A transformação genética é uma alternativa ao melhoramento convencional de citros que permite a modificação de genótipos pela introdução de um ou mais genes oriundos de organismos semelhantes ou filogeneticamente distantes do hospedeiro. Os genes transferidos para espécies de interesse devem ser controlados por promotores, os quais regulam a expressão gênica de forma temporal, espacial e na magnitude desejada. Na maioria dos casos, os genes são expressos de forma constitutiva utilizando o promotor CaMV35S isolado do Vírus do Mosaico da Couve Flor. No entanto, o desenvolvimento de novas abordagens de transformação de plantas (cisgenia e intragenia), que fazem o uso de genes e sequências regulatórias derivadas da mesma espécie ou espécies relacionadas, requer a disponibilidade de elementos genéticos, incluindo promotores constitutivos, isolados de citros. Assim, o objetivo do trabalho foi clonar e caracterizar promotores constitutivos de Citrus sinensis. Para isso, a região promotora dos genes Fator de elongação 1-α (CsEF1), Gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase C2 (CsGAPC2) e Cyclofilina (CsCYC) foi isolada e avaliados pela fusão ao gene repórter uidA. A funcionalidade dos três promotores foi confirmada por ensaio histoquímico da atividade GUS em folhas, caules e raízes de plantas transgênicas de citros cv. \'Hamlin\'. A análise de RT-qPCR mostra que a expressão do gene uidA sob controle dos promotores CsCYC, CsGAPC2 e CsEF1 correspondeu a uma atividade aproximada de 64%, 58% e 47%, respectivamente em comparação com o promotor CaMV35S. A análise in silico dos promotores CsGAPC2, CsCYC e CsEF1 mostra que a atividade de cada um é controlada por uma série de putativos elementos cis-regulatórios. A sequência completa e versões truncadas originadas a partir de deleções em cada promotor foram fundidas ao gene uidA e analisadas em plantas transgênicas de Nicotiana benthamiana pelo ensaio histoquímico e fluorimétrico da atividade GUS. As análises de deleções não causaram perda de função dos promotores em estudo, mas afetaram a expressão gênica nos promotores CsGAPC2 e CsEF1. Os promotores isolados representam bons candidatos a serem utilizados em trabalhos de transformação genética de citros. / Genetic transformation is an alternative to citros conventional breeding that allows the modification of genotypes by the introduction of one or more genes derived from different organisms that can not be crossed by natural means. The transferred genes to the species of interest are controlled by promoters, which regulate a gene expression temporally, spatially and in the desired magnitude. In most cases, the introduced genes have been constitutively expressed using the CaMV35S promoter obtained from the cauliflower mosaic virus. However, the development of novel plant transformation approaches (cisgenesis and intragenesis) imply the use of genetic material from the same species or from closely related species capable of sexual hybridization, which requires the isolation of genetic elements, including citros constitutive promoters. The objective of this study was clone and characterize Citrus sinensis constitutive promoters. For this, the promoter region of the genes Elongation Factor 1-α (CsEF1), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase C2 (CsGAPC2) and Cyclofiline (CsCYC) was isolated and evaluated by fusion to the uidA reporter gene. The functionality of three promoter was confirmed by histochemical GUS assay in leaves, stems and roots of transgenic citrus plants cv. \'Hamlin\'. RT-qPCR analysis revealed that uidA gene expression under control of the CsCYC, CsGAPC2 and CsEF1 promoters was approximately 64%, 58% and 47% expression compared with the CaMV35S promoter. In silico analysis of the CsGAPC2, CsCYC and CsEF1 promoters displays their activity is controlled by a series of putative cis-regulatory elements. The full length promoter and truncated versions originated from deletions in promoters sequences were fused to the uidA gene and analyzed in Nicotiana benthamiana transgenic plants by histochemical and fluorimetric GUS assay. Deletion analysis did not cause loss of function on any of the promoters, but affected the gene expression on CsGAPC2 and CsEF1 truncated versions. The isolated promoters represent good candidates to be used in citros genetic transformation.

A transformação genética é uma alternativa ao melhoramento convencional de citros que permite a modificação de genótipos pela introdução de um ou mais genes oriundos de organismos semelhantes ou filogeneticamente distantes do hospedeiro. Os genes transferidos para espécies de interesse devem ser controlados por promotores, os quais regulam a expressão gênica de forma temporal, espacial e na magnitude desejada. Na maioria dos casos, os genes são expressos de forma constitutiva utilizando o promotor CaMV35S isolado do Vírus do Mosaico da Couve Flor. No entanto, o desenvolvimento de novas abordagens de transformação de plantas (cisgenia e intragenia), que fazem o uso de genes e sequências regulatórias derivadas da mesma espécie ou espécies relacionadas, requer a disponibilidade de elementos genéticos, incluindo promotores constitutivos, isolados de citros. Assim, o objetivo do trabalho foi clonar e caracterizar promotores constitutivos de Citrus sinensis. Para isso, a região promotora dos genes Fator de elongação 1-α (CsEF1), Gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase C2 (CsGAPC2) e Cyclofilina (CsCYC) foi isolada e avaliados pela fusão ao gene repórter uidA. A funcionalidade dos três promotores foi confirmada por ensaio histoquímico da atividade GUS em folhas, caules e raízes de plantas transgênicas de citros cv. \'Hamlin\'. A análise de RT-qPCR mostra que a expressão do gene uidA sob controle dos promotores CsCYC, CsGAPC2 e CsEF1 correspondeu a uma atividade aproximada de 64%, 58% e 47%, respectivamente em comparação com o promotor CaMV35S. A análise in silico dos promotores CsGAPC2, CsCYC e CsEF1 mostra que a atividade de cada um é controlada por uma série de putativos elementos cis-regulatórios. A sequência completa e versões truncadas originadas a partir de deleções em cada promotor foram fundidas ao gene uidA e analisadas em plantas transgênicas de Nicotiana benthamiana pelo ensaio histoquímico e fluorimétrico da atividade GUS. As análises de deleções não causaram perda de função dos promotores em estudo, mas afetaram a expressão gênica nos promotores CsGAPC2 e CsEF1. Os promotores isolados representam bons candidatos a serem utilizados em trabalhos de transformação genética de citros. / Genetic transformation is an alternative to citros conventional breeding that allows the modification of genotypes by the introduction of one or more genes derived from different organisms that can not be crossed by natural means. The transferred genes to the species of interest are controlled by promoters, which regulate a gene expression temporally, spatially and in the desired magnitude. In most cases, the introduced genes have been constitutively expressed using the CaMV35S promoter obtained from the cauliflower mosaic virus. However, the development of novel plant transformation approaches (cisgenesis and intragenesis) imply the use of genetic material from the same species or from closely related species capable of sexual hybridization, which requires the isolation of genetic elements, including citros constitutive promoters. The objective of this study was clone and characterize Citrus sinensis constitutive promoters. For this, the promoter region of the genes Elongation Factor 1-α (CsEF1), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase C2 (CsGAPC2) and Cyclofiline (CsCYC) was isolated and evaluated by fusion to the uidA reporter gene. The functionality of three promoter was confirmed by histochemical GUS assay in leaves, stems and roots of transgenic citrus plants cv. \'Hamlin\'. RT-qPCR analysis revealed that uidA gene expression under control of the CsCYC, CsGAPC2 and CsEF1 promoters was approximately 64%, 58% and 47% expression compared with the CaMV35S promoter. In silico analysis of the CsGAPC2, CsCYC and CsEF1 promoters displays their activity is controlled by a series of putative cis-regulatory elements. The full length promoter and truncated versions originated from deletions in promoters sequences were fused to the uidA gene and analyzed in Nicotiana benthamiana transgenic plants by histochemical and fluorimetric GUS assay. Deletion analysis did not cause loss of function on any of the promoters, but affected the gene expression on CsGAPC2 and CsEF1 truncated versions. The isolated promoters represent good candidates to be used in citros genetic transformation.

Conforme novas tecnologias e metodologias estão surgindo, e pesquisadores estão sedentos por ferramentas moleculares mas rápidas, mais eficientes e fáceis de usar, dominar os princípios e tecnologias do design de vetores e padronização de partes biológicas tornaram-se desafios fundamentais. Isso está abrindo espaço para o surgimento de uma disciplina inteiramente nova chamada Biologia Sintética. Esta área de estudo inovadora combina partes e módulos biológicos para criar sistemas mais confiáveis e robustos. Linhagens fúngicas são comumente alvo desses estudos, não apenas porque muitos achados fundamentais em relação à clonagem molecular surgiram das lições dadas por elas, mas também devido a um imenso e inexplorado potencial desses organismos em uma ampla gama de aplicações - desde biocombustíveis e produção de químicos finos até terapias biomédicas. Neste contexto, a presente dissertação é dividida em duas partes: a primeira diz respeito ao design e construção de uma ferramenta modular e versátil para ser aplicada em várias linhagens de fungos. Essa ferramenta é um plasmídeo binário para transformação mediada pro Agrobacterium tumefaciens, que foi construído em quatro diferentes versões contendo GFP ou mCherry como proteínas repórter e um gene sintético de resistência à higromicina como marcador de seleção. O vetor foi validado em Paracoccidioides lutzii, um patógeno oportunista humano dimórfico que é muito importante para medicina, mas ainda carecia de ferramentas genéticas eficientes. A segunda parte consiste na criação de uma biblioteca de promotores para a levedura oleaginosa Rhodosporidium toruloides, um promissor hospedeiro para a produção de bioprodutos a partir de biomassa, uma vez que pode eficientemente consumir açúcares C5 e C6 e aromáticos derivados da lignina. Vinte e nove promotores foram testados em um cassete de duplo-repórter - compreendendo ambas as proteínas fluorescentes GFP e mRuby - utilizando citometria de fluxo para análise de células únicas. A coleção de promotores apresentados neste trabalho é a maior disponível para R. toruloides até o momento e foi um avanço indispensável para superar a10 escassez de ferramentas para este organismo. Notavelmente, também apresentamos os primeiros promotores bidirecionais descritos para essa levedura e otimizamos o protocolo de transformação. Portanto, a Biologia Sintética foi eficientemente aplicada para expandir a coleção de partes biológicas padronizadas e otimizar vetores para transformação e manipulação genética de fungos. Estas ferramentas são de valor imediato e são aplicáveis a desafios muito distintos, mas igualmente importantes: a busca de novas soluções para a saúde humana e para uma economia bio-sustentável. / As new technologies and methodologies are surfacing, and researchers are now eager for fast, enhanced and easy-to-use molecular tools, mastering the principles and technologies of vector design and standardization of biological parts have become fundamental challenges. This is making room for the rise of an entirely novel discipline called Synthetic Biology. This innovative field of study combines biological parts and modules to create more reliable and robust systems. Fungal strains are commonly the target of these studies, not only because several fundamental findings regarding molecular cloning arose from lessons given by them, but also due to an immense and much unexplored potential of those organisms in a wide range of applications - ranging from biofuels and fine chemicals production to biomedical therapies. In this context, the present dissertation is divided in two parts: the first one concerns the design and construction of a modular and versatile tool to be applied in several fungal strains. This tool is a plasmid binary vector for Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, which was built in four different versions containing either GFP or mCherry as reporter proteins and a synthetic hygromycin resistance gene as selection marker. The vector was validated in Paracoccidioides lutzii, a dimorphic human opportunist pathogen that is very important for health care but was still lacking efficient genetic tools. The second part consists in the creation of a promoter library for the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides, a promising host for the production of bioproducts from biomass since it can efficiently consume C5 and C6 sugars and lignin-derived aromatics. Twenty-nine promoters were tested with a dual-reporter cassette - comprising both GFP and mRuby fluorescent proteins - using flow cytometer for single-cell analysis. The assortment of promoters presented in this work is the largest set available for R. toruloides until now and was an imperative advancement to overcome the scarcity of tools for this organism. Remarkably, we also presented the first bidirectional promoters described for this yeast and optimized the transformation protocol. Thus, we efficiently applied Synthetic Biology to expand the collection of standard biological parts and to12 optimize vectors for fungal transformation and genetic manipulation. These tools are of immediate value and are applicable for very distinct but equally important challenges: the pursuit of new solutions for human health and for a sustainable biobased economy