El estudio de la unión de un ligando con un receptor es de particular relevancia en el desarrollo de fármacos, donde se persigue encontrar un ligando con elevada afinidad hacia un determinado receptor. El ligando se une al receptor en el denominado “sitio de unión”. El proceso de unión puede dividirse en 2 etapas: i) difusión del ligando a través del receptor hasta el sitio de unión, y ii) la selección de aquella conformación (bioactiva) que cumple con las características geométricas y fisicoquímicas que le permiten unirse al receptor. En la presente memoria se ha estudiado la difusión molecular del ligando a través de la matriz proteica hasta el sitio de unión, así como la selección de la conformación bioactiva implicada en el reconocimiento ligando-receptor. En la primera parte se ha desarrollado una metodología Multinivel que proporciona un método eficiente para la exploración conformacional de moléculas tipo fármaco, permitiendo identificar estructuras estables y su población relativa. Hace uso de una exploración conformacional a nivel RM1 y posterior refinamiento a nivel más robusto de teoría: B3LYP y MP2. Se consigue así un buen balance costo/calidad para la estimación precisa de la población relativa de los confórmeros relevantes. Para compuestos en solución se utiliza la metodología de solvente continuo MST. Esto hace necesario derivar una nueva versión parametrizada del modelo MST para el hamiltoniano RM1. El modelo parametrizado ha probado proveer estimaciones precisas de la energía de solvatación para compuestos neutros. El tratamiento de compuestos iónicos es más delicado, dado que existe una dependencia fuerte entre el factor de escalado utilizado para modular la frontera electrostática entre el solvente y el soluto y el grupo ionizable. El uso de un factor de escalado adaptado al entorno químico provee una estrategia computacional viable para obtener estimaciones precisas de la energía de solvatación para compuestos cargados. Los resultados obtenidos para la histamina neutra son alentadores considerando la complejidad conformacional y tautomérica que presenta y coinciden con la mayoría de los estudios previos. En la segunda parte, se ha estudiado el impacto de las distorsiones de la planaridad del grupo hemo en la afinidad por O(2). Se halló que éstas pueden modular la afinidad de una globina por ligandos bimoleculares. Las distorsiones resultan en una disminución de la afinidad por O(2).con excepción del modo breathing, que implica la compresión-expansión del grupo hemo en el plano. El “breathing” positivo del hemo de la protoglobina “Methanosarcina Acetivorans” (MaPgb) podría contribuir a la alta afinidad por O(2) reportada dado que no presenta efecto distal, habitualmente responsable de la alta afinidad hallada en otras globinas. Por otra parte, la accesibilidad del ligando a esta proteína se logra a través de un sistema de túneles novedoso definido entre las hélices G y B (túnel 1) y B y E (túnel 2). El túnel 2, a diferencia del 1, está siempre abierto. Phe(145)G8 se halla en 2 conformaciones: abierta y cerrada, que regula la migración de ligandos a través del 1. La dimerización y la presencia de ligando unido al hemo facilitan la apertura del 1. La presencia del ligando unido al hemo es detectada por Phe(93)E11, y transmitida a Phe(145)G8 a través del cambio de las hélices B y E. Esto proporciona una explicación a los estudios cinéticos de Cristiano Viappiani. Cabe pensar que las conformaciones de ligación lenta y rápida reflejan la apertura del túnel 1 cuando se ha fijado un primer ligando en el grupo hemo. MaPgb podría participar en un proceso bimolecular, donde la entrada de un ligando facilitara de un segundo. / The study of ligand-receptor interaction is relevant to drug design. In this work we have studied: ligand diffusion through the receptor to the active site and selection of the bioactive conformation implied in ligand-receptor recognition In the first part we have developed a Multilevel methodology to efficiently explore the conformational space of drug-like molecules. It is based on a conformational search at a RM1 level and a “a posteriori” refinement with B3LYP and MP2. For molecules in solution a parametrization of the MST solvation model for RM1 was needed. Precise free energies of solvation have been obtained with the new set of parameters for neutral compounds. For ionic compounds there is a strong dependence with the scale factor used to modulate the electrostatic frontier between solvent and solute. The use of environment-adapted scale factor provides a suitable strategy. The results obtained for neutral histamine are encouraging considering its conformational and tautomeric complexity and agree with most of the previous studies. In the second part, we have studied the impact of heme distortions on its O2 affinity. Distortions reduce affinity with the exception of the breathing mode (compressionexpansion) Positive breathing found in “Methanosarcina Acetivorans” protoglobin (MaPgb) could contribute to the reported high O(2) affinity since there is no distal effect, generally responsible of high affinity in globins. A new tunnel system defined between G and B helices (tunnel 1) and B and E helices (tunnel 2) allows ligand access. Contrary to tunnel 1, tunnel 2 is always open. Phe(145)G8 is found in open and closed conformations that regulate migration through tunnel 1. Dimerization and the presence of a heme-bound ligand facilitate opening of tunnel 1. The bound ligand is detected by Phe(93)E11 and transferred to Phe(145)G8 through changes in helices B and E. This could shed light on the kinetic studies by Cristiano Viappiani. Slow and fast conformations could reflect the opening of tunnel 1 when another ligand is bound. MaPgb could be involved in a bimolecular process where the entrance of a ligand would facilitate binding of a second one.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Debora Freitas de Sousa (deborahera@gmail.com) on 2009-08-06T13:44:20Z No. of bitstreams: 1 Tese_WellingtonSantosSilva.pdf: 1216826 bytes, checksum: 415fcca55058632547f794078e964aa3 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2009-08-07T13:11:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_WellingtonSantosSilva.pdf: 1216826 bytes, checksum: 415fcca55058632547f794078e964aa3 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-08-07T13:11:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_WellingtonSantosSilva.pdf: 1216826 bytes, checksum: 415fcca55058632547f794078e964aa3 (MD5) Previous issue date: 2007 / Um complexo de genes localizado no braço curto do cromossomo 11 (11p15.5) conhecido como complexo de genes da β-globina apresenta um elevado número de polimorfismos. A combinação de determinado número de polimorfismos é denominada haplótipo. Seis polimorfismos de restrição no complexo de genes da β-globina (HincII-5’ε, HindIII-Gγ, HindIII-Aγ, HincII-ψβ1, HincII-3’ψβ1 e HinfI 5’β) foram analisados em três populações do Recôncavo Baiano, sendo duas da zona urbana nos municípios de Cachoeira e Maragojipe e um quilombo na zona rural do município de Cachoeira totalizando 114 indivíduos. O estudo baseou-se principalmente na distribuição de haplótipos constituídos por cinco sítios de restrição situados a 5’do gene δ. O número de haplótipos diferentes encontrados nas populações variou de dez a treze, apresentando valores da diversidade haplotípica maiores do que o observado nas populações parentais. Os haplótipos 2 (+- - - -), 3 (- - - - +), 4 (- +- - +) e 6 (- + + - +) ligados aos cromossomos βA foram os mais comuns, e dois haplótipos privados foram encontrados na população de Maragojipe, os haplótipos 9 (- + + + +) e 14 (+ + - - +). Os Outros haplótipos identificados (1, 5, 9, 11, 12, 13, 14 e 16) apresentaram freqüências menores. Tanto a análise dos sítios de restrição quanto dos haplótipos deles derivados demonstrou homogeneidade entre as populações. Os níveis de endogamia para os haplótipos foram superiores aos dos sítios de restrição. Um grupo de trinta e dois pacientes com hemoglobinopatias foi também analisado (17 Hb.SS, 12 Hb.SC e 03 Hb.CC). Os resultados clínicos do grupo revelaram crises álgicas como a caraterística predominante, colelitíase, eosinofilia, asplenia funcional em adultos falcêmicos, trombose retiniana e úlcera cutânea de maléolo. Quarenta e cinco porcento dos pacientes Hb.SC apresentaram hepatomegalia e houve diferença siginficativa nos níveis de lactato sangüíneo entre os pacientes Hb.SC e Hb.SS, sendo maior no último grupo. A distribuição haplotípica entre as amostras e o grupo de pacientes revelou uma associação não aleatória entre os dois grupos. Os haplótipos βS predominantes foram o BEN e o CAR com freqüências de 52,9 e 32,5%, respectivamente, nos pacientes Hb.SS. Nos cromossomos βC foram observados os haplótipos tipos I e II com freqüências de 55,5 e 44,5%, respectivamente. A freqüência maior do haplótipo BEN está de acordo com os registros históricos para a população do estado da Bahia, mas difere da população de Salvador que apresentou freqüências semelhantes para os haplótipos CAR e BEN provavelmente devido a migrações internas de afro descendentes oriundos de outras regiões do País. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / A cluster of globin genes is located on chromosome 11 near the β-globin gene. This region is referred to β-globin cluster region. DNA markers in the β-globin cluster region are highly variable. The combination of DNA markers observed on a particular chromosome form what is called a haplotype. Six restriction site polymorphisms in the β-globin gene cluster (HincII-5’ε, HindIII-Gγ, HindIII-Aγ, HincII-ψβ1, HincII-3’ψβ1 e HinfI 5’β) were analyzed in three populations from the Recôncavo region of Bahia, totalizing 114 individuals. Two populations were from urban zones in the cities of Cachoeira and Maragojipe and the third was an afro-descendent population from the rural zone of the city of Cachoeira. The investigation was primarily based on the analysis of haplotypes generated by five restriction sites located in the 5’region of the δ-globin gene. The number of different haplotypes found in the populations varied between ten and thirteen, which represented higher diversity values than that observed in the parental populations. The haplotypes 2 (+- - - -), 3 (- - - - +), 4 (- +- - +) and 6 (- + + - +) on the chromosomes βA were the most common and two exclusive haplotypes, 9 (- + + + +) e 14 (+ + - - +) were found in the Maragojipe’s population. The other haplotypes (1, 5, 9, 11, 12, 13, 14 e 16) presented lower frequencies. Restriction site analyses and the haplotypes derived thereafter demonstrated homogeneity between populations. The endogamy levels for haplotypes were higher than restriction sites. Additionally, a group of thirty two patients with hemoglobinopathies (17 sickle cell disease, 12 Hb.SC disease and 03 Hb.CC disease) was also analyzed. Clinical assessment of these patients demonstrated that pain crisis was the predominant trait, followed by colelitiasis, eosinophily, dysfunctional spleen in adults with sickle cell disease, retinal thrombosis and cutaneous ulcer of ankle. Forty-five percent of the patients with Hb.SC disease presented hepatomegaly and statistically significant lower levels of sanguine lactate when compared with patients with sickle cell disease. Haplotype frequencies were significantly different between the samples and the group of patients. In the sickle cell subgroup, the predominant haplotypes were BEN and CAR with frequencies of 52,9 and 32,5%, respectively. From the anthropological viewpoint it is interesting to note that the high frequency of the BEN haplotype is in accordance with the historical record for the population of the state of the Bahia. However, it differs from the population of Salvador (capital of that state), where similar frequencies for the CAR and BEN haplotypes are found, probably as a consequence of domestic slave trade and subsequent internal migrations of other regions of the Country.

Orientadores: Maria de Fatima Sonati, Maricilda Palandi de Mello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T14:17:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wenning_MarciaReginadeSouzaCossa_D.pdf: 2460425 bytes, checksum: bd59f41846de3b0439b17450b12154a1 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A Doença da Hb H resulta da remoção ou inativação de três dos quatro genes da cadeia a da hemoglobina normalmente presentes no genoma diplóide e é caracterizada por anemia hemolítica crônica de intensidade moderada a grave. Os pacientes apresentam microcitose, hipocromia e poiquilocitose, com cerca de 25 a 30% de Hb Bart¿s (?4) ao nascimento e 5-30% de Hb H (ß4) na vida adulta. Embora a base molecular da doença tenha influência nos níveis de Hb H produzidos, uma heterogeneidade em relação a esse aspecto tem sido observada mesmo em pacientes com genótipos a idênticos, sugerindo que outros fatores contribuem para esta diversidade além dos determinantes talassêmicos. No presente trabalho, procuramos identificar transcritos diferencialmente expressos nos reticulócitos de dois pacientes com Doença da Hb H, irmãos, de origem étnica mista (chinesa e africana), um do sexo masculino, 21 anos de idade, com 18% de Hb H (MKS), e outro do sexo feminino, 19 anos, com 5% desta Hb (FKS), ambos com genótipo -a3.7/--SEA. O método envolveu a técnica de Differential Display Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (DDRT-PCR) e a realização de Hibridização Subtrativa Supressiva (SSH). A validação dos achados foi feita pela Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR). Quatro perfis diferenciais de expressão foram selecionados, todos mais representados no paciente com maior nível de Hb H. Dois foram detectados por ambas as abordagens metodológicas: um transcrito altamente homólogo à parte do gene da PIP5KIIA (fosfatidilinositol 4-fosfato-5 quinase tipo II a) e outro ao gene da cadeia ß da hemoglobina humana. Os outros dois transcritos, selecionados apenas pela SSH, apresentararam similaridade ao gene FAM46C (Family with sequence similarity 46, member C), que corresponde a uma proteína hipotética de função indeterminada, e ao gene EIF4E-BP1 (eukariotic translation initiation factor 4E ¿ binding protein 1), que codifica uma proteína regulatória da tradução com capacidade de inibição do fator eIF4E (eukariotic translation initiation factor 4E). Na tentativa de identificar os mecanismos responsáveis pelo aumento dos transcritos da PIP5KIIA e da globina ß nos reticulócitos de MKSalguns outros genes, relacionados às vias de atuação ou ao processo de transcrição dos primeiros, tiveram sua expressão também avaliada pela qRT-PCR. Os resultados obtidos, embora não conclusivos, sugeriram que a diferença nos níveis de Hb H apresentada pelos pacientes aqui estudados está correlacionada com a taxa de síntese de cadeias ß, e que a enzima PIP5KIIA, provavelmente via sinalização celular pelo fosfatidilinositol, de alguma maneira participa de sua regulação. O significado destes achados e o papel dos transcritos dos genes FAM46C e EIF4E-BP1 devem ser futuramente investigados para uma melhor compreensão dos mecanismos de regulação da expressão dos genes da globina ß em pacientes com talassemia a / Abstract: Hb H disease results from the inactivation of three of the four a-globin genes normally present on diploid genome and it is characterized by a moderate to severe chronic hemolytic anemia. Patients usually present microcytosis, hypochromia and poikilocytosis, with 25 to 30% of Hb Bart¿s (?4) at birth and 5 to 30% of Hb H (ß4) in adult life. Although the molecular base of this disease influences the Hb H levels produced, some heterogeneity has been observed in relation to this aspect, even in patients with identical a genotypes, thus suggesting that other factors contribute to this diversity besides a-thalassemic determinants. The aim of the present study was to identify differentially expressed transcripts in the reticulocytes from two patients with Hb H disease, siblings, from Chinese and African origins, a 21-year- old male (MKS) with 18% of Hb H and a 19-year-old female (FKS) with 5% of Hb H, both with genotype -a3.7/--SEA. The methodology involved two techniques: the Differential Display Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (DDRT-PCR) and the Suppression Subtractive Hybridization (SSH). Quantitative real time PCR (qRT-PCR) experiments were used to confirm some results. Four differentially expressed profiles were obtained, all of them better represented in the subject with the highest Hb H level. Two transcripts were detected by both methodological approaches, one being highly similar to PIP5KIIA gene (Phosphatidylinositol ¿ 4 phosphate 5-kinase, type II a) and the other one similar to human ß-globin gene. Two others transcripts were selected only by SSH and they showed to be to FAM 46C (Family with sequence similarity 46, member C) and EIF4E-BP1 (eukariotic translation initiation factor 4E-binding protein 1) gene homologues. In order to identify the mechanisms that are responsible for the transcripts PIP5KIIA and ß- globin increase in the reticulocytes from MKS patient, some other genes related to the transcriptional process also had its expression evaluated by qRT-PCR. Although not conclusive, our results suggest that the difference between the Hb H levels, showed by the subjects here studied, is correlated with ß-globin synthesis rate and that PIP5KIIA may participate of its regulation, probably by cell signalizing through Phosphatidylinositol. Studies, particularly involving a higher number of patients, and experiments aimed at elucidating the PIP5KIIA function in erythroid cells, should help to understand this process. The initiation factor -4E binding protein (EIF4E-BP1) and its capacity to bind to eIF4E, acts as negative regulator of cell growth. Its overexpression was detected in the patient with the highest HbH level. The significance of these findings and the role of the FAM46C and EIF4E-BP1 gene transcripts should be further investigated so that the regulating of the ß-globin gene expression in a-thalassemic patients can be better understood / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Fisiopatologia Medica