Seis mil setecientos quince alpacas (Lama paco) criadas sobre los 4000 msnm, fueron utilizadas para evaluar el efecto de tres rangos de condición corporal (1.5-2, 2.5-3 y ≥3.5) y de cuatro edades (1-2, 3, 4 y >4) sobre la calidad y longitud de mecha del vellón. La calidad de vellón fue evaluada en la paleta, flanco y grupa del cuerpo del animal y clasificadas subjetivamente como fino, medio-fino y grueso. La longitud de mecha fue medida en el flanco con una regla desde el nivel de la piel al ápice de la mecha y los resultados fueron agrupados, de acuerdo a las exigencias textiles, en dos clases, vellón con mechas largas y cortas. El efecto de la condición corporal y de la edad sobre la longitud de mecha y calidad de vellón fueron evaluados con la prueba de análisis de varianza y la prueba de Chi cuadrado(X2) respectivamente. Hubo efecto significativo solo en alpacas con longitud de mecha ≥7cm (P menor 0.01), donde aquellas de 1 y 2 años de edad exhibieron la mayor longitud (10.56 ± 2.23cm) y esta disminuyó en relación al incremento en edad e inversamente a la condición corporal; sin embargo, hubo un efecto asociativo entre edad y condición corporal a partir de los tres años de edad con una mayor longitud (P menor 0.05) en alpacas con mayor condición corporal y edad. En relación a la calidad de vellón, el porcentaje de alpacas con vellón fino disminuyó con el incremento en edad e inversamente el porcentaje de vellón grueso aumento; sin embargo, no hubo efecto de la condición corporal dentro de cada calidad de vellón. Se concluye, que hubo un efecto significativo de la edad y condición corporal sobre mechas largas y que la calidad de vellón fue solo afectada por la edad. / Six thousands seven hundred fifteen alpacas (lama pacos), raised on native pasture located over 4 000 m of altitude, were used to study the effect of three range of body condition score (1.5-2, 2.5-3 and ≥3.5) and of four ages (1-2, 3, 4 and >4) on the quality and staple length of the fleece. On the shoulder, middle side and hip of the animal body was tested the fleece quality and subjectively classified as fine, medium and coarser. Staple length was measured on the middle side with a ruler from skin level to staple tip and the results were classified, according to the textile industry requirement, into two groups, one in short staples (less 7 cm) and the second in large staples (≥ 7 cm).The effect of body condition score and age on staple length and fleece quality was tested by analysis of variance and Chi square respectively. There only was a significant effect in those alpacas with staple length ≥7 cm (P less 0.01), where those of one and two year old showed the longest staple length (10.56 ± 2.23 cm), afterward, decreased in the oldest age and increased as the body condition score increased; however, there was an associative effect between age and body condition score from three years old onward, showing the longest staple length those with more age and higher body condition score (P less 0.05). Regarded to fleece quality, the percentage of alpaca with fine fleece decreased as the age increased and inversely increased the coarse fleece; however, there wasn’t an effect of body condition score within each fleece quality. The Results showed a significant effect of age and body condition scores on staple length; meanwhile, the quality of fleece only was influenced by age.

Seis mil setecientos quince alpacas (Lama paco) criadas sobre los 4000 msnm, fueron utilizadas para evaluar el efecto de tres rangos de condición corporal (1.5-2, 2.5-3 y ≥3.5) y de cuatro edades (1-2, 3, 4 y >4) sobre la calidad y longitud de mecha del vellón. La calidad de vellón fue evaluada en la paleta, flanco y grupa del cuerpo del animal y clasificadas subjetivamente como fino, medio-fino y grueso. La longitud de mecha fue medida en el flanco con una regla desde el nivel de la piel al ápice de la mecha y los resultados fueron agrupados, de acuerdo a las exigencias textiles, en dos clases, vellón con mechas largas y cortas. El efecto de la condición corporal y de la edad sobre la longitud de mecha y calidad de vellón fueron evaluados con la prueba de análisis de varianza y la prueba de Chi cuadrado(X2) respectivamente. Hubo efecto significativo solo en alpacas con longitud de mecha ≥7cm (P menor 0.01), donde aquellas de 1 y 2 años de edad exhibieron la mayor longitud (10.56 ± 2.23cm) y esta disminuyó en relación al incremento en edad e inversamente a la condición corporal; sin embargo, hubo un efecto asociativo entre edad y condición corporal a partir de los tres años de edad con una mayor longitud (P menor 0.05) en alpacas con mayor condición corporal y edad. En relación a la calidad de vellón, el porcentaje de alpacas con vellón fino disminuyó con el incremento en edad e inversamente el porcentaje de vellón grueso aumento; sin embargo, no hubo efecto de la condición corporal dentro de cada calidad de vellón. Se concluye, que hubo un efecto significativo de la edad y condición corporal sobre mechas largas y que la calidad de vellón fue solo afectada por la edad. / Six thousands seven hundred fifteen alpacas (lama pacos), raised on native pasture located over 4 000 m of altitude, were used to study the effect of three range of body condition score (1.5-2, 2.5-3 and ≥3.5) and of four ages (1-2, 3, 4 and >4) on the quality and staple length of the fleece. On the shoulder, middle side and hip of the animal body was tested the fleece quality and subjectively classified as fine, medium and coarser. Staple length was measured on the middle side with a ruler from skin level to staple tip and the results were classified, according to the textile industry requirement, into two groups, one in short staples (less 7 cm) and the second in large staples (≥ 7 cm).The effect of body condition score and age on staple length and fleece quality was tested by analysis of variance and Chi square respectively. There only was a significant effect in those alpacas with staple length ≥7 cm (P less 0.01), where those of one and two year old showed the longest staple length (10.56 ± 2.23 cm), afterward, decreased in the oldest age and increased as the body condition score increased; however, there was an associative effect between age and body condition score from three years old onward, showing the longest staple length those with more age and higher body condition score (P less 0.05). Regarded to fleece quality, the percentage of alpaca with fine fleece decreased as the age increased and inversely increased the coarse fleece; however, there wasn’t an effect of body condition score within each fleece quality. The Results showed a significant effect of age and body condition scores on staple length; meanwhile, the quality of fleece only was influenced by age.

Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas Recombinantes y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / La topología de una proteína, definida como el camino tridimensional que sigue la cadena polipeptídica en el espacio, impone restricciones naturales al conjunto de movimientos que esta puede realizar para alcanzar su estado nativo. Por esta razón esta propiedad define el mecanismo de plegamiento de una proteína. Sin embargo, en los últimos años se han descrito proteínas que obligan a la cadena polipeptídica a buscar su camino de plegamiento a través de intrincados y complejos movimientos, es el caso de las proteínas anudadas. Estas proteínas suponen un desafío para las teorías de plegamiento actuales y han abierto nuevas interrogantes respecto al mecanismo de plegamiento de las proteínas. La primera proteína anudada fue identificada en el año 2000, desde entonces se han descrito muchas otras llegando a representar del 2% del Protein data bank (PDB). Esta baja abundancia relativa de proteínas anudadas contrasta con lo observado en simulaciones de modelos de polímeros que indican que la probabilidad de formar este tipo de estructuras es alta. Esto hace pensar que las proteínas evitan la formación de nudos. No obstante no se conoce la tendencia natural de una proteína a anudarse. Otra interrogante que nace del estudio de proteínas anudadas tiene relación con la función que cumplen estas estructuras en las proteínas que las presentan y cómo estas proteínas logran plegarse. Se ha demostrado que algunos motivos anudados se conservan en distintas familias y superfamilias a pesar de su baja identidad de secuencia. Esta evidencia sugiere que dichos motivos podrían aportar alguna ventaja comparativa a las proteínas que los presentan. En este aspecto, estudios teóricos y evidencias experimentales indican que la topología anudada podría aumentar la estabilidad de las proteínas. Sin embargo, ninguno de dichos estudios explica cómo la topología anudada confiere estabilidad. En este trabajo tratamos de determinar las consecuencias que tiene sobre el mecanismo de plegamiento de una proteína el obligar a su cadena polipeptídica a anudarse. Para ello se comparó el proceso de plegamiento de una proteína anuda con la de su contraparte no-anudada. Experimentalmente esto sugiere dos desafíos importantes: primero, es necesario que la formación del nudo no altere significativamente la estructura de la proteína. Segundo, es indispensable poder controlar la topología del estado desplegado para asegurar la homogeneidad de los estados termodinámicos estudiados. El primer desafío fue abordado utilizando como modelo de estudio la proteína mARC de la superfamilia de factores de transcripción RHH. Esta es una versión monomérica del represor ARC del fago p22 generada al unir el extremo carboxilo de una subunidad con el extremo amino de la siguiente utilizando un péptido conector de 15 aminoácidos rico en glicina. Modelos por homología de mARC muestran que el péptido conector puede formar un lazo flexible que no genera contactos con el centro hidrofóbico de la proteína. De esta manera, dependiendo de la posición de dicho lazo se pueden generar dos conformaciones de mARC, una conformación anudada y otra no-anudada. El segundo desafío experimental fue abordado caracterizando el mecanismo de plegamiento de mARC utilizando pinzas ópticas. Esta aproximación permite estirar la proteína desde sus extremos y aplicar una fuerza sobre ella, de esta forma se puede controlar la topología del estado desplegado y con ello poder comparar la diferencia de energía libre entre el estado desplegado anudado y no-anudado de mARC. Por otra parte, mediante un rearreglo de los elementos de estructura secundaria de mARC puede generarse una permutante no circular de ella, pARC. Esta proteína presenta la misma arquitectura y estabilidad al equilibrio que mARC pero su topología le impide formar nudos. Así, esta permutante fue utilizada como control del efecto topológico del anudamiento de mARC. Los resultados obtenidos al estirar mARC a velocidad constante permitieron identificar dos tipos de moléculas con largos de contorno (L0 largo de una molécula completamente estirada) diferentes. Un grupo de moléculas presentó un L0 de 37 ± 7 nm, que coincide con lo esperado para la conformación anudada de mARC. El otro grupo mostró un L0 de 43 ± 7 nm, esperado para la conformación no-anudada de esta proteína. Al contrario, pARC sólo mostró un tipo de moléculas con un L0 de 22 ± 7 nm. De estos resultados se concluye que mARC está presente en dos conformaciones, una anudada y otra no anudada. De los experimentos de estiramiento a velocidad constante se obtuvo el trabajo irreversible, realizado fuera del equilibrio, asociado a las transiciones de desplegamiento y replegamiento de mARC y pARC. Utilizando el teorema de Crooks fue posible calcular, a partir de estos datos, el ΔG en condición de equilibrio para el desplegamiento de las conformaciones anudada (ΔG1= 21,8 ± 0,4 kcal/mol) y no-anudada (ΔG2= 12,3 ± 0,5 kcal/mol) de mARC así como también de pARC (ΔG3= 7 ± 0,4 kcal/mol). Estos resultados indican que mARC anudado es más estable que mARC no-anudado por 8,9 ± 0,9 kcal/mol, este valor corresponde al costo energético de anudar una cadena polipeptídica de 120 residuos en su estado desplegado. Esta es la primera vez que es posible determinar experimentalmente este valor. Además, esta diferencia de energía explica, cómo es que la topología anudada confiere estabilidad en esta proteína. Para caracterizar cinéticamente las proteínas se realizaron experimentos a fuerza constante. Sólo fue posible estudiar dos moléculas de mARC las cuales, a pesar de las diferencias que muestran en sus parámetros cinéticos calculados, corresponden a la conformación no-anudada de la proteína. No fue posible realizar estudios cinéticos con pARC / The topology of a protein, defined as the tridimensional path of the polypeptide chain in space, restricts the moves that the chain can perform for searching its native state. For this reason this property defines the folding mechanism of a protein. However, in recent years has been discovered some proteins that seek their native states through complex and intricate movements. Such is the case of knotted proteins which topology challenge current theories of protein folding and have opened new questions about protein folding mechanisms. The first knotted structure was identified in 2000, since then many others have been discovered reaching the 2% of the structures in the Protein data bank (PDB). The low relative abundance of the knotted structures contrast with simulation of polymer models showing that knotted structures are easy to exist in those systems. This suggests that proteins somehow have avoided knotted topologies. Another interesting thing to investigate about knotted proteins is the function that may have the knotted topology on this proteins and how that structures may fold. It has been determined that some knotted motifs are conserved in families and superfamilies despite of the low sequence identity. These results suggest that knotted motifs could provide some comparative advantage with respect to normal proteins. In this regard some theoretical and experimental evidence show that knotted topologies could enhance the stability of proteins. Nevertheless, none of these studies explain how this topologies does it. In this work we seek to elucidate the energetic consequence that brings the knotting of a polypeptide chain to its folding mechanism. For this, we compare the folding process of a knotted protein with their unknotted counterpart. In terms of experimental approach this problem impose two challenges, the first one is that the knot formation should don’t disturb the structure of the protein. The second one is that we must control de topology of the unfolded state in order to ensure the homogeneity of the thermodynamic species under experimentation. The first challenge was archived using the mARC protein from the RHH superfamily of transcription factors. This protein is a monomeric version of the ARC repressor from the p22 phage and it was constructed connecting the C terminus of the first subunit to the N terminus of the next one using a 15 residue glycine-rich polypeptide linker. Structural models mARC shows that the linker forms a flexible loop that doesn’t form contacts with hydrophobic core of the protein. Moreover, homology models indicate that the loop can move around the protein generating two conformations: a knotted and an unknotted one. The second challenge was addressed by characterizing the folding mechanism of mARC using optical tweezers. This approximation allows us to pull the protein from its C and N-terminal ends to control the topology of the unfolded state and thus to compare the energy differences between the knotted unfolded state and the unknotted unfolded state of mARC. In the other hand, by a rearrangement of the secondary structure of mARC it is possible to generate a non-cyclic permutant, pARC. This protein is reported to have the same architecture and folding stability of mARC but, its topology prevents knotting. So, pARC was used as a topological control of the effect of knotting the mARC protein. We found that mARC can be captured in two conformations characterized by different contour length (L0, total extension of a polymer chain). One group of molecules has a L0 of 43 ± 7 nm and corresponds to the expected for the unknotted conformation of mARC. The other group of molecules shows a L0 of 37 ± 7 nm and corresponds to the expected for the knotted conformation. On the contrary pARC only shows one type of molecules characterized by a L0 of 22 ± 7 nm. All together these results support the hypothesis that mARC is present in two conformations, one knotted and other unknotted. Moreover, applying Crook’s theorem to the irreversible work associated to the unfolding and refolding transitions of mARC and pARC allowed to determine the free energy (ΔG) at equilibrium required to the unfold the knotted (ΔG1= 21,8 ± 0,4 kcal/mol), unknotted (ΔG2= 12,3 ± 0,5 kcal/mol) conformations of mARC and pARC (ΔG3= 7 ± 0,4 kcal/mol). These results indicate that knotted mARC is more stable than their unknotted counterpart by 8,9 ± 0,9 kcal/mol mainly due to the energetic cost to tie the unfolded state of the protein. This value corresponds to the energetic cost of knotting a polypeptide chain of 120 residues in its unfolded state and explains the source of the stabilizing effect of the knotted topology in mARC. For the kinetic characterization we performed constant force experiments. It was only possible to study two molecules of mARC. Despite of the differences between the kinetic parameters calculated for them, both corresponds to the unknotted conformation of the protein / Fondecyt

Al exponer el tubérculo de papa a temperaturas inferiores a los 7 °C, ocurre lo que se conoce como “endulzamiento por frío”. Este daño fisiológico, es la principal causa de rechazo de lotes de papa serrana para la industria, consiste en la acumulación de azúcares reductores (glucosa y fructosa) como resultado de la sucesiva degradación del almidón y sus componentes. Para ver la calidad de una papa almacenada en frío, sus niveles de azúcar deberán incrementarse en lo mínimo o no variar, para no perder su potencial como producto agroindustrial, caso contrario serviría para el procesamiento solo después de la cosecha. Por ello en el presente trabajo de tesis se seleccionó cultivares nativos de papa tolerantes al endulzamiento en frío, mediante su análisis fenotípico, bioquímico y molecular. Esto se desarrolló en las instalaciones del Centro Internacional de la Papa (CIP), en los laboratorios de Procesamiento, Fisiología y de Biología Molecular de la División de mejoramiento de cultivos. Se trabajó con 40 cultivares de papas nativas, seleccionadas anteriormente por su calidad de fritura teniendo como referente la relación entre: materia seca, fritura y azúcares reductores. / When potato tubers are exposed to temperatures lower than 7 °C, a process known as “Low Temperature Sweetening” takes place. This physiological damage involves the accumulation of the reducing sugars (glucose and fructose) as a result of successive degradation of the starch and its components, and is the principal reason native potato crops are rejected by industry. To maintain its potential as an agroindustrial product, a potato should be processed quickly (before sugars can accumulate) or be cold tolerant so if cold stored, will not change its levels of sugars much. To address this issue, the present thesis work selected native cultivars of potato resistant to cold induced sweetening, and characterized them phenotypically, biochemically, and genetically. This was done at the International Potato Research Institute (CIP), in the laboratories of the Processing, Physiology, and Molecular Biology Division of the department of Germplasm Improvement. There were 40 varieties of native potatoes, selected previously for their frying quality, dry matter content, and reducing sugar content.

El estudio de la unión de un ligando con un receptor es de particular relevancia en el desarrollo de fármacos, donde se persigue encontrar un ligando con elevada afinidad hacia un determinado receptor. El ligando se une al receptor en el denominado “sitio de unión”. El proceso de unión puede dividirse en 2 etapas: i) difusión del ligando a través del receptor hasta el sitio de unión, y ii) la selección de aquella conformación (bioactiva) que cumple con las características geométricas y fisicoquímicas que le permiten unirse al receptor. En la presente memoria se ha estudiado la difusión molecular del ligando a través de la matriz proteica hasta el sitio de unión, así como la selección de la conformación bioactiva implicada en el reconocimiento ligando-receptor. En la primera parte se ha desarrollado una metodología Multinivel que proporciona un método eficiente para la exploración conformacional de moléculas tipo fármaco, permitiendo identificar estructuras estables y su población relativa. Hace uso de una exploración conformacional a nivel RM1 y posterior refinamiento a nivel más robusto de teoría: B3LYP y MP2. Se consigue así un buen balance costo/calidad para la estimación precisa de la población relativa de los confórmeros relevantes. Para compuestos en solución se utiliza la metodología de solvente continuo MST. Esto hace necesario derivar una nueva versión parametrizada del modelo MST para el hamiltoniano RM1. El modelo parametrizado ha probado proveer estimaciones precisas de la energía de solvatación para compuestos neutros. El tratamiento de compuestos iónicos es más delicado, dado que existe una dependencia fuerte entre el factor de escalado utilizado para modular la frontera electrostática entre el solvente y el soluto y el grupo ionizable. El uso de un factor de escalado adaptado al entorno químico provee una estrategia computacional viable para obtener estimaciones precisas de la energía de solvatación para compuestos cargados. Los resultados obtenidos para la histamina neutra son alentadores considerando la complejidad conformacional y tautomérica que presenta y coinciden con la mayoría de los estudios previos. En la segunda parte, se ha estudiado el impacto de las distorsiones de la planaridad del grupo hemo en la afinidad por O(2). Se halló que éstas pueden modular la afinidad de una globina por ligandos bimoleculares. Las distorsiones resultan en una disminución de la afinidad por O(2).con excepción del modo breathing, que implica la compresión-expansión del grupo hemo en el plano. El “breathing” positivo del hemo de la protoglobina “Methanosarcina Acetivorans” (MaPgb) podría contribuir a la alta afinidad por O(2) reportada dado que no presenta efecto distal, habitualmente responsable de la alta afinidad hallada en otras globinas. Por otra parte, la accesibilidad del ligando a esta proteína se logra a través de un sistema de túneles novedoso definido entre las hélices G y B (túnel 1) y B y E (túnel 2). El túnel 2, a diferencia del 1, está siempre abierto. Phe(145)G8 se halla en 2 conformaciones: abierta y cerrada, que regula la migración de ligandos a través del 1. La dimerización y la presencia de ligando unido al hemo facilitan la apertura del 1. La presencia del ligando unido al hemo es detectada por Phe(93)E11, y transmitida a Phe(145)G8 a través del cambio de las hélices B y E. Esto proporciona una explicación a los estudios cinéticos de Cristiano Viappiani. Cabe pensar que las conformaciones de ligación lenta y rápida reflejan la apertura del túnel 1 cuando se ha fijado un primer ligando en el grupo hemo. MaPgb podría participar en un proceso bimolecular, donde la entrada de un ligando facilitara de un segundo. / The study of ligand-receptor interaction is relevant to drug design. In this work we have studied: ligand diffusion through the receptor to the active site and selection of the bioactive conformation implied in ligand-receptor recognition In the first part we have developed a Multilevel methodology to efficiently explore the conformational space of drug-like molecules. It is based on a conformational search at a RM1 level and a “a posteriori” refinement with B3LYP and MP2. For molecules in solution a parametrization of the MST solvation model for RM1 was needed. Precise free energies of solvation have been obtained with the new set of parameters for neutral compounds. For ionic compounds there is a strong dependence with the scale factor used to modulate the electrostatic frontier between solvent and solute. The use of environment-adapted scale factor provides a suitable strategy. The results obtained for neutral histamine are encouraging considering its conformational and tautomeric complexity and agree with most of the previous studies. In the second part, we have studied the impact of heme distortions on its O2 affinity. Distortions reduce affinity with the exception of the breathing mode (compressionexpansion) Positive breathing found in “Methanosarcina Acetivorans” protoglobin (MaPgb) could contribute to the reported high O(2) affinity since there is no distal effect, generally responsible of high affinity in globins. A new tunnel system defined between G and B helices (tunnel 1) and B and E helices (tunnel 2) allows ligand access. Contrary to tunnel 1, tunnel 2 is always open. Phe(145)G8 is found in open and closed conformations that regulate migration through tunnel 1. Dimerization and the presence of a heme-bound ligand facilitate opening of tunnel 1. The bound ligand is detected by Phe(93)E11 and transferred to Phe(145)G8 through changes in helices B and E. This could shed light on the kinetic studies by Cristiano Viappiani. Slow and fast conformations could reflect the opening of tunnel 1 when another ligand is bound. MaPgb could be involved in a bimolecular process where the entrance of a ligand would facilitate binding of a second one.

Al exponer el tubérculo de papa a temperaturas inferiores a los 7 °C, ocurre lo que se conoce como “endulzamiento por frío”. Este daño fisiológico, es la principal causa de rechazo de lotes de papa serrana para la industria, consiste en la acumulación de azúcares reductores (glucosa y fructosa) como resultado de la sucesiva degradación del almidón y sus componentes. Para ver la calidad de una papa almacenada en frío, sus niveles de azúcar deberán incrementarse en lo mínimo o no variar, para no perder su potencial como producto agroindustrial, caso contrario serviría para el procesamiento solo después de la cosecha. Por ello en el presente trabajo de tesis se seleccionó cultivares nativos de papa tolerantes al endulzamiento en frío, mediante su análisis fenotípico, bioquímico y molecular. Esto se desarrolló en las instalaciones del Centro Internacional de la Papa (CIP), en los laboratorios de Procesamiento, Fisiología y de Biología Molecular de la División de mejoramiento de cultivos. Se trabajó con 40 cultivares de papas nativas, seleccionadas anteriormente por su calidad de fritura teniendo como referente la relación entre: materia seca, fritura y azúcares reductores. / When potato tubers are exposed to temperatures lower than 7 °C, a process known as “Low Temperature Sweetening” takes place. This physiological damage involves the accumulation of the reducing sugars (glucose and fructose) as a result of successive degradation of the starch and its components, and is the principal reason native potato crops are rejected by industry. To maintain its potential as an agroindustrial product, a potato should be processed quickly (before sugars can accumulate) or be cold tolerant so if cold stored, will not change its levels of sugars much. To address this issue, the present thesis work selected native cultivars of potato resistant to cold induced sweetening, and characterized them phenotypically, biochemically, and genetically. This was done at the International Potato Research Institute (CIP), in the laboratories of the Processing, Physiology, and Molecular Biology Division of the department of Germplasm Improvement. There were 40 varieties of native potatoes, selected previously for their frying quality, dry matter content, and reducing sugar content.

La papa (Solanum spp.) tiene una gran importancia alimenticia y es de gran utilidad en el mejoramiento genético, esta representado por 8 especies cultivadas y alrededor de 200 especies silvestres con gran diversidad de caracteres. El “Proyecto de Conservación In Situ de los cultivos nativos y sus parientes silvestres” se viene desarrollando como respuesta a la amenaza latente de perdida de la diversidad genética y busca fortalecer la conservación de las especies nativas más importantes en las chacras de los campesinos. Una de las primeras acciones ha sido inventariar y caracterizar la diversidad y variabilidad de los cultivos priorizados. Para el caso de la papa, los inventarios y el uso de marcadores morfológicos han demostrado un alto grado de diversidad genética mantenida por los agricultores andinos, sin embargo, debido a que estas características morfológicas son afectadas por el ambiente se hace necesario corroborar los resultados obtenidos mediante otras técnicas que no se encuentren bajo la presión ambiental. Por tal motivo, se decidió analizar el grado de diversidad genética presentada en una muestra aleatoria de 79 variedades nominales de papa nativa (Solanum spp.) procedente de cinco zonas del Perú (Ayacucho, Cajamarca, Cuzco, Huancavelica y Puno) cultivadas en las chacras de los agricultores que forman parte del Proyecto de “Conservación In situ de los cultivos nativos y sus parientes silvestres”, mediante el uso de 18 marcadores moleculares microsatélites-SSR Los microsatélites son secuencia cortas de di, tri o tetranucleótidos que están distribuidas en tandem a lo largo del genoma, siguen una herencia mendeliana, no son afectados por factores ambientales, son de carácter codominante y tienen un alta tasa polimórfica. Las secuencias son detectadas mediante PCR con el uso de iniciadores específicos, separación en geles de poliacrilamida y tinción con plata. Los análisis de agrupamiento, riqueza alélica y análisis de diversidad genética realizados a partir de los datos obtenidos de 19 locus microsatélites registrados, demostraron el alto grado de diversidad genética que presenta la muestra colectada y corrobora los resultados obtenidos en el proyecto In situ. Además la comparación de la riqueza alélica mantenida por cada región de colecta hace presumir que existe un flujo génico constante entre estos lugares.

Un set de 18 marcadores microsatélite (SSR, del inglés “simple sequence repeat”, repetición de secuencia simple) identificados en Solanum tuberosum (papa cultivada) y que cubren sus 12 cromosomas fue desarrollado previamente para genotipificar el germoplasma de la papa cultivada. Hemos evaluado su utilidad a diferentes distancias filogenéticas de su especie originaria, la papa cultivada S. tuberosum, en una muestra de 50 especies de papa silvestre y otras 2 especies del mismo género. Los marcadores SSR produjeron amplicones en 27% a 100% de las 52 especies, dependiendo del marcador. Se comprobó mediante secuenciación de una muestra de amplicones que los motivos repetitivos estuvieron presentes en la mayoría de los fragmentos secuenciados. Además, se observó un alto grado de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP, del inglés “single nucleotide polymorphism”, polimorfismo de un solo nucleótido) e inserciones / supresiones (indel, del inglés insertion / deletion) entre los motivos repetitivos y la secuencia de los iniciadores (primers). Estos resultados indican, en primer lugar, que los 18 loci microsatélites producen amplicones en loci homólogos. En segundo lugar el alto grado de polimorfismo fuera del motivo repetitivo indica que existe un considerable grado de homoplasia que reducirá extensamente la utilidad del set de SSR para papa cultivada en estudios filogenéticos en especies de papa silvestre distanciadas de la base de germoplasma de la papa cultivada. A pesar de esto, el análisis de distancia genética usando el índice de similitud de Jaccard y el método de agrupamiento Neighbor Joining, produjo dendrogramas que coinciden con hipótesis de relaciones cladísticas basadas en recientes filogenias moleculares, pero no así con relaciones anteriores basadas en series. / --- A kit of 18 microsatellite markers, also referred to as simple sequence repeats (SSR), covering all 12 chromosomes of the potato was previously developed for genotyping the cultivated potato. We have assessed its utility on a sample of 50 wild potato species and 2 other species of the same genus at varying phylogenetic distances from its source, the cultivated potato Solanum tuberosum. The SSR markers produced amplicons in 27% to 100% of the 52 species. A sample of them was sequenced. Although repeat motifs were present in most of the amplicons sequenced, a high degree of single nucleotide polymorphism (SNP) and insertion / deletion events (indel) was observed between the repeat motifs and the primer sequence. These results indicate that: firstly, the 18 microsatellite loci produce amplicons in homologous loci; and secondly, homoplasy will be relatively frequent and hence reduce largely the utility of the cultivated potato SSR kit for phylogenetic studies in wild potato species distant from the cultivated potato germplasm base. Despite this, genetic distance analyses using Jaccard similarity index and Neighbor Joining clustering method produced trees roughly matching hypotheses of cladistic relationships based on recent molecular phylogenies, but not on prior series relationships.

El tizón tardío causado por el oomiceto Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, es la enfermedad más seria y devastadora en cultivos de papa alrededor del mundo. Aparte del uso de fungicidas, el uso de variedades resistentes es otro método para la protección de los cultivos contra esta enfermedad. Las especies silvestres de papa han demostrado ser una fuente continua de resistencia al tizón tardío en muchos programas de mejoramiento. Esta resistencia está controlada por genes R los cuales son fácilmente superados por razas nuevas de P. infestans, y/o por un número desconocido de genes que expresan un tipo cuantitativo de resistencia el cual podría ser más durable. Con el objetivo de caracterizar la resistencia a tizón tardío, 57 genotipos de una progenie diploide PCS1, originada del cruce entre Solanum paucissectum Ochoa 762126.227 (R) con S. paucissectum 762124.236 (S) fue analizada por medio de marcadores moleculares.La primera parte de la tesis estuvo enfocada en la evaluación de la técnica del perfil NBS (sitio de unión nucleotídica), estrategia basada en PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que eficientemente reconoce regiones cromosómicas que contienen genes R y análogos de genes R (RGAs) y al mismo tiempo produce marcadores polimórficos en estos genes. Los porcentajes de polimorfismo medio detectado al usar RsaI y HaeIII como enzimas de restricción fueron 11% y 8%, respectivamente. El número promedio de polimorfismo por combinación de iniciador-enzima fue igual a 5, con un rango que va desde 3 a 13 bandas polimórficas. Los resultados indican que el perfil NBS proporciona un medio efectivo para identificar polimorfismo en papa.La segunda parte se encontró enfocada en la evaluación de regiones genómicas responsables para resistencia a tizón tardío. La familia PCS1 fue analizada con 15 marcadores de ADN conocidos por estar ligados a QTL (locus de carácter cuantitativo) para resistencia en el genoma de la papa. Los fragmentos de ADN específicos basados en PCR fueron probados por asociación con este carácter cuantitativo analizado. Dos marcadores significativamente ligados a QTL para resistencia a P. infestans fueron encontrados en los cromosomas V y XI en la progenie PCS1. / --- Late blight caused by the oomycete Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, is the most serious and devastating disease of potato production worldwide. Beside fungicides, the use of resistance varieties is another strategy to protect potato production against this disease. Wild potato species have proven to be a source of resistance to late blight used by much breeding programs. This resistance is controlled by R genes which may be easily overcome by new races of P. infestans, and/or by an unknown number of genes resulting in a quantitative type of resistance which may be more durable. With the goal of characterizing resistance to late blight, 57 genotypes of a PCS1 diploid offspring originated from cross among Solanum paucissectum Ochoa 762126.227 (R) with S. paucissectum 762124.236 (S) it was analyzed by means of molecular markers.The first part of the thesis focused on the evaluation of the NBS profiling technique, a strategy based on PCR (polymerase chain reaction) that efficiently it recognizes chromosomal regions containing R genes or R genes analogs (RGAs). At the same time it produces polymorphic markers for this gene. Mean polymorphic rates detected using RsaI and HaeIII as restriction enzymes were 11% and 8%, respectively. Mean number of polymorphisms per enzyme-primer combination was equal to 5, ranging from 3 to 13 polymorphic bands. Our results indicate that NBS profiling provides an effective means to identify polymorphism in potato.The second part of the thesis focused on the evaluation of genomic regions responsible for resistance to late blight. PCS1 family was genotyped with 15 DNA markers known to be linked to QTL (quantitative trait locus) for resistance on potato genome. Specific DNA fragments based on PCR were tested for association with this analyzed quantitative character. Two markers significantly linked to QTL for resistance to P. infestans were found on chromosomes V and XI in the PCS1 progeny.

La variabilidad genética en una muestra poblacional de 49 individuos no emparentados de la provincia de Andahuaylas, fue analizada con los marcadores microsatélites TPOX y TH01 mediante la técnica de PCR múltiplex. Los amplificados fueron separados mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y visualizados por tinción con nitrato de plata. Ambos loci resultaron polimórficos, con 5 alelos en cada loci, y se encontraron en equilibrio de Hardy-Weinberg. La heterocigosidad de los loci TPOX y TH01 presentaron valores bajos en comparación con lo reportado en otras poblaciones mundiales; lo cual determinó que la variabilidad genética de la población estudiada, medida por la heterocigosidad promedio por locus, resultara baja. Se estimaron valores de FST como medida de subdivisión poblacional en ambos loci, entre la muestra poblacional de Andahuaylas y poblaciones caucásicas, asiáticas, africanas, oceánicas y algunas relacionadas, en cuanto su origen, a la muestra poblacional estudiada. No se encontró subdivisión genética con la muestra poblacional peruana de Mesa Redonda (Tito y col., 2004) en los loci TPOX y TH01, ni con una muestra poblacional de hispanos residentes en Estados Unidos reportada por Budowle y col. (1999) y la población Mapuche de Argentina (Tourret y col., 1999) en el locus TPOX. Se corroboró una fuerte correlación genética con la población de Mesa Redonda mediante el análisis de las distancias genéticas de Reynolds representadas en un árbol filogenético neighbor-joining. / ---A population study in a sample of 49 unrelated individuals from the Province of Andahuaylas (Southern Peru) was carried out using the TPOX and TH01 STRs markers, in order to estimate their level of genetic variability. The two loci were typified by PCR multiplex. The PCR products were separated by electrophoresis on gel polyacrylamide and visualized by silver staining. Both loci were polymorphic, with 5 alleles each one, and met Hardy-Weinberg expectations. In both loci, the heterozygosity showed values that were low in comparison with world populations. The genetic variability of the Andahuaylas population, measured as the average heterozygosity per locus, was low. FST were calculated as a measure of population subdivision, between the Andahuaylas population and others world populations, in both loci. No appreciable genetic subdivision was found with the Peruvian Mesa Redonda Lima population (Tito et al., 2004) in both loci, and in the TPOX locus with a sample of Hispanic population from United States reported by Budowle et al. (1999) and The Mapuche population from Argentina (Tourret et al., 1999). The Reynolds’ distances represented in a neighbor-joining tree confirmed the great genetic correlation with Mesa Redonda Lima population.