Orientador: Áureo Evangelista Santana / Banca: Belinda Pinto Simões / Banca: Márcia Mery Kogika / Banca: Mirela Tinucci Costa / Banca: Gilson Hélio Toniollo / Resumo: As células-tronco promovem a reconstituição hematopoética e de outros tecidos, estando presentes no embrião, sangue periférico, medula óssea e sangue do cordão umbilical (SCU). Os modelos experimentais de células-tronco do sangue periférico e da medula óssea, em cães, têm propiciado informações relevantes para transplantes de células-tronco em humanos. Entretanto, não existe estudo sobre o SCU canino. O objetivo deste ensaio foi padronizar um método de coleta de SCU de cães sadios e quantificar as células sangüíneas e células-tronco CD34+ do SCU. No presente protocolo, a coleta de SCU de 40 cães neonatos foi realizada para contagem das células sangüíneas, com o auxílio de um contador automático de células, bem como das células-tronco, CD34+, utilizando-se do citômetro de fluxo. O método de coleta do SCU na porção justaplacentária dos vasos umbilicais permitiu a quantificação das células sangüíneas e células-tronco. Os valores hematológicos do SCU, exceto o VCM e o número de plaquetas, apresentaram-se reduzidos com relação àqueles de cães recém-nascidos e adultos. Apesar do volume escasso de SCU (1325 mL), a quantidade de células-tronco do cordão umbilical canino (3,38l2,72 CD34+ x106/kg) é semelhante àquela reportada para medula óssea, bem como para o sangue periférico mobilizado de cães adultos, sendo coincidente com aquela preconizada para reconstituição hematopoética. / Abstract: Stem cells promote the reconstitution of the hematopoietic and others tissues, and are present in the embryo, peripheral blood, bone marrow and umbilical cord blood (UCB). The experimental models of bone marrow and peripheral blood stem cells in dogs provide important information for stem cells transplants in humans. However, there are no studies on the UCB cells of dogs. This experiment aimed at standardizing the collection method and at quantifying blood and stem cells in the umbilical cord of dogs aiming at hematological recuperation. In this assay, UCB of 40 neonates dogs was collected for blood cell count in automatic cell counter and stem cell CD34+ count in flow cytometer. The method of UCB collection at the juxta-placental portion of the umbilical vessels allowed UCB blood and stem cell CD34+ quantification. The hematological values of UCB, except for the Mean Corpuscular Volume and platelet count, were reduced as compared to the reference values of the peripheral blood of healthy neonate and adult dogs. Despite the small volume of UCB (1325 mL), the quantity of stem cells in the canine umbilical cord (3.38l2.72 CD34+ x106/kg) is similar to that reported in the bone marrow and mobilized peripheral blood of adult dogs, coinciding with the amunt recommend for hematopoietic reconstitution. / Doutor

Orientador: Noboro Miasaki / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Pediatria / Inclui anexos / Resumo: O escore de Apgar foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a necessidade ou não de ressuscitação. Seu uso indiscriminado levou ao diagnóstico de asfixia, enquanto este diagnóstico requer evidência de hipercapnia, hipóxia e acidose. O escore de Apgar isoladamente é insuficiente para o diagnóstico de asfixia pois pode ser influenciado por fatores como prematuridade, baixo peso ao nascimento, uso de anestésicos, manuseio obstétrico e pediátrico, além da liberação de catecolaminas pelo próprio sofrimento fetal aumentando a pontuação no escore. Bioquimicamente, situações diversas podem acontecer. Na acidose maternogênica ou transfusional, a produção de ácido láctico é realizada pela mãe, especialmente no segundo estágio do trabalho de parto pelas musculaturas esquelética e uterina. Na acidose de origem fetal, a produção de ácido láctico se inicia com a diminuição da oferta de oxigênio e metabolismo anaeróbio gerado pelo feto. Existe ainda a ocorrência de acidose fisiológica no feto durante o processo do parto, caracterizado por interrupções frequentes no fluxo placentário durante as contrações uterinas. Com o objetivo de avaliar a condição de nascimento foi realizado a correlação entre o estudo acido-básico materno-fétal, o escore de Apgar e o comportamento da ATPase Na+-K+ dependente, principal componente da Bomba de sódio, responsável por aproximadamente 70% do fluxo de cátions. Os exames foram realizados em 41 recém-nascidos á termo, no sangue do cordão umbilical, coletado imediatamente após o nascimento, após duplo clampeamento. A média de peso de nascimento da população de estudo foi de 3178 ± 486g e de idade gestacional, 30,91 ± 0,98 semanas. Trinta casos (73,17%) tiveram Apgar no I o minuto > 7 e 11 (26,83%) < 7. De acordo com o pH da artéria umbilical os casos foram classificados em: sem acidose (pH > 7,25) em 17 casos, pré-acidose (jpH entre 7,20 e 7,24) em 8 e com acidose (pH < 7,20) em 16. Metade dos casos com Apgar no Io minuto > 7 apresentaram pré-acidose ou acidose. De acordo com a diferença de pH e BE materno-artéria umbilical, os casos de acidose foram subdivididos em: acidose fetal (diferença de BE > 6 e de pH > 0,15) em 10 casos (62,5%) e acidose maternogênica (diferença de BE < 6 e de pH < 0,15) em 6 casos (37,5%). Com acidose de origem fetal, 50% dos casos apresentaram Apgar no Io rninuto < 3 enquanto na acidose maternogênica o menor Apgar de Io minuto foi igual a 7 em 33% dos casos. Todos os casos com Apgar de 5o minuto igual a 7 pertenciam ao grupo com acidose fetal. A ATPase, especificamente a ATPase Ouabaína-sensivel, è responsável pelo gradiente de Na+ e K+ intra e extracelular e, portanto, pela manutenção do volume celular normal. A liberação de catecolaminas, sob acidose e hipóxia, estimula a troca Na+-H+, trocando um Na+ externo por ura próton interno. O resultado é a captação simultânea de Na+ e C1" com edema celular. A hipóxia determina ainda perda de K+ pela célula. Há então ativação da Bomba de sódio na tentativa de corrigir o desequilíbrio eletrolítico, extruindo íon Na+ e captando íon K+. Predominou em toda a amostra, independente da presença ou não de acidose ou hipóxia, Na+ intíaeritrocitário elevado (69,69%), Na+ extraeritrocitário diminuído (85,71%), K+ intraeritrocitário diminuído (63,63%) e K+ extraeritrocitário elevado (62,85%), compatível com inibição da ATPase Ouabaína-sensivel, que esteve diminuída em todos os casos. Entretanto, com acidose de origem fetal, a diminuição da ATPase Ouabaína-sensivel esteve entre 50-100% do limite inferior normal, enquanto na maternogênica esta diminuição não ultrapassou 50% do mesmo limite. Embora a inibição enzimática verificada em toda a amostra esteja provavelmente relacionada à inibição fisiológica determinada pela circulação de uma substância "like-ouabaina" produzida pela unidade feto-placentaria, houve maior inibição da ATPase na acidose de origem fetal, reflexo do verdadeiro sofrimento fetal. No recém-nascido deprimido de qualquer idade gestacional, a avaliação acido-básica maternofetal é indispensável para o diagnóstico da condição de nascimento e da causa da depressão neonatal. No recém-nascido à termo, vigoroso, também esta avaliação è necessária, já que em 50% dos casos houve pré-acidose ou acidose. Esta avaliação é fundamental para o diagnóstico real da condição de nascimento e para permitir possíveis avaliações neuropsicomotoras futuras relacionadas a acidem ia neonatal. A determinação da Bomba de sódio deve merecer maior atenção como marcador do edema celular na asifixia perinatal.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2013. / Submitted by Luiza Silva Almeida (luizaalmeida@bce.unb.br) on 2013-07-17T19:09:59Z No. of bitstreams: 1 2013_CarolinaGonzalesdaSilva.pdf: 1871143 bytes, checksum: 939e8e78e70378e8fbfbf273f00b5582 (MD5) / Approved for entry into archive by Leandro Silva Borges(leandroborges@bce.unb.br) on 2013-07-17T19:53:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_CarolinaGonzalesdaSilva.pdf: 1871143 bytes, checksum: 939e8e78e70378e8fbfbf273f00b5582 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-17T19:53:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_CarolinaGonzalesdaSilva.pdf: 1871143 bytes, checksum: 939e8e78e70378e8fbfbf273f00b5582 (MD5) / A clonagem por transferência nuclear (TN) ainda é uma técnica com baixa eficiência em bovinos. Um dos fatores que deve ser melhorado é a fonte de células doadoras de núcleo. Quanto menos diferenciadas forem estas células, mais facilmente elas serão reprogramadas pelo citoplasma receptor, a fim de originarem embriões e bezerros a termo de uma forma saudável. Células do fluido amniótico (CFA), da geleia de Wharton do cordão umbilical (CGW) e do tecido adiposo (CTA) são fontes de células multipotentes com potencial para uma melhor reprogramação e que ainda não haviam sido testadas para a produção de embriões bovinos por meio de TN. O objetivo deste trabalho foi isolar, cultivar, criopreservar e utilizar no procedimento de TN as CFA, CGW e CTA de bovinos. Primeiramente, foram isoladas CFA de úteros de abatedouro para testar o melhor meio de cultivo (DMEM vs Amniomax Complete II), e o melhor agente crioprotetor (glicerol vs DMSO vs DMF) quanto a preservação de viabilidade celular avaliada por azul de Trypan 0,4%. Posteriormente, testou-se a possibilidade de isolamento in vivo dos tipos celulares. O cultivo foi feito por centrifugação das CFA e explante das CGW e CTA. Para comparação morfológica foi realizada a Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) das células em cultivo. Para avaliação de integridade de DNA realizou-se a metodologia de TUNEL. Para a análise estatística foi realizada ANOVA seguida de teste de Tukey (p<0,05). O meio Amniomax Complete II apresentou crescimento e confluência das CFA em todos os materiais isolados de quatro animais. O DMSO e o glicerol preservaram uma maior porcentagem de células (84,50±9,53% e 63,00±18,18%, respectivamente), e foram superiores ao meio com DMF (42,00±13,92%). Obteve-se êxito no isolamento in vivo dos tipos celulares, por meio de aspiração intravaginal guiada por ultrassom no caso das CFA, coleta do cordão umbilical no momento do parto para as CGW e coleta de biópsia de animal jovem para as CTA. A avaliação de TUNEL revelou 100% de células com DNA íntegro para os três tipos celulares em primeira passagem. As micrografias em MEV revelaram CTA em padrão fusiforme de crescimento e CFA e CGW sem forma definida sob cultivo. Houve diferença significativa nas taxas de eletrofusão, com resultados superiores para CFA e CGW (85,89±9,93% e 69,64±11,72%, respectivamente), em relação às CTA (50,07±10,64%). A produção embrionária não diferiu estatisticamente entre os três tipos celulares (46,47±7,92%, 45,46±13,03% e 62,67±15,15%, para CTA, CFA e CGW, respectivamente), entretanto observou-se uma superioridade de aproximadamente 17% na produção de blastocistos para CGW em relação a CTA e CFA. Foram obtidas gestações de todos os tipos celulares, mas somente uma gestação veio a termo, proveniente de TN com CFA, e uma gestação encontra-se aos 200 dias, proveniente de CTA. O animal nascido por secção cesariana veio a óbito logo após o parto por insuficiência respiratória. Demonstrou-se ser possível isolar, cultivar e criopreservar CFA, CGW e CTA de bovinos vivos sem prejudicá-los e produzir embriões por meio de TN com eficiência utilizando esses tipos celulares. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cloning by nuclear transfer (NT) is still a technique with low efficiency in cattle. One of the factors that should be improved is the source of nucleus donor cells. The less differentiated are the cells, the easier is to reprogram their nuclei by cytoplasm receiver in order to originate healthy embryos and calves. Cells from amniotic fluid (CAF), Wharton's jelly of the umbilical cord (CWJ) and adipose tissue (CAT) are sources of multipotent cells with potential for improve reprogramming and that had not been tested for the production of bovine embryos by NT. The aim of this study was to isolate, cultivate, cryopreserve and utilize in the NT procedure, the CAF, CWJ and CAT of bovine. Firstly, CAF of uteri obtained from slaughterhouse were isolated to test what is the best medium for in vitro culture (DMEM vs Amniomax Complete II), and the best cryoprotectant agent (glycerol vs DMSO vs DMF), as the preservation of the cell viability assessed by Trypan Blue 0,4%. Subsequently, the possibility of isolating in vivo the described cell types was tested. The culture was done by centrifugation of CAF and explantation of CWJ and CAT. For morphological comparison, scanning electron microscopy (SEM) of the cells in culture was performed. For evaluating DNA integrity, the TUNEL method was carried out. For the statistical analysis was performed ANOVA followed by Tukey test (p<0,05). The medium Amniomax Complete II presented growth and confluence of the CAF in all material isolated from four animals. The DMSO and glycerol preserved a higher percentage of cells (84.50±9.53% and 63.00±18.18%, respectively), and were superior to medium with DMF (42.00±13.92%). Success was obtained in the isolation of cell types in vivo through use intravaginal ultrasound- guided aspiration for CAF, collection from the umbilical cord at birth for CWJ and by collecting biopsy from young animal for CAT. The evaluation of TUNEL revealed 100% of cells with intact DNA for the three cell types in the first passage. The SEM micrographs revealed a fusiform growth of CAT, and CAF and CGW without defined form under culture. There were significant differences in the rates of electrofusion, with results superior for CAF and CWJ (85.89±9.93% and 69.64±11.72%, respectively), relative to CAT (50.07±10.64%). The embryo production did not differ significantly among the three cell types (46.47±7.92%, 45.46±13.03% and 62.67±15.15% for CAT, CAF and CWJ, respectively), however a superiority of 17% in blastocyst production of CWJ in relation to the CAT and CAF was observed. Pregnancies were obtained for all cell types, but only one pregnancy has come to term, from TN with CAF and one gestation is on day 200 from the CAT. The born calf died soon after birth by cesarean section, due respiratory insufficiency. This study proved it is possible to isolate, cultivate and cryopreserve CAF, CAT and CWJ from live animals without harming them and to produce bovine embryos by TN efficiently using these cell types.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-11-01T15:41:16Z No. of bitstreams: 1 2013_ElisaRibeiroCunha.pdf: 46352581 bytes, checksum: f7df57fc98ce9a6fb4373fe126a86276 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-11-04T10:59:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_ElisaRibeiroCunha.pdf: 46352581 bytes, checksum: f7df57fc98ce9a6fb4373fe126a86276 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-04T10:59:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_ElisaRibeiroCunha.pdf: 46352581 bytes, checksum: f7df57fc98ce9a6fb4373fe126a86276 (MD5) / Apesar de todo o potencial para o uso da transferência nuclear (TN) em bovinos, vários parâmetros continuam limitantes para a melhor eficiência da técnica. Considerando essas limitações, este trabalho propõe o uso de modelos celulares que não passaram pela gastrulação, sob influência do cultivo in vitro por longos períodos e diferentes formas de criopreservação. Em seguida, o melhor tipo celular para a produção de embriões por TN e foi avaliado sob o efeito de tratamentos que otimizem reprogramação nuclear. Células do fluido amniótico (CFA) e do cordão umbilical (CCU) foram utilizadas em comparação aos fibroblastos da orelha (CFO) e foram submetidos ao cultivo celular por 20 passagens e criopreservação em diferentes soluções contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), 5% de dimetilformamida e 7% de glicerol. A viabilidade celular, ultraestrutura, fragmentação do DNA e estabilidade cromossomal foram avaliadas para determinar o tipo celular mais resistente. Em todos os animais, foi possível avaliar as CFA e CCU por 20 passagens com diferentes tempos de crescimento celular para atingir a fase de confluência. As soluções com 10% de DMSO garantiram a viabilidade de 90,33±5,58%, 90,56±4,40% e 81,90±3,31%, respectivamente para CFO, CCU e CFA, sendo significativamente mais eficiente e com menor variação para preservação que as outras soluções crioprotetoras. Não houve alterações no cariótipo e houve baixa fragmentação nuclear ao longo das passagens estudadas. Na avaliação ultraestrutural, as CFA se mostraram mais sensíveis à criopreservação em relação às CCU e CFO, e apresentaram uma baixa viabilidade em P20 (17,2± 8,87%). A partir deste experimento, as CCU foram usadas na TN e submetidas a três atamentos: (T1) CCU foram tratadas com 1,5 mM de procaína por dois ciclos de crescimento; (T2) tratadas com 50 nM de tricostatina A (TSA) por 4h na ativação e 20 h no cultivo embrionário; (T3) tratadas com 50 nM de TSA por 4 h na ativação e 16 h no cultivo embrionário. Todos os tratamentos foram comparados com o grupo sem tratamento (controle). O tratamento com procaína provocou alterações na morfologia e teve baixa produção de blastocistos (4,4%). O tratamento com TSA por 24 h teve baixa produção de blastocistos (4,5%) e foi significativamente diferente da TSA 20 h e do controle. O tratamento por 20 h (17,19%) viabilizou o uso da TSA, mas não foi superior ao controle (21,73%). Os resultados demonstram que, em bovinos as CFA e CCU podem ser isoladas, cultivadas in vitro e criopreservadas em 10% de DMSO, apresentando estabilidade cromossomal e baixa fragmentação nuclear, sendo que as CCU são mais resistentes que as CFA. O uso de 1,5 mM de procaína e de 50 nM de TSA por 24 h não foram viáveis na produção de embriões por TN. Porém, o uso de 50 nM TSA por 20 h não comprometeu a produção de blastocistos produzidos por TN. No entanto, concentrações e tempo de exposição ao TSA diferentes devem ser testados para aumentar a produção embrionária e o nascimento de bezerros saudáveis. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Despite all the potential of animal cloning by nuclear transfer (NT), some parameters still limit the efficiency of this technique. Considering these limitations, the objective of this work was to study the cellular types that did not participated in the gastrulation process, in conditions of long-term culture and cryopreservation with different solutions. We also studied the potential of these cell types to produce embryos by NT when recontructed zygotes were treated with substances to optimize nuclear reprogramming. Amniotic fluid cells (AFCs) and umbilical cord cells (UCCs) were used in a comparative study with ear fibroblast cells (EFCs) that were cultured in vitro until 20 passages and cryopreserved in 10% Dimethyl sulfoxide (DMSO), 5% Dimethyl formamide and 7% Glycerol solutions. The cellular viability, ultrastructure, DNA fragmentation and chromosome stability were evaluated to determine the most resistant cellular type. In all animals, it was possible to evaluate the AFCs and UCCs until 20 passages with different periods of cellular growth to reach the confluence phase. Solutions containing 10% DMSO ensured viability of 90.33±5.58%, 90.56 ±4.40% and 81.90±3.31%, respectively for EFCs, AFCs and UCCs, being significantly more efficient and with less variation than other cryoprotectant solutions. There was no changes in karyotype and nuclear fragmentation was low at the cellular passages studied. In the ultrastructural evaluation, AFCs were more sensitive to cryopreservation than UCCs and EFCs and presented low viability rate at P20 (17.2±8.87%). From these results, the UCCs were used in the NT and submitted to three treatments: (T1) UCCs were treated with 1.5 mM procaine in two growth cycles; (2) reconstructed oocytes treated with 50 nM of trichostatin A (TSA) for 4 h in the activation phase and for 20 h in embryo development; (3) reconstructed oocytes treated with 50 nM TSA for 4 h in the activation phase and for 16 h during initial embryo culture. All treatments were compared with the untreated group (control). Treatment with procaine caused changes in cellular morphology and resulted in low blastocysts rate (4.4%). Treatment with TSA for 24 hours had low blastocyst production (4.5%) and was significantly different from the control and TSA 20 h treatment. The treatment for 20 hours made feasible the use of TSA (17.19% of blastocysts), but was not superior to the control group (21.73%). The results demonstrate that in bovine, AFCs and UCCs can be isolated, cultured in vitro and cryopreserved in 10% DMSO, not causing damage to DNA and chromosomes. The UCCs were more resistant than AFCs in all aspects. The use of 1.5 mM procaine and 50 nM TSA for 24 hours was not viable for NT embryos production. However, the use of 50 nM TSA for 20 hours did not compromise the blastocysts production, but different concentrations and times of exposure to TSA should be tested to enhance bovine NT embryo production and birth of healthy calves.

A presente tese abordou o tema de potenciais biomarcadores em uma população altamente vulnerável – díades mães/bebês com história de exposição ao crack na gestação. Foram avaliados 57 bebês expostos e 99 não expostos, e as suas mães. No primeiro artigo, a ênfase foi à ativação inflamatória, onde se detectou um aumento da IL-6 (perfil pró-inflamatório) nos expostos, mesmo mediante ajuste para confundidores (10.208,54 IC95% 1.328,54–19.088,55 vs. 2.323,03 IC95% 1.484,64–3.161,21; p= 0.007). A IL-10 (perfil antiinflamatório) também se mostrou elevada nos bebês expostos (432,22 IC95% 51,44–812,88 vs. 75,52 IC95% 5,64– 145,39, p = 0.014). A IL-6 esteve aumentada nas mães expostas ao crack (25.160,05, IC95% 10.958,15–39.361,99 vs. 8.902,14 IC95% 5.774,97–12.029,32; p = 0.007), sem alterações de IL-10 entre as puérperas. Não houve correlação entre os níveis de citocina materna e do bebê (Spearman test; p ≥ 0.28). Neste estudo, concluiu-se que IL-6 e IL-10 podem ser marcadores da ativação inflamatória precoce em bebês com exposição intrauterina ao crack. Nossos resultados corroboram com os achados da literatura indicando que as citocinas possam ser mediadores potenciais para explicar os efeitos comportamentais e cognitivos do estresse prénatal sobre o feto, integrando imunologia e a hipótese da neuroinflamação a saúde mental da criança. No segundo artigo, avaliou-se uma medida de estresse oxidativo (EO), o TBARS, e de Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF), nas referidas díades. Os resultados encontrados na análise multivariada do TBARS no sangue de cordão umbilical (SCU) apontam para um menor EO nos bebês expostos (63,97 IC95% 39,43 – 88,50 em expostos vs 177,04 IC95% 140,93 – 213,14 em não expostos, p < 0.001). Trata-se de um achado inovador, apontando na direção de uma ativação do sistema antioxidante endógeno nos recém-nascidos expostos, em função da ruptura da homeostase causada pela toxicidade do crack durante a gestação. O feto mobilizaria rotas de antioxidantes endógenos desde muito precocemente no seu desenvolvimento, como a promovida pela Cocaine and Amphetamine Regulated Transcript (CART). Ainda neste estudo, pode-se ver um aumento de BDNF nos bebês expostos (3,86 IC95% 2,29 – 5,43 vs 0,85 IC95% 0,47- 1,23; p < 0.001), mas uma diminuição nas gestantes expostas em relação às não expostas (4,03 IC95% 2.87 – 5.18 vs 6,67 IC95% 5,60 – 7,74; p = 0.006). Os dados de BDNF em bebês expostos ao crack são bastante inovadores, mas coerentes com a literatura, no sentido de uma reação de neuroplasticidade. Em gestantes, o dado surpreende, tendo em vista que a literatura de adultos indica aumento de BDNF em usuários de crack em relação a controles. Uma possibilidade para explicar este achado é uma possível variação na cronicidade e intensidade no consumo de crack do grupo teste. Alternativamente, a maior prevalência de estresse pós-traumático (TEPT) nas gestantes usuárias de crack poderia justificar este achado. Pacientes com TEPT tendem a apresenta níveis de BDNF menores que os controles normais. Em suma, apontam-se quatro possíveis biomarcadores, em uma população de difícil acesso e de alta relevância em saúde pública. Percebe-se que pode haver diferentes respostas de acordo com a etapa do desenvolvimento e que gestantes podem ter um perfil de recrutamento de neurotrofinas, e talvez outros biomarcadores, diferentes do que não gestantes. Portanto, observa-se que as mudanças estruturais, fisiológicas e moleculares promovidas pela cocaína resultam do envolvimento de uma vasta rede de neurotransmissores, interligados, e atuantes em diferentes áreas do cérebro e em diferentes momentos de maturação. / The present thesis addressed the theme on potential biomarkers in a highly vulnerable population – dyads mothers/babies with a history of exposure to crack/cocaine during the pregnancy 57 exposed babies and 99 not exposed babies and their mothers were assessed. In the first article, the emphasis was the inflammatory activation, were detected an increase of IL-6 (pro-inflammatory profile) in exposed, even within adjustments for confounders (10,208.54, 95%CI 1,328.54–19,088.55 vs. 2,323.03, 95%CI 1,484.64–3,161.21; p= 0.007). The IL-10 (anti-inflammatory profile) was also shown elevated on exposed babies (432.22, 95%CI 51.44–812.88 vs. 75.52, 95%CI 5.64–145.39, p = 0.014). The IL-6 was increased in the mothers exposed to crack (25,160.05, 95%CI 10,958.15–39,361.99 vs. 8,902.14, 95%CI 5,774.97–12,029.32; p = 0.007), without alterations of IL-10 amongst the mothers. There were no correlation amongst the levels of maternal cytosine and the babies (Spearman test; p>0.28). In this study, it was concluded that IL-6 and IL-10 could be markers of early inflammatory activation on babies exposed to crack/cocaine. Our results support the findings of the literature indicating that the cytosine could be potential mediators to explain the behavior and cognitive effects of prenatal stress on the fetus, integrating immunology and the hypothesis of the neuroinflammation to the child’s mental health. In the second article, we assessed a measurement of oxidative stress, the TBARS and the BDNF in the referred dyads. The results found in the multivariate analysis of the TBARS in the umbilical chord’s blood (UCB) point to a less oxidative stress in the babies exposed to (63.97, 95%CI 39.43 – 88.50 in exposed vs. 177.04, 95%CI 140.93 – 213.14 non exposed, p < 0.001). This is an innovative finding, pointing in the direction of an endogenous antioxidant activation system on the newly born exposed, on the basis of the homeostasis rupture caused by the crack toxicity during the pregnancy. The fetus would mobilize endogenous antioxidant routes since very early in its development, as promoted by Cocaine and Amphetamine Regulated Transcript (CART). Still in this study, we can see the increase of the BDNF in the exposed babies (3.86, 95%CI 2.29 – 5.43 vs 0.85, 95%CI 0.47- 1.23; p < 0.001), but a decrease in the exposed pregnant women in relation to the non-exposed (4.03, 95%CI 2.87 – 5.18 vs. 6.67, 95%CI 5.60 – 7.74; p = 0.006). The data of BDNF in babies exposed to crack are highly innovative, but consistent to the literature in the sense of a reaction of neuroplasticity. In pregnant women the data is surprising, having in mind that the adult literature indicates an increase of BDNF in crack/cocaine users in relation to controllers. A possibility to explain this finding is a possible variation in the practicality and intensity of usage of crack/cocaine from the test group. Alternatively the most prevalence post-traumatic stress (PTSD) in the crack pregnant users could justify this finding. Patients with PTSD tend to present levels of BDNF less than the normal controllers. This leads us to four possible biomarkers, in a population difficult to access and in a highly relevance to public health. We can tell that there are different answers according to the development stage and that the pregnant women could have a neurotrophins recruitment profile and perhaps other biomarkers, different to non pregnant. Therefore, we can observe that structural, physiological, molecular changes promoted by cocaine result from an involvement from a vast network of neurotransmitters integrated and active in different areas of the brain and in different moments of maturation.

Resumo não disponível.

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A presente tese abordou o tema de potenciais biomarcadores em uma população altamente vulnerável – díades mães/bebês com história de exposição ao crack na gestação. Foram avaliados 57 bebês expostos e 99 não expostos, e as suas mães. No primeiro artigo, a ênfase foi à ativação inflamatória, onde se detectou um aumento da IL-6 (perfil pró-inflamatório) nos expostos, mesmo mediante ajuste para confundidores (10.208,54 IC95% 1.328,54–19.088,55 vs. 2.323,03 IC95% 1.484,64–3.161,21; p= 0.007). A IL-10 (perfil antiinflamatório) também se mostrou elevada nos bebês expostos (432,22 IC95% 51,44–812,88 vs. 75,52 IC95% 5,64– 145,39, p = 0.014). A IL-6 esteve aumentada nas mães expostas ao crack (25.160,05, IC95% 10.958,15–39.361,99 vs. 8.902,14 IC95% 5.774,97–12.029,32; p = 0.007), sem alterações de IL-10 entre as puérperas. Não houve correlação entre os níveis de citocina materna e do bebê (Spearman test; p ≥ 0.28). Neste estudo, concluiu-se que IL-6 e IL-10 podem ser marcadores da ativação inflamatória precoce em bebês com exposição intrauterina ao crack. Nossos resultados corroboram com os achados da literatura indicando que as citocinas possam ser mediadores potenciais para explicar os efeitos comportamentais e cognitivos do estresse prénatal sobre o feto, integrando imunologia e a hipótese da neuroinflamação a saúde mental da criança. No segundo artigo, avaliou-se uma medida de estresse oxidativo (EO), o TBARS, e de Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF), nas referidas díades. Os resultados encontrados na análise multivariada do TBARS no sangue de cordão umbilical (SCU) apontam para um menor EO nos bebês expostos (63,97 IC95% 39,43 – 88,50 em expostos vs 177,04 IC95% 140,93 – 213,14 em não expostos, p < 0.001). Trata-se de um achado inovador, apontando na direção de uma ativação do sistema antioxidante endógeno nos recém-nascidos expostos, em função da ruptura da homeostase causada pela toxicidade do crack durante a gestação. O feto mobilizaria rotas de antioxidantes endógenos desde muito precocemente no seu desenvolvimento, como a promovida pela Cocaine and Amphetamine Regulated Transcript (CART). Ainda neste estudo, pode-se ver um aumento de BDNF nos bebês expostos (3,86 IC95% 2,29 – 5,43 vs 0,85 IC95% 0,47- 1,23; p < 0.001), mas uma diminuição nas gestantes expostas em relação às não expostas (4,03 IC95% 2.87 – 5.18 vs 6,67 IC95% 5,60 – 7,74; p = 0.006). Os dados de BDNF em bebês expostos ao crack são bastante inovadores, mas coerentes com a literatura, no sentido de uma reação de neuroplasticidade. Em gestantes, o dado surpreende, tendo em vista que a literatura de adultos indica aumento de BDNF em usuários de crack em relação a controles. Uma possibilidade para explicar este achado é uma possível variação na cronicidade e intensidade no consumo de crack do grupo teste. Alternativamente, a maior prevalência de estresse pós-traumático (TEPT) nas gestantes usuárias de crack poderia justificar este achado. Pacientes com TEPT tendem a apresenta níveis de BDNF menores que os controles normais. Em suma, apontam-se quatro possíveis biomarcadores, em uma população de difícil acesso e de alta relevância em saúde pública. Percebe-se que pode haver diferentes respostas de acordo com a etapa do desenvolvimento e que gestantes podem ter um perfil de recrutamento de neurotrofinas, e talvez outros biomarcadores, diferentes do que não gestantes. Portanto, observa-se que as mudanças estruturais, fisiológicas e moleculares promovidas pela cocaína resultam do envolvimento de uma vasta rede de neurotransmissores, interligados, e atuantes em diferentes áreas do cérebro e em diferentes momentos de maturação. / The present thesis addressed the theme on potential biomarkers in a highly vulnerable population – dyads mothers/babies with a history of exposure to crack/cocaine during the pregnancy 57 exposed babies and 99 not exposed babies and their mothers were assessed. In the first article, the emphasis was the inflammatory activation, were detected an increase of IL-6 (pro-inflammatory profile) in exposed, even within adjustments for confounders (10,208.54, 95%CI 1,328.54–19,088.55 vs. 2,323.03, 95%CI 1,484.64–3,161.21; p= 0.007). The IL-10 (anti-inflammatory profile) was also shown elevated on exposed babies (432.22, 95%CI 51.44–812.88 vs. 75.52, 95%CI 5.64–145.39, p = 0.014). The IL-6 was increased in the mothers exposed to crack (25,160.05, 95%CI 10,958.15–39,361.99 vs. 8,902.14, 95%CI 5,774.97–12,029.32; p = 0.007), without alterations of IL-10 amongst the mothers. There were no correlation amongst the levels of maternal cytosine and the babies (Spearman test; p>0.28). In this study, it was concluded that IL-6 and IL-10 could be markers of early inflammatory activation on babies exposed to crack/cocaine. Our results support the findings of the literature indicating that the cytosine could be potential mediators to explain the behavior and cognitive effects of prenatal stress on the fetus, integrating immunology and the hypothesis of the neuroinflammation to the child’s mental health. In the second article, we assessed a measurement of oxidative stress, the TBARS and the BDNF in the referred dyads. The results found in the multivariate analysis of the TBARS in the umbilical chord’s blood (UCB) point to a less oxidative stress in the babies exposed to (63.97, 95%CI 39.43 – 88.50 in exposed vs. 177.04, 95%CI 140.93 – 213.14 non exposed, p < 0.001). This is an innovative finding, pointing in the direction of an endogenous antioxidant activation system on the newly born exposed, on the basis of the homeostasis rupture caused by the crack toxicity during the pregnancy. The fetus would mobilize endogenous antioxidant routes since very early in its development, as promoted by Cocaine and Amphetamine Regulated Transcript (CART). Still in this study, we can see the increase of the BDNF in the exposed babies (3.86, 95%CI 2.29 – 5.43 vs 0.85, 95%CI 0.47- 1.23; p < 0.001), but a decrease in the exposed pregnant women in relation to the non-exposed (4.03, 95%CI 2.87 – 5.18 vs. 6.67, 95%CI 5.60 – 7.74; p = 0.006). The data of BDNF in babies exposed to crack are highly innovative, but consistent to the literature in the sense of a reaction of neuroplasticity. In pregnant women the data is surprising, having in mind that the adult literature indicates an increase of BDNF in crack/cocaine users in relation to controllers. A possibility to explain this finding is a possible variation in the practicality and intensity of usage of crack/cocaine from the test group. Alternatively the most prevalence post-traumatic stress (PTSD) in the crack pregnant users could justify this finding. Patients with PTSD tend to present levels of BDNF less than the normal controllers. This leads us to four possible biomarkers, in a population difficult to access and in a highly relevance to public health. We can tell that there are different answers according to the development stage and that the pregnant women could have a neurotrophins recruitment profile and perhaps other biomarkers, different to non pregnant. Therefore, we can observe that structural, physiological, molecular changes promoted by cocaine result from an involvement from a vast network of neurotransmitters integrated and active in different areas of the brain and in different moments of maturation.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-12-01Bitstream added on 2014-06-13T18:41:57Z : No. of bitstreams: 1 canesin_apmn_dr_jab.pdf: 426303 bytes, checksum: 79ecce7fa832f238b8b7aa1be1546c03 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As células-tronco promovem a reconstituição hematopoética e de outros tecidos, estando presentes no embrião, sangue periférico, medula óssea e sangue do cordão umbilical (SCU). Os modelos experimentais de células-tronco do sangue periférico e da medula óssea, em cães, têm propiciado informações relevantes para transplantes de células-tronco em humanos. Entretanto, não existe estudo sobre o SCU canino. O objetivo deste ensaio foi padronizar um método de coleta de SCU de cães sadios e quantificar as células sangüíneas e células-tronco CD34+ do SCU. No presente protocolo, a coleta de SCU de 40 cães neonatos foi realizada para contagem das células sangüíneas, com o auxílio de um contador automático de células, bem como das células-tronco, CD34+, utilizando-se do citômetro de fluxo. O método de coleta do SCU na porção justaplacentária dos vasos umbilicais permitiu a quantificação das células sangüíneas e células-tronco. Os valores hematológicos do SCU, exceto o VCM e o número de plaquetas, apresentaram-se reduzidos com relação àqueles de cães recém-nascidos e adultos. Apesar do volume escasso de SCU (1325 mL), a quantidade de células-tronco do cordão umbilical canino (3,38l2,72 CD34+ x106/kg) é semelhante àquela reportada para medula óssea, bem como para o sangue periférico mobilizado de cães adultos, sendo coincidente com aquela preconizada para reconstituição hematopoética. / Stem cells promote the reconstitution of the hematopoietic and others tissues, and are present in the embryo, peripheral blood, bone marrow and umbilical cord blood (UCB). The experimental models of bone marrow and peripheral blood stem cells in dogs provide important information for stem cells transplants in humans. However, there are no studies on the UCB cells of dogs. This experiment aimed at standardizing the collection method and at quantifying blood and stem cells in the umbilical cord of dogs aiming at hematological recuperation. In this assay, UCB of 40 neonates dogs was collected for blood cell count in automatic cell counter and stem cell CD34+ count in flow cytometer. The method of UCB collection at the juxta-placental portion of the umbilical vessels allowed UCB blood and stem cell CD34+ quantification. The hematological values of UCB, except for the Mean Corpuscular Volume and platelet count, were reduced as compared to the reference values of the peripheral blood of healthy neonate and adult dogs. Despite the small volume of UCB (1325 mL), the quantity of stem cells in the canine umbilical cord (3.38l2.72 CD34+ x106/kg) is similar to that reported in the bone marrow and mobilized peripheral blood of adult dogs, coinciding with the amunt recommend for hematopoietic reconstitution.

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