La méthode de conception de médicaments à partir de molécules « fragments » (connue sous le nom de « Fragment-Based Drug Design ») a été proposée au milieu des années 90, et a depuis été reconnue comme une alternative tangible aux techniques plus classiques de recherche de médicaments telles que le criblage à haut débit par exemple. La méthode des fragments consiste à cribler un petit nombre (< 10000) de composés organiques de faible poids moléculaire (< 300 Da) afin de détecter ceux qui se lient à la cible (protéine ou acides nucléiques). Du fait de leur faible complexité, les fragments présentent une affinité faible pour la cible, et la détection s'effectue généralement grâce à une technique biophysique (en particulier, résonance magnétique nucléaire (RMN), cristallographie aux rayons X, résonance plasmonique de surface). Les fragments « hits » sont ensuite modifiés par addition de nouvelles fonctions chimiques, ou par liaison de deux fragments, afin d'élaborer, étape par étape, une molécule capable d'établir des interactions plus nombreuses avec la cible, et d'améliorer ainsi l'affinité. Comparée aux méthodes classiques de criblage haut débit, la méthode des fragments offre divers avantages, notamment une meilleure exploration de l'espace chimique, une meilleure efficacité de liaison des molécules « hits », et une plus grande facilité d'optimisation des hits en molécules plus affines. Dans le cadre de ce projet de thèse, plusieurs aspects de la méthode des fragments ont été abordés : dans une première partie, nous étudions un cas concret d'application de la méthode des fragments à la recherche d'un inhibiteur de la peroxiredoxine 5 humaine, en utilisant la RMN comme outil de criblage des fragments ainsi que comme outil d'étude des interactions protéine-fragment. La découverte d'un inhibiteur de cette enzyme représente une avancée importante, qui devrait permettre de mieux comprendre son fonctionnement. Les autres parties de ce projet de thèse abordent des aspects plus méthodologiques de la méthode des fragments : les fragments conservent-ils leur site de liaison, leur efficacité de liaison et leur mode d'interaction au cours de leur élaboration en inhibiteur ? Les fragments peuvent-ils être spécifiques d'une protéine ? D'un site de liaison particulier ? Ces questions, rarement traitées, sont pourtant essentielles à la compréhension du comportement des molécules fragments, et sont abordées d'une part en défragmentant plusieurs inhibiteurs de la protéine Bcl-xL et en étudiant par RMN le comportement de ces fragments vis-à-vis de la protéine en termes d'affinité et de site de liaison, d'autre part en réalisant le criblage par RMN d'une série de fragments sur cinq protéines différentes (peroxiredoxine 5 humaine, sérum albumine humaine et trois protéines homologues de la famille Bcl-2). De manière générale, ce projet de thèse vise à étudier des aspects peu abordés de la méthode des fragments et à proposer des pistes permettant de mieux comprendre le comportement des fragments vis-à-vis de leur cible, au cours du criblage initial comme lors de leur optimisation / Fragment-Based Drug Design (FBDD) has been proposed in 1996 and has since been recognized as a tangible alternative to the more classical drug discovery methods such as High-Throuput Screening. FBDD consists of screening a small number (< 10 000) of low-molecular weight (< 300 Da) compounds and detect those that bind to the target (protein or nucleic acids). Because of their low complexity, fragment molecules usually display low affinities for their target, hence detecting fragment-protein interactions is mostly achieved using a biophysical technique (mostly Nuclear Magnetic Resonance (NMR), X-ray crystallography or Surface Plasmon Resonance). “Hit” fragments are then modified by addition of chemical substituents, or linked together, so as to elaborate a more complex molecule, forming more interactions with the target and hence displaying an improved affinity. As compared to the more classical High Throughput Screening method, fragment screening provides several advantages, including a better exploration of chemical space, highly ligand-efficient hits and easier optimization of the hits into more affine molecules. In this PhD project, several aspects of FDBB have been addressed : first, FBDD approaches were applied to the research of an inhibitor of the human peroxiredoxin 5 protein, using NMR not only as a screening method but also for the characterization of the protein-fragment interactions. The discovery of an inhibitor against this enzyme would allow to better understand its function. Next, methodological aspects of the FBDD method were addressed : Do fragments conserve their binding site, binding efficiency and mode of interaction upon optimization? Can the fragments display specificity towards a given target? Towards a given binding site? These issues, rarely studied, are yet essential to the understanding of the behavior of fragment molecules, and will be addressed firstly by defragmentating several Bcl-xL inhibitors into fragments and studying their behavior towards the protein in terms of a_nity and binding mode, secondly by screening a set of fragments against five different proteins (human peroxiredoxin 5, human serum albumin and three homologous proteins of the Bcl-2 family of proteins). More generally, this PhD project aims at studying less characterized aspects of the fragment methodology and proposing answers to better understand the behavior of fragment molecules towards their targets, both in the initial screening step and then during their optimization

La maturation de nombreuses protéines requiert une voire plusieurs modification(s) post-traductionnelle(s). Environ 60 oncoprotéines (Ras, Rheb, RhoB, CENP-E, -F) sont activées par une série de modifications post-traductionnelles incluant la prénylation, la protéolyse et la carboxyméthylation. La prénylation est l'ajout d'un groupement isoprénoïde sur le résidu cystéinyle localisé au niveau de la séquence C-terminale tétrapeptidique appelée "boîte CA1A2X" (A1A2: deux acides aminés aliphatiques; X: une méthionine ou une sérine pour la FTase et une leucine ou une isoleucine pour la GGTase-I). Cette réaction est catalysée par une métaloenzyme à zinc, la farnésyltransférase (C15) (FTase) ou la géranylgéranyltransférase (C20) (GGTase-I). La farnésylation apporte l'hydrophobie suffisante pour la localisation cellulaire adéquate de protéines suractivées dans certaines pathologies comme le cancer. Ce disfonctionnement peut être induit soit directement par mutation de la protéine farnésylée soit indirectement par mutation d'un activateur ou inactivateur de la protéine farnésylée. D'intenses études se sont donc focalisées pour concevoir des inhibiteurs de farnésyltransférase (FTis).<br />Actuellement, trois composés, avec une inhibition sélective de la FTase vis-à-vis de la GGTase-I, sont en essais cliniques. Une étude sur des lignées cellulaires cancéreuses a montré que plus de 70% de ces lignées sont sensibles aux FTis, mais leur mécanisme d'action exact reste encore inconnu. Une connaissance précise du nombre de protéines farnésylées et l'élucidation des conséquences de leur farnésylation faciliteraient la découverte de ce mécanisme. Cependant, l'excellente efficacité et la faible toxicité systémique sur des modèles précliniques animaux des FTis présentent ces inhibiteurs comme agents prometteurs dans la thérapie anti-cancéreuse.<br />Une des stratégies pour inhiber cette enzyme consiste à concevoir des peptidomimétiques de la "boîte CA1A2X". La connaissance de la FTase a permis le passage des FTis peptidomimétiques contenant des thiols à des molécules sans thiol, non-peptidiques, pouvant ou ne pouvant pas interagir avec l'atome de zinc. Sur la base de ce modèle et d'études de modélisation moléculaire, nous avons conçu trois séries de composés, dans lesquelles le chélateur de zinc, le 1-(4-cyanobenzyl)-5-méthylimidazole, est constant :<br />- une série dans laquelle l'espaceur est la 4-aminopipéridine-2-carboxylate de méthyle où la partie hydrophobe est substituée,<br />- deux séries où l'espaceur est le 1,4-diazépane substituté ou non par un phényle et dans lesquelles la partie hydrophobe est l'élément de modulation.<br />Les évaluations enzymatique et cellulaire (DU145 et PC3) des composés synthétisés nous ont permis de compléter les relations structure-activité, permettant ainsi de proposer de nouvelles structures. Les protéines associées aux centromères, CENP-E et CENP-F, sont des cibles pertinentes des FTis, puisque leur association fonctionnelle avec le fuseau mitotique nécessite une farnesylation. Nous avons également souhaité évaluer quelques FTis sélectionnés pour leur effet sur les CENP.

Les biotechnologies sont arrivées au point ou la quantité d'information disponible permet de penser les objets biologiques comme des systèmes complexes. Dans ce contexte, les phénomènes qui émergent de ces systèmes sont intimement liés aux spécificités de leur organisation. Cela pose des problèmes computationnels et statistiques qui sont précisément l'objet d'étude de la communauté liée à l'apprentissage statistique. Cette thèse traite d'applications de méthodes d'apprentissage pour l'étude de phénomène biologique dans une perspective de système complexe. Ces méthodes sont appliquées dans le cadre de l'analyse d'interactions protéine-ligand et d'effets secondaires, du phenotypage de populations de cellules et du plan d'expérience pour des systèmes dynamiques non linéaires partiellement observés.D'importantes quantités de données sont désormais disponibles concernant les molécules mises sur le marché, tels que les profils d'interactions protéiques et d'effets secondaires. Cela pose le problème d'intégrer ces données et de trouver une forme de structure sous tendant ces observations à grandes échelles. Nous appliquons des méthodes récentes d'apprentissage non supervisé à l'analyse d'importants jeux de données sur des médicaments. Des exemples illustrent la pertinence de l'information extraite qui est ensuite validée dans un contexte de prédiction.Les variations de réponses à un traitement entre différents individus posent le problème de définir l'effet d'un stimulus à l'échelle d'une population d'individus. Par exemple, dans le contexte de la microscopie à haut débit, une population de cellules est exposée à différents stimuli. Les variations d'une cellule à l'autre rendent la comparaison de différents traitement non triviale. Un modèle génératif est proposé pour attaquer ce problème et ses propriétés sont étudiées sur la base de données expérimentales.A l'échelle moléculaire, des comportements complexes émergent de cascades d'interactions non linéaires entre différentes espèces moléculaires. Ces non linéarités engendrent des problèmes d'identifiabilité du système. Elles peuvent cependant être contournées par des plans expérimentaux spécifiques, un des champs de recherche de la biologie des systèmes. Une stratégie Bayésienne itérative de plan expérimental est proposée est des résultats numériques basés sur des simulations in silico d'un réseau biologique sont présentées.

Les méthodes de criblage virtuel sont largement utilisées dans le processus de conception de médicaments afin de réduire le nombre de composés à tester expérimentalement. Cependant, les résultats obtenus par criblage virtuel ne sont que des prédictions et leur fiabilité n'est pas garantie. L'évaluation de ces méthodes est donc essentielle pour guider le bioinformaticien dans le choix de l'outil et du protocol adaptés dans les conditions de son expérience. Dans une première étude, nous avons développé une nouvelle métrique pour l'analyse des résultats de criblage : la Courbe de Prédictivité. Cette métrique permet une analyse fine de la pertinence des scores d'affinité pour la détection de composés actifs et complète les métriques existantes, permettant une meilleure compréhension des résultats de criblage. Lors de notre projet suivant, nous avons souhaité faciliter ce processus d'analyse en intégrant l'ensemble des métriques de criblage virtuel dans un outil web interactif : Screening Explorer. Une seconde partie de ma thèse a consisté en la recherche de nouveaux inhibiteurs du VIH (Virus de l’Immunodéficience Humaine). L'équipe génomique de notre laboratoire a identifié plusieurs gènes dont l'expression influence le développement du SIDA, révèlant ainsi de potentielles cibles thérapeutiques. Une étude bibliographique a permis d'identifier plusieurs composés inhibiteurs de ces cibles. La société Peptinov, associée à notre laboratoire, va prochainement estimer le potentiel thérapeutique de ces composés dans des essais in vitro (i) d'infection par le VIH, (ii) de prolifération virale et (iii) de réactivation virale. / Virtual screening methods are widely used in drug discovery processes in order to reduce the number of compounds to test experimentally. However, virtual screening results are only predictions and their reliability is not guaranteed. Evaluating these methods is crucial to guide the bioinformatician in the choice of the right tool and protocol according to the conditions of his experiment. In a first study, we developed a new metric to analyze the results of virtual screening: the Predictiveness Curve. This metric allows to finely analyze the relevance of binding scores for the detection of active compounds and complete existing metrics, allowing a better comprehension of screening results. In a following project, we facilitated the analysis process by integrating all of the virtuel screening metrics in an interactive tool: Screening Explorer. The second part of my thesis consisted in the research of novel HIV inhibitors. The genomic team of our laboratory identified several genes whose expression influence the development of AIDS, therefore revealing potential therapeutic targets. A bibliographic study allowed to identify compounds that can inhibit those targets. The company Peptinov, associated to our laboratory, is currently estimating the therapeutic potential of the compounds in vitro in assays of (i) HIV infection, (ii) viral proliferation and (iii) viral reactivation.

La conception de médicaments est un long processus complexe impliquant de nombreuses disciplines différentes. Entre la découverte de la touche (molécule active initiale) puis de la tête de série (molécule optimisée), jusqu’à la mise sur le marché du produit fini (médicament), il s’écoule en général une dizaine d’année, pour un coût avoisinant le milliard d’euros. Afin d’optimiser ce processus, de nombreuses approches sont développées pour identifier plus rapidement les molécules les plus prometteuses pour une cible thérapeutique donnée. Les protéines kinases (PK) jouent un rôle majeur dans la signalisation moléculaire et dans les mécanismes cellulaires. La dérégulation d’une PK peut engendrer des pathologies graves telles que des maladies neurodégénératives ou le cancer ; la conception d’inhibiteurs de PK (PKI) est ainsi un domaine de recherche thérapeutique extrêmement actif. Dans ce manuscrit de thèse, deux approches de chémoinformatique complémentaires sont explorées pour l’identification de nouveaux PKI. Tout d’abord, un criblage virtuel de produits naturels a été réalisé dans un contexte de recherche de molécules bioactives à finalité cosmétique ou thérapeutique. Pour ce travail, il a d’abord été nécessaire de développer un outil in silico de préparation de molécules, VSPrep, qui s’appuie sur des outils gratuits pour les chercheurs académiques. Enfin, un nouvel outil de conception de molécules bioactives à partir de fragments moléculaires (FBDD) a également été développé. L’implémentation de cet outil, Frags2Drugs, ainsi que sa validation dans des projets FBDD sont décrites dans ce manuscrit. / Drug design is a long and complex multidisciplinary process. From the discovery of the initial hit (bioactive molecule), to the lead (optimized compound), and finally to the commercialization of the end product (drug), almost 10 years are necessary and this process costs an average of $1 billion dollars. In order to optimize this process, new methods are relentlessly developed so that novel promising molecules might be identified faster for a given target. Protein kinases (PK) play a central role in most molecular pathways and are essential to control cellular mechanisms. The mutation of one PK can lead to severe pathologies such as neurodegenerative diseases or cancer, making the research of PK inhibitors (PKI) an intense area of therapeutic research. In this manuscript, two complementary chemoinformatics approaches are discussed for identifying PKI, and both depend on the preparation of small molecules (ligands). For this specific task, a new workflow protocol, VSPrep, was developed using only freely available tools for academics. First, a virtual screening approach of natural products was performed in order to identify bioactive molecules for cosmetics or therapeutic applications. Second, a novel in silico Fragment-Based Drug Discovery (FBDD) tool, Frags2Drugs, was developed specifically for kinase research. It combines molecular fragments derived from PKI into novel inhibitors bound to specific protein kinases. The tool was validated on several internal kinase projects leading to novel protein kinase inhibitors with acceptable drug-like properties.

Les biotechnologies sont arrivées au point ou la quantité d'information disponible permet de penser les objets biologiques comme des systèmes complexes. Dans ce contexte, les phénomènes qui émergent de ces systèmes sont intimement liés aux spécificités de leur organisation. Cela pose des problèmes computationnels et statistiques qui sont précisément l'objet d'étude de la communauté liée à l'apprentissage statistique. Cette thèse traite d'applications de méthodes d'apprentissage pour l'étude de phénomène biologique dans une perspective de système complexe. Ces méthodes sont appliquées dans le cadre de l'analyse d'interactions protéine-ligand et d'effets secondaires, du phenotypage de populations de cellules et du plan d'expérience pour des systèmes dynamiques non linéaires partiellement observés.D'importantes quantités de données sont désormais disponibles concernant les molécules mises sur le marché, tels que les profils d'interactions protéiques et d'effets secondaires. Cela pose le problème d'intégrer ces données et de trouver une forme de structure sous tendant ces observations à grandes échelles. Nous appliquons des méthodes récentes d'apprentissage non supervisé à l'analyse d'importants jeux de données sur des médicaments. Des exemples illustrent la pertinence de l'information extraite qui est ensuite validée dans un contexte de prédiction.Les variations de réponses à un traitement entre différents individus posent le problème de définir l'effet d'un stimulus à l'échelle d'une population d'individus. Par exemple, dans le contexte de la microscopie à haut débit, une population de cellules est exposée à différents stimuli. Les variations d'une cellule à l'autre rendent la comparaison de différents traitement non triviale. Un modèle génératif est proposé pour attaquer ce problème et ses propriétés sont étudiées sur la base de données expérimentales.A l'échelle moléculaire, des comportements complexes émergent de cascades d'interactions non linéaires entre différentes espèces moléculaires. Ces non linéarités engendrent des problèmes d'identifiabilité du système. Elles peuvent cependant être contournées par des plans expérimentaux spécifiques, un des champs de recherche de la biologie des systèmes. Une stratégie Bayésienne itérative de plan expérimental est proposée est des résultats numériques basés sur des simulations in silico d'un réseau biologique sont présentées. / Biotechnologies came to an era where the amount of information one has access to allows to think about biological objects as complex systems. In this context, the phenomena emerging from those systems are tightly linked to their organizational properties. This raises computational and statistical challenges which are precisely the focus of study of the machine learning community. This thesis is about applications of machine learning methods to study biological phenomena from a complex systems viewpoint. We apply machine learning methods in the context of protein-ligand interaction and side effect analysis, cell population phenotyping and experimental design for partially observed non linear dynamical systems.Large amount of data is available about marketed molecules, such as protein target interaction profiles and side effect profiles. This raises the issue of making sense of this data and finding structure and patterns that underlie these observations at a large scale. We apply recent unsupervised learning methods to the analysis of large datasets of marketed drugs. Examples show the relevance of extracted information which is further validated in a prediction context.The variability of the response to a treatment between different individuals poses the challenge of defining the effect of this stimulus at the level of a population of individuals. For example in the context High Content Screening, a population of cells is exposed to different stimuli. Between cell variability within a population renders the comparison of different treatments difficult. A generative model is proposed to overcome this issue and properties of the model are investigated based on experimental data.At the molecular scale, complex behaviour emerge from cascades of non linear interaction between molecular species. These non linearities leads to system identifiability issues. These can be overcome by specific experimental plan, one of the field of research in systems biology. A Bayesian iterative experimental design strategy is proposed and numerical results based on in silico biological network simulations are presented.

Le cancer représente l'un des problèmes majeurs en santé publique. Jusqu'à présent, en parallèle de l'intervention chirurgical, plusieurs traitements ont été mis au point et largement utilisés en thérapie clinique telles que les chimiothérapies. Cependant, leur efficacité est parfois limitée et couplée à des effets secondaires très néfastes, laissant les patients dans une impasse thérapeutique. Par conséquent, de nouvelles approches thérapeutiques doivent être développées sur de nouvelles cibles avérées en oncologie afin d'apporter des soins personnalisés aux patients. La première partie de mon travail de thèse a été dédiée à la compréhension des mécanismes moléculaires de la nucléotidase cytosolique de type II (cN-II), une enzyme du métabolisme des purines dont l'implication dans des phénomènes de résistance à des traitements anticancéreux a pu être démontrée. Aussi, une étude sur la cinétique enzymatique à l'état pré-stationnaire et stationnaire a été entreprise sur la forme sauvage et une forme mutée de l'enzyme lui conférant une activité accrue fortement impliquée dans les cas de résistance. Par cette approche, il a été possible de décortiquer le mécanisme cinétique, de définir l'étape cinétiquement limitant afin d'identifier les intermédiaires prépondérants de la réaction pouvant être ciblés pour le développement de nouveaux inhibiteurs. Cette étude cinétique est présentée dans ce premier volet de la thèse. En second lieu, mon travail s'est focalisée sur un second membre de cette famille d'enzyme qui est l'ecto-5'-nucléotidase (CD73). Cette enzyme exprimée sous forme dimérique à la surface extracellulaire régule la concentration en adénosine extracellulaire (par hydrolyse de l'adénosine monophosphate), ce dernier étant un puissant immunosuppresseur de la réponse immune anticancéreuse. L'objectif de mon travail de thèse a été de développer de nouveaux inhibiteurs de type allostérique en utilisant une approche basée sur la structure tridimensionnelle et la dynamique moléculaire. Une des étapes clés a été tout d'abord de mettre au point un système expression hétérologue afin d'obtenir l'enzyme recombinante en quantité suffisante pour les études enzymatiques ultérieures. Différents systèmes d'expression ont été testés et seul le système en cellules d'insecte infectées par le baculovirus a permis d'obtenir l'enzyme active en grande quantité. En parallèle, une étude in silico a permis de reproduire la dynamique fonctionnelle de l'enzyme requise pour sa fonction. A partir de ses données, un criblage virtuel d'une chimiothèque de 324 000 molécules a été réalisé sur le site de dimérisation et a permis d'identifier 33 composés chefs de files. Parmi, ces composés, dix molécules se sont avérés être de puissants inhibiteurs de CD73 (Ki < 1 µM) avec un mécanisme d'inhibition de type allostérique ou non-compétitif. La cytotoxicité des composés a été évaluée sur des lignées cellulaires transformées ou tumorales montrant un effet uniquement à des concentrations très élevées (supérieures à 100 µM). L'étude des relations structure-fonction devrait permettre à présent de proposer de voies d'optimisation afin d'améliorer l'efficacité des composés les plus actifs afin d'aboutir à de nouveaux candidats médicaments. / Cancer burden still remains a major worldwide health problem. To date, several types of conventional anticancer treatments are widely used in clinical. However, the alternative effects of these treatments often leave patients impaired. Therefore, it is required to understand the unique medical needs of individual patients and to conduct effective, high–quality research focusing on the not yet identified oncotargets.The first part of my thesis is dedicated to decipher molecular basis of cN-II reaction. This study characterizes the steady state and transient state kinetics of cN-II wild type and hyperactive mutant which involved in cancer treatment resistance. Furthermore, the characterization of the rate-limiting step and reaction intermediates gave insights into the binding mechanisms and the development of small molecules inhibitors of cN-II.In the second part of this work, we aimed to investigate allosteric inhibitors of CD73 using structure-based drug design approach. In this study the suitable protein expression system was established for the production of sufficient quantities of fully active CD73. This work followed by in silico studies, including molecular dynamics, virtual screening, and hits identification and in vitro hits validations and kinetics characterizations. The cytotoxicity of the most powerful inhibitors exhibited on different cell types was determined. SAR studies gave insights into the binding mode of best compounds and function.

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