京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(工学) / 乙第13016号 / 論工博第4141号 / 新制||工||1650(附属図書館) / 32944 / (主査)教授 跡見 晴幸, 教授 森 泰生, 教授 梅田 眞郷 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Philosophy (Engineering) / Kyoto University / DGAM

Recentemente desenvolvida, a biotecnologia denominada por Microarrays permite o monitoramento simultâneo dos valores de expressão gênica de centenas de milhares de genes, fator este que traz uma nova interpretação aos resultados obtidos em pesquisas desenvolvidas nas mais diversas áreas do conhecimento incluindo, por exemplo, a Farmacologia e Medicina, uma vez que os resultados obtidos são interpretados ao nível molecular. Contudo, apesar de muita tecnologia ser empregada à técnica de Microarrays, sua aplicação ainda ocasiona algumas complicações decorrentes, por exemplo, das inúmeras fontes de variação existentes, da escala das respostas ou da natural dificuldade de se analisar uma grande quantidade de fragmentos genéticos avaliados sob poucas unidades experimentais. Frente a estas complicações, atualmente, muitas são as propostas metodológicas de análises estatísticas para atenuar ou eliminar os problemas inerentes à técnica de Microarrays e propiciar a extração de resultados mais confiáveis a partir dos valores de expressão gênica, porém muitos desafios ainda persistem. Sob esta colocação, o presente trabalho procurou explorar duas metodologias de análise estatística alternativas no que diz respeito a seus conceitos, embora ambas tenham sido contextualizadas ao problema de Microarrays e aplicadas para se atingir o mesmo objetivo: possibilitar a identificação dos genes diferencialmente expressos sob distintas condições experimentais. A primeira metodologia consistiu da aplicação de Modelos de Análise de Variância de efeitos fixos com a adoção de modificações nas estatísticas de teste, metodologias de correções para múltiplos testes e a construção de gráficos vulcão. Já, a segunda metodologia consistiu da contextualização e aplicação da Teoria da Resposta ao Item TRI aos experimentos de Microarrays, abordagem esta pouco explorada na análise deste tipo de dado, mas a qual possibilita a seleção de genes diferencialmente expressos a partir de uma medida latente estimada para cada gene e a construção de uma escala para as categorias de resposta de expressão gênica. A motivação para este trabalho originou de um experimento de Microarrays com ratos congênicos disponibilizado pelo Laboratório de Cardiologia e Genética Molecular do Instituto do Coração (InCor-USP) cujo objetivo é identificar genes associados à hipertensão. / Recently developed, the biotechnology denominated Microarrays permits a simultaneous monitoring of the gene expression values of hundred thousands of genes; fact that introduces a new interpretation of the results obtained in researches developed in many distinct areas including, for example, Pharmacology and Medicine, once the obtained results are read according to the molecular level. However, despite the fact that much technology is used in the Microarrays technique, its application still causes some implications, for example, the countless sources of existing variance, the scale of answers or the natural difficulty in analyzing a large number of genetic fragments measured by few experimental units. Facing such complications, a lot of methodologies were suggested in order to reduce or eliminate the problems caused by the Microarrays technique and also foster the obtainment of more reliable results from the gene expression values, yet many challenges still persist. Under this perspective, the present work aimed at exploring two alternative methodologies regarding concepts, despite both were contextualized according to the Microarrays problem and applied with the same objective: enabling the identification of the genes differently expressed under different experimental conditions. The first methodology was composed by the application of Analysis of Variance Models of fixed effects with changes in the test statistics, correction methodologies for multiple tests and volcano plot. The second methodology consisted of the contextualization and application of the Item Response Theory IRT towards the Microarrays experiments, being this one not much explored in analysis that use this kind of data, but enabling the selection of genes differently expressed from an estimated latent trait for each gene and the construction of a scale for the categories of gene expression answers. The motivation for the present work came from an experiment of Microarrays with congenic mice made available by the Cardiology and Molecular Genetics Laboratory of the Heart Institute (InCor-USP) that aimed at identifying genes associated with hypertension.

Recentemente desenvolvida, a biotecnologia denominada por Microarrays permite o monitoramento simultâneo dos valores de expressão gênica de centenas de milhares de genes, fator este que traz uma nova interpretação aos resultados obtidos em pesquisas desenvolvidas nas mais diversas áreas do conhecimento incluindo, por exemplo, a Farmacologia e Medicina, uma vez que os resultados obtidos são interpretados ao nível molecular. Contudo, apesar de muita tecnologia ser empregada à técnica de Microarrays, sua aplicação ainda ocasiona algumas complicações decorrentes, por exemplo, das inúmeras fontes de variação existentes, da escala das respostas ou da natural dificuldade de se analisar uma grande quantidade de fragmentos genéticos avaliados sob poucas unidades experimentais. Frente a estas complicações, atualmente, muitas são as propostas metodológicas de análises estatísticas para atenuar ou eliminar os problemas inerentes à técnica de Microarrays e propiciar a extração de resultados mais confiáveis a partir dos valores de expressão gênica, porém muitos desafios ainda persistem. Sob esta colocação, o presente trabalho procurou explorar duas metodologias de análise estatística alternativas no que diz respeito a seus conceitos, embora ambas tenham sido contextualizadas ao problema de Microarrays e aplicadas para se atingir o mesmo objetivo: possibilitar a identificação dos genes diferencialmente expressos sob distintas condições experimentais. A primeira metodologia consistiu da aplicação de Modelos de Análise de Variância de efeitos fixos com a adoção de modificações nas estatísticas de teste, metodologias de correções para múltiplos testes e a construção de gráficos vulcão. Já, a segunda metodologia consistiu da contextualização e aplicação da Teoria da Resposta ao Item TRI aos experimentos de Microarrays, abordagem esta pouco explorada na análise deste tipo de dado, mas a qual possibilita a seleção de genes diferencialmente expressos a partir de uma medida latente estimada para cada gene e a construção de uma escala para as categorias de resposta de expressão gênica. A motivação para este trabalho originou de um experimento de Microarrays com ratos congênicos disponibilizado pelo Laboratório de Cardiologia e Genética Molecular do Instituto do Coração (InCor-USP) cujo objetivo é identificar genes associados à hipertensão. / Recently developed, the biotechnology denominated Microarrays permits a simultaneous monitoring of the gene expression values of hundred thousands of genes; fact that introduces a new interpretation of the results obtained in researches developed in many distinct areas including, for example, Pharmacology and Medicine, once the obtained results are read according to the molecular level. However, despite the fact that much technology is used in the Microarrays technique, its application still causes some implications, for example, the countless sources of existing variance, the scale of answers or the natural difficulty in analyzing a large number of genetic fragments measured by few experimental units. Facing such complications, a lot of methodologies were suggested in order to reduce or eliminate the problems caused by the Microarrays technique and also foster the obtainment of more reliable results from the gene expression values, yet many challenges still persist. Under this perspective, the present work aimed at exploring two alternative methodologies regarding concepts, despite both were contextualized according to the Microarrays problem and applied with the same objective: enabling the identification of the genes differently expressed under different experimental conditions. The first methodology was composed by the application of Analysis of Variance Models of fixed effects with changes in the test statistics, correction methodologies for multiple tests and volcano plot. The second methodology consisted of the contextualization and application of the Item Response Theory IRT towards the Microarrays experiments, being this one not much explored in analysis that use this kind of data, but enabling the selection of genes differently expressed from an estimated latent trait for each gene and the construction of a scale for the categories of gene expression answers. The motivation for the present work came from an experiment of Microarrays with congenic mice made available by the Cardiology and Molecular Genetics Laboratory of the Heart Institute (InCor-USP) that aimed at identifying genes associated with hypertension.

Successful pregnancy is related to Th2 immune response profile, including molecules encoded by the major histocompatibility complex (MHC); however, Toxoplasma gondii infection induces Th1 immune response that is associated with adverse pregnancy outcome. To investigate the influence of MHC haplotype in pregnancy outcome in T. gondii-infected animals, congenic mice, C57BL/KsJ and CB10-H2 females, were orally infected with ME-49 strain on the first day of pregnancy and sacrificed on 8 and 18 days post-infection. C57BL/KsJ showed higher number of parasites in the lungs at 8dI, irrespective of pregnancy, compared with CB10-H2; and both CB10-H2 and C57BL/KsJ showed high number of parasites in the brain at 18dI, irrespective of pregnancy. Parasites were not found in the uterus/placenta in both lineages of mice irrespective of the day of infection and there was no difference in abortion rate of infected mice, although CB10-H2 mice presented higher histological damage compared with C57BL/KsJ at 8 and 18 days of pregnancy and infection. Infection of non-pregnant C57BL/KsJ increased mast cell infiltration in the uterus, and gestation decreased this cell numbers. Furthermore, C57BL/KsJ presented higher IFN-γ levels systemically on 8dI; and TNF and IL-6 on 8 and 18dI compared with CB10-H2, despite gestation or not. Additionally, in the uterus/placenta of CB10-H2, pregnancy increased FOXP3 and under infection IL-10, IL-13 and IL-17 expression levels. Our data suggest that both genetic background and MHC haplotypes are essential to protect against reabsorption rate and abortion in congenital toxoplasmosis. / O sucesso da gestação está relacionado com um perfil de resposta imunológica tipo Th2 e envolvimento de vários mecanismos para manutenção da tolerância materno-fetal, incluindo as moléculas codificadas pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Entretanto, a infecção por Toxoplasma gondii induz um perfil de resposta tipo Th1 que é associada aos resultados prejudiciais da gestação. Para investigar a influência do haplotipo do MHC na toxoplasmose congênita, fêmeas de camundongos congênicos, C57BL/KsJ (H-2d) e CB10-H2 (H-2b) foram oralmente infectadas com 5 cistos da cepa ME-49 no primeiro dia de gestação e sacrificadas aos 8 e 18 dias após a infecção. As fêmeas C57BL/KsJ apresentaram alto número de parasitos nos pulmões aos 8dI, comparadas às fêmeas CB10-H2 e ambas as linhagens apresentaram alto número de parasitos no cérebro aos 18dI, independentemente da gestação. Não foram encontrados parasitos no útero/placenta em nenhuma das linhagens, independente do tempo de infecção e não houve diferença no índice de aborto dentre as fêmeas infectadas, apesar da linhagem CB10-H2 ter apresentado maiores danos histológicos comparada à C57BL/KsJ aos 8 e 18 dias de gestação e infecção. A infecção nas fêmeas C57BL/KsJ não-gestantes provocou aumento na migração de mastócitos para o útero enquanto que a gestação diminui tal migração. Além disso, camundongos C57BL/KsJ apresentaram altos níveis sistêmicos de IFN-γ aos 8dI e TNF e IL-6 aos 8 e 18dI comparados aos CB10-H2 gestantes e não-gestantes. Ainda, no útero/placenta das fêmeas CB10-H2 a gestação aumentou os níveis de expressão de FOXP3 e, sob a infecção, houve aumento no nível de expressão de IL-10, IL-13 e IL-17. Nossos resultados sugerem que, tanto o background genético como o haplotipo do MHC sejam essenciais na proteção contra os índices de reabsorção fetal e aborto nos casos de toxoplasmose congênita. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas