 Zusammenfassung 108 8 References 111 9 Acknowledgements 131 10 Declaration 132