Introdução: A síndrome ou seqüência malformativa de Rokitansky-Mayer-Küster-Hauser (SR), de caráter geralmente esporádico, caracteriza-se por aplasia útero-vaginal, freqüentemente associada a anomalias esqueléticas e do trato urinário e a caracteres sexuais secundários, hormônios esteróides e cariótipo normais. A condição é claramente heterogênea, podendo fazer parte de outras seqüências e complexos mais abrangentes. Sua freqüência ao nascimento foi estimada em cerca de 1/5.000 meninas. O banco de dados OMIM (McKusick, 2005) classifica-a como autossômica recessiva e apenas um caso atípico, portador de virilização, foi atribuído a mutação descrita no gene WNT4 (Biason-Laubert e col.., 2004). A vitamina A e seus derivados ativos (ácidos retinóicos ou AR) desempenham papel importante nos processos de diferenciação, proliferação e apoptose celular. Mendelsohn e col. (1994) e Kastner e col. (1997) descreveram malformações congênitas semelhantes afins às da SR em camundongos portadores de mutações nos genes RAR-G e RXR-A dos receptores de AR. A região homóloga em humanos de um desses receptores corresponde exatamente à região descrita por Kucheria e col. (1988) em duas mulheres não aparentadas com agenesia mülleriana e portadoras de translocação (12;14)(q14;q31). Os fatores etiológicos responsáveis pelas anomalias müllerianas são ainda pouco conhecidos, mas o achado freqüente de afetadas com outros defeitos associados (renais, esqueléticos, cardíacos e auditivos) sugere o envolvimento de genes primordiais do desenvolvimento. Materiais e métodos: No total, 43 pacientes (todas com cariótipo 46,XX) e 21 familiares foram todos submetidos a exame clínico e ginecológico e de imagem (ultra-sonografia urogenital e raios-X de coluna) padronizados e à coleta de sangue para estudo cromossômico e molecular. O DNA foi extraído e amplificado por PCR Touch-Down; a triagem das mutações foi realizada em cinco genes (RARG, RXR-A, WNT-4, LHX-1 e KLHL-4) por eletroforese SSCP, dHPLC e de seqüenciamento (MegaBace). Quinze pacientes do total apresentando fenótipo mais grave foram triadas quanto a variações no número de cópias de DNA pela técnica de ~1 Mb array-CGH. As alterações detectadas foram validadas por FISH e MLPA. Foram excluídas alterações no número de cópias previamente descritas em indivíduos normais (DGV). Dois novos genes (LHX-1 e KLHL-4) surgiram como possíveis candidatos após a triagem com array- CGH e foram incluídos aos três genes candidatos previamente existentes. Resultados e conclusão: Trinta e nove pacientes possuíam quadro bastante típico de SR com agenesia útero-vaginal, em 27 delas acompanhado de manifestações extra-genitais como defeitos renais, ósseos, agenesia de ovários e surdez. Quatro pacientes apresentaram defeitos müllerianos isolados (agenesia de vagina) e uma outra era portadora da associação MURCS. A analise molecular por meio das técnicas de SSCP, dHPLC e seqüenciamentode todas as regiões codificados dos cinco genes candidatos permitiu identificar 95 alterações. A comparação com os bancos de dados (http://www.ensembl.org/) determinou que as alterações identificadas correspondem a variações populacionais polimórficas previamente descritas e sem efeito patogênico, uma vez que nenhuma delas altera a seqüência de aminoácidos das proteínas por elas codificadas. Mediante array-CGH foram identificadas, em 5 pacientes, um total de 7 alterações submicroscópicas (deleções e duplicações) comprometendo as regiões 1q21.1, 17q12, 22q11.21, 22q11.22, e Xq21.31. Alguns familiares das afetadas, também portadores dessas alterações, apresentavam manifestações leves, indicando que as alterações apresentam penetrância incompleta e expressividade variável. Nossos resultados afastam a RAR-G, RXR-A, WNT-4 como diretamente envolvidos na patogênese da síndrome de Rokitansky e sugerem a existência de variações no numero de copias de novas regiões cromossômicas como relevantes durante o desenvolvimento mülleriano, indicando especificamente os genes LHX1 e KLHL4 como candidatos. / Background: Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH) syndrome, comprising utero-vaginal atresia in otherwise phenotypically normal women with a normal karyotype (46,XX), has an incidence of about 1/5,000 among newborn girls. Anomalies of the genital tract range from upper vaginal atresia to total Müllerian agenesis (congenital absence of the Fallopian tubes, uterus, and upper vagina). Patients with müllerian aplasia (MA) often exhibit additional clinical features such as renal, vertebral and cardiac defects. A number of different syndromes have been associated with MA, and in most cases its aetiology remains poorly understood. We studied 43 women with the MRKH defect and 21 relatives presenting associated anomalies. The study included clinical and ultrasonographic examination of the urogenital system, radiographs of the vertebral column and sequencing of three candidate genes named RAR gama, RXR alpha and WNT-4. Fifteen of our patients, with more complex phenotypes (genital, renal, cardiac, and skeletal defects), were screened for DNA copy number changes by 1 Mb whole genome bacterial artificial chromosome (BAC) array based comparative genomic hybridization (CGH). The detected alterations were validated by an independent method and further mapped by high resolution oligo-arrays. Results: All patients had a normal 46,XX karyotype and were also normal to the RAR gama, RXR alpha and WNT-4 genes. Submicroscopic genomic imbalances affecting the 1q21.1, 17q12, 22q11.21, and Xq21.31 chromosome regions were detected in five probands. Presence of the alterations in the normal mother of one patient suggests incomplete penetrance and/or variable expressivity. Conclusion: 5 of the 15 patients were found to have cryptic genomic alterations. The imbalances on 22q11.21 support recent findings by us and others that alterations in this chromosome region may result in impairment of müllerian duct development. The remaining imbalances indicate involvement of previously unknown chromosome regions in MA, and point specifically to LHX1 and KLHL4 as candidate genes.

O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença autoimune com forte componente genético, caracterizada por inflamação crônica e produção de autoanticorpos. O objetivo deste trabalho foi determinar o perfil de variação no número de cópias (CNVs) e de regiões de perda de heterozigose (LOH) na patogênese do LES. A detecção de CNVs e LOH foi feita pela metodologia Cytoscan HD array em pacientes com LES (n = 23) e indivíduos saudáveis (n = 110). Devido à formação tri-híbrida da população brasileira, foi desenvolvido e validado um painel de 345 marcadores informativos de ancestralidade, a partir dados provenientes do próprio array, para estimar as proporções de ancestralidade individual e, em última instância, inseri-las nos modelos de regressão logística como variável de controle nas análises de distribuição de CNVs e LOH. O perfil de CNVs evidenciou que o número e o tamanho de duplicações são maiores nos indivíduos saudáveis do que nos pacientes com LES. Duplicações nos genes FCGR3B e ADAM3A foram descritas como fator de proteção ao LES, quando tais genes foram avaliados por PCR quantitativa em maior grupo amostral de pacientes (n = 135) e controles (n = 200). Além disso, mostrou-se o efeito sinérgico da presença da deleção em ambos os loci FCGR3B e ADAM3A no aumento do risco para desenvolver a doença. Deleções em pacientes com LES envolvendo os genes CFHR4, CFHR5 e HLA-DPB2, previamente descritos em associação com o LES na literatura, foram identificadas por array e confirmadas por PCR digital. O protocolo desenvolvido para identificação de variantes raras, resultou em um conjunto de 21 CNVs raras em pacientes com LES. Em relação às regiões de perda de heterozigose, não foram encontradas evidências de que o número médio e a extensão dos segmentos LOH seja diferente entre pacientes e indivíduos saudáveis. No entanto, os cromossomos 6 e 12 em pacientes exibem regiões de perda de heterozigose em maior quantidade e tamanho do que os de indivíduos saudáveis, além de apresentarem 17 segmentos LOH restritos ao grupo de pacientes com LES. Os resultados aqui descritos evidenciam que novos loci de susceptibilidade ao LES podem ser encontrados quando a distribuição de CNVs é analisada em todo o genoma, em que a investigação de sua relação com a patogênese pode contribuir para a compreensão da base genética da doença. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with a strong genetic background characterized by chronic inflammation and autoantibody production. The purpose of this study was to determine the copy number variation (CNV) and loss of heterozygosity (LOH) profiles in the susceptibility to SLE. The detection of CNVs and LOH was performed by the Cytoscan HD array methodology in SLE patients (n = 23) and healthy subjects (n = 110). Due to the tri-hybrid composition of the Brazilian population, a panel of 345 ancestral informative markers was developed and validated, based on data from the array itself, to estimate the proportions of individual ancestry and, ultimately, to insert them into the logistic regression models as a control variable in the analysis of CNV and LOH distribution. The CNVs profile showed that the burden and the size of duplications are higher in healthy individuals than in SLE patients. Duplications in FCGR3B and ADAM3A genes were described as a protective factor for SLE, when these genes were evaluated by quantitative PCR in a larger SLE (n = 135) and control (n = 200) groups. In addition, the synergistic effect of the presence of deletion in both FCGR3B and ADAM3A loci increase the risk of developing the disease. Deletions in SLE patients encompassing the CFHR4, CFHR5 and HLA-DPB2 genes, previously described in the literature in association to SLE, were identified by the array and confirmed by droplet digital PCR. The pipeline developed here for the identification of rare variants resulted in a set of 21 rare CNVs in SLE patients. Regarding the loss of heterozygosity regions, no evidence was found that the mean number and extent of LOH segments is different between patients and healthy individuals. However, the chromosomes 6 and 12 in SLE patients exhibit greater quantity and size of LOH than those of healthy individuals, besides showing 17 LOH segments restricted to the group of SLE. The results described here show that novel susceptibility loci to SLE can be found once the distribution of variants is analyzed throughout the genome, in which the investigation of its relation to the pathogenesis may contribute to the understanding of the genetic basis of the disease.

O genoma humano varia entre os indivíduos não somente na forma de sequência, mas também estruturalmente. Originalmente, organismos diploides possuem duas cópias de cada região autossômica, uma por cromossomo. Entretanto, com o avanço das técnicas moleculares de identificação do DNA, foram descritas sequências que se repetem em diferentes regiões do genoma em número maior ou menor do que as duas cópias esperadas. Essas variantes são denominadas copy number variants (CNVs) e definidas como segmentos genômicos, geralmente maiores do que 1 kilobase (kb), que variam em número de cópias em comparação com o genoma de referência. As CNVs podem contribuir para a variabilidade do risco entre os indivíduos na etiologia de doenças complexas. Nesse contexto, o Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença autoimune com forte componente genético, caracterizada por inflamação crônica e produção de autoanticorpos. Estudos de associação genômica em larga escala (GWAS) identificaram vários loci associados ao LES que contribuem para a susceptibilidade à patogênese. Entretanto, as pesquisas atuais com CNVs e LES focalizam apenas a análise individual de algumas variantes. O objetivo do presente trabalho foi conduzir o primeiro estudo de CNVs em larga escala em pacientes com LES. A detecção de CNVs foi feita por ensaio de Hibridação Genômica em arrays, utilizando a plataforma Affymetrix GeneChip® CytoScan HD em amostra de 23 pacientes com LES. Foram identificadas 406 CNVs distribuídas em todos os cromossomos, exceto no Y. A média foi de 18 CNVs por paciente. As deleções foram mais frequentes do que as duplicações, 311 e 95, respectivamente. O perfil de CNVs revelou 269 CNVs envolvendo genes, 152 CNVs únicas e 59 regiões de CNVs (CNVRs). Nove CNVs identificadas não haviam sido descritas em bancos de dados de variantes estruturais. Adicionalmente, encontramos CNVs em cinco genes previamente associados com LES: CFHR4, CFHR5, STAT4, MECP2 e HLA-DPB2. CNVs nestes genes foram reportadas em pacientes com LES pela primeira vez. O conhecimento das CNVs associadas com LES e autoimunidade podem contribuir para o entendimento da etiologia da doença. Em conclusão, o presente estudo foi o primeiro delineamento em larga escala de CNVs do genoma completo em pacientes com LES. / The human genome varies between individuals not only at the sequence level but also structurally. Originally, diploid organisms have two copies of each autosomal region, one per chromosome. Advances in molecular-based techniques for DNA identification enabled the description of many repeated sequences with higher or lower copy number than that two copies expected. Those sequences are termed copy number variants (CNVs) and are defined as genomic segments, usually greater than 1 kilobase (kb) in size, ranging in copy number when compared to reference genome. CNVs can contribute to risk variability among individuals in complex diseases etiology. In this context, Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with strong genetic component and is characterized by chronic inflammation and autoantibodies production. To date, genome-wide association studies (GWAS) have identified several loci associated with SLE that contribute to pathogenesis susceptibility. However, current CNVs studies associated with SLE focus only in few variants analysis. The aim of the present study was to conduct the first genome-wide CNVs study in SLE patients. CNVs detection was performed by high-resolution array Genomic Hybridization Assay, using the Affymetrix GeneChip® CytoScan HD platform, in 23 SLE patients samples. We identified 406 CNVs distributed in all chromosomes, except Y. The average was 18 CNVs per patient. Deletions were more frequent than duplications, 311 and 95, respectively. CNV profile showed 269 CNVs overlapped by genes, 152 unique CNVs and 59 CNV regions (CNVRs). Nine CNVs were never described in structural variants databases. We found CNVs in five genes previously associated with SLE: CFHR4, CFHR5, STAT4, MECP2 and HLA-DPB2. CNVs in these genes were reported in SLE patients for the first time. Knowledge of CNVs associated with SLE risk and autoimmunity could also improve our understanding of disease etiology. In conclusion, the present study was the first effort to search for CNVs in whole genome of SLE patients.

Abstract Dupuytren’s disease is a Caucasian male-dominant disease that affects the palmar fascia. Incidence grows with age, but persons with strong diathesis seem to develop the disease at an earlier age than the majority of the diseased. Myofibroblasts are histopathologically the main cell type in DD tissue. Despite scientific research, the aetiology of the disease is still unrevealed. Only genetic susceptibility is generally accepted as predisposing to DD. Available treatment has thus far been unsatisfactory, because only symptoms can be cured to date.The disease recurs. With genetic susceptibility the recurrence rates are high (even up to 70%) and the time to recurrence is inevitably shorter. This behaviour is considered the aggressive type of DD. To be able to predict the behaviour of DD, whether it is an aggressive or conventional type, twenty-one Dupuytren samples were gathered and compared with five controls by means of immunohistochemical stainings. It was found that cellularity was better expresented in aggressive and recurred samples. Alfa-SMA and Ki-67 showed more activity in the aggressive tissue type of DD. Tenascin was vaguely expressed in aggressive-type samples. To compare the gene and protein expressions and to obtain a more profound understanding of the disease, a microarray technique was used. With a microarray it is possible to compare nucleotide pair hybridisations to resolve the genome of the tissues. In this study RT-PCR was used to examine mRNA levels to determine gene expression changes. Twelve DD palmar fascia samples were compared with three healthy control samples. Both myoglobin and ROR2, which we considered as the most valuable results, were found in the DD samples. ROR2 acts as a receptor or co-receptor for the Wnt system. The Wnt signalling pathway transfers signals from outside of the cell through cell surface receptors, and plays a significant role in proliferation processes such as in fibrotic conditions. To evaluate a possible chromosomal imbalance behind the aetiology of the disease, eighteen DD palmar fascia samples were compared with two reference samples. However, we were not able to detect any chromosomal imbalance in the DD samples. The method used was Oligonucleotide aCGH Agilent’s 60-mer oligonucleotide-based microarray according to the manufacturer’s instructions, which can reveal gains and losses of approximately 35 kilobases in the whole genome. The result does not exclude copy number changes entirely; a small presence of aberrant cells will not be detected if the change is less than 50%. In conclusion, we revealed elements in DD tissue that would enable us to predict the nature of the disease; whether the disease is aggressive with a stronger tendency to recur. Histological differences could be detected, and this can be used to benefit patients. As a new element, ROR2 was discovered in DD tissue.The genome-wide analysis with the 44K oligonucleotide-based array method revealed no changes of DNA number sequences. / Tiivistelmä Kämmenkalvon kuroumatauti eli Dupuytrenin kontraktuura on valkoihoisen miehen kämmenkalvon sairaus. Sairastumisen todennäköisyys lisääntyy ikääntymiseen liittyen, mutta vahva sukurasitus poikkeuksellisesti altistaa sairaudelle jo tavanomaista nuoremmalla iällä. Myofibroblastit ovat tärkein ja edustetuin solutyyppi Dupuytren kudoksessa. Huolimatta runsaasta tutkimustyöstä ei etiologiaa ole saatu vielä selvitettyä. Sukurasitus näyttää selkeästi altistavan taudille. Toistaiseksi kyetään hoitamaan ainoastaan sairauden aiheuttamat seuraukset, mutta ei perussyytä. Lisäksi tauti uusiutuu. Dupuytrenin sukurasitus lisää uusiutumista suurella todennäköisyydellä. Myös uusiutumisaika on tuolloin tavanomaista nopeampi, ja kyseessä katsotaan olevan ns.aggressiivisempi taudin muoto. Väitöskirjatyössäni pyrittiin löytämään mahdollisia tekijöitä, joiden perusteella voitaisiin ennustaan onko kyseessä aggressiivisempi vai tavanomainen taudin muoto. Tätä varten tutkittiin kaksikymmentä yksi Dupuytren kudosnäytettä ja viisi tervettä kämmenkalvon näytettä immunohistologisilla värjäyksillä, ja voitiin todeta, että soluisuus oli selkeästi koholla aggressiivisten ja taudin uusineiden potilaiden näytteissä. Tulos oli samanlainen myös alfa-SMA ja Ki-67 suhteen. Tenaskiiniä voitiin löytää edellisiä niukemmin aggressiivisista näytteistä. Dupuytrenin taudin luonteen lisäselvittelemiseksi geeni- ja proteiinitasolla tehtiin mikroarray, jossa emäsparien pariutumisen avulla selvitetään taudin genomia ja myös sitten tästä aiheutuvien proteiinien ilmentymistä. Kahtatoista Dupuytren potilaan kämmenkalvon kudosnäyttettä verrattiin kolmeen terveeseen verrokki kudosnäytteeseen ja voitiin todeta myoglobiinin ja ROR2:n selkeät pitoisuuden muutokset terveisiin näytteisiin verrattaessa. ROR2 toimii solujen välisten viestien välityksen reseptorina, eli siirtää signaalin solun ulkopuolelta sen sisäpuolelle solun pinnalla olevan kiinnittymiskohdan avulla. Sillä on selkeä merkitys ja tehtävä proliferatiivisissä tapahtumissa, kuten sidekudoksen lisääntymisessä. Mahdollisia kromosomin määrän muutoksia Dupuytren kudoksessa selviteltiin kahdeksantoista kudosnäytteen tutkimisella ja löydösten tulosta verrattiin sitten kahteen normaaliin verrokki kudosnäytteen tulokseen. Tutkimuksessa ei saatu selville kromosomien määrän muutosta, kun muutosten kokonaismäärä on vähäinen tai ainakin alle 50 % kokonaismäärää alhaisempi. Yhteenvetona voidaan todeta, että löytyi histologisia kudoselementtejä, joiden perusteella voidaan ennustaa, onko Dupuyrenin tauti aggressiivisempi ja todennäköisemmin uusiutuva luonteeltaan. ROR2 ei ole aikaisemmin yhdistetty Dupuytrenin kontraktuuraan. Dupuytren kudoksesta ei voitu 44K oligonukleotide mikroarray tekniikalla paljastaa geenimäärien muutoksia.

Brachydactyly type A1 (BDA1) is a rare autosomal dominant trait characterized by the shortening of the middle phalanges of digits 2-5 and of the proximal phalange of digit 1 in both hands and feet. Many of the brachymesophalangies including BDA1 have been associated with genetic perturbations along the BMP-SMAD signaling pathway. The goal of this thesis is to identify the molecular pathways that are associated with the BDA1 phenotype through the genetic assessment of BDA1-affected families. We identified four missense mutations that are clustered with other reported BDA1 mutations in the central region of the N-terminal signaling peptide of IHH. We also identified a missense mutation in GDF5 cosegregating with a semi-dominant form of BDA1. In two families we reported two novel BDA1-associated sequence variants in BMPR1B, the gene which codes for the receptor of GDF5. In 2002, we reported a BDA1 trait linked to chromosome 5p13.3 in a Canadian kindred (BDA1B; MIM %607004) but we did not discover a BDA1-causal variant in any of the protein coding genes within the 2.8 Mb critical region. To provide a higher sensitivity of detection, we performed a targeted enrichment of the BDA1B locus followed by high-throughput sequencing. We report the identification of a novel 9.5 Kb intergenic tandem duplication in two unrelated BDA1-affected families. In-vitro and in-vivo reporter assays demonstrated the enhancer activity of noncoding conserved sequence elements found within the microduplication. We also show an upregulation of the neighboring genes, NPR3 and PDZD2, in the patients' fibroblasts that suggests a gain-of-function through the duplication of cis-regulatory elements on dose sensitive genes. By expanding the repertoire of BDA1-causing mutations in IHH, GDF5, BMPR1B and at the BDA1B locus, we have begun to elucidate a common genetic pathway underlying phalangeal formation and elongation.

O Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH) é a doença do neurodesenvolvimento mais comum na infância, afetando cerca de 5,8% de crianças e adolescentes no mundo. Muitos estudos vêm tentando investigar a suscetibilidade genética em TDAH, mas sem muito sucesso. Este estudo teve como objetivo analisar variantes raras e comuns contribuindo para a arquitetura genética do TDAH. Foram gerados os primeiros dados de exoma de TDAH de 30 trios brasileiros em que o filho foi diagnosticado com TDAH esporádico. Foram analisados tanto variações de único nucleotídeo (ou SNVs, single-nucleotide variants) quanto variações de número de cópias (ou CNVs, copy-number variants), tanto nesses trios quanto em outros conjuntos de dados, incluindo uma amostra brasileira de 503 crianças/adolescentes controles, bem como resultados previamente publicados em quatro estudos com variação de número de cópias e uma meta-análise de estudos de associação ao longo do genoma. Tanto os trios quanto os controles fazem parte da Coorte de Escolares de Alto Risco para o desenvolvimento de Psicopatologia e Resiliência na Infância do Instituto Nacional de Psiquiatria do Desenvolvimento (INPD). Os resultados de trios brasileiros mostraram três padrões marcantes: casos com variações herdadas e somente SNVs de novo ou CNVs de novo, e casos somente com variações herdadas. Embora o tamanho amostral seja pequeno, pudemos ver que diferentes comorbidades são mais frequentes em casos somente com variações herdadas. Após explorarmos a composição de variações nos probandos brasileiros, foram selecionados genes recorrentes entre amostras do nosso estudo ou em bancos de dados públicos. Além disso, usando somente genes expressos no cérebro (amostras pós-mortem dos projetos Brain Atlas e Genotype-Tissue Expression), construímos uma rede de interação proteína-proteína \"in silico\" com interações físicas confirmadas por pelo menos duas fontes. Análises topológicas e funcionais dos genes da rede mostraram genes relacionados a sinapse, adesão celular, vias glutamatérgicas e serotonérgicas, o que confirma achados de trabalhos independentes na literatura indicando ainda novos genes e variantes genéticas nessas vias. / Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder (ADHD) is the most common neuro-developmental disorder in children, affecting 5.8% of children and adolescents in the world. Many studies have attempted to investigate the genetic susceptibility of ADHD without much success. The present study aimed to analyze rare and common variants contributing to the genetic architecture of ADHD. We generated exome data from 30 Brazilian trios where the children were diagnosed with sporadic ADHD. We analyzed both single-nucleotide variants (SNVs) and copy-number variants (CNVs) in these trios and across multiple datasets, including a Brazilian sample of 503 children/adolescent controls from the High Risk Cohort Study for the Development of Childhood Psychiatric Disorders, and also previously published results of four CNV studies of ADHD involving children/adolescent Caucasian samples. The results from the Brazilian trios showed 3 major patterns: cases with inherited variations and de novo SNVs or de novo CNVs and cases with only inherited variations. Although the sample size is small, we could see that various comorbidities are more frequent in cases with only inherited variants. After exploring the rare variant composition in our 30 cases we selected genes with variations (SNVs or located in CNV regions) in our trio analysis that are recurrent in the families analyzed or in public data sets. Moreover, using only genes expressed in brain (post-mortem samples from Brain Atlas and The Genotype-Tissue Expression project), we constructed an in silico protein-protein interaction (PPI) network, with physical interactions confirmed by at least two sources. Topological and functional analyses of genes in this network uncovered genes related to synapse, cell adhesion, glutamatergic and serotoninergic pathways, both confirming findings of previous studies and capturing new genes and genetic variants in these pathways.

A doença de Alzheimer (DA) é a causa mais comum de demência na população, sendo responsável por cerca de 50 a 60% dos casos. Embora o diagnóstico clínico da doença na maioria das vezes seja acurado, a confirmação da DA só é feita post mortem através principalmente da caracterização dos dois tipos principais de lesões neurais: depósitos extracelulares de placas de β amiloide e emaranhados de proteína tau hiperfosforilada. Até o momento, o envolvimento de apenas quatro genes foi confirmado na etiologia da DA, três deles (APP, PSEN1 e PSEN2) associados à forma familial de herança mendeliana, que corresponde a um tipo raro e grave. No entanto, apesar de inúmeros trabalhos de associação genômica, (Genome wide association studies- GWAS) sugerirem uma possível participação de vários outros genes na suscetibilidade à manifestação da forma multifatorial da DA, o gene APOE, ainda é o único consistente e reproduzivelmente associado à doença. As descobertas derivadas dos GWAS investigando o papel de SNPs coletivamente explicam somente uma pequena porcentagem da variação herdada que contribui para o risco de desenvolver a DA. Atualmente, há novas abordagens para investigar a base genética do restante da variabilidade fenotípica herdada e que pode influenciar a suscetibilidade ao desenvolvimento de doenças complexas. O papel da variação do número de cópias de segmentos de DNA (Copy Number Variation - CNV) na genética de doenças complexas foi demonstrado por diversos estudos nos últimos anos e evidencia que desequilíbrios genômicos também podem contribuir significantemente para a resistência ou susceptibilidade a várias patologias. Outro aspecto que vem assumindo crescente importância é a análise de modificações epigenéticas que podem constituir um mecanismo molecular básico e contribuir diretamente para a patogênese da DA. Logo, este trabalho teve como objetivo principal investigar dois aspectos relacionados à DA: (1) a identificação de CNVs que podem estar contribuindo para o desenvolvimento da forma multifatorial da DA, usando a técnica de array-CGH, e (2) a análise de alterações do padrão global de metilação do DNA no córtex frontal de indivíduos com a forma multifatorial da DA, usando um microarranjo que interroga o status de metilação de 450.000 sítios CpGs. Em nossa investigação sobre desequilíbrios genômicos na DA, identificamos 6 CNVs raras com conteúdo gênico relevante para o fenótipo investigado. Dois indivíduos distintos do grupo DA apresentam microduplicações em genes que codificam diferentes subunidades do mesmo tipo de canal de Ca2+ dependente de voltagem, o tipo L. Além disso, dos outros genes selecionados como especialmente interessantes, 4 estão envolvidos em diferentes processos inflamatórios e 1 é responsável por codificar a enzima nicotinamida fosforibosiltransferase, participante importante da via de biossíntese da molécula nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD). A implicação de um possível envolvimento de mediadores da sinalização celular do Ca2+ e da via de biossíntese da NAD na etiologia da DA também foi reforçada pelos nossos resultados sobre o padrão de metilação do DNA na DA. Dois genes importantes para a homeostasia intracelular do Ca2+ e via de biossíntese da NAD apresentaram sítios CpGs diferenciamente metilados nos sujeitos com DA / Alzheimer\'s disease (AD) is the most common form of dementia in the population, corresponding to 50-60% of all cases. Although clinical diagnosis seems to be accurate, the definitive diagnosis of the disease can only be made by a post mortem neuropathological exam that certifies the presence of the two hallmarks of AD: the accumulation of extracellular senile plaques containing β-amyloid (Aβ) and the intracellular neurofibrillary tangles containing hyperphosphorylated tau protein. Four genes are known to be involved in the etiology of AD, three of them (APP, PSEN1 and PSEN2) are associated to the familial form of the disease, which show autosomal dominant inheritance and correspond to the more severe and rare type of AD. Despite many genome wide association studies (GWAS), APOE still remains the only unequivocal genetic risk factor associated to the multifactorial form of AD. The discoveries from GWAS using SNPs collectively explain only a small percentage of heritable variation that may contribute in AD risk. Currently, new approaches have been used to investigate the genetic basis of the phenotypical variability inheritance that can influence the susceptibility of complex diseases. The important role of DNA copy number variation (CNV) has been demonstrated by several studies over the last years and shows that genomic imbalances may also significantly contribute to resistance or susceptibility to various complex diseases. Additionally, there is now increasing interest in exploring how epigenetic modifications, in particular DNA methylation, could influence complex diseases etiology. Thus, the major aim of this work were to investigate two aspects related to the multifactorial form of AD: (1) identification of rare CNVs, using array-CGH, that could contribute to the development of the disease, and (2) analysis of the DNA methylation pattern in frontal cortex of individuals with AD. In our study, we identified 6 rare CNVs with relevant gene content to the investigated phenotype. Two distinct subjects with AD from our casuistic presented microduplications in genes that encode different subunits of the same type of Ca2+ voltage channel, the L-type. Furthermore, among the other selected genes, four are involved in different inflammatory process and one encodes the nicotinamide phosphoribosyltransferase enzyme, important mediator of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) biosynthesis. The implication of a possible involvement of Ca2+ intracellular signaling mediators and NAD biosynthesis pathway in the etiology of AD was also reinforced by our analysis of DNA methylation pattern. Interestingly, two important genes, one to intracellular Ca2+ homeostasis and the other to NAD biosynthesis pathway presented CpGs sites differently methylated in the AD subjects

Os tumores malignos hepáticos são raros nas crianças, sendo o tumor embrionário hepatoblastoma a neoplasia hepática mais comum em crianças abaixo dos 5 anos e, ainda assim, responsável por apenas 1% dos tumores incidentes nessa faixa etária. Devido, entre outros fatores, à sua baixa incidência, o hepatoblastoma é um tumor ainda pouco caracterizado a nível molecular. O presente trabalho contemplou três frentes de análises moleculares em hepatoblastomas: análise de alterações em número de cópias (através da técnica array-CGH), investigação de mutações somáticas em regiões codificadoras (sequenciamento de exoma por next-generation) e delineamento de perfil global de metilação de DNA (beadarrays). Encontramos um baixo número de alterações em número de cópias, na maioria ganhos de grande extensão cromossômica, evidenciando uma baixa instabilidade cromossômica em comparação ao encontrado em outros tumores sólidos de adultos. Uma região em 2q24 previamente associada a um pior prognóstico em hepatoblastomas foi encontrada como ganho de alta amplitude (amplicon). A análise de expressão gênica na área destacou 5 dos 48 genes como super-expressos em nossas amostras de hepatoblastomas (DAPL1, ERMN, GALNT5, SCN1A e SCN3A). Foi observada também uma baixa ocorrência de mutações somáticas não-sinônimas, quando comparada à magnitude de variações encontradas em outros tumores sólidos de adultos. Descrevemos uma nova mutação não-sinônima danosa no exon 3 do gene CTNNB1 (beta-catenina), marcador molecular de destaque em hepatoblastomas, que provavelmente desenvolve um papel importante na tumorigênese deste tipo de neoplasia. Dentre a lista de alterações somáticas encontradas, cabe destacar o enriquecimento da via Wnt, via da beta-catenina, já bem estudada em hepatoblastomas e que apresenta correlação tanto com desenvolvimento embrionário como com o processo de carcinogênese. Destacamos uma lista de mutações somáticas não-sinônimas presentes com boa cobertura em nossos experimentos, e ausentes ou presentes em baixa frequência (< 1%) na população. O presente estudo é o pioneiro na análise de alterações globais no padrão de metilação de citosinas em hepatoblastomas, e revelou um padrão incomum de hipometilação global nos tumores, não associado à metilação de regiões repetitivas LINE-1; especificamente, hepatobastomas apresentam um nível intermediário entre o encontrado para os fígados maduros e aquele encontrado para os fígados fetais. Tal achado dá suporte ao modelo no qual a tumorigênese do hepatoblastoma recapitularia fases do desenvolvimento fetal do fígado. Foram destacados 11 genes que apresentaram padrão de metilação de DNA diferencial em seus promotores. Em suma, nossos achados revelam que o tumor embrionário hepatoblastoma apresenta relativa estabilidade genética, com uma frequência menor de alterações (alterações em número de cópias e mutações somáticas em regiões codificadoras) que tumores sólidos de adultos. Simultaneamente, foi detectado um padrão marcante de hipometilação global de DNA associado ao tumor, evidenciando a importância de aspectos epigenéticos em sua tumorigênese / Hepatic malignant tumors are rare in children, the embryonal tumor hepatoblastoma is the most common liver cancer in children under 5 years old but, in spite of that, accounts for only 1% of incident tumors in this age group. Due to its low incidence, among other factors, hepatoblastoma is a tumor poorly characterized at molecular level. This study included three approaches of molecular analyzes in hepatoblastomas: examination of copy number alterations (through array-CGH technique), investigation of somatic mutations in coding regions (next-generation exome sequencing) and determination of the global DNA methylation profile (bead arrays). We found a low frequency of copy number alterations, mostly consisting of large extent chromosomal gains, reflecting lower chromosomal instability than other solid adult tumors. A region at 2q24, previously associated with worse prognosis in hepatoblastomas, was found amplified in high amplitude (amplicon). Gene expression analysis of the 48 genes comprised in the amplicon segment highlighted five genes as overexpressed (DAPL1, ERMN, GALNT5, SCN1A and SCN3A). We also observed a low frequency of non-synonymous somatic mutations in our hepatoblastomas samples compared to the amount of variation found in other adult solid tumors. We described a predicted harmful non-synonymous mutation in exon 3 of CTNNB1 gene (beta-catenin), the best characterized molecular marker in hepatoblastomas. The list of somatic alterations points to a remarkable enrichment of genes from the Wnt pathway, which is well-studied in hepatoblastomas and is associated both with embryonic development and with the process of carcinogenesis. We highlighted a list of non-synonymous somatic mutations that presented high coverage in our experiments, and were absent or present at low frequency (<1%) in the general population. This study is the first to analyze global changes in cytosine methylation in hepatoblastomas, and revealed an unusual pattern of global hypomethylation in these tumors, not associated with LINE-1 repetitive regions; specifically, hepatobastomas exhibited an intermediate level of methylation, in between the patterns of mature and fetal livers. This finding supports the model in which the oncogenesis of hepatoblastoma recapitulates stages of fetal liver development. We highlighted 11 genes that showed differential pattern of DNA methylation in their promoters compared to differentiated liver. In summary, our findings show that the embryonal tumor hepatoblastoma are relatively genetically stable with lower frequency of alterations (changes in copy number and somatic mutations in coding regions) than most solid adult tumors. Simultaneously, a clear pattern of global hypomethylation of non-repetitive DNA was associated with the tumor, indicating the importance of epigenetic aspects in its tumorigenesis

Autism Spectrum Disorder (ASD) is a heterogeneous group of neurodevelopmental disorders that affects about 1% of the worldwide population and has a strong genetic component. Stereotyped behavior and restricted interests, as well as problems of social interaction and communication characterize ASD. Moreover, in 10% of cases, ASD occurs as a secondary condition in addition to a syndrome, such as Phelan-McDermid syndrome (PMS), which is associated with a great clinical variability. Among genetic factors, copy number variations (CNVs) are one of the most important. However, the clinical significance of many CNVs remains nuclear and there is an underrepresentation of small CNVs associated with ASD in the literature. In this context, this project aimed to 1) characterize large and small CNVs in Brazilian patients with ASD using an array-CGH previously customized in our laboratory. 2) Clinically and genetically describe a cohort of Brazilian patients with PMS, as well as to determine the frequency of this syndrome among Brazilian patients with ASD and other neurodevelopmental disorders. In result, we 1) further validated the customized array-CGH, 2) provided additional evidence of association with ASD for 27 candidate genes, 3) described 15 CNVs never reported in the literature in association with this disorder, 4) presented evidence that around 70% of CNVs found in our cohort are not polymorphism of our population and 5) reinforced the idea of shared molecular pathways among different neurodevelopmental disorders. In addition, we described for the first time a Brazilian cohort of patients with PMS and contributed to the molecular and clinical characterization of this syndrome. We also provided additional evidence of genotype-phenotype association with regard to the presence of renal problems and speech status in patients with PMS and estimated the frequency of this syndrome among Brazilian patients with ASD and intellectual disability (syndromic or not). With these results, we hope to contribute to better understand the ASD and PMS etiology, especially in our population / O Transtorno do Espectro Autista (TEA) corresponde ao um grupo heterogêneo de alterações no neurodesenvolvimento que afeta cerca de 1% da população mundial e apresenta um forte componente genético. O TEA é caracterizado pela presença de comportamento estereotipado e interesses restritos, além de problemas de interação social e comunicação. Além disso, em 10% dos casos, o TEA ocorre como uma condição secundária somada a uma síndrome. Um exemplo é a síndrome de Phelan-McDermid (PMS), associada a uma grande variabilidade clínica. Dentre os fatores genéticos, as variações no número de cópias (CNVs) são um dos mais importantes. No entanto, o significado clínico de muitas CNVs permanece incerto, além de haver juma sub-representação de CNVs pequenas associadas ao TEA na literatura. Dentro deste contexto, este projeto teve como objetivos 1) caracterizar CNVs grandes e pequenas em pacientes brasileiros com TEA utilizando uma lâmina de array-CGH previamente customizada no Laboratório de Genética do Desenvolvimento - USP. 2) descrever clínica e geneticamente uma casuística de pacientes brasileiros com PMS, bem como determinar a frequência desta síndrome em pacientes com TEA e com outras alterações de neurodesenvolvimento. Como resultados, nós 1) validamos a lâmina customizada, 2) fornecemos evidencia adicional de associação com o TEA para 27 genes, 3) descrevemos 15 CNVs nunca reportadas em associação com o transtorno 4) apresentamos evidências de que cerca de 70% das CNVs encontradas em nossa coorte não são polimorfismo de nossa população e 5) reforçamos a ideia de vias moleculares compartilhadas entre diferentes alterações do neurodesenvolvimento. Além disso, descrevemos pela primeira vez uma casuística brasileira de pacientes com PMS e contribuímos para a síndrome. Fornecemos evidência adicional de associação genótipo-fenótipo no que diz respeito à presença de problemas renais e status de fala em pacientes com PMS e estimamos a frequência da síndrome entre pacientes brasileiros com TEA e com deficiência intelectual (sindrômica ou não). Com estes resultados, esperamos ter contribuído para o entendimento da etiologia tanto do TEA, quanto da PMS, sobretudo na nossa população

Copy number variation detection in prokaryotic organisms is currently receiving more and more attention, mainly due to the association of CNV with pathogenicity and antibiotic resistance in bacteria. The algorithm designed in this thesis uses peak detection in sequencing coverage to detect CNV segments. Read coverage is commonly obtained by mapping sequencing reads of one individual to an already known reference of another individual of the same species. However, two individuals will always differ in a certain number of genes, resulting in unmapped reads that are unnecessarily discarded. Therefore, this work assumes that the biological accuracy of CNV detection can be increased by using a new reference that is created from the same set of reads as the reads mapped to this reference. Sequencing reads of Klebsiella pneumoniae individuals are used to verify this assertion.