O objetivo deste trabalho foi avaliar o selamento apical em 7 e 30 dias de, obturações de canais radiculares com a técnica de cone único utilizando 4 cimentos endodônticos, AH Plus, MTA Fillapex, cimento Portland, e cimento experimental Sealepox, por meio do sistema de infiltração de fluidos FLODEC, e a qualidade de obturação, em microscopia confocal a laser, analisando o perímetro de penetração dos cimentos nos túbulos dentinários, e a porcentagem de fendas na interface cimento/dentina, e por meio de estereomicroscopia, a porcentagem de cimento, guta-percha e espaços vazios a 2,4 e 6mm do ápice radicular, dos cimentos. Sessenta e oito dentes unirradiculados, com canais únicos tiveram seus canais instrumentados e, então, obturados com os cimentos, previamente corados com Rodamina B. As amostras foram conservadas em meio úmido a 37º de temperatura. Após 7 dias, os dentes foram adaptados para os testes de infiltração de fluidos, fazendo-se as leituras durante 12 minutos constantes, para todos os espécimes. Trinta dias depois, as leituras foram realizadas novamente com os mesmos parâmetros anteriores. Todos os espécimes foram cortados em secções de 2mm de espessura nos níveis de 2,4 e 6mm do ápice radicular. Mediante estereomicroscopia, foram calculadas as porcentagens de cimento, guta-percha e espaços vazios, e em microscopia confocal, as porcentagens de fendas e o perímetro de penetração dos cimentos no interior dos túbulos dentinários, em todas as secções. Os resultados obtidos mostraram que, todos os cimentos permitiram a infiltração de fluidos em 7 dias, sendo que, o MTA Fillapex exibiu, significativamente, menor infiltração que os cimentos AH Plus e Portland. Em 30 dias não houve diferenças estatísticas entre os cimentos. Nas avaliações em microscopia confocal, observou-se a presença de fendas na interface dentina/cimento em todas as secções avaliadas. À estereomicroscopia observaram-se espaços vazios em todas as secções, bem como, variações nas porcentagens de cimento e guta-percha. / The aim of this study was to evaluate sealing-ability at 7 and 30 days of root canal obturations using a single cone obturation technique of 4 endodontic sealers, AH Plus, Mta Fillapex, Portland Cement and a experimental sealer Sealepox, using a fluid filtration recording device (FLODEC), to evaluate the obturation quality using confocal laser microscopy analyzing interfacial adaptation of sealer/dentin interface, perimeter of sealer penetration into dentinal tubules, and using stereomicroscopy, the percentage of sealer, guta-percha and voids at 2, 4 and 6mm from de apex. Sixtyeight single rooted teeth with one canal were instrumented and then, obturated, with the sealers, in which, Rodamine B was previously added. Samples were stored in 100% humidity and at 37º temperature. After 7 days, all the specimens were submitted to microleakage tests for a 12-minute period. Mta Fillapex showed the lowest leakage percentage when compared with AH Plus and Portland cement. 30 days after the first test, microleakage evaluations were repeated, and the results showed no statistical differences. Then, all samples were cut horizontally of 2mm of thickness at 2,4,6mm from the apex. Using estereomicrocopy, percentage of sealer, guta-percha and voids were measured, and using confocal laser microscopy percentages of interfacial adaptation and perimeter of sealer penetration into dentinal tubules were calculated. According to the results it was concluded that all sealers permitted fluid filtration at 7 and 30 days, being that, at 7 days, MTA Fillapex exhibited significantly, less fluid filtration than AH Plus and Portland Cement. At 30 days, no statistically differences were found. On confocal evaluations, it was observed the presence of gaps at the sealer/dentin interface in all evaluated sections. Stereomicroscopy assessments showed voids in all sections and as well variations on sealer and guta-percha percentages.

Objective: The objective of this study was to evaluate the bond strength of fiberglass posts (Exacto N° 2 ®) cemented with resin cement (RC) and resin modified glass ionomer cement (RMGI), with and without ultrasonic activation in the root canal of bovine teeth. The penetration of the cements into dentine tubules was also assessed. Methods: Forty bovine incisors were selected and endodontically treated, and then divided into 4 groups (n = 10). Fiberglass posts were cemented with RC and RMGI and activated with an ultrasound insert in 2 groups; the other two groups received no ultrasonic activation. After 1 week of cementation, the roots were sectioned into 9 slices of approximately 1,5 mm each. Confocal microscopy and push-out test were performed, and all specimens were subjected to 200x magnification optical microscopy for mode of failure evaluation. Statistical analysis was done with three-way ANOVA, followed by the Fishers test ( = 0.05). Results: There was no difference among the root thirds in the RMGI group while a difference was found among the thirds in the RC group. In addition, the bond strength of the RC group was higher than the RMGI group, in all thirds. The RC also showed a greater penetration than the RMGI, in all thirds, with and without activation. The ultrasound activation caused a greater penetration only in the cervical and middle thirds in the RMGI group, and in the middle third of the RC group. Conclusion: The RC presented higher bond strength and penetration compared to the RMGI and ultrasonic activation improved the penetration of the RMGI cement in the middle and cervical root thirds and of the RC in the middle root third. A significant correlation between bond strength and penetration was verified in all groups. Clinical relevance: Ultrasound can promote a better penetration of resin cements used in fiberglass post cementation, reaching the most difficult anatomical areas in the root canal. / Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar a resistência de união de pinos de fibra de vidro (Exacto N°2 ) com e sem ativação ultrassônica, associado a dois materiais: cimento resinoso (CR) e cimento ionomerico modificado com resina (CIMR), nos terços radiculares através de teste push-out e de Microscopia Confocal para avaliar a penetração dos cimentos. Métodos: Quarenta incisivos bovinos foram selecionados e tratados endodonticamente, depois divididos em 4 grupos (n=10): em dois grupos os pinos de fibra de vidro foram cimentados com CR e CIMR, e ativados com um inserto de ultrassom; nos outros dois grupos não foi realizada ativação ultrassônica. Após 1 semana da cimentação, as raízes foram seccionadas em 9 fatias de aproximadamente 1,5 mm cada. A microscopia confocal e o teste push-out foi realizado, e todos os espécimes foram submetidos a microscopia óptica com 200 vezes de aumento para avaliação do módulo de falha. Os valores de resistência de união (RU) foram submetidos a ANOVA a três critérios, seguido de Fisher ( = 0.05). Resultados. Os resultados deste estudo em relação a resistência de união, mostrou que não houve diferença entre os terços no CIMR e houve diferença entre os terços no cimento CR, além disso os valores de resistência de união dos espécimes do cimento CR foram acima dos espécimes do cimento CIMR e essa diferença se repete para todos os terços. Com relação a penetração na comparação dos materiais, o CR mostrou sempre apresentar uma penetração maior do que o cimento CIMR, em todos os terços com e sem ativação. Com relação a ativação verificou-se que a ativação com o ultrassom apresentou maior penetração somente no terço cervical e médio no cimento CIMR, e no CR no terço médio. Conclusão: O CR apresentou melhor resistência de união e penetração, em comparação com o cimento CIMR e que a ativação com ultrassom melhorou a penetração do terço médio e cervical no cimento CIMR e Terço médio no cimento CR além de isso tem uma correlação importante que a maior área de penetração maior resistência de união. Relevância Clínica: o uso do ultrassom pode promover uma melhor penetração dos cimentos resinosos para a cimentação de pinos fibras de vidro intracanal, alcançando as áreas anatômicas mais difíceis dentro do canal radicular.

O aumento da resistência aos antifúngicos convencionais e os possíveis efeitos colaterais destes fármacos têm estimulado pesquisas sobre produtos naturais com potencial antimicrobiano e baixa toxicidade. Assim, o objetivo desta pesquisa foi realizar uma avaliação clínica e laboratorial do tratamento da estomatite protética (EP) através de produtos naturais, por meio de cultura micológica quantitativa, de microscopia confocal e de análise das propriedades superficiais de uma resina acrílica. Em todas as avaliações, os grupos experimentais foram divididos de acordo com as seguintes substâncias: G1 - água destilada estéril; G2 - nistatina; G3 - extrato alcoólico de própolis a 20%; G4 - gel de Punica granatum Linné; G5 - gel de Uncaria tomentosa (Imuno-Max Gel). Para a cultura micológica quantitativa, 30 pacientes diagnosticados com EP utilizaram os seus respectivos medicamentos três vezes por dia, durante 14 dias, associados à escovação das próteses com dentifrício. Nas avaliações, foram coletados materiais das áreas eritematosas da mucosa palatina e das áreas correspondentes na prótese total superior. Este procedimento foi realizado antes do tratamento (T0), após 14 dias do início do tratamento (T1) e 30 dias após a suspensão do uso dos medicamentos (T2). Os dados obtidos foram submetidos ao teste não-paramétrico de Friedman para comparações intragrupos e ao teste de Kruskal-Wallis para comparações intergrupos. Para análise através de microscopia confocal, 30 espécimes de uma resina acrílica termopolimerizável foram inoculados com C. albicans para a formação do biofilme e, em seguida, imersos em sua respectiva droga. Os biofilmes remanescentes sobre os espécimes foram corados através de fluorocromos indicadores de viabilidade celular. Os dados obtidos foram analisados através do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis e do pós-teste de comparação múltipla de Dunn. Para análise das propriedades superficiais, 50 espécimes de uma resina acrílica termopolimerizável foram fabricados, polidos e testados para a verificação inicial da rugosidade e da microdureza (T0). A seguir, cada espécime foi imerso na sua correspondente substância por 24 horas. Após 14 dias de imersão (T1), as propriedades superficiais dos espécimes foram novamente mensuradas. A variação intragrupos na rugosidade e na microdureza foi avaliada através do teste t pareado. A avaliação intergrupos, quanto ao efeito dos produtos testados na rugosidade e na microdureza, foi realizada através da análise de variância (ANOVA), seguida de teste de Tukey. Para todos os testes deste estudo foi considerado um nível de significância de 5% (p<0,05). De acordo com os resultados, foi possível concluir que o gel de P. granatum Linné exibiu propriedades superiores em relação aos produtos naturais testados. Esta substância apresentou um efeito mais completo, uma vez que, associada à escovação manual, proporcionou a maior redução da contaminação fúngica da mucosa palatina de pacientes com EP em longo prazo, além de promover, in vitro, a perda total da viabilidade celular e maior remoção das células fúngicas em biofilmes. Por fim, este produto não alterou significantemente, in vitro, a rugosidade e a microdureza da resina acrílica testada. / The increased resistance to conventional antifungal drugs and their possible side effects have stimulated research on natural products with antimicrobial activity and low toxicity. This study comprised a clinical and laboratory evaluation of the treatment of denture stomatitis (DS) using natural products by quantitative mycological culture, confocal microscopy and analysis of surface properties of an acrylic resin. In all evaluations, the experimental groups were divided according to the following substances: G1 - sterile distilled water; G2 - nystatin (Micostatin); G3 - 20% propolis alcoholic extract; G4 - P. granatum Linné gel; G5 - Uncaria tomentosa gel (Imuno-Max Gel). For quantitative mycological culture, 30 patients diagnosed with DS used their respective medicines three times a day for 14 days, associated with denture brushing with dentifrice. For the analysis, material was collected from erythematous areas of the palatal mucosa and from corresponding areas on the maxillary denture. This procedure was performed before treatment (T0), at 14 days after treatment onset (T1) and 30 days after interrupting the use of drugs (T2). Data were analyzed by the non-parametric Friedman test for intragroup comparisons and Kruskal-Wallis test for intergroup comparisons. For analysis by confocal microscopy, 30 specimens of a polymerized acrylic resin were inoculated with C. albicans for biofilm development and then immersed in the respective drugs. The remaining biofilms on the specimens were stained using fluorochrome indicators of cell viability. Data were analyzed by non-parametric Kruskal-Wallis test and Dunn\'s multiple comparison post-hoc test. For the analysis of surface properties, 50 specimens of polymerized acrylic resin were fabricated, polished and tested for initial verification of roughness and microhardness (T0). Then, the specimens were individually immersed in the respective drugs for 24 hours. After 14 days of immersion (T1), the surface properties of the specimens were measured again. The intragroup variation in roughness and microhardness was evaluated by the paired t-test. The intergroup evaluation as to the effect of tested products on roughness and microhardness was performed by analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey test. All tests in this study considered a significance level of 5% (p<0.05). According to the results, it was concluded that P. granatum Linné gel exhibited superior properties compared to the natural products tested. This substance showed a more thorough effect, since it provided the greatest long-term reduction of fungal contamination of the palatal mucosa of patients with DS when associated with manual brushing, besides promoting total loss of cell viability and increased removal of fungal cells in biofilms in vitro. Finally, in vitro, this drug did not significantly change the roughness and hardness of the acrylic resin tested.

Il est difficile de réaliser une forte adhésion entre deux hydrogels par un procédé simple. Récemment, un nouveau concept a été proposé par Leibler et ses collaborateurs pour coller des hydrogels ou des tissus biologiques. Il consiste à utiliser des nanoparticules sur lesquels s'adsorbent les chaînes de polymère et qui jouent ainsi le rôle de connecteurs. L'objectif principal de la thèse est d'identifier et de contrôler les mécanismes à l'origine de l'adhésion de deux hydrogels par des nanoparticules. De nombreuses questions sont abordées : la nature des nanoparticules de silice (taille, charge, concentration, état de dispersion), l'influence de la structure de l'hydrogel et son état de gonflement, la répartition des nanoparticules sur les interfaces. Les expériences sont menées avec plusieurs catégories d'hydrogels: le Poly(N,N diméthyl-acrylamide) (PDMA), le Polyacrylamide (PAAm), des gels nanocomposites (PDMA renforcé par des nanoparticules de silice), ou encore des gels à double-réseaux. Nous mesurons les propriétés adhésives à l'aide de tests de joints de recouvrement, de pelage à 90°, et de pelage en Y, que nous avons mis au point. Nous avons utilisé des expériences d'ATR-FTIR, de microcopie confocale à fluorescence et de microscopie électronique à balayage pour mettre en évidence l'adsorption des chaînes polymères à la surface des hydrogels, évaluer la quantité de particules de silice à la surface du gel, et caractériser leur distribution. Les résultats nous permettent de proposer un mécanisme d'adhésion et de définir les conditions qui permettent de réaliser une adhésion optimale. / It is very challenging to achieve strong adhesion between two soft and wet materials like hydrogels. Recently Leibler and his collaborators invented a new concept to assemble hydrogels or biological tissues using nanoparticles. The principle relies on the adsorption of gel chains at the surface of nanoparticles, which act as connectors, and on the ability of the adsorbed gel chains to reorganize under stress. The main objective of this work is to identify and control the physical mechanisms fundamental to gel adhesion by silica nanoparticles. Many questions are investigated: the nature of the nanoparticles (size, surface chemistry, concentration, state of dispersion), the gel structure and its state of swelling, the distribution of the nanoparticles at the gel surface. Experiments are conducted using several types of gels: Poly(N,N dimethylacrylamide) (PDMA), Poly(acrylamide) (PAAm), nanocomposite gels (PDMA reinforces with silica nanoparticles), or double-network (DN) gels. We quantify the adhesive properties using lap-shear experiments, peeling tests at 90°, and Y-peeling tests that we developed. We use ATR-FTIR experiments, confocal microscopy and scanning electron microscopy to demonstrate the adsorption of polymers onto the silica nanoparticles and characterize their spatial repartition. The results allow us to propose a mechanism explaining the adhesion and to define conditions for optimal adhesion.

A proposta desse trabalho foi verificar através de microscopia confocal de varredura a laser, se a utilização de uma resina fotopolimerizável de baixa viscosidade (Biscover®) e do etil-cianoacrilato (Super Bonder®) seriam eficientes em prevenir ou reduzir a formação de biofilme de Candida albicans. Cinqüenta e seis corpos de prova em resina acrílica para reembasamento (New Truliner) foram divididos aleatoriamente em 7 grupos: G1 (C)- Controle; G2 (SBAE)- Recebeu uma camada de Super Bonder® em sua superfície antes de esterilizar; G3 (SBDE)- Recebeu uma camada de Super Bonder® em sua superfície depois de esterilizar; G4 (SB3G)- 3 gotas de Super Bonder® incorporadas na resina; G5 (SB4G)- 4 gotas de Super Bonder® incorporadas na resina; G6 (BCDE)- Recebeu uma camada de Biscover® em sua superfície depois de esterilizar e G7 (BCAE) Recebeu uma camada de Biscover® em sua superfície antes de esterilizar. Todos os corpos de prova foram inoculados com Candida albicans para formação de biofilme. Os biofilmes remanescentes sobre os corpos de prova foram corados através dos fluorocromos SYTO-9 e iodeto de propídeo para análise no microscópio confocal. Os dados foram analisados através dos testes estatísticos de Kruskal-Wallis e Dunn, a um nível de significância de 5%. Os resultados obtidos pelo microscópio confocal mostraram que, de todos os corpos de prova modificados, os que receberam a Super Bonder® em sua superfície, G2(SBAE) e G3(SBDE) foram os únicos que significativamente reduziram a formação de biofilme de Candida albicans. Através da análise das imagens geradas pelo microscópio confocal, pôde-se observar que nos grupos G2(SBAE) e G3(SBDE) os campos apresentaram um reduzido número de células fúngicas e a maioria se encontrava na forma de levedura (inócua), enquanto que, para os demais grupos, além de observado um elevado número de células, a maioria destas se apresentava em forma de hifa (patogênica). Desse modo, a partir das condições experimentais desse estudo pôde-se concluir que as modificações do material testado com a Super Bonder® aplicada em sua superfície podem ser uma abordagem potencialmente útil para reduzir ou controlar a formação do biofilme em resinas acrílicas. / The purpose of this study was to verify, using the confocal laser scanning microscopy (CLSM), if the use of a photoactivated resin of low viscosity (Biscover®) and a ethyl-cyanoacrylate (Super Bonder®) could be efficient in the prevention or reduction of Candida albicans biofilms. Fifty six reline resin specimens (New Truliner) were fabricated and randomly divided into 7 groups: G1 (C)- Control; G2 (SBAE)- a Super Bonder® layer was applied on the surface before sterilization; G3 (SBDE)- the surface received a Super Bonder® layer after sterilization; G4 (SB3G)- 3 drops of Super Bonder® were incorporated in the structure of the resin; G5 (SB4G)- 4 drops of Super Bonder® were incorporated in the structure of the resin; G6 (BCDE)- a Biscover® layer was applied on the surface after sterilization; G7 (BCAE) the surface received a Biscover® layer before sterilization. All the specimens were inoculated with Candida albicans for biofilm dvelopment. The remaining biofilms on the specimens were stained with fluorochromes SYTO-9 and propidium iodide to be analyzed by CLSM. The data were statistically analyzed using the Kruskal-Wallis and Dunn test, considering a significance level of 5%. The data obtained by CLSM revealed that of all specimens modified, those that received a Super Bonder® layer on their surface, G2(SBAE) e G3(SBDE), presented the better results, reducing Candida albicans biofilm formation. Analyzing the images produced by CLSM it was possible to see that groups G2(SBAE) e G3(SBDE) showed a reduced number of cells, and they were in a less phatogenetic form (Yeast), while the other groups showed a high number of cells in a more pathogenetic form (Hyphae). Considering the experimental conditions of this study we can conclude that the material modifications done with Super Bonder® on the surface could be an interesting way to prevent or control biofilm formation on acrylic resin.

O presente estudo teve como objetivo avaliar, por meio da análise da microdureza dentinária, teste push-out e microscopia confocal a laser, a influência da irrigação final do canal radicular com quitosana 0,2% e EDTA 15% sobre a adesão e penetração do cimento endodôntico através dos túbulos dentinários. Selecionaram-se 50 caninos superiores humanos, os quais após a remoção das coroas foram instrumentados com Reciproc® e hipoclorito de sódio 1%. Os espécimes foram distribuídos em 5 grupos (n=10), conforme protocolo de irrigação final: G1- irrigação convencional com EDTA 15%; G2- EndoVac com EDTA 15%; G3- irrigação convencional com quitosana 0,2%; G4- EndoVac com quitosana 0,2%; G5- grupo controle (sem irrigação final). As raízes foram obturadas pela técnica da condensação lateral com AH Plus e seccionadas transversalmente. O primeiro slice de cada terço foi destinado à resistência de união por cisalhamento por extrusão (RU), e o segundo slice às análises de microdureza dentinária e microscopia confocal a laser. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística descritiva com números absolutos, médias e desvios-padrões e análise de variância de Kruskal-Wallis seguido de teste de Tukey, com significância de 5%. Os resultados mostraram que em todos os grupos houve redução da microdureza dentinária de forma significantemente diferente ao controle (p=0,001). Na comparação intragrupos entre G1, G2 e G3 a penetração de cimento endodôntico no terço cervical foi maior que no apical (p<0,005). No G4 não houve diferença significante entre os três terços (p=0,481). Para a RU, considerando os terços cervical e apical, houve semelhança entre todos os protocolos de irrigação, sendo esses diferentes estatisticamente do grupo controle (p<0,001). Em geral, a resistência de união observada no terço cervical foi estatisticamente superior aos demais terços (p<0,001). No terço cervical dos espécimes em geral, houve predominância de falhas mistas (55,4%) e de falhas adesivas à obturação nos terços médio (58,8%) e apical (56,8%). Concluiu-se que o uso das soluções estudadas, independentemente do protocolo, reduziram a microdureza nos três terços radiculares, favoreceram a penetração do cimento através dos túbulos e aumentaram a adesão do cimento às paredes dentinárias em relação ao controle. / This study aimed to assess, through dentin hardness analysis, push-out tests and laser confocal microscopy, the influence of root canal final irrigation with 0.2% chitosan and 15% EDTA among endodontic cement adhesion and penetration through the dentinal tubules. Fifty human upper canines were selected. After crowns cut off and removal, roots were instrumented with Reciproc® and 1% sodium hypochlorite. The specimens were divided into 5 groups (n = 10) according to final irrigation protocol: G1- conventional irrigation with 15% EDTA; G2-EndoVac use + 15% EDTA; G3- conventional irrigation with 0.2% chitosan; G4-EndoVac use with 0.2% chitosan; G5- control group (without final irrigation). Roots were filled by lateral condensation technique with AH Plus and sectioned transversely. The first slice of each third was reserved for bond strength shear extrusion (SE) tests, and the second slice for dentin microhardness and laser confocal microscopy analysis. Data were submitted to descriptive statistical analysis with absolute numbers, means, standard deviations and Kruskal-Wallis variance analysis followed by Tukey\'s test. A significance level of 5% was considered. Results showed that in all groups there was a reduction in dentin microhardness, with significantly difference if compared with the control group (p=0.001). In intra-groups comparisons between G1, G2 and G3, cervical third sealer penetration was higher than apical third (p<0.005). In the G4 there was no significant difference between thirds (p=0.481). In the SE cervical and apical thirds comparisons, showed to be similar among all irrigation protocols, with statistically difference from the control group (p<0.001). The bond strength observed in the cervical third was statistically higher to the other thirds (p<0.001). In specimens cervical third, there was a predominance of mixed failures (55.4%) and adhesive failures on obturation in the middle (58.8%) and apical (56.8%) thirds. It can be concluded that regardless of the protocol, the studied solutions reduced the microhardness in the three root thirds, favored tubules cement penetration and increased dentin walls cement adhesion if compared to the control group.

La mitochondrie est un carrefour d’informations au centre du fonctionnement cellulaire puisque son rôle physiologique consiste à récupérer l’énergie fournie par la dégradation des produits issus de notre alimentation pour produire de l’ATP, par le processus d’oxydation phosphorylante. Cependant, des altérations du fonctionnement de la mitochondrie peuvent être responsables de nombreuses pathologies. Parmi les stress métaboliques pouvant entraîner un dysfonctionnement mitochondrial, l’ischémie-reperfusion est un phénomène présent également dans de nombreuses situations pathologiques. L’objectif de ce travail consiste à développer une approche méthodologique basée sur la microscopie confocale et l’analyse d’images afin de décortiquer les conséquences cellulaires des stress métaboliques induits lors d’épisodes de privation de substrats associée ou non à une privation partielle ou totale d’oxygène. Après avoir mis au point le programme d’analyse d’images basée sur la méthode du « tophat », deux approches ont été développées pour visualiser et quantifier la fonction mitochondriale. La première, qui combine le marquage du TMRM et l’autofluorescence du NADH, a permis de mettre en évidence des différences de réponses au stress d’ischémie-reperfusion au niveau de la chaîne respiratoire ou de l’ouverture du PTP pour les quatre types cellulaires testés : HMEC-1, INS1, RT112 ou hépatocytes primaires. La seconde approche a consisté à tester l’utilisation de biosenseurs permettant de suivre les variations de concentration d’ATP (Ateam) ou d’activation de l’AMPK (AMPKAR). Les conditions expérimentales réalisées dans ce travail n’ont pas permis de valider leur utilisation. / Mitochondria form an information hub at the center of the cellular metabolism because of its physiological role consisting in the porduction of ATP from the degradation of porducts stemming from our food through the OXPHOS process. However, changes in the functionnig of the mitochondria can be responsible for numerous diseases. Among the different foms of metabolic stress leading to mitchondrial dysfunctions, ischemia-reperfusion can be found in numerous pathological situations. This work aims at developing a methodological approach based on confocal microscopy and image analysis to dissect –at cell level- the consequences of metabolic stress induced by episodes of deprivation in substrata associated or not with hypoxia or anoxia. Having developed the program of image analysis based on the « tophat » method, two approaches were designed to vizualize and quantify the mitochondrial function. The first one, combining TMRM labelling with NADH fluorescence made it possible to highlight some differences in the response to the stress caused by ischemia-reperfusion at the level of the respiratory chain or concerning the PTP opening in the four cellular types that were tested : HMEC-1, INS1, RT112 or pirmary heaptocyes. The second approach consisted in testing the use of biosensors designed to follow the variations of ATP concentration (ATeam) or the activation of AMPK (AMPKAR). The experimental conditions established in this work did not allow us to validate their use.

Nesta dissertação foram investigadas as propriedades ópticas e estruturais em filmes ultrafinos e de um sistema de moléculas isoladas de poli (9,9 dioctilfluoreno) (PFO). As amostras poliméricas foram produzidas sobre substrato de quartzo empregando a técnica de spin-coating a partir de soluções de PFO em clorofórmio. Através desse método foi possível obter filmes extremamente finos e moléculas isoladas, com boas condições para o estudo de processos fotofísicos. Técnicas espectroscópicas, tais como, microscopia confocal de fluorescência (LSMC), espectroscopia de absorção UV/Vis, bem como espectroscopia de fotoluminescência foram utilizadas neste trabalho. Inicialmente, o método de preparação dos filmes através de sucessivas diluições foi avaliado pelos espectros de absorção mostrando que é possível obter informação da absorção molecular por medidas de absorbância em condições extremas de baixa diluição. Medidas de fotoluminescência a baixa temperatura de 5 K mostraram que a fase &#946; pode ser induzida em filmes ultrafinos de PFO em clorofórmio. Através da técnica de microscopia confocal foi realizada a sondagem de um pequeno conjunto molecular considerado neste trabalho como sistema de molécula isolada, no qual permitiu um melhor entendimento sobre os mecanismos associados à tensão e/ou a organização da cadeia polimérica (fase planar &#946; e fase não planar), induzida pelo substrato, que afeta fortemente as propriedades de emissão. Emissões foram resolvidas pela primeira vez em moléculas isoladas entre as energias da fase &#946; e da fase não planar que foram associadas a perturbações da estrutura planar por conformações primárias da cadeia, como dobras e torções distribuídas ao longo da cadeia. Além disso, moléculas isoladas de PFO sobre o substrato de quartzo possuem a estrutura da fase &#946; congelada à temperatura ambiente. Esta estrutura é perturbada pelas vibrações atômicas do substrato que alargam a linhas de emissão, sem quebrar a conformação ordenada rígida imposta pelo substrato. Além disso, foi possível comparar as propriedades como eficiência da emissão e migração do estado excitado entre filmes ultrafinos e em moléculas isoladas. / Optical and structural properties of ultrathin films and isolated molecules of poly (9,9 dioctylfluorene) (PFO) are investigated in this work. The polymeric films were produced on top of quartz substrate by spin-coating technique from PFO chloroform solutions having different dilutions. Through this method it was possible to obtain extremely thin films (<10 nm) and isolated molecules, with suitable quality that allowed the study of photophysical processes at molecular level. We employed three spectroscopic techniques to characterize such ultrathin films, namely, confocal fluorescence microscopy (LSMC), UV/Vis absorption spectroscopy and temperature dependent photoluminescence spectroscopy. The spincoated films were initially prepared though successive dilutions in PFO/CHCl3 solutions. We demonstrate that it is possible to obtain information of the molecular structure by using absorbance measurements under extreme conditions of low molecular dilution. Measurements of photoluminescence at low temperatures (5 K) showed that the phase &#946; may be induced in ultrathin films of PFO in chloroform. Using confocal microscopy we probed a small molecular assembly considered in this work as an isolated molecule system, which allowed to understand of mechanisms associated with stress and/or the organization of the polymer chain (phase planar &#946; and phase non-planar), induced by the substrate, which strongly affects the emission properties. Emissions in isolated molecules have been resolved for the first time between the energies of the &#946; phase and the amorphous phase that were associated to perturbations of the planar structure by primary chain conformations, such as folds and twists distributed along the chain. In addition, PFO isolated molecules have frozen &#946; phase structure at room temperature on the quartz substrate. This structure is disturbed by the atomic vibrations of the substrate that broaden the emission lines without breaking the ordered conformation imposed by the rigid substrate. Moreover, it was possible to compare the properties of the efficiency emission and excited state migration between ultrathin films and isolated molecules.

O fotoenvelhecimento tem sido um assunto de grande interesse na área cosmética e dermatológica. Portanto, é relevante a caracterização da pele fotoenvelhecida, bem como o desenvolvimento de formulações dermocosméticas adequadas e direcionadas à finalidade de uso proposta. As vitaminas A e E e seus derivados tem se destacado como substâncias ativas para tal finalidade, e, baseado nesse conceito, foi proposto um composto inovador, o Tocoretinate (éster de all-trans-ácido retinoico e D-?-tocoferol), uma potencial substância ativa alternativa ao ácido retinoico para atuar na melhoria das condições da pele fotoenvelhecida. Nesse contexto, o objetivo do presente projeto foi caracterizar as alterações cutâneas decorrentes do fotoenvelhecimento, desenvolver e avaliar a estabilidade e a eficácia clínica de formulações cosméticas antienvelhecimento contendo Tocoretinate (TR), palmitato de retinila ou acetato de tocoferila. Para tal, inicialmente foi feito o planejamento experimental Box-Behnken com metodologia de superfície de resposta (MSR) foi executado para avaliar os principais efeitos e interações das matérias-primas da formulação. Foram selecionadas três formulações contendo, ou não, 0,5% de palmitato de retinila, 5% do acetato de tocoferila e 0,1% de Tocoretinate, as quais foram avaliadas quanto a sua estabilidade. A caracterização da pele fotoenvelhecida brasileira na face, nos antebraços e no dorso das mãos foi realizada em 80 voluntárias em dois grupos de idade por meio de questionários de autoavaliação e por técnicas de biofísica e imagem da pele. A mesma avaliação foi realizada no antebraço volar e face de 41 voluntárias francesas de 40 a 65 anos. As formulações desenvolvidas foram avaliadas por técnicas de biofísica e análise de imagem antes e após 84 dias de uso pelas voluntárias brasileiras acima de 40 anos. A MSR permitiu a avaliação dos efeitos isolados bem como da interação de matérias primas em respostas como: parâmetros reológicos, sensorial e hidratação. As formulações desenvolvidas foram consideradas estáveis pelos testes de estabilidade realizados. Os principais efeitos relacionados ao fotoenvelhecimento foram: perda da qualidade elástica, maior número e largura de rugas, menor ecogenicidade, maior ângulo tipológico individual e maior tamanho de corneócitos. Na análise morfológica, foi observado um padrão de pigmentação irregular, queratinócitos distribuídos irregularmente, achatamento da junção dermoepidérmica e a presença de fibras de colágeno deterioradas. Diferentes características morfológicas, estruturais e biofísicas foram encontradas na pele brasileira e francesa, que são submetidas a diferentes fatores ambientais e apresentam hábitos distintos. A formulação contendo Tocoretinate atuou na hidratação, na elasticidade líquida, no aumento do componente viscoso da pele, na redução da espessura do estrato córneo, aumento da espessura da epiderme, melhoria da homogeneidade e redução da pigmentação da epiderme e aumento da profundidade das papilas dérmicas. As formulações contendo derivados de vitaminas A e E apresentaram efeito na hidratação cutânea e função barreira da pele, no aumento da porção viscoelástica da curva, aumento da reflectância entre os queratinócitos após 84 dias de estudo. A caracterização da pele por técnicas de biofísica e análise de imagem foi fundamental para a definição do protocolo de estudo clínico de eficácia aplicando as referidas técnicas. O estudo clínico mostrou a eficácia da formulação desenvolvida contendo Tocoretinate na melhoria das condições da pele fotoenvelhecida, e fornece embasamento científico relevante para o uso deste ingrediente ativo inovador tanto em produtos cosméticos como na clínica dermatológica. / Photoaging is a subject of great interest in cosmetics and dermatology. Thus, it is important to characterize photodamaged skin and the development of appropriate dermocosmetic formulations for this purpose. Vitamins A and E and their derivatives have emerged as active substances for this purpose, and, based on this concept, an innovative compound was proposed, the Tocoretinate (ester of all-trans retinoic acid and D-?-tocopherol), which is a potential active ingredient to replace retinoic acid, acting on the improvement of photodamaged skin conditions. The objective of this project is to characterize the skin changes due to photoaging and to develop, evaluate the stability and clinical efficacy of anti-aging cosmetic formulations containing Tocoretinate, retinyl palmitate and tocopheryl acetate. An experimental design of three factors in three levels of experience (Box-Behnken) with response surface methodology (RSM) was performed to evaluate the main effects and interactions of raw materials of the formulations. Three formulations were selected containing, or not, 0.5% retinyl palmitate, 5% tocopheryl acetate and 0.1% Tocoretinate, which were submitted to stability tests. The characterization of the brazilian photodamaged skin on the face, forearms and back of the hands was carried out on 80 volunteers in two age groups through self-assessment questionnaires and biophysical and skin imaging techniques. The same evaluation was performed on the volar forearm and face of 41 French volunteers aged between 40-65 years old. The developed formulations were evaluated by biophysical and skin imaging techniques before, and after 84 days of application of the formulations. RSM allowed the evaluation of the effects of the raw materials on the responses: rheological behavior, sensory properties and hydration. The formulations were considered stable in stability tests. The clinical and morphological features related to photoaging were: loss of the elastic quality, more wrinkles, less echogenicity, higher individual typological angle and larger size of corneocytes and a thicker stratum corneum. For the morphological analysis, an irregular pigmentation pattern was observed, keratinocytes irregularly distributed, flattening of the dermal-epidermal junction and the presence of damaged collagen fibers. Different morphological, structural and biophysical characteristics were found in Brazilian and French skin, that are exposed to different environmental factors and has distinct habits. The formulation containing Tocoretinate acted on skin hydration, elasticity, reduced stratum corneum thickness, increased epidermal thickness, improved uniformity, reduced skin pigmentation, and also increased depth of dermal papillae. Formulations containing derivatives of vitamins A and E acted on skin barrier function and hydration, increasing the portion of the viscoelastic curve and improved the interkeratinocyte reflectance after 84 days of the study. The characterization of the skin by biophysical techniques and skin imaging analysis was fundamental in effectively defining the clinical study protocol applying these techniques. The clinical study showed the efficacy of the formulations developed containing Tocoretinate in improving photodamaged skin conditions, and provides relevant scientific basis for the use of this innovative active ingredient both in dermocosmetics and in dermatology.

Introdução: O remodelamento da matriz extracelular no líquen escleroso (LS) caracteriza-se histologicamente por uma faixa hialinizada situada predominantemente na derme superficial, semelhante ao que ocorre na lipoidoproteinose (LPE), uma genodermatose rara, na qual ocorre deficiência na produção da proteína 1 da matriz extracelular (ECM-1). Recentemente, em casos de LS foram descobertos auto-anticorpos contra a ECM-1 e um novo caminho foi proposto para desvendar a sua etiopatologia. O LS também é freqüentemente comparado com a Esclerodermia, visto que alguns autores consideram que são espectros de uma mesma doença. Na Esclerodermia e na LPE há aumento do colágeno tipo V (COL V), mas pouco se sabe sobre este tipo de colágeno no LS. Assim, o objetivo do presente trabalho foi demonstrar a localização e a quantidade de COL V e ECM-1 nas vulvas de pacientes com LS. Materiais e métodos: foram estudadas 21 biópsias de pacientes com LS vulvar e 21 biópsias de vulvas normais. A morfometria foi realizada nas imagens geradas através da imunofluorescência marcada com anticorpos contra os colágenos I (COL I), III (COL III) e V, e também nas de imunoistoquímica para ECM-1. Ademais, utilizou-se microscopia confocal a laser para visualizar o COL V e a ECM-1 na mesma lâmina. Resultados: Peles do grupo controle mostraram fraca e homogênea distribuição das fibras de COL I, III e V na imunofluorescência. Em contraste, peles com LS exibiram desarranjo da arquitetura da derme superficial e difuso aumento da fluorescência das fibras de COL I, III e V na faixa hialina. A fração de área das fibras de COL I, III, e V foram significativamente maiores nas peles de pacientes com LS em relação ao controle (p<0,05). Peles controles mostraram co-localização da ECM-1 e do COL V na parede de pequenos vasos e ao longo da membrana basal. Entretanto, no LS houve perda de expressão da ECM-1 na parede dos vasos sanguíneos (p<0,001) e difuso aumento da fluorescência verde do COL V (p<0,001). Conclusão: Houve inversa relação entre o COL V e a proteína ECe constatado pela histomorfometria, imunofluorescência, imunoistoquímica e reconstrução tridimensional, sugerindo que estratégias terapêuticas para prevenir o aumento da síntese de COL V e a diminuição da ECM-1 poderão ser promissoras no prognóstico e tratamento do LS / Background: The extracellular matrix remodeling in lichen sclerosus (LS) is characterized in routine light microscopy by a hyalinized band predominantly located in the superficial dermis. The same pattern occurs in the lipoid proteinosis (LPE), a rare genodermatosis, in which the production deficiency of extracellular matrix protein 1 (ECM-1) is responsible for triggering the disease. Recently, in cases of LS, autoantibodies were discovered against ECM-1 and a new way to unravel their aetiopathology was proposed. LS is also frequently compared with Scleroderma, since some authors consider that they are spectra of a similar disease. In Scleroderma and LPE there is an increase of type V collagen (COL V), but little is known about this type of collagen in LS. Thus, the objective of the current study was to demonstrate the location and quantity of COL V and ECM-1 on the vulvas of patients with LS. Materials and methods: Twenty one biopsies from patients with vulvar LS matched with 21 biopsies from normal vulvas were included in this study. Immunofluorescence against type I (COL I), (COL III) and V collagen and immunohistochemistry for ECM-1 was performed and the slides were analysed by morphometry. Furthermore, laser confocal microscopy was used to visualize the COL V fibers and the ECM-1 protein on the same slide. Results: Skins of the control group showed low and homogeneous distribution of fibers COL I, III and V in immunofluorescence. In contrast, skins with LS exhibited disruption of the architecture of the superficial dermis and diffuse increase in fluorescence fibers COL I, III and V in the range hyaline. The area fraction of fibers COL I, III, and V were significantly higher in the skin of patients with LS compared to control (p <0.05). Skins controls showed colocalization of ECM-1 and COL V the wall of small vessels and along the basement membrane. However, the LS had loss of expression of ECM-1 the wall of blood vessels (p <0.001) increase the fluorescence and diffuse green COL V (p <0.001). Conclusion: There was an inverse relationship between COL V and ECM-1 protein in LS as demonstrated by histomorphometry, immunofluorescence, immunohistochemistry and three-dimensional reconstruction, suggesting that therapeutic strategies to prevent the increased synthesis COL V and ECM-1 protein in LS as demonstrated by histomorphometry, immunofluorescence, immunohistochemistry and three-dimensional reconstruction, suggesting that therapeutic strategies to prevent the increased synthesis COL V and decreased ECM-1 may be promising in the prognosis and treatment of the LS