Orientador: Regina Maria Puppin Rontani / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-12T19:22:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_FabiolaGalbiattide_D.pdf: 3340202 bytes, checksum: 3dfefda6770edf12e25a625fcffd516d (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O monômero antibacteriano 12-metacriloxidodecilpiridinio de brometo (MDPB) foi incorporado, juntamente com o flúor, ao sistema adesivo Clearfil Protect Bond (CPB) para auxiliar na prevenção de cárie secundária. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar em três experimentos in vitro o efeito desses componentes na desinfecção de cavidade, durabilidade da união à dentina afetada por cárie (DAC) e prevenção de cárie secundária. No Capítulo 1, o efeito antibacteriano do MDPB foi avaliado em biofilme de S. mutans presentes na superfície de dentina a partir de quatro tempos de aplicação do primer contendo MDPB (20s, 90s, 300s e 590s). A viabilidade celular foi avaliada utilizando microscópio confocal de varredura a laser (CLSM) e contagem de unidades formadoras de colônias. Somente a partir de 300s de aplicação do primer foi verificado o efeito bactericida do MDPB contra biofilme de S. mutans na dentina. No Capítulo 2, a degradação à DAC artificial foi avaliada utilizando teste de microtração (µTB) após a aplicação dos sistemas adesivos CPB e Adper Scotchbond Multi-Purpose (SBM) e armazenamento em cultura de S. mutans por três dias e água deionizada por três meses. A presença do flúor e MDPB no sistema adesivo CPB não preveniu a degradação da união à DAC, pois não houve diferença nos valores de µTB entre CPB e SBM nos dois métodos de degradação. Assim, o meio de armazenamento dos espécimes com S. mutans por 3 dias foi tão eficaz na degradação à DAC quanto o armazenamento em água por 3 meses. No Capítulo 3, a inibição da cárie secundária por CPB e SBM foi avaliada após 5 dias de desafio cariogênico com métodos químico (gel ácido) e biológico (meio com S. mutans). A formação da zona de inibição à cárie (IZ) pelos sistemas adesivos foi avaliada por CSLM e a distribuição de cálcio e fósforo para investigar a perda mineral na dentina ao longo da interface dentina/restauração foi avaliada por análise de fluorescência por raios-x (µ-EDX). O sistema adesivo CPB produziu IZ mais espessa e menor perda mineral quando submetido ao desafio químico, mas produziu a menor espessura de IZ e a maior perda mineral quando submetido ao desafio biológico. O sistema adesivo SBM induziu valores intermediários de perda mineral e IZ frente aos dois desafios. Desta forma, o método de desenvolvimento de cárie secundária artificial e a camada híbrida criada por CPB e SBM influenciaram na inibição de cárie secundária por sistemas adesivos. Dentro das limitações deste trabalho pode-se concluir que o monômero MDPB presente no sistema adesivo CPB possuiu efeito bactericida contra biolfime de S. mutans na superfície de dentina após 300 s de sua aplicação. Além disso, este monômero não preveniu a degradação da união após armazenamento em cultura de S. mutans e água deionizada, bem como a desmineralização da dentina na interface dente/restauração após desafio cariogênico químico e biológico. / Abstract: The antibacterial monomer 12-methacryloyloxydodecylpyridinium bromide (MDPB) was incorporated with fluoride component in Clearfil Protect Bond adhesive system to help in secondary caries prevention. Thus, the present study conducted three in vitro experiments with the aim to evaluate the fluoride and MDPB effects in cavity disinfection, bonding durability on caries-affected dentin (CAD) and secondary caries prevention. In Chapter 1, the MDPB antibacterial effect was evaluate against S. mutans biofilm on dentin surface after four application times of MDPB primer (20s, 90s, 300s e 590s). The cellular viability was evaluated by confocal laser scanning microcopy (CLSM) and viable count test. MDPB had bactericidal effect against S. mutans biofilm on dentin after 300s of primer application. In Chapter 2, the artificial CAD bonding degradation was evaluated using microtensile bonding strength test (µTB) after CPB and Adper Scotchbond Multi-Purpose (SBM) adhesive systems application and storage in S. mutans culture for three days and deionized water for three months. The fluoride and MDPB in CPB adhesive system did not prevent the CAD bonding degradation because there was no statistical difference between µTB values of CPB and SBM in both degradation methods. Therefore, S. mutans culture was an effective method to produce degradation in vitro in a short period of time as 3 months of water storage. In Chapter 3, the secondary caries inhibition by CPB and SBM was evaluated after chemical (acidic gel) and biological (S. mutans culture) challenges during 5 days. The inhibition zone formation (IZ) by adhesive systems used was evaluated by CLSM. The calcium and phosphorus distribution was evaluate by X-Ray fluorescence analysis (µ-EDX) to investigate the mineral loss on dentin along dentin/restoration interface. CPB adhesive system produced the thickest IZ and lowest mineral loss when it was submitted to chemical challenge; however the same adhesive system produced the lowest value of IZ thickness and the highest mineral loss in the biological challenge. SBM adhesive system showed intermediate mineral loss and IZ thickness values in both cariogenic challenges. Thus, the artificial caries method and the hybrid layer quality of CPB and SBM affected the secondary caries inhibition by adhesive systems. Based on the findings of this study, and within the limitation of this investigation, could be concluded that the MDPB monomer in CPB adhesive system had bactericidal effect after 300 s of its application. Furthermore, this monomer did not prevent the bonding degradation after S. mutans culture and water storage, as well as the dentin demineralization at tooth/restoration interface after chemical and biological cariogenic challenges. / Doutorado / Doutor em Materiais Dentários

A proposta desse trabalho foi verificar através de microscopia confocal de varredura a laser, se a utilização de uma resina fotopolimerizável de baixa viscosidade (Biscover®) e do etil-cianoacrilato (Super Bonder®) seriam eficientes em prevenir ou reduzir a formação de biofilme de Candida albicans. Cinqüenta e seis corpos de prova em resina acrílica para reembasamento (New Truliner) foram divididos aleatoriamente em 7 grupos: G1 (C)- Controle; G2 (SBAE)- Recebeu uma camada de Super Bonder® em sua superfície antes de esterilizar; G3 (SBDE)- Recebeu uma camada de Super Bonder® em sua superfície depois de esterilizar; G4 (SB3G)- 3 gotas de Super Bonder® incorporadas na resina; G5 (SB4G)- 4 gotas de Super Bonder® incorporadas na resina; G6 (BCDE)- Recebeu uma camada de Biscover® em sua superfície depois de esterilizar e G7 (BCAE) Recebeu uma camada de Biscover® em sua superfície antes de esterilizar. Todos os corpos de prova foram inoculados com Candida albicans para formação de biofilme. Os biofilmes remanescentes sobre os corpos de prova foram corados através dos fluorocromos SYTO-9 e iodeto de propídeo para análise no microscópio confocal. Os dados foram analisados através dos testes estatísticos de Kruskal-Wallis e Dunn, a um nível de significância de 5%. Os resultados obtidos pelo microscópio confocal mostraram que, de todos os corpos de prova modificados, os que receberam a Super Bonder® em sua superfície, G2(SBAE) e G3(SBDE) foram os únicos que significativamente reduziram a formação de biofilme de Candida albicans. Através da análise das imagens geradas pelo microscópio confocal, pôde-se observar que nos grupos G2(SBAE) e G3(SBDE) os campos apresentaram um reduzido número de células fúngicas e a maioria se encontrava na forma de levedura (inócua), enquanto que, para os demais grupos, além de observado um elevado número de células, a maioria destas se apresentava em forma de hifa (patogênica). Desse modo, a partir das condições experimentais desse estudo pôde-se concluir que as modificações do material testado com a Super Bonder® aplicada em sua superfície podem ser uma abordagem potencialmente útil para reduzir ou controlar a formação do biofilme em resinas acrílicas. / The purpose of this study was to verify, using the confocal laser scanning microscopy (CLSM), if the use of a photoactivated resin of low viscosity (Biscover®) and a ethyl-cyanoacrylate (Super Bonder®) could be efficient in the prevention or reduction of Candida albicans biofilms. Fifty six reline resin specimens (New Truliner) were fabricated and randomly divided into 7 groups: G1 (C)- Control; G2 (SBAE)- a Super Bonder® layer was applied on the surface before sterilization; G3 (SBDE)- the surface received a Super Bonder® layer after sterilization; G4 (SB3G)- 3 drops of Super Bonder® were incorporated in the structure of the resin; G5 (SB4G)- 4 drops of Super Bonder® were incorporated in the structure of the resin; G6 (BCDE)- a Biscover® layer was applied on the surface after sterilization; G7 (BCAE) the surface received a Biscover® layer before sterilization. All the specimens were inoculated with Candida albicans for biofilm dvelopment. The remaining biofilms on the specimens were stained with fluorochromes SYTO-9 and propidium iodide to be analyzed by CLSM. The data were statistically analyzed using the Kruskal-Wallis and Dunn test, considering a significance level of 5%. The data obtained by CLSM revealed that of all specimens modified, those that received a Super Bonder® layer on their surface, G2(SBAE) e G3(SBDE), presented the better results, reducing Candida albicans biofilm formation. Analyzing the images produced by CLSM it was possible to see that groups G2(SBAE) e G3(SBDE) showed a reduced number of cells, and they were in a less phatogenetic form (Yeast), while the other groups showed a high number of cells in a more pathogenetic form (Hyphae). Considering the experimental conditions of this study we can conclude that the material modifications done with Super Bonder® on the surface could be an interesting way to prevent or control biofilm formation on acrylic resin.

O aumento da resistência aos antifúngicos convencionais e os possíveis efeitos colaterais destes fármacos têm estimulado pesquisas sobre produtos naturais com potencial antimicrobiano e baixa toxicidade. Assim, o objetivo desta pesquisa foi realizar uma avaliação clínica e laboratorial do tratamento da estomatite protética (EP) através de produtos naturais, por meio de cultura micológica quantitativa, de microscopia confocal e de análise das propriedades superficiais de uma resina acrílica. Em todas as avaliações, os grupos experimentais foram divididos de acordo com as seguintes substâncias: G1 - água destilada estéril; G2 - nistatina; G3 - extrato alcoólico de própolis a 20%; G4 - gel de Punica granatum Linné; G5 - gel de Uncaria tomentosa (Imuno-Max Gel). Para a cultura micológica quantitativa, 30 pacientes diagnosticados com EP utilizaram os seus respectivos medicamentos três vezes por dia, durante 14 dias, associados à escovação das próteses com dentifrício. Nas avaliações, foram coletados materiais das áreas eritematosas da mucosa palatina e das áreas correspondentes na prótese total superior. Este procedimento foi realizado antes do tratamento (T0), após 14 dias do início do tratamento (T1) e 30 dias após a suspensão do uso dos medicamentos (T2). Os dados obtidos foram submetidos ao teste não-paramétrico de Friedman para comparações intragrupos e ao teste de Kruskal-Wallis para comparações intergrupos. Para análise através de microscopia confocal, 30 espécimes de uma resina acrílica termopolimerizável foram inoculados com C. albicans para a formação do biofilme e, em seguida, imersos em sua respectiva droga. Os biofilmes remanescentes sobre os espécimes foram corados através de fluorocromos indicadores de viabilidade celular. Os dados obtidos foram analisados através do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis e do pós-teste de comparação múltipla de Dunn. Para análise das propriedades superficiais, 50 espécimes de uma resina acrílica termopolimerizável foram fabricados, polidos e testados para a verificação inicial da rugosidade e da microdureza (T0). A seguir, cada espécime foi imerso na sua correspondente substância por 24 horas. Após 14 dias de imersão (T1), as propriedades superficiais dos espécimes foram novamente mensuradas. A variação intragrupos na rugosidade e na microdureza foi avaliada através do teste t pareado. A avaliação intergrupos, quanto ao efeito dos produtos testados na rugosidade e na microdureza, foi realizada através da análise de variância (ANOVA), seguida de teste de Tukey. Para todos os testes deste estudo foi considerado um nível de significância de 5% (p<0,05). De acordo com os resultados, foi possível concluir que o gel de P. granatum Linné exibiu propriedades superiores em relação aos produtos naturais testados. Esta substância apresentou um efeito mais completo, uma vez que, associada à escovação manual, proporcionou a maior redução da contaminação fúngica da mucosa palatina de pacientes com EP em longo prazo, além de promover, in vitro, a perda total da viabilidade celular e maior remoção das células fúngicas em biofilmes. Por fim, este produto não alterou significantemente, in vitro, a rugosidade e a microdureza da resina acrílica testada. / The increased resistance to conventional antifungal drugs and their possible side effects have stimulated research on natural products with antimicrobial activity and low toxicity. This study comprised a clinical and laboratory evaluation of the treatment of denture stomatitis (DS) using natural products by quantitative mycological culture, confocal microscopy and analysis of surface properties of an acrylic resin. In all evaluations, the experimental groups were divided according to the following substances: G1 - sterile distilled water; G2 - nystatin (Micostatin); G3 - 20% propolis alcoholic extract; G4 - P. granatum Linné gel; G5 - Uncaria tomentosa gel (Imuno-Max Gel). For quantitative mycological culture, 30 patients diagnosed with DS used their respective medicines three times a day for 14 days, associated with denture brushing with dentifrice. For the analysis, material was collected from erythematous areas of the palatal mucosa and from corresponding areas on the maxillary denture. This procedure was performed before treatment (T0), at 14 days after treatment onset (T1) and 30 days after interrupting the use of drugs (T2). Data were analyzed by the non-parametric Friedman test for intragroup comparisons and Kruskal-Wallis test for intergroup comparisons. For analysis by confocal microscopy, 30 specimens of a polymerized acrylic resin were inoculated with C. albicans for biofilm development and then immersed in the respective drugs. The remaining biofilms on the specimens were stained using fluorochrome indicators of cell viability. Data were analyzed by non-parametric Kruskal-Wallis test and Dunn\'s multiple comparison post-hoc test. For the analysis of surface properties, 50 specimens of polymerized acrylic resin were fabricated, polished and tested for initial verification of roughness and microhardness (T0). Then, the specimens were individually immersed in the respective drugs for 24 hours. After 14 days of immersion (T1), the surface properties of the specimens were measured again. The intragroup variation in roughness and microhardness was evaluated by the paired t-test. The intergroup evaluation as to the effect of tested products on roughness and microhardness was performed by analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey test. All tests in this study considered a significance level of 5% (p<0.05). According to the results, it was concluded that P. granatum Linné gel exhibited superior properties compared to the natural products tested. This substance showed a more thorough effect, since it provided the greatest long-term reduction of fungal contamination of the palatal mucosa of patients with DS when associated with manual brushing, besides promoting total loss of cell viability and increased removal of fungal cells in biofilms in vitro. Finally, in vitro, this drug did not significantly change the roughness and hardness of the acrylic resin tested.

As soluções desinfetantes têm sido empregadas como um dos principais métodos no controle de biofilmes microbianos, tais como os formados sobre a superfície de próteses totais. O objetivo desta pesquisa foi analisar o efeito antimicrobiano das soluções desinfetantes sobre biofilmes de C. albicans em resina acrílica termopolimerizável, por meio de microscopia confocal de varredura a laser, de cultura microbiológica e de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Sessenta corpos-de-prova (5 x 5 x 1 mm) foram confeccionados, esterilizados e inoculados individualmente com C. albicans (1.107 cel/mL), aguardando-se 24 horas a 37°C para a formação do biofilme. A seguir, 24 corpos-de-prova foram divididos aleatoriamente em 4 grupos (n=6), de acordo com as soluções testadas: G1 (controle) água destilada por 10 minutos; G2 gluconato de clorexidina a 4% por 10 minutos; G3 hipoclorito de sódio a 1% por 10 minutos; G4 hipoclorito de sódio a 2% por 5 minutos. Após a desinfecção, os biofilmes remanescentes sobre os corpos-de-prova foram corados através dos fluorocromos SYTO-9 e iodeto de propídeo para análise no microscópio confocal. Ademais, 24 novos corpos-de-prova foram submetidos ao mesmo processo de desinfecção e destinados à análise através de cultura microbiológica. Após 48 horas de incubação, foi feita a contagem das unidades formadoras de colônia (UFC). Ainda, o mesmo processo de desinfecção foi utilizado para 12 novos corpos-de-prova para análise em MEV. Os dados foram analisados através do teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste Student-Newman-Keuls, considerando um nível de significância de 5%. Os resultados obtidos pelo microscópio confocal demonstraram que todas as soluções desinfetantes promoveram a morte de todas as células fúngicas remanescentes sobre os corpos-de-prova. Resultado semelhante foi obtido através da análise por meio de cultura microbiológica, pois todas as soluções desinfetantes foram capazes de impedir o crescimento fúngico em cultura. Através da análise em microscópio confocal e em MEV, não foi observada remoção das células do biofilme fúngico sobre os corpos-de-prova pela solução de gluconato de clorexidina a 4%. Por outro lado, as soluções de hipoclorito a 1% e 2% promoveram uma remoção quase completa do biofilme fúngico da superfície dos corpos-de-prova. Além disso, através do MEV, alterações morfológicas foram observadas nas poucas células fúngicas remanescentes da desinfecção através de hipoclorito de sódio a 1%. Desse modo, a partir das condições experimentais deste estudo, pode-se considerar que as soluções de hipoclorito de sódio a 1% e 2% apresentaram um efeito antimicrobiano superior, quando comparados com a solução de gluconato de clorexidina a 4%. / Disinfectant solutions have been used as one of the principal methods to control microbial biofilms such as those formed on the complete denture surface. The aim of this study was to analyze the antimicrobial effect of disinfectant solutions on C. albicans biofilms on heat-polymerized acrylic resin by microbiological culture analysis, confocal laser scanning microscopy (CLSM) and scanning electron microscopy (SEM). Sixty specimens (5 x 5 x 1 mm) were fabricated, sterilized and individually inoculated with C. albicans (1.107 cells/mL) during 24 hours at 37°C to allow the biofilm formation. After that, these 24 specimens were randomly divided into 4 groups (n=6) according to the disinfection solutions tested: G1 (control) distilled water for 10 minutes; G2 4% chlorhexidine gluconate for 10 minutes; G3 1% sodium hypochlorite for 10 minutes; G4 2% sodium hypochlorite for 5 minutes. After disinfection, the remaining biofilms on the specimens were stained with fluorochromes SYTO-9 and propidium iodide to be analyzed by CLSM. Furthermore, the same disinfection process was applied to another 24 specimens which were submitted to microbiological culture analysis. After 48 hours of incubation, quantification of colony-forming units (CFU/mL) was performed. Also, the same disinfection process was applied to the remaining 12 specimens for the SEM analysis. The data were statistically analyzed using the Kruskal-Wallis and Student- Newman-Keuls tests, considering a significance level of 5%. The data obtained by CLSM revealed that all disinfectant solutions killed all remaining fungal cells on the specimens. Similar results were obtained by microbiological culture analysis, where all disinfectant solutions were able to avoid fungal growth in culture. CLSM and SEM analyses of specimens indicated that the 4% chlorhexidine gluconate solution did not remove the C. albicans cells from the resin acrylic surface. On the other hand, the 1% and 2% sodium hypochlorite solutions provided an almost complete biofilm removal from the acrylic surface. Furthermore, by SEM examination, morphologic damages became evident in the few residual Candida cells after 1% sodium hypochlorite disinfection. Thus, such findings suggest that, under the experimental conditions of this study, the 1% and 2% sodium hypochlorite solutions showed superior antimicrobials effect when compared with the 4% chlorhexidine gluconate solution.

A administração tópica de colírios é a maneira mais conveniente de se tratar doenças oculares. O grande desafio para a tecnologia farmacêutica é garantir que o fármaco administrado nessa forma farmacêutica chegue ao local de ação em concentrações adequadas, com efeitos adversos reduzidos, tempo de ação prolongado e dose única. Para tanto, o desenvolvimento de sistemas de liberação e de estratégias adequadas de administração tornam-se necessários. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da iontoforese na penetração ocular de dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM) de geração 4, com diferentes grupos superficiais (PAMAM G4, catiônico e PAMAM G3.5, aniônico), preparar complexos desses dendrímeros com um anti-inflamatório modelo, a dexametasona (Dexa), e avaliar a influência da associação de dendrímeros e iontoforese na penetração corneal da Dexa em modelos ex vivo e in vivo. Complexos Dexa-PAMAM foram obtidos e caracterizados por espectroscopia de infravermelho e ressonância magnética nuclear (H1-RMN, 13C-RMN e DOSY), espalhamento dinâmico de luz e espectroscopia UV/vis para avaliar a formação dos complexos, seu tamanho e potencial zeta, além de alterações na solubilidade da Dexa. A velocidade de liberação da Dexa dos complexos foi verificada por estudos de liberação in vitro utilizando membrana sintética. A penetração e distribuição dos PAMAMs na córnea e sua influência na penetração da Dexa foi avaliada ex vivo utilizando córnea de porco, microscopia confocal de varredura a laser (MCVL) e cromatografia de ultra performance aliada a um detector de massas para quantificação do fármaco permeado. A citotoxicidade dos PAMAMs foi avaliada em cultura de células epiteliais da retina e células epiteliais da córnea. Por fim, verificou-se in vivo a influência da iontoforese e dos PAMAMs sobre a quantidade de Dexa no humor aquoso de olhos de coelhos. Os estudos de caracterização indicaram que a Dexa foi incorporada aos PAMAMs e que esses complexos apresentaram cerca de 50 nm de tamanho médio pela técnica de NTA, com a presença de partículas pequenas e agregadas quando dispersos em meio fisiológico e potencial zeta de + 6,4 mV e -18,5 mV para Dexa-PAMAM G4 e Dexa-PAMAM G3.5, respectivamente. A solubilidade aparente da Dexa aumentou 3,9 e 10,3 vezes nos complexos com PAMAM G4 e PAMAM G3.5, respectivamente. O PAMAM G3.5 e PAMAM G4 diminuiram 82 e 1,7 vezes, respectivamente, o coeficiente de difusão da Dexa. Os estudos ex vivo indicaram que a iontoforese foi capaz de direcionar os dendrímeros para dentro da córnea, além de aumentar 2,9, 5,6 e 3,0 vezes a quantidade de Dexa permeada a partir das formulações que continham Dexa livre, Dexa-PAMAM G4 e Dexa-PAMAM G3.5, respectivamente. Aumentou também a quantidade de Dexa retida na córnea em aproximadamente 2 vezes para todas as formulações. Os experimentos de citotoxicidade evidenciaram a maior toxicidade do PAMAM G4 e sua dependência da concentração e tempo de incubação. Por fim, os experimentos in vivo mostraram que a iontoforese aumentou a concentração de Dexa no humor aquoso cerca de 2, 2,5 e 6,6 para a Dexa livre, Dexa-PAMAM G4 e Dexa-PAMAM G3.5, respectivamente. Portanto, a associação de dendrímeros PAMAM com a iontoforese representa uma estratégia promissora para a administração tópica direcionada e sustentada de fármacos na córnea. / Topical administration of eye drops is the most convenient way for treatment of eye diseases. The challenge for the pharmaceutical technology is to ensure that the drug administered in the eye drops reaches the site of action in appropriate concentrations with reduced side effects, prolonged effect and single dose. Therefore, the development of drug delivery systems and appropriate strategies become necessary. The objective of this work was to evaluate the influence of iontophoresis in the ocular penetration of generation 4 polyamidoamine dendrimers (PAMAM) with different surface groups (PAMAM G4, cationic, and PAMAM G3.5, anionic), prepare complexes of these dendrimers with an anti-inflammatory drug model, dexamethasone (Dexa), and evaluate the influence of dendrimers and iontophoresis association on Dexa cornea penetration using ex vivo and in vivo models. Dexa-PAMAM complexes were obtained and characterized by infrared spectroscopy, nuclear magnetic resonance (H1-NMR, 13C-NMR and DOSY), dynamic light scattering and UV/VIS spectroscopy to evaluate the formation of the complexes, their size and zeta potential, as well as changes in drug solubility. Dexa release rate from complexes was determined from the in vitro release studies using synthetic membrane. The penetration and distribution of PAMAMs into the cornea and their influence in the ex vivo Dexa penetration was assessed using pig\'s cornea, confocal scanning laser microscopy (CSLM) and ultra performance chromatography coupled to a mass spectrometer for quantification of the drug permeated. PAMAMs cytotoxicity was assessed in culture of retina epithelial cells and cornea epithelial cells. Finally, the influence of iontophoresis and PAMAMs on Dexa concentration in the aqueous humor of rabbit eyes was evaluated in vivo. The characterization results showed that Dexa was incorporated to PAMAMs and that these complexes had an average size of approximately 50 nm using the NTA technique, with the distribution of small particles and aggregates when dispersed in physiological medium. The zeta potential of Dexa-PAMAM G4 and Dexa PAMAM G3.5 complexes were +6.4 mV and -18.5 mV, respectively. PAMAM G4 and G3.5 PAMAM enhanced Dexa solubility by 3.9 and 10.3-fold, respectively. PAMAM G3.5 and PAMAM G4 decreased by 82 and 1.7-fold Dexa diffusion coefficient. The ex vivo studies indicated that iontophoresis directed dendrimers into the cornea, increasing the amount of Dexa permeated by 2.9, 5.6 and 3.0-fold for the formulations containing free Dexa, Dexa-PAMAM G4 and Dexa-PAMAM G3.5, respectively. Iontophoresis also increased approximately 2-fold the amount of drug retained into the cornea for all formulations. The cytotoxicity experiments revealed that PAMAM G4 toxicity was dependent on the concentration and incubation time. Finally, the in vivo experiments showed that iontophoresis increased Dexa concentration in the aqueous humor by 2, 2.5 and 6.6-fold for free Dexa, Dexa-PAMAM G4 and Dexa-PAMAM-G3.5, respectively. Therefore, the combination of iontophoresis with PAMAM dendrimers represents a promising strategy for targeted and sustained topical drug delivery to the cornea.

Orientador: Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-22T12:39:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_AnaCarolinaMascarenhas_D.pdf: 14871773 bytes, checksum: 0b983ce8eb1e0c8e89f22b1467508d1e (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro a efetividade de substâncias químicas auxiliares (SQA) e medicações intracanais (MIC) sobre microrganismos e endotoxina em canais radiculares. Dentes humanos extraídos unirradiculares (n=520) foram raspados e seccionados, tendo suas coroas descartadas e as raízes padronizadas no comprimento de 15 mm. As raízes foram armazenadas em solução fisiológica (NaCl 0,9%) (SF) estéril e congeladas em freezer a -20ºC até sua utilização. As 520 raízes foram impermeabilizadas, instrumentadas, incluídas em placas de poliestireno, esterilizadas por gás de óxido de etileno e inoculadas com E. faecalis, E. coli e C. albicans durante 28 dias. Dentre as 520 raízes, 400 foram utilizadas para análise microbiológica (identificação fenotípica/molecular) e quantificação de endotoxinas pelo teste LAL (Lisado do amebócito de Limulus). Para tanto, coletas foram realizadas em diferentes momentos da fase de PQM e do uso de MIC: 7, 14 e 30 dias. As quatrocentas raízes foram divididas aleatoriamente em grupos e instrumentadas de acordo com a SQA utilizada durante o preparo químicomecânico (PQM) com (n=360) ou sem (n=40) o uso de EDTA 17%, respectivamente: hipoclorito de sódio (NaOCl) 5,25% (n=90/10), clorexidina 2% gel (CLG 2%) (n=90/10), NaOCl 5,25% e irrigação com CLL 2% (clorexidina líquida) (n=90/10) e SF (controle) (n=90/10). Em seguida, as raízes irrigadas com EDTA 17% foram divididas em grupos de acordo com a MIC utilizada: CLG 2% (n=90), hidróxido de cálcio (HC) + CLG 2% (n=90), HC + SF (9:1) (n=90) e SF (controle) (n=90). Demais raízes (n=120) foram submetidas a diferentes SQA e MIC, sendo analisadas por meio de microscopia confocal quanto à viabilidade microbiana. Os dados foram submetidos à análise estatística em nível de significância de 5%. Observou-se que PQM com CLG 2%, NaOCl 5,25% e NaOCl 5,25% seguido de irrigação final com CLL 2% promoveu redução de E. coli, E. faecalis, C. albicans e endotoxina de E. coli. Após sete dias do PQM, observou-se reinfecção do canal radicular. CLG 2%, NaOCl 5,25%, NaOCl 5,25% seguido de irrigação com CLL 2%, HC + SF, e HC + CLG 2% não demonstraram capacidade de eliminar endotoxina de E. coli. Concluiu-se que CLG 2%, NaOCl 5,25%, NaOCl 5,25% seguido de irrigação com CLL 2%, HC + SF, e HC + CLG 2% foram efetivos na redução de E. coli, E. faecalis e C. albicans. Menor redução microbiana ocorreu nos túbulos dentinários comparada à luz do canal radicular. Nenhuma substância foi capaz de eliminar endotoxina de E. coli / Abstract: The aim of this study was to evaluate in vitro the effectiveness of the auxiliary chemical substances and intracanal medications on microorganisms and endotoxins in root canals. Single-rooted extracted human teeth (n=520) were scraped and sectioned, and their crowns discarded. The roots were standarded at 15 mm and stored in sterile saline at -20ºC until use. They (n=520) were externally waterproof, endodontically instrumented, included in microtiter plates, sterilized by ethylene oxide gas and inoculated with E. faecalis, E. coli, and C. albicans for 28 days. Among the 520 roots, 400 were used for microbiological assay (phenotypic/molecular identification) and endotoxin assay by LAL test (Limulus amebocyte Lysate). Samples were collected at different times on CMP and intracanal medication: 7, 14 and 30 days. Four hundred roots were randomly divided into groups and instrumented according to the auxiliary chemical substances used during chemomechanical preparation (CMP) with (n=360) or without (n=40) 17% EDTA, respectively: 5.25% sodium hypochlorite (NaOCl) (n=90/10); 2% chlorhexidine gel (CLG) (n=90/10); 5.25% NaOCl and final irrigation with 2% CLL (n=90/10); and saline (control) (n=90/10). The roots irrigated with 17% EDTA were divided into subgroups according to intracanal medication: 2% CLG (n=90); calcium hydroxide (CH) plus 2% CLG (n=90); CH plus saline (9:1) (n=90); and saline (control) (n=90). Another roots (n=120) were submitted to different auxiliary chemical substances and intracanal medications and analyzed by confocal microscopy regarding microbial viability. The results were statistically analyzed at 5% significance level. CMP with 2% CLG, 5.25% NaOCl, and 5.25% NaOCl plus 2% CLL promoted reduction of E. coli, E. faecalis, C. albicans and endotoxin levels. Seven days after CMP, the root canals were re-infected. 2% CLG, 5.25% NaOCl, 5.25% NaOCl plus 2% CLL, CH, and CH plus 2% CLG showed no ability on endotoxin elimination. It was concluded that 2% CLG, 5.25% NaOCl, 5.25% NaOCl plus 2% CLL, CH, and CH plus 2% CLG was effective on reducing E. coli, E. faecalis, and C. albicans. Lower microbial reduction occurred in the dentinal tubules compared to the root canal. No substance was able to eliminate endotoxin / Doutorado / Endodontia / Doutora em Clínica Odontológica

Le domaine des nanomatériaux joue un rôle de plus en plus important dans de nombreuses applications, qu’elles soient de natures biologique, médicales électroniques etc… Dans ce travail, nous présenterons des résultats concernant deux types de nanoparticules, le premier genre traite de nanoparticules hybrides confectionnées chimiquement pour des fins biologiques, le deuxième concerne des nanocristaux de silicium fabriqués par pyrolise laser pour des applications potentielles en optoélectronique. Les études sont menées en mettant en œuvre deux différentes techniques optiques, l’une en champ lointain, l’autre en champ proche. Dans le cas des nanohybrides, nous nous intéresserons à une caractérisation par microscopie en champ proche, qu’elle soit de nature spectroscopique ou d’imagerie simple, en utilisant en particulier une configuration optique guidante. Nous ferons un premier point à propos de l’émission de ses nanoparticules, puis discuterons des problèmes d’artefacts et de la résolution des images que nous pouvons atteindre avec notre montage. Nous prouverons l’importance essentielle du rôle des nanohybrides en tant que marqueur biologiques, et ceci dans deux différentes types de configuration de capteurs biologiques. Les nanoparticules de silicium de petites tailles (< 3 nm) seront étudiées essentiellement par microscopie confocale. Plus précisément, nous nous intéressons aux différents procédés de luminescence qui ont lieu lors de l’excitation d’une nanoparticule unique, en tenant compte des effets de taille et de surface. Nous chercherons à étudier l’influence de l’environnement des nanoparticules sur leurs propriétés spectrales en les plaçant dans des couches minces de natures diélectriques différentes. Nous conclurons enfin sur une brève description des différents effets Sark qui prennent lieu dans un tel système. / The domain of nanomatrials plays an important role in many biological, medical and electronic applications. In this work, we present results concerning two types of nanoparticles : the first kind treats with hybrid nanoparitcls chemically synthesized for biological means, the second concerns silicon nanocrystals fabricated by laser pyrolisis for optoelectronic applications. The studies are done by using two different optical techniques, one in the far field, the other in the near field. In the nanohybrids case, we are interested by spectroscopic, and imaging near field characterization, by particularly using a waveguide configuration. We will first shed light about the emission properties of such nanoparticles, and then discuss artefact problems, in addition to the resolution of the images we can attain in our setup. We will prove the essential importance of the role of nanohybrids as biological markers with two different types of biosensors. The small sized silicon nanoparticles (< 3 nm) are essentially studied by confocal microscopy. More precisely, we will be interested by the different luminescence processes taking place during the excitation of a unique nanoparticle, by taking into consideration the surface effects. We will search to study the influence of the nanoparticles environment on their spectral properties by placing them in thin films having different dielectric properties. We will conclude with a small description of the stark effects which take place in such a system

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit zwei neuen methodischen Ansätzen auf dem Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie. Im ersten Teil der Arbeit wir eine Methode vorgestellt, mit der die Winkelselektivität der Fluoreszenzanregung verbessert werden kann. Die ExPAN (excitation polarization angle narrowing) genannte Technik nutzt stimulierte Emission, um den Effekt der Photoselektion zu vergrößern. ExPAN lässt sich potentiell für verschiedene Methoden einsetzen, in denen fluoreszenzmarkierte Proben untersucht werden und ist insbesondere im Kontext von Fluoreszenzanisotropie-Messungen oder der Bestimmung von molekularen Orientierungen von Interesse. Solche Methoden finden in den Biowissenschaften breite Anwendung und werden z.B. zum Studium von Rezeptor-Liganden-Interaktionen oder der Proteindynamik eingesetzt. Im Rahmen der Arbeit wird ExPAN in Kombination mit einem neuen Ansatz in der Weitfeldmikroskopie untersucht, bei der die Orientierung von Farbstoffmolekülen als Kontrastmechanismus genutzt wird. Dabei wird die Polarisationsrichtung des Anregungslichts rotiert, um Informationen über die molekulare Orientierung zu gewinnen. Aufgrund der Photoselektion weist das Fluoreszenzsignal von Molekülen mit bevorzugter Ausrichtung dadurch eine periodische Modulation auf. Es wird gezeigt, dass diese Information zur Unterscheidung von Molekülen mit abweichender Orientierung genutzt werden kann, selbst wenn sich deren Signale räumlich überlagern. Für die Versuche wurde ein modifiziertes Weitfeld-Mikroskop konstruiert und die Methode zum einen experimentell an Einzelmolekülen und zum anderen mittels Simulationen erprobt. Dabei konnten Signale von Farbstoffmolekülen mit einem Abstand von bis zu 80 nm separiert werden. Darüber hinaus wurde ein moduliertes Fluoreszenzsignal bei oberflächenmarkierten Mikropartikeln in wässriger Lösung sowie bei fixierten biologischen Proben beobachtet. Eine Verbesserung der Photoselektion durch ExPAN wird experimentell nachgewiesen und gezeigt, dass mit ExPAN auch ähnlich orientierte Moleküle unterschieden werden können. Im zweiten Teil der Arbeit wird eine Methode zur Verbesserung der Auflösung von konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen vorgestellt, die als Multidetektor-Scanning (MDS) bezeichnet wird und auf dem Prinzip der Image-Scanning-Mikroskopie (ISM) beruht. Mit ISM lässt sich die Auflösung von Fluoreszenzmikroskopen theoretisch verdoppeln. Da ISM einen Flächendetektor voraussetzt, wurden in der Vergangenheit hauptsächlich CCD oder CMOS Kameras als Detektoren eingesetzt. In dieser Arbeit werden anstelle einer Kamera mehrere Einzelphotonendetektoren verwendet und über ein Glasfaserbündel zu einem Flächendetektor kombiniert. Dadurch ist es erstmals möglich, die Methode in Verbindung mit Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM) einzusetzen. FLIM hat sich in den Biowissenschaften als wichtige Mikroskopie-Technik etabliert und wird unter anderem bei Protein-Protein-Interaktionsstudien oder zur Untersuchung des NADH-Metabolismus eingesetzt. Die Verbesserung der räumlichen Auflösung von FLIM mit MDS ist somit für eine Reihe von biologischen Fragestellungen von potentiellem Interesse. Im Rahmen der Arbeit wurde ein Multidetektor-Scanning-Mikroskop konstruiert und durch die Vermessung von fluoreszierenden Mikropartikeln charakterisiert. Eine Verbesserung der Auflösung durch MDS wird an fixierten biologischen Proben demonstriert. Dabei wurde eine Auflösung von 168 nm mit MDS sowie 146 nm mit MDS und Dekonvolution erreicht. Schließlich wird die Kombination der Methode mit Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie demonstriert.

Les activités électriques ectopiques à l’origine des épisodes de fibrillation atriale pourraient être dues à des échanges calciques anormaux dans les cardiomyocytes (CM) de veine pulmonaire (VP). Le cycle du calcium des CM de VP a donc été caractérisé et comparé à celui des CM d’oreillette gauche (OG) et de ventricule gauche (VG). Des outils ont été développés pour mesurer la régularité d’organisation des réseaux de tubules transverses et la contractilité des CM de VP. Contrairement aux CM d’OG et de VG, l’organisation hétérogène du réseau de tubules dans la population des CM de VP conduit à une grande variabilité de forme des transitoires calciques et d’amplitude de contraction. Au sein des VP, ces différents types de CM sont regroupés en îlots. La fréquence des libérations calciques spontanées est également plus grande dans les CM de VP que dans ceux d’OG et de VG. La population des CM de VP présente une dynamique calcique aux caractéristiques uniques pouvant être source d’arythmies. / Ectopic foci leading to atrial fibrillation episodes might be due to abnormal calcium handling by the pulmonary vein (PV) cardiomyocytes (CM). Therefore, the calcium cycle of PV CM was characterized and compared to those of left atria (LA) and left ventricle (LV) CM. Some tools have been developed to measure the organization of transverse tubular networks and contractility of PV CM. Unlike LA and LV CM, the heterogeneous organization of the tubular networks in the PV CM population leads to wide ranges of calcium transient shapes and contraction amplitudes. Within the whole PV, these different types of CM are gathered in islets. The frequency of spontaneous calcium release is also higher in PV CM than in LA and LV CM. The special features of the calcium handling properties of the PV CM population could be a source of arrhythmias.

Asbestos é um termo geral usado comercialmente para descrever minerais fibrosos de silicato. A fibra mais utilizada até hoje é denominada crisotila, com uso considerado seguro. Embora, fragmentos menores podem permanecer por longo tempo em tecidos pulmonares. As fibras de crisotila, assim como as demais fibras de asbestos, possuem sílica na sua composição e podem ser fagocitadas com a participação de receptores scavenger. Este trabalho teve como objetivo o estudo de mecanismos de interação e de internalização das pequenas fibras de crisotila em duas linhagens celulares. Uma análise por microscopia confocal de varredura a laser e microscopia eletrônica de transmissão foi realizada e observou-se que ambas as linhagens são capazes de internalizar fibras, que apresentavam livres ou envoltas pela membrana plasmática. A presença de elementos do citoesqueleto próximos às fibras de crisotila foi verificada, assim como alterações no nível de expressão de alguns desses elementos. Dentro deste contexto, a participação de receptores no processo de internalização de fibras de crisotila também foi estudada e verificamos que esses receptores podem estar envolvidos de alguma forma com o processo de internalização de fibras de crisotila. / Asbestos is a term used commercially to describe silicate minerals. Chrysotile is the most used fiber until today and it is considered safe. However, smaller fragments can be found in lung tissues for a long period of time. Chrysotile fibers, as other asbestos fibers, are composed by silica and may be phagocyted with the participation of scavenger receptors. This studys goal was to study the interaction an internalization mechanisms of small chrysotile fibers in two cell lineages. Confocal laser scan microscopy analysis and electronic microscopy transmission analysis were conducted in both lineages, that showed capable of internalize fibers, that were involved or not by cell membrane. Cytoeskeleton elements presence near the fibers was verified and there were also changes in expression levels these elements. In this context, the participation of scavenger receptors in the internalization process of chrysotile fibers was also studied, and we verified that these receptors may be associated to the internalization process of chrysotile fibers.