Orientadores: Fernando Cendes, Marilisa Mantovani Guerreiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-05T02:40:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_CamilaFernanda_M.pdf: 1130628 bytes, checksum: 56c50441642a7ed66e0a9f12c52d6c49 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: As esquizencefalias constituem malformações cerebrais congênitas caracterizadas por fendas no manto cerebral, as quais se estendem da superfície pial aos ventrículos laterais, delineadas por substância cinzenta. Podem ocorrer uni ou bilateralmente e as paredes da fenda podem ser separadas (lábios abertos) ou unidas (lábios fechados). As características clínicas da esquizencefalia são extremamente variáveis e compreendem distúrbios motores, cognitivos e síndromes epilépticas. Os objetivos são avaliar as principais características clínicas (alterações neuropsicomotoras, síndromes epilépticas) e de neuroimagem (características das fendas e alterações estruturais do encéfalo associadas) de pacientes com esquizencefalia, bem como analisar a presença de fatores de risco e correlacionar os achados. Foram avaliados os pacientes com diagnóstico de esquizencefalia, com base em achados de neuroimagem (tomografia computadorizada ou ressonância magnética de crânio). Todos os pacientes foram submetidos a anamnese e exame clínico-neurológico. Investigamos: idade e sexo, presença de fatores de risco, de deficiências motoras e neurossensoriais, microcefalia, grau de alfabetização em pacientes de idade escolar, presença e características de epilepsia (tipos de crises epilépticas, estado de mal epiléptico, crises em salvas, uso de monoterapia ou politerapia, controle de crises), características do EEG, características próprias da fenda (tipo, tamanho e localização), presença de outras alterações estruturais do encéfalo. Em relação aos parâmetros clínicos e de EEG, comparamos esquizencefalias unilaterais com bilaterais e posteriormente as fendas abertas com as fechadas. A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste de qui-quadrado e de Fisher, com nível de significância de 0,05. Foram avaliados 50 pacientes, 26 com esquizencefalia unilateral (grupo unilateral= GI) e 24 com esquizencefalia bilateral (grupo bilateral=GII). A idade variou entre 1 e 37 anos (média= 10,8). Os grupos são similares em idade e sexo. Todos os pacientes apresentaram déficits motores (hemiparesia ou tetraparesia), com predomínio de tetraparesia em GII (92% versus 27% de GI). Microcefalia e deficiências neurossensoriais também foram mais observados em GII, nos respectivos valores: 46% e 63%, enquanto para GI as proporções foram de 12% e31%.Evidenciamos menor índice de alfabetização nos pacientes do GII (13%, versus 46% do GI). Encontramos diferença estatística significativa entre os grupos quanto às alterações neuropsicomotoras. Epilepsia estava presente em 14 (54%) pacientes do GI e em 15 (63%) do GII; crises parciais estavam presentes em 43% (6) do GI e 33% (3) do GII; crises generalizadas foram encontradas em 1 paciente de cada grupo, representando 7% do GII; crises parciais e generalizadas ocorreram em 7 (50%) pacientes do GI e em 9 (60%) pacientes do GII; antecedente de estado de mal em 2 (14%) do GI e 4 (27%) do GII; crises agrupadas ocorreram em 6 (43%) do GI e em 7 (47%) do GII. Oito (57%) pacientes do GI e 7 (47%) do GII estavam em uso de monoterapia e 8 (57%) do GI e 9 (60%) do GII apresentaram controle de crises. A proporção de EEG anormal (69% do GI e 71% do GII). Não houve diferença estatisticamente significativa entre os parâmetros estudados. Ao compararmos fendas abertas e fechadas, encontramos: 54% de epilepsia nas fechadas e 67% nas abertas; controle de crises em 23% das fechadas e 38% das abertas; tetraparesia em 23% das fechadas e 63% das abertas; deficiências neurossensoriais em 38% das fechadas e 50% das abertas. Houve correlação entre fendas abertas e tetraparesia. Fatores de risco foram referidos por 56% do total de pacientes, e 18% não tinham informações sobre antecedentes gestacionais.Observamos 60% de fendas abertas e 65% de tamanho pequeno. A localização preferencial das fendas foi lobos frontais e suas transições. A imensa maioria dos pacientes (94%) tem outras alterações nos exames de neuroimagem, sendo polimicrogiria a mais freqüente. Concluímos que o comportamento da epilepsia foi semelhante nos pacientes com fendas unilaterais e bilaterais, abertas e fechadas, mas as alterações de ordem neuropsicomotora foram mais importantes em pacientes com esquizencefalia bilateral e fendas abertas. Ou seja, a extensão do comprometimento cortical não teve correlação com prognóstico para as manifestações epilépticas, mas a teve para déficits motores, cognitivos e neurossensoriais. As características morfológicas das esquizencefalias foram amplamente variadas e comumente associadas a outras anormalidades. O conjunto de tais alterações pode influenciar na determinação da gravidade da epilepsia dos pacientes com esquizencefalia, porém são necessários mais estudos para definir essa questão / Abstract: Schizencephaly is a congenital cerebral malformations characterised by clefts in the cerebral mantle, extending from the pial surface to the lateral ventricles, outlined by gray matter. They can occur uni- or bilaterally, and the cleft walls can be separated (open lips) or fused (closed lips). Schizencephaly presents extremely variable clinical characteristics, including cognitive and motor disorders and epileptic syndromes. The objective is evaluate the main clinical characteristics (neuropsychomotor alterations and epileptic syndromes) and neural imaging characteristics (cleft characteristics and associated encephalic structural alterations) of patients presenting with schizencephaly, as well as analyze the presence of risk factors and correlate the study findings. Patients diagnosed as schizencephalic were evaluated, based on neuro-imaging findings (computed tomography or magnetic resonance imaging). All patients were subjected to anamnesis and a clinical-neurological examination. We evaluated: age and gender, presence of risk factors, presence of motor and neurosensorial disabilities, presence of microcephaly, literacy level in school-aged patients, presence and characteristics of epilepsy (epileptic seizure types, status epilepticus, cluster seizures, mono- or polytherapy use, seizure control), EEG characteristics, cleft characteristics (type, size and location), presence of other encephalic structural alterations. Regarding clinical and EEG parameters, we compared uni- and bilateral schizencephaly and, later, open and closed clefts. Statistical analysis was made using the chi-square test and Fisher test with a 0.05 significance level. Fifty patients were evaluated¿26 with unilateral schizencephaly (unilateral group = GI) and 24 with bilateral schizencephaly (bilateral group = GII). Age ranged from 1 to 37 ( average = 10,8). Both groups are similar in terms of sex and gender. All patients have motor deficits ( hemiparesis or tetraparesis), with a prevalence of tetraparesis in GII (92% versus 27% in GI). Microcephaly, neurosensorial disabilities and a lower literacy level were also more prevalent in GII, with the respective values: 46%, 63%, 13%, while the proportions for GI were 12%, 31% and 46%. We found a statistically significant difference between the groups in terms of neuropsychomotor alterations. Epilepsy was present in 14 (54%) GI patients and in 15 (63%) GII patients; partial seizures were present in 43% (6) GI patients and 33% (3) GII patients; generalized seizures were found in 1 patient from each group, representing 7% of GII; partial and generalized seizures were present in 7 (50%) GI patients and 9 (60%) GII patients; status epilepticus history in 2 (14%) GI patients and 4 (27%) GII patients; cluster seizures occurred in 6 (43%) GI and 7 (47%) GII patients. Eight (57%) GI patients and 7 (47%) GII patients were on monotherapy and 8 (57%) GI and 9 (60%) GII patients had their seizures controlled. Ratio of abnormal EEG (69% of GI and 71% of GII). There was no statistically significant different among the parameters researched. When comparing open and closed clefts, we found: 54% of epilepsy in closed clefts and 67% in open clefts; seizure control in 23% of closed clefts and 38% of open clefts; tetraparesis in 23% of closed clefts and 63% of open clefts; neurosensorial disabilities in 38% of closed clefts and 50% of open clefts. There was a correlation between open clefts and tetraparesis. Risk factors were referred by 56% of the patients, and 18% had no information concerning their gestational history. We observed 60% of open clefts and 65% of small-sized ones. The preferred location of clefts was the frontal lobes and their transitions. The vast majority of the patients (94%) have other alterations in neuro-imaging examination, the most prevalent of which being polymicrogyria. We conclude that epilepsy behaviour was similar in patients with uni- and bilateral clefts, closed and open, but the neuropsychomotor alterations were more significant in patients with bilateral schizencephaly and open clefts, i.e., the extension of cortical impairment did not correlate to the prognosis for epileptic episodes, but correlated to motor, cognitive and neurosensorial deficits. The schizencephalies¿ morphologic characteristics varied widely and were commonly associated to other abnormalities. Such set of alterations can influence the epilepsy severity determination in patients with schizencephaly; however, more studies are necessary to determine this issue / Mestrado / Neurologia / Mestre em Ciências Médicas

A via das quinureninas é a principal rota de degradação do aminoácido triptofano. Os metabólitos dessa via, comumente chamados de quinureninas, estão envolvidos em vários processos fisiológicos e patológicos e, recentemente, algumas quinureninas foram relacionadas à fisiopatologia de várias doenças neurodegenerativas. Tendo em vista que dados da literatura são contraditórios no que se refere à geração de espécies reativas a partir de algumas quinureninas e considerando que as concentrações de alguns desses metabólitos estão elevadas em várias doenças neurodegenerativas, este trabalho teve por objetivo investigar os efeitos in vitro de alguns intermediários da via das quinureninas, particularmente a 3-hidroxiquinurenina (3HKyn), a quinurenina (Kyn), o ácido 3-hidroxiantranílico (3HAA), o ácido antranílico (AA) e o ácido quinolínico (QA) sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos de 30 dias de idade. Verificamos que a 3HKyn e o 3HAA diminuíram as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e a quimiluminescência em córtex cerebral de ratos jovens, o que indica um efeito antioxidante desses compostos, ao passo que a Kyn e o AA não alteraram os parâmetros de lipoperoxidação. Por outro lado, o QA aumentou a peroxidação lipídica nesta estrutura cerebral por aumentar significativamente as medidas de TBA-RS e quimiluminescência. Além disso, se pode verificar uma prevenção significativa da oxidação da GSH causada pelo 3HAA, enquanto o QA, na presença de íon ferroso e ácido ascórbico, diminuiu significativamente as concentrações de glutationa reduzida, o que indica que esse efeito seja mediado por radicais hidroxila gerados através da reação de Fenton. Já a 3HKyn, a Kyn e o AA não alteraram significativamente as concentrações de GSH. Também se verificou que a 3HKyn diminuiu a oxidação do diacetato de 2, 7-diclorofluoresceína, além de mostrar a propriedade de seqüestrar radicais peroxila e hidroxila. Por outro lado, o 3HAA somente seqüestrou radicais peroxila, sugerindo que a estrutura orto-aminofenólica é essencial para o composto possuir propriedades antioxidantes. Com o objetivo de verificar se o tempo de exposição à 3HKyn alterava a sua atividade antioxidante, determinamos a reatividade antioxidante total (TAR) e os valores de TBA-RS em células C6 cultivadas de glioma de ratos ao longo de 48 h na ausência (controle) ou presença de 3HKyn. Os resultados demonstraram um aumento da TAR e uma diminuição das TBA-RS pela 3HKyn em tempos curtos de exposição (1-6 horas), sendo que o metabólito não alterou significativamente esses parâmetros em tempos maiores de exposição, sugerindo uma diminuição da capacidade antioxidante da 3HKyn ao longo do tempo. Também verificamos uma diminuição do potencial antioxidante total (TRAP) e da TAR pelo QA em homogeneizado de córtex cerebral Finalmente, foi evidenciado qua a 3HKyn, na concentração de 100 µM, foi capaz de prevenir os efeitos tóxicos causados pelo QA e pelo ácido glutárico (GA). O GA é a principal neurotoxina que se encontra acumulada na acidemia glutárica tipo I. Em resumo, nossos resultados sugerem um efeito antioxidante da 3HKyn e do 3HAA e um efeito pró-oxidante do QA in vitro em córtex cerebral de ratos jovens. As alterações provocadas pelas várias quinureninas foram obtidas nas concentrações de 10, 100 e 500 µM. Embora não saibamos as concentrações dessas substâncias em doenças neurodegenerativas em que eles se acumulam, é possível que, em uma situação in vivo, a produção de substâncias antioxidantes através da rota das quinureninas poderia contrabalançar os efeitos tóxicos causados por outros metabólitos como o QA.

As acidemias orgânicas são desordens metabólicas caracterizadas, bioquimicamente, pelo acúmulo de um ou mais ácidos orgânicos e, clinicamente, por disfunções neurológicas graves. Os ácidos propiônico (PA) e metilmalônico (MMA) são metabólitos presentes, em altas concentrações, nos tecidos e fluídos biológicos de pacientes afetados pelas acidemias propiônica e metilmalônica, respectivamente. Os neurofilamentos (NFs) são proteínas do citoesqueleto neuronal formados pela polimerização de três subunidades, denominadas: NF de alto peso molecular (NFH), NF de médio peso molecular (NF-M) e NF de baixo peso molecular (NF-L), com pesos moleculares aparentes de 200, 150 e 68 kDa, respectivamente. Essas proteínas são amplamente fosforiladas, sendo que seu nível de fosforilação está relacionado com a polimerização dos NFs e com a regulação das interações entre os constituintes do citoesqueleto. Neste trabalho fizemos um estudo ontogenético dos efeitos in vitro do PA e do MMA 2,5 mM sobre a imunorreatividade da subunidade NF-H em fatias de córtex cerebral de ratos de 9, 12, 17, 21 e 60 dias de idade. Para tanto utilizamos uma abordagem metodológica baseada na imunodetecção da NF-H com dois anticorpos diferentes: o anticorpo monoclonal anti NF-200 clone NE14 que se liga somente a epítopos fosforilados da NF-H e, portanto, reconhece a NF-H fosforilada; e o anticorpo monoclonal anti NF-200 clone N52 que reconhece a NF-H total, independentemente do nível de fosforilação. Nossos resultados mostraram que os metabólitos induzem alterações na imunorreatividade da NF-H presente na fração citoesquelética de maneira dependente do estágio de desenvolvimento do animal Considerando o conjunto de dados obtidos com os anticorpos NE14 e N52 na fração citoesquelética, podemos dizer que o tratamento das fatias de córtex cerebral de ratos de 9 dias aumentou o nível de fosforilação sem alterar o imunoconteúdo total; em ratos de 12 e 17 dias de vida levou a um acúmulo da subunidade NF-H na fração citoesquelética e que esta proteína está na forma fosforilada; e finalmente, em ratos de 21 e 60 dias de vida os metabólitos não alteraram os parâmetros estudados. Mostramos, também, que o acúmulo da NF-H provocado pelos metabólitos em ratos de 12 e 17 dias de vida não decorreu de um aumento na síntese da proteína, mas, provalvelmente devido a um desequilíbrio na relação NF-H solúvel/NF-H polimerizada, que favoreceu a forma polimerizada. Finalmente, mostramos um possível envolvimento de mecanismos de neurotransmissão GABAérgica e glutamatérgica para os efeitos observados em ratos de 12 e 17 dias de idade, respectivamente. Considerando que a fosforilação é um mecanismo importante para a regulação da dinâmica de polimerização dos NFs e das interações com outros componentes do citoesqueleto, sugerimos que uma desorganização na sua homeostase possa causar uma neurodegeneração, que é característica dos pacientes portadores das acidemias propiônica e metilmalônica.

O telúrio é um elemento raro usado na indústria eletrônica como componente industrial de muitas ligas. Tanto as formas orgânicas quando as inorgânicas do telúrio são altamente tóxicas para o SNC de roedores. Neste trabalho, nós inicialmente realizamos uma curva de dose, através de uma única administração subcutânea do composto orgânico de telúrio, ditelureto de difenila, em ratos de 15 dias de idade, estabelecendo a perda de massa corporal como critério de toxicidade do composto utilizado. A partir disso, o objetivo principal do nosso trabalho foi investigar o efeito de uma única administração subcutânea do ditelureto de difenila sobre a fosforilação dos filamentos intermediários (FI) de córtex cerebral e hipocampo de ratos Wistar jovens (15 dias de idade), 1, 3 ou 6 dias após a exposição à droga. Verificamos também a capacidade do composto orgânico de selênio, o disseleneto de difenila de reverter esse efeito. Além disso, também determinamos o efeito do tratamento in vivo com o ditelureto de difenila sobre a atividade da Na+, K+ -ATPase. Os resultados obtidos mostraram que nos dias 3 e 6 após a injeção da droga, os animais injetados com 0,3 μmol/Kg de peso corporal, ou doses maiores da neurotoxina, apresentaram uma perda significativa de massa corporal, quando comparados com os animais controles. Com base nesses dados, a concentração de 0,3 μmol/Kg de peso corporal foi escolhida para a realização dos estudos posteriores. Nesse período ocorreu também um aumento da fosforilação dos neurofilamentos (FI neuronais), da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e da vimentina (FI gliais), no córtex cerebral dos ratos. O efeito do ditelureto de difenila sobre a fosforilação dos FI em córtex cerebral foi acompanhado por um aumento do imunoconteúdo das proteínas NF-M, NF-L e GFAP na fração citoesquelética, sugerindo um aumento de polimerização destas proteínas. Por outro lado, o aumento do imunoconteúdo da NF-L e GFAP no homogeneizado total 3 dias após a administração do ditelureto de difenila, é compatível com um aumento de expressão dessas proteínas. Porém, 6 dias após a injeção do composto verificou-se apenas um aumento do imunoconteúdo da GFAP na fração citoesquelética, assim como da subunidade de alto peso molecular dos neurofilamentos (NFH) e da GFAP no homogeneizado total de córtex cerebral. Por outro lado, no hipocampo, ocorreu um aumento de fosforilação apenas da GFAP e da vimentina, proteínas típicas de astrócitos, sendo que esse efeito só foi observado no sexto dia após a injeção da neurotoxina. Esse efeito foi acompanhado por um aumento do imunoconteúdo da GFAP na fração citoesquelética 6 dias após a exposição ao ditelureto de difenila. O efeito sobre a fosforilação das proteínas do citoesqueleto foi completamente prevenido pelo disseleneto de difenila (5 μmol/Kg de peso corporal) injetado uma única vez, 24 h após a administração do ditelureto de difenila. Além disso, também demostramos nesse trabalho que, ele é capaz de inibir a atividade da Na+, K+ -ATPase 6 dias após a administração da droga. Nossos resultados mostraram, portanto, que o ditelureto de difenila, quando administrado de forma aguda em ratos jovens, é capaz de aumentar a expressão de proteínas de FI e de afetar o sistema fosforilante associado a essas proteínas. Os dados mostraram ainda que o aparecimento desses efeito tem uma latência de 3 a 6 dias após a injeção da toxina e indicaram que o córtex cerebral é mais sensível do que o hipocampo aos efeitos do composto orgânico do telúrio. Além disso, o ditelureto de difenila é capaz de inibir a enzima Na+, K+ - ATPase cortical, reforçando a susceptibilidade do córtex cerebral à ação desta neurotoxina. Mostramos ainda neste trabalho, que o aumento de fosforilação das proteínas de FIs pode ser prevenida pelo disseleneto de difenila Com base nos resultados obtidos, pode-se supor que as alterações no citoesqueleto e a inibição da atividade da Na+, K+ -ATPase em células corticais podem estar envolvidas com a neurotoxicidade desse composto. / Tellurium is a rare element used as an industrial component of many alloys and in the electronic industry. This element also is one important intermediate and/or reagent in organic synthesis. Inorganic and organic tellurium compounds are highly toxic to the CNS of rodents. In this work we initially established the toxic dose and the time-action characteristics of diphenyl ditelluride acutely injected using body weight measurements as the end point of toxicity. Considering these findings, the aim of this work was to investigate the effect of a single subcutaneous injection of organic tellurium compounds, diphenyl ditelluride, on the intermediate filament (IF) phosphorylation in cerebral cortex and hippocampus from young Wistar rats (15 day-old), 1, 3 or 6 days after injection. We also investigated if diphenyl diselenide would be able to prevent this effect. Furthermore, we verified the effect of in vivo treatment with diphenyl ditelluride on Na+-K+-ATPase activity. Results showed that at days 3 and 6 animals injected with 0.3 μmol/Kg body weight or higher doses of diphenyl ditelluride presented loss of body mass when compared with control animals. Considering this finding, we have chosen the concentration of 0.3 μmol/Kg body weight for the next experiments. We observed an hyperphosphorylation of neurofilaments (the neuronal IF) and of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and of vimentin (Vim) (astrocyte IFs) in cerebral cortex. The effect of diphenyl ditelluride 3 days of injection on IF phosphorylation was accompanied by an increased NF-M, NF-L and GFAP immunocontent in IF-associated cytoskeletal fraction, suggesting an increase in protein polymerization. Otherwise, the stimulated GFAP, NF-L immunoreactivity in tissue homogenate suggests an increased protein synthesis. However, 6 days after the neurotoxin administration, only GFAP immunocontent increased in IF-associated cytoskeletal fraction, while GFAP and NF-H immunoreactivity was stimulated in tissue homogenate from cerebral cortex. On the other hand, in hippocampus, we observed that astrocyte IF (GFAP and Vimentin) hyperphosphorylation was accompanied by increased immunocontent of these proteins in cytoskeletal fraction at day 6 after tellurium injection. The cortical IF hyperphosphorylation induced by diphenyl ditelluride, was totally prevented by a single subcutaneous injection of diphenyl disselenide (5μmol/kg body weigth) 24h after diphenyl ditelluride administration. We also showed that beyond the effects of the in vivo treatment with diphenyl ditelluride on the cytoskeleton of cortical cells, this neurotoxin inhibited Na+-K+-ATPase activity at day 6 after drug injection. So, our results showed that a single subcutaneous injection of (PheTe)2 in young rats is able to stimulate the phosphorylation and expression of IF proteins. Moreover, our data demonstrated that effects of diphenyl ditelluride were time- and brain structure-dependent. We also verified in this work that cerebral cortex is more susceptible than hippocampus to neurotoxin injury. In addition, the diphenyl ditelluride was also able to inhibit the Na+-K+- ATPase activity. We showed also in this work that cortical IF hyperphosphorylation induced by diphenyl ditelluride was totally prevented by diphenyl disselenide Therefore, we can suppose that the observed alterations in cytoskeleton and the inhibition of the activity Na+-K+- ATPase in cortical cells may be related with the neurotoxicity of this substance.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:50:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327819.pdf: 1712221 bytes, checksum: 45e41df5bb0ecabf3db076a4eb2c82f0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Modelo experimental de isquemia cerebral focal em camundongos C57/BL6 resultou em isquemia patológica no córtex cerebral. Neste estudo, a isquemia focal foi induzida pela oclusão da artéria cerebral média. Analisamos as camadas corticais I, II/III, V and VI nas áreas motoras caudal forelimb area (CFA) e medial agranular cortex (AGm) em Grupos controle e isquêmico. Nossos resultados demonstraram evidentes diferenças morfológicas e quantitativas em neurônios normais, neurônios isquêmicos, astrócitos e microglia-like localizados nas camadas superficial (II/III) e profunda (V). Alterações patológicas celulares foram mais proeminentes, na camada V, da CFA, mostrando picnose nuclear, fragmentação da cromatina, degeneração principalmente em neurônios, como também, evidências morfológicas de apoptose. A área cortical motora CFA, foi severamente comprometida pelo insulto isquêmico comparado a área AGm, revelando neuroinflamação no tecido pela da proliferação de astrócitos e microglia-like.Também identificamos alterações celulares nas áreas motoras AGm e CFA, após 48 horas, de isquemia focal experimental, empregando procedimento histológico padrão com as colorações de Hematoxilina?Eosina (H&E) e Nissl e imunomarcação com NeuN, GFAP e Caspase-3. Entre as alterações patológicas o edema celular foi observado em neurônios e astrócitos, devido a lesão isquêmica especialmente na CFA. O edema é uma severa complicação clínica que ocorre em muitas doenças neurovasculares, e constitui uma das maiores causas de morbidade e morte em todo o mundo. Verificamos neste modelo, que o evento hipóxico/isquêmico foi associado com edema citotóxic e edema vasogênico. A permanente oclusão vascular resultou na redução do fluxo sanguíneo para o cérebro e consequentemente acúmulo de líquido em neurônios e astrócitos principalmente no córtex motor primário (referido como CFA). Alterações vasculares foram caracterizadas por descontinuidade endotelial e evidente hipertrofia de astrócitos em torno do edema vasogênico. Gliose reativa foi caracterizada por alterações específicas na morfologia dos astrócitos e aumento na síntese de Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) e cicatriz glial. Baseados em nossos resultados, concluímos que o modelo de isquemia focal em camundongos, determinou importante astrogliose, na camada V da CFA, e a AGm não demonstrou esta alteração patológica.<br> / Abstract : Experimental focal cerebral ischemia results in cortical brain lesion followed by ischemic stroke. In this study, focal cerebral ischemia was induced in mice by occlusion of the middle cerebral artery. We studied I, II/III, V and VI cortical layers in caudal forelimb area (CFA) and medial agranular cortex (AGm) from control and ischemic motor cortex C57BL/6 mice. We observed significant differences in the extent of the neurons, ischemic neurons, astrocytes and microglia in the superficial II/III and deep V cortical layers analyzed in CFA and AGm motor cortex. We verified that the cellular changes were more prominent on V layer of primary motor cortex (CFA) with nuclear pyknosis, chromatin fragmentation, necrosis and degeneration, as well as, morphologic evidence of apoptosis mainly in neurons. As result, the caudal forelimb area (CFA) was more severity impaired than medial agranular cortex (AGm) in focal cerebral ischemic model. This was evident with proliferation of astrocytes that could result in neuroinflammation by microglia-like cells.This study described pathologic variations produced by ischemic lesion in mice, especially in the AGm and CFA, after forty-eight hours of the focal ischemia, by histologic procedure standard with Hematoxilina?Eosina (H&E) e Nissl staining and immunohistochemistry with NeuN, GFAP e Caspase-3 antybody. The results revealed pronounced edema in the neurons and astrocytes with altered nuclear volume. Brain edema is a severe clinical complication in a number of pathologies, and it is a major cause of increased morbidity and death worldwide. Cerebral hypoxia/ischemia is associated with cytotoxic edema and vasogenic edema. In a mouse model of ischemic lesion, we observed permanent vascular occlusion, resulting in reduced blood flow to the brain, swollen neurons and pronounced cytotoxic astrocyte swelling, as well as neuropathological indications of vasogenic edema, especially in the primary motor of the cortex (CFA). Vascular damage was characterized by endothelial discontinuity and evident reactive astrocyte hypertrophy around areas of vasogenic edema. Reactive astrogliosis was characterized by specific alterations of astrocyte morphology with pronounced upregulation of Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) expression and scar formation. Based on results from our mouse model of focal cerebral ischemia, it was concluded that reactive astrogliosis was prominent in layer V of CFA motor cortex, while no layer of AGm demonstrated such abnormality.

A via das quinureninas é a principal rota de degradação do aminoácido triptofano. Os metabólitos dessa via, comumente chamados de quinureninas, estão envolvidos em vários processos fisiológicos e patológicos e, recentemente, algumas quinureninas foram relacionadas à fisiopatologia de várias doenças neurodegenerativas. Tendo em vista que dados da literatura são contraditórios no que se refere à geração de espécies reativas a partir de algumas quinureninas e considerando que as concentrações de alguns desses metabólitos estão elevadas em várias doenças neurodegenerativas, este trabalho teve por objetivo investigar os efeitos in vitro de alguns intermediários da via das quinureninas, particularmente a 3-hidroxiquinurenina (3HKyn), a quinurenina (Kyn), o ácido 3-hidroxiantranílico (3HAA), o ácido antranílico (AA) e o ácido quinolínico (QA) sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos de 30 dias de idade. Verificamos que a 3HKyn e o 3HAA diminuíram as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e a quimiluminescência em córtex cerebral de ratos jovens, o que indica um efeito antioxidante desses compostos, ao passo que a Kyn e o AA não alteraram os parâmetros de lipoperoxidação. Por outro lado, o QA aumentou a peroxidação lipídica nesta estrutura cerebral por aumentar significativamente as medidas de TBA-RS e quimiluminescência. Além disso, se pode verificar uma prevenção significativa da oxidação da GSH causada pelo 3HAA, enquanto o QA, na presença de íon ferroso e ácido ascórbico, diminuiu significativamente as concentrações de glutationa reduzida, o que indica que esse efeito seja mediado por radicais hidroxila gerados através da reação de Fenton. Já a 3HKyn, a Kyn e o AA não alteraram significativamente as concentrações de GSH. Também se verificou que a 3HKyn diminuiu a oxidação do diacetato de 2, 7-diclorofluoresceína, além de mostrar a propriedade de seqüestrar radicais peroxila e hidroxila. Por outro lado, o 3HAA somente seqüestrou radicais peroxila, sugerindo que a estrutura orto-aminofenólica é essencial para o composto possuir propriedades antioxidantes. Com o objetivo de verificar se o tempo de exposição à 3HKyn alterava a sua atividade antioxidante, determinamos a reatividade antioxidante total (TAR) e os valores de TBA-RS em células C6 cultivadas de glioma de ratos ao longo de 48 h na ausência (controle) ou presença de 3HKyn. Os resultados demonstraram um aumento da TAR e uma diminuição das TBA-RS pela 3HKyn em tempos curtos de exposição (1-6 horas), sendo que o metabólito não alterou significativamente esses parâmetros em tempos maiores de exposição, sugerindo uma diminuição da capacidade antioxidante da 3HKyn ao longo do tempo. Também verificamos uma diminuição do potencial antioxidante total (TRAP) e da TAR pelo QA em homogeneizado de córtex cerebral Finalmente, foi evidenciado qua a 3HKyn, na concentração de 100 µM, foi capaz de prevenir os efeitos tóxicos causados pelo QA e pelo ácido glutárico (GA). O GA é a principal neurotoxina que se encontra acumulada na acidemia glutárica tipo I. Em resumo, nossos resultados sugerem um efeito antioxidante da 3HKyn e do 3HAA e um efeito pró-oxidante do QA in vitro em córtex cerebral de ratos jovens. As alterações provocadas pelas várias quinureninas foram obtidas nas concentrações de 10, 100 e 500 µM. Embora não saibamos as concentrações dessas substâncias em doenças neurodegenerativas em que eles se acumulam, é possível que, em uma situação in vivo, a produção de substâncias antioxidantes através da rota das quinureninas poderia contrabalançar os efeitos tóxicos causados por outros metabólitos como o QA.

As acidemias orgânicas são desordens metabólicas caracterizadas, bioquimicamente, pelo acúmulo de um ou mais ácidos orgânicos e, clinicamente, por disfunções neurológicas graves. Os ácidos propiônico (PA) e metilmalônico (MMA) são metabólitos presentes, em altas concentrações, nos tecidos e fluídos biológicos de pacientes afetados pelas acidemias propiônica e metilmalônica, respectivamente. Os neurofilamentos (NFs) são proteínas do citoesqueleto neuronal formados pela polimerização de três subunidades, denominadas: NF de alto peso molecular (NFH), NF de médio peso molecular (NF-M) e NF de baixo peso molecular (NF-L), com pesos moleculares aparentes de 200, 150 e 68 kDa, respectivamente. Essas proteínas são amplamente fosforiladas, sendo que seu nível de fosforilação está relacionado com a polimerização dos NFs e com a regulação das interações entre os constituintes do citoesqueleto. Neste trabalho fizemos um estudo ontogenético dos efeitos in vitro do PA e do MMA 2,5 mM sobre a imunorreatividade da subunidade NF-H em fatias de córtex cerebral de ratos de 9, 12, 17, 21 e 60 dias de idade. Para tanto utilizamos uma abordagem metodológica baseada na imunodetecção da NF-H com dois anticorpos diferentes: o anticorpo monoclonal anti NF-200 clone NE14 que se liga somente a epítopos fosforilados da NF-H e, portanto, reconhece a NF-H fosforilada; e o anticorpo monoclonal anti NF-200 clone N52 que reconhece a NF-H total, independentemente do nível de fosforilação. Nossos resultados mostraram que os metabólitos induzem alterações na imunorreatividade da NF-H presente na fração citoesquelética de maneira dependente do estágio de desenvolvimento do animal Considerando o conjunto de dados obtidos com os anticorpos NE14 e N52 na fração citoesquelética, podemos dizer que o tratamento das fatias de córtex cerebral de ratos de 9 dias aumentou o nível de fosforilação sem alterar o imunoconteúdo total; em ratos de 12 e 17 dias de vida levou a um acúmulo da subunidade NF-H na fração citoesquelética e que esta proteína está na forma fosforilada; e finalmente, em ratos de 21 e 60 dias de vida os metabólitos não alteraram os parâmetros estudados. Mostramos, também, que o acúmulo da NF-H provocado pelos metabólitos em ratos de 12 e 17 dias de vida não decorreu de um aumento na síntese da proteína, mas, provalvelmente devido a um desequilíbrio na relação NF-H solúvel/NF-H polimerizada, que favoreceu a forma polimerizada. Finalmente, mostramos um possível envolvimento de mecanismos de neurotransmissão GABAérgica e glutamatérgica para os efeitos observados em ratos de 12 e 17 dias de idade, respectivamente. Considerando que a fosforilação é um mecanismo importante para a regulação da dinâmica de polimerização dos NFs e das interações com outros componentes do citoesqueleto, sugerimos que uma desorganização na sua homeostase possa causar uma neurodegeneração, que é característica dos pacientes portadores das acidemias propiônica e metilmalônica.

O telúrio é um elemento raro usado na indústria eletrônica como componente industrial de muitas ligas. Tanto as formas orgânicas quando as inorgânicas do telúrio são altamente tóxicas para o SNC de roedores. Neste trabalho, nós inicialmente realizamos uma curva de dose, através de uma única administração subcutânea do composto orgânico de telúrio, ditelureto de difenila, em ratos de 15 dias de idade, estabelecendo a perda de massa corporal como critério de toxicidade do composto utilizado. A partir disso, o objetivo principal do nosso trabalho foi investigar o efeito de uma única administração subcutânea do ditelureto de difenila sobre a fosforilação dos filamentos intermediários (FI) de córtex cerebral e hipocampo de ratos Wistar jovens (15 dias de idade), 1, 3 ou 6 dias após a exposição à droga. Verificamos também a capacidade do composto orgânico de selênio, o disseleneto de difenila de reverter esse efeito. Além disso, também determinamos o efeito do tratamento in vivo com o ditelureto de difenila sobre a atividade da Na+, K+ -ATPase. Os resultados obtidos mostraram que nos dias 3 e 6 após a injeção da droga, os animais injetados com 0,3 μmol/Kg de peso corporal, ou doses maiores da neurotoxina, apresentaram uma perda significativa de massa corporal, quando comparados com os animais controles. Com base nesses dados, a concentração de 0,3 μmol/Kg de peso corporal foi escolhida para a realização dos estudos posteriores. Nesse período ocorreu também um aumento da fosforilação dos neurofilamentos (FI neuronais), da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e da vimentina (FI gliais), no córtex cerebral dos ratos. O efeito do ditelureto de difenila sobre a fosforilação dos FI em córtex cerebral foi acompanhado por um aumento do imunoconteúdo das proteínas NF-M, NF-L e GFAP na fração citoesquelética, sugerindo um aumento de polimerização destas proteínas. Por outro lado, o aumento do imunoconteúdo da NF-L e GFAP no homogeneizado total 3 dias após a administração do ditelureto de difenila, é compatível com um aumento de expressão dessas proteínas. Porém, 6 dias após a injeção do composto verificou-se apenas um aumento do imunoconteúdo da GFAP na fração citoesquelética, assim como da subunidade de alto peso molecular dos neurofilamentos (NFH) e da GFAP no homogeneizado total de córtex cerebral. Por outro lado, no hipocampo, ocorreu um aumento de fosforilação apenas da GFAP e da vimentina, proteínas típicas de astrócitos, sendo que esse efeito só foi observado no sexto dia após a injeção da neurotoxina. Esse efeito foi acompanhado por um aumento do imunoconteúdo da GFAP na fração citoesquelética 6 dias após a exposição ao ditelureto de difenila. O efeito sobre a fosforilação das proteínas do citoesqueleto foi completamente prevenido pelo disseleneto de difenila (5 μmol/Kg de peso corporal) injetado uma única vez, 24 h após a administração do ditelureto de difenila. Além disso, também demostramos nesse trabalho que, ele é capaz de inibir a atividade da Na+, K+ -ATPase 6 dias após a administração da droga. Nossos resultados mostraram, portanto, que o ditelureto de difenila, quando administrado de forma aguda em ratos jovens, é capaz de aumentar a expressão de proteínas de FI e de afetar o sistema fosforilante associado a essas proteínas. Os dados mostraram ainda que o aparecimento desses efeito tem uma latência de 3 a 6 dias após a injeção da toxina e indicaram que o córtex cerebral é mais sensível do que o hipocampo aos efeitos do composto orgânico do telúrio. Além disso, o ditelureto de difenila é capaz de inibir a enzima Na+, K+ - ATPase cortical, reforçando a susceptibilidade do córtex cerebral à ação desta neurotoxina. Mostramos ainda neste trabalho, que o aumento de fosforilação das proteínas de FIs pode ser prevenida pelo disseleneto de difenila Com base nos resultados obtidos, pode-se supor que as alterações no citoesqueleto e a inibição da atividade da Na+, K+ -ATPase em células corticais podem estar envolvidas com a neurotoxicidade desse composto. / Tellurium is a rare element used as an industrial component of many alloys and in the electronic industry. This element also is one important intermediate and/or reagent in organic synthesis. Inorganic and organic tellurium compounds are highly toxic to the CNS of rodents. In this work we initially established the toxic dose and the time-action characteristics of diphenyl ditelluride acutely injected using body weight measurements as the end point of toxicity. Considering these findings, the aim of this work was to investigate the effect of a single subcutaneous injection of organic tellurium compounds, diphenyl ditelluride, on the intermediate filament (IF) phosphorylation in cerebral cortex and hippocampus from young Wistar rats (15 day-old), 1, 3 or 6 days after injection. We also investigated if diphenyl diselenide would be able to prevent this effect. Furthermore, we verified the effect of in vivo treatment with diphenyl ditelluride on Na+-K+-ATPase activity. Results showed that at days 3 and 6 animals injected with 0.3 μmol/Kg body weight or higher doses of diphenyl ditelluride presented loss of body mass when compared with control animals. Considering this finding, we have chosen the concentration of 0.3 μmol/Kg body weight for the next experiments. We observed an hyperphosphorylation of neurofilaments (the neuronal IF) and of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and of vimentin (Vim) (astrocyte IFs) in cerebral cortex. The effect of diphenyl ditelluride 3 days of injection on IF phosphorylation was accompanied by an increased NF-M, NF-L and GFAP immunocontent in IF-associated cytoskeletal fraction, suggesting an increase in protein polymerization. Otherwise, the stimulated GFAP, NF-L immunoreactivity in tissue homogenate suggests an increased protein synthesis. However, 6 days after the neurotoxin administration, only GFAP immunocontent increased in IF-associated cytoskeletal fraction, while GFAP and NF-H immunoreactivity was stimulated in tissue homogenate from cerebral cortex. On the other hand, in hippocampus, we observed that astrocyte IF (GFAP and Vimentin) hyperphosphorylation was accompanied by increased immunocontent of these proteins in cytoskeletal fraction at day 6 after tellurium injection. The cortical IF hyperphosphorylation induced by diphenyl ditelluride, was totally prevented by a single subcutaneous injection of diphenyl disselenide (5μmol/kg body weigth) 24h after diphenyl ditelluride administration. We also showed that beyond the effects of the in vivo treatment with diphenyl ditelluride on the cytoskeleton of cortical cells, this neurotoxin inhibited Na+-K+-ATPase activity at day 6 after drug injection. So, our results showed that a single subcutaneous injection of (PheTe)2 in young rats is able to stimulate the phosphorylation and expression of IF proteins. Moreover, our data demonstrated that effects of diphenyl ditelluride were time- and brain structure-dependent. We also verified in this work that cerebral cortex is more susceptible than hippocampus to neurotoxin injury. In addition, the diphenyl ditelluride was also able to inhibit the Na+-K+- ATPase activity. We showed also in this work that cortical IF hyperphosphorylation induced by diphenyl ditelluride was totally prevented by diphenyl disselenide Therefore, we can suppose that the observed alterations in cytoskeleton and the inhibition of the activity Na+-K+- ATPase in cortical cells may be related with the neurotoxicity of this substance.

A via das quinureninas é a principal rota de degradação do aminoácido triptofano. Os metabólitos dessa via, comumente chamados de quinureninas, estão envolvidos em vários processos fisiológicos e patológicos e, recentemente, algumas quinureninas foram relacionadas à fisiopatologia de várias doenças neurodegenerativas. Tendo em vista que dados da literatura são contraditórios no que se refere à geração de espécies reativas a partir de algumas quinureninas e considerando que as concentrações de alguns desses metabólitos estão elevadas em várias doenças neurodegenerativas, este trabalho teve por objetivo investigar os efeitos in vitro de alguns intermediários da via das quinureninas, particularmente a 3-hidroxiquinurenina (3HKyn), a quinurenina (Kyn), o ácido 3-hidroxiantranílico (3HAA), o ácido antranílico (AA) e o ácido quinolínico (QA) sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos de 30 dias de idade. Verificamos que a 3HKyn e o 3HAA diminuíram as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e a quimiluminescência em córtex cerebral de ratos jovens, o que indica um efeito antioxidante desses compostos, ao passo que a Kyn e o AA não alteraram os parâmetros de lipoperoxidação. Por outro lado, o QA aumentou a peroxidação lipídica nesta estrutura cerebral por aumentar significativamente as medidas de TBA-RS e quimiluminescência. Além disso, se pode verificar uma prevenção significativa da oxidação da GSH causada pelo 3HAA, enquanto o QA, na presença de íon ferroso e ácido ascórbico, diminuiu significativamente as concentrações de glutationa reduzida, o que indica que esse efeito seja mediado por radicais hidroxila gerados através da reação de Fenton. Já a 3HKyn, a Kyn e o AA não alteraram significativamente as concentrações de GSH. Também se verificou que a 3HKyn diminuiu a oxidação do diacetato de 2, 7-diclorofluoresceína, além de mostrar a propriedade de seqüestrar radicais peroxila e hidroxila. Por outro lado, o 3HAA somente seqüestrou radicais peroxila, sugerindo que a estrutura orto-aminofenólica é essencial para o composto possuir propriedades antioxidantes. Com o objetivo de verificar se o tempo de exposição à 3HKyn alterava a sua atividade antioxidante, determinamos a reatividade antioxidante total (TAR) e os valores de TBA-RS em células C6 cultivadas de glioma de ratos ao longo de 48 h na ausência (controle) ou presença de 3HKyn. Os resultados demonstraram um aumento da TAR e uma diminuição das TBA-RS pela 3HKyn em tempos curtos de exposição (1-6 horas), sendo que o metabólito não alterou significativamente esses parâmetros em tempos maiores de exposição, sugerindo uma diminuição da capacidade antioxidante da 3HKyn ao longo do tempo. Também verificamos uma diminuição do potencial antioxidante total (TRAP) e da TAR pelo QA em homogeneizado de córtex cerebral Finalmente, foi evidenciado qua a 3HKyn, na concentração de 100 µM, foi capaz de prevenir os efeitos tóxicos causados pelo QA e pelo ácido glutárico (GA). O GA é a principal neurotoxina que se encontra acumulada na acidemia glutárica tipo I. Em resumo, nossos resultados sugerem um efeito antioxidante da 3HKyn e do 3HAA e um efeito pró-oxidante do QA in vitro em córtex cerebral de ratos jovens. As alterações provocadas pelas várias quinureninas foram obtidas nas concentrações de 10, 100 e 500 µM. Embora não saibamos as concentrações dessas substâncias em doenças neurodegenerativas em que eles se acumulam, é possível que, em uma situação in vivo, a produção de substâncias antioxidantes através da rota das quinureninas poderia contrabalançar os efeitos tóxicos causados por outros metabólitos como o QA.

As acidemias orgânicas são desordens metabólicas caracterizadas, bioquimicamente, pelo acúmulo de um ou mais ácidos orgânicos e, clinicamente, por disfunções neurológicas graves. Os ácidos propiônico (PA) e metilmalônico (MMA) são metabólitos presentes, em altas concentrações, nos tecidos e fluídos biológicos de pacientes afetados pelas acidemias propiônica e metilmalônica, respectivamente. Os neurofilamentos (NFs) são proteínas do citoesqueleto neuronal formados pela polimerização de três subunidades, denominadas: NF de alto peso molecular (NFH), NF de médio peso molecular (NF-M) e NF de baixo peso molecular (NF-L), com pesos moleculares aparentes de 200, 150 e 68 kDa, respectivamente. Essas proteínas são amplamente fosforiladas, sendo que seu nível de fosforilação está relacionado com a polimerização dos NFs e com a regulação das interações entre os constituintes do citoesqueleto. Neste trabalho fizemos um estudo ontogenético dos efeitos in vitro do PA e do MMA 2,5 mM sobre a imunorreatividade da subunidade NF-H em fatias de córtex cerebral de ratos de 9, 12, 17, 21 e 60 dias de idade. Para tanto utilizamos uma abordagem metodológica baseada na imunodetecção da NF-H com dois anticorpos diferentes: o anticorpo monoclonal anti NF-200 clone NE14 que se liga somente a epítopos fosforilados da NF-H e, portanto, reconhece a NF-H fosforilada; e o anticorpo monoclonal anti NF-200 clone N52 que reconhece a NF-H total, independentemente do nível de fosforilação. Nossos resultados mostraram que os metabólitos induzem alterações na imunorreatividade da NF-H presente na fração citoesquelética de maneira dependente do estágio de desenvolvimento do animal Considerando o conjunto de dados obtidos com os anticorpos NE14 e N52 na fração citoesquelética, podemos dizer que o tratamento das fatias de córtex cerebral de ratos de 9 dias aumentou o nível de fosforilação sem alterar o imunoconteúdo total; em ratos de 12 e 17 dias de vida levou a um acúmulo da subunidade NF-H na fração citoesquelética e que esta proteína está na forma fosforilada; e finalmente, em ratos de 21 e 60 dias de vida os metabólitos não alteraram os parâmetros estudados. Mostramos, também, que o acúmulo da NF-H provocado pelos metabólitos em ratos de 12 e 17 dias de vida não decorreu de um aumento na síntese da proteína, mas, provalvelmente devido a um desequilíbrio na relação NF-H solúvel/NF-H polimerizada, que favoreceu a forma polimerizada. Finalmente, mostramos um possível envolvimento de mecanismos de neurotransmissão GABAérgica e glutamatérgica para os efeitos observados em ratos de 12 e 17 dias de idade, respectivamente. Considerando que a fosforilação é um mecanismo importante para a regulação da dinâmica de polimerização dos NFs e das interações com outros componentes do citoesqueleto, sugerimos que uma desorganização na sua homeostase possa causar uma neurodegeneração, que é característica dos pacientes portadores das acidemias propiônica e metilmalônica.