INTRODUÇÃO: A restrição do crescimento intrauterino (RCIU) é conhecida como uma condição na qual o feto não consegue desenvolver todo o seu potencial de crescimento intrínseco. Crianças com RCIU em idade escolar têm prejuízos no aprendizado, memória, atenção e cognição em geral, e maior predisposição a transtornos psicológicos como Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH), quando comparados com crianças não restritas. OBJETIVO: este estudo busca encontrar modificações neurobiológicas encefálicas, em ratos Wistar adolescentes, que possam explicar os efeitos, em parâmetros comportamentais, de neuroplasticidade e memória, da RCIU por redução da pressão de perfusão uterina (RPPU). MÉTODOS: ratas Wistar prenhes de 75 dias de idade foram submetidas à RPPU no dia gestacional 14, período que corresponde ao inicio da fase de rápido crescimento, diferenciação e maturação em ratos, por meio da colocação de um clipe na artéria aorta abdominal descendente antes da bifurcação para as artérias ilíacas e um clipe em cada artéria ovariana. O grupo Sham foi submetido à laparotomia exploratória sem a RPPU e o grupo controle não foi submetido a nenhum procedimento cirúrgico. Ratos Wistar de 30 dias, provenientes de mães submetidas à RPPU, Sham ou Controles, foram submetidos ao Teste de Campo Aberto, para avaliação da atividade locomotora e exploratória, e no 32º dia pós-natal (DPN) foram submetidos ao teste de Reconhecimento do Novo Objeto para avaliar a memória de longo prazo. Os encéfalos da prole foram coletados no 34º DPN e conservados para análise. A Técnica de imunoistoquímica foi realizada para mensurar a expressão de marcadores celulares neurais: NeuN (neurônios maduros) GFAP (astrócito) no córtex pré-frontal e estriado da prole. RESULTADOS: a RPPU causou diminuição no peso ao nascimento no grupo RCIU e Sham, porém não houve diferença no peso entre os grupos no 30º DPN. A RPPU aumentou significativamente a duração da gestação no grupo RCIU em um dia. Os animais restritos apresentaram aumento na atividade exploratória no teste de campo aberto. RCIU e Sham apresentaram déficit de memória no teste de reconhecimento do novo objeto. Associado a essas alterações comportamentais, a RCIU levou a o aumento significativo na expressão de NeuN no CPF e de GFAP no estriado no 34º DPN. CONCLUSÃO: a RPPU produz alterações na gravidez causando maior duração da ges-tação e RCIU na prole, conduzindo a modificações comportamentais e de memória, assim como a nível encefálico celular, promovendo novas perspectivas sobre as consequências do modelo em ratos de RCIU-RPPU. São necessários mais estudos para desvendar se essas modificações continuam presente na vida adulta dos ratos. / INTRODUCTION: Intrauterine growth restriction (IUGR) is known as a condition where the fetus cannot develop its intrinsic growth potential. IUGR Children in early scholar age have impaired learning abilities, memory, attention and cognitive deficit in general; also, they are in higher risk of psychological disorders as Attention Deficit and Hyperactivity Disorder (ADHD) when compared with non-IUGR children. OBJECTIVE: The study aims to find neurobiologi-cal brain modifications, in adolescent Wistar rats, that could clarify these memory and behav-ioral impairments in a rat animal model of IUGR by Reduced Uterine Perfusion Pressure (RUPP). METHODS: 75 days-old pregnant Wistar rats were underwent to RUPP procedure on 14th gestational day, period where the fast growing, differentiation and maturation phase begins in rats, by putting one clip at the abdominal descendent aorta before iliac bifurcation and one clip in each ovarian artery. The Sham group underwent exploratory laparotomy procedure without the RUPP and the control group was not exposed to any surgical procedure. 30 days old Wistar rats from RUPP, Sham, and Control mothers were exposed to the Open Field Test to assess the locomotor and exploratory activity and, at 32th postnatal day (PND), to the Novel Object Recognition test to assess the long-term memory. Offspring brains were collected at 34th PND and preserved for analysis. Immunohistochemistry technique was performed to measure the expression of neural cells markers: NeuN (mature neurons) and GFAP (astrocytes) in prefrontal cortex and striatum on the offspring. RESULTS: RUPP caused a decreased birth weight in IUGR and Sham group, however there was no difference between birth weight at 30th PND. RUPP significantly increased gestation in 1 day in IUGR rats. IUGR animals had greater exploratory, locomotor activity in the Open Field test. IUGR and Sham showed memory deficit in the Novel Object Recognition test. Associated to those behavioral modifications, the RUPP leaded to a significant increase in expression of NeuN and GFAP marker in prefrontal cortex and striatum at PND34. CONCLUSIONS: The RUPP dis-turbs pregnancy increasing gestation length and inducing IUGR in the offspring; which leads to behavioral and memory modifications, also, in a brain cellular level, promoting new insight about the IUGR-RUPP rat model consequences. Further analysis are needed to find whether this changes are still present in adult life.

Introdução: Crianças nascidas pequenas para a idade gestacional (PIG) apresentam maior risco de permanecerem com baixa estatura na vida adulta. Os fatores de crescimento insulino-símile tipo 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) são os principais fatores endócrinos determinantes do crescimento fetal. A maioria das ações conhecidas destes hormônios é mediada via um receptor tirosina quinase, conhecido como IGF-1R. As mutações inativadoras e deleções do gene do IGF1R em heterozigose vêm sendo relatadas de forma crescente nos últimos 9 anos em pacientes com história de déficit de crescimento pré e pós-natal. Postula-se que pelo menos 2 a 3% das crianças nascidas PIG poderiam apresentar defeitos no IGF1R. O quadro clínico destes pacientes apresenta grande variabilidade quanto à gravidade do retardo de crescimento pré- e pós-natal e aos parâmetros hormonais. Objetivo: Caracterizar in vitro a resistência ao IGF-1 de pacientes com defeitos no IGF1R, identificados em nosso ambulatório. Material e métodos: Desenvolvemos cultura de fibroblastos de 2 controles (C1 e C2) e de 4 pacientes nascidos PIG (SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4) com suspeita de insensibilidade ao IGF-1 por ausência de recuperação do crescimento na vida pós natal. Destes pacientes, um paciente (SGA1) era portador de mutação missense em heterozigose no gene IGF1R (p.Arg511Trp) e os demais apresentavam baixa expressão dos IGF1R em leucócitos periféricos quando avaliados por PCR em tempo real. Um destes pacientes (SGA2) apresentava também a variante alélica p.Gly6Arg do IGF1R em heterozigose, alteração esta encontrada também em controles e familiares sem déficit de crescimento. As ações do IGF-1 foram determinadas por ensaios de proliferação, análise da expressão do IGF-1R e estudos de fosforilação de proteínas da via de sinalização do IGF-1 em fibroblastos (via PI3K). Resultados: As linhagens SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4 proliferaram respectivamente 55%, 66%, 64% e 28% a menos sob estímulo de IGF-1 em relação ás linhagens controles. No estudo da expressão do RNAm do IGF1R por PCR em tempo real, foi observada redução na expressão do IGF1R nas linhagens SGA2, SGA3 e SGA4 em relação aos controles, assim como o conteúdo total da proteína IGF-1R. Por outro lado, a linhagem SGA1 mostrou expressão aumentada do IGF1R e no conteúdo da proteína em relação aos controles. Em relação á ativação da via PI3K, todas as linhagens dos pacientes apresentaram menor fosforilação de AKT após estímulo com IGF-1, quando comparadas com as linhagens controles. Conclusão: Demonstramos a presença de insensibilidade parcial ao IGF-1 nas linhagens estudadas. A baixa expressão do IGF1R observada em leucócitos periféricos nas linhagens SGA2, SGA3 e SGA4 foi confirmada em fibroblastos tanto em nível de RNAm quanto da sua proteína. Nestas linhagens a insensibilidade ao IGF-1 é secundária a diminuição da expressão deste receptor. Em contraste a na linhagem com a mutação p.Arg511Trp (SGA1) observou-se expressão normal do IGF-1R na superfície celular. Pacientes com alterações no gene IGF1R não apresentam um fenótipo característico que os diferencie de outras crianças nascidas PIG sem alterações neste gene, mostrando a importância dos estudos moleculares neste grupo de pacientes / Small for gestational age (SGA) children are at a greater risk of having a short stature in adulthood. The type 1 and 2 insulin-like growth factors (IGF-1 and IGF-2) are the main endocrine factors determining fetal growth, and most of the known actions of these hormones are mediated via a receptor tyrosine kinase, IGF-1R. Inactivating mutations and deletions of the IGF1R gene in heterozygosis have been reported with increasing frequency in the last 9 years in patients with a history of a failure to thrive pre- and postnatally. It is postulated that at least 2-3% of the children born SGA could be defective for the IGF1R. The clinical presentation of these patients is highly variable with regard to the severity of growth retardation and pre- and post-natal hormonal parameters. Objectives: The goal of this study was to identify the in vitro insensitivity to IGF-1 in patients with defects in IGF1R. Methods: We developed fibroblast cultures from two controls (C1 and C2) and 4 patients born SGA (SGA1, SGA2, SGA3 and SGA4) with a suspected insensitivity to IGF-1 by the absence of catch-up growth during their postnatal life. Of these patients, one (SGA1) carried a heterozygous missense mutation in the IGF1R gene (p.Arg511Trp), and the others exhibited low expression levels of IGF1R in their peripheral leukocytes, as evaluated using real-time PCR. One of these patients (SGA2) was also heterozygous for the allelic variant p.Gly6Arg of IGF1R, an alteration also found in the controls and family members not displaying growth restriction. The actions of IGF-1 were determined using proliferation assays, an analysis of the expression of IGF- 1R and phosphorylation studies of proteins of the IGF-1 signaling pathway in fibroblasts (via PI3K).Results: The SGA1, SGA2, SGA3 and SGA4 fibroblasts proliferated 55%, 66%, 64% and 28%, respectively, less under the stimulation of IGF-1 compared to the control lines. Using real-time PCR, the IGF1R mRNA expression showed reduced levels of IGF1R in the SGA2, SGA3 and SGA4 cells compared to the controls, and the total IGF-1R protein was also decreased in these cells. Moreover, the SGA1 cells showed increased expression levels of IGF1R mRNA and protein compared to the controls. In relation to the activation of PI3K, all of the cells showed decreased phosphorylation of AKT after the stimulation with IGF-1 compared to the control cells. Conclusion: We demonstrated the presence of a partial insensitivity to IGF-1 in the studied samples. The low expression of IGF1R observed in the peripheral leukocytes in the SGA2, SGA3 and SGA4 fibroblasts was confirmed at both the mRNA and protein levels, and the Andréa de Castro Leal Doutorado insensitivity of the cells to IGF-1 is secondary to the decreased expression of the receptor. In contrast, the cells with the mutation p.Arg511Trp (SGA1) displayed normal IGF-1R expression on the cell surface. The patients with alterations in the IGF1R gene do not exhibit a characteristic phenotype that differentiates them from other children born SGA and with no changes in this gene, thus showing the importance of molecular studies for this group of patients

Crianças nascidas pequenas para a idade gestacional (PIG) apresentam maior risco de permanecerem com baixa estatura na vida adulta. Os fatores de crescimento insulina-símile 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) são os principais fatores endócrinos determinantes do crescimento fetal. Na vida pós-natal o GH, principal hormônio promotor de crescimento, exerce a maior parte de seus efeitos por meio do IGF-1. A grande maioria das ações conhecidas do IGF-1 e IGF-2 são mediadas via receptor tirosina quinase conhecido como receptor tipo 1 de IGFs (IGF-1R). Os objetivos deste trabalho foram estudar os genes IGF1 e IGF1R em crianças nascidas pequenas para a idade gestacional que não recuperaram o crescimento na vida pós-natal. Foram selecionados 145 pacientes nascidos PIG, 72 sem catch up e 73 com catch up. Em 54 PIG sem catch up foi estudado toda a seqüência codificadora do gene IGF1 por meio de PCR e seqüenciamento direto, nos demais PIG sem catch up e nos 73 PIG com catch up foi estudado apenas o exon 6 do IGF-1 por PCR e seqüenciamento direto para avaliação de um polimorfismo encontrado nesta região. Nos pacientes que apresentavam concentração sérica de IGF-1 e IGFBP-3 acima da média para idade e sexo e seqüência do IGF1 normal (n=23) foi realizada coleta de sangue periférico com posterior separação de leucócitos mononucleares pelo gradiente de ficoll seguido por extração de RNA pelo método de Trizol® Posteriormente, a partir do RNA, sintetizamos o cDNA (DNA complementar) utilizando primers randômicos. Foi realizado PCR e seqüenciamento direto do cDNA, além de análise da expressão do IGF1R por PCR em tempo real. Nenhuma mutação foi encontrada no gene IGF1. Entretanto um locus altamente polimórfico foi encontrada na região 3\' não traduzida do exon 6 deste gene, região esta envolvida no processo de poliadenilação. A freqüência das variantes alélicas foi semelhante em PIG com e sem catch-up e em controles nascidos AIG. Analisando o fenótipo de pacientes PIG que apresentavam a variante alélica wild type ou uma das três variantes alélicas mais freqüentemente encontradas, não observamos diferenças significativas entre peso e comprimento ao nascimento, níveis de IGF-1 e crescimento na vida pós-natal. No gene IGF1R encontramos duas variantes alélicas nunca descritas previamente. A primeira variante encontrada está localizada no exon 1, em uma região de peptídeo sinal do pro IGF-1R e consiste na troca do nucleotídeo guanina pelo nucleotídeo adenina na posição 16 da região codificadora (c.16G>A), levando a troca do aminoácido glicina por arginina na posição 6 da proteína (p.G6R). A outra mutação encontrada está localizada no exon 7 onde observamos uma troca do nucleotídeo citosina por timina na posição 1531 do cDNA (c.1531 C>T), levando a uma troca de arginina por triptofano na posição 511 do IGF1R (p.R511W). Adicionalmente, foi observada uma expressão do IGF1R diminuída em 5 pacientes estudados.Concluímos que as variantes alélicas encontradas na região de poliadenilação do IGF1 não influenciam significativamente as características ao nascimento e pós-natais de crianças nascidas PIG ou a altura adulta de indivíduos normais nascidos AIG. O estudo do IGF1R identificou duas novas variantes alélicas em heterozigose no gene IGF1R e, em cinco pacientes, observamos uma expressão reduzida deste gene. Pacientes com alterações no gene IGF1R não apresentam um fenótipo característico que os diferencie de outras crianças nascidas PIG sem alterações neste gene, mostrando a importância dos estudos moleculares. / Children born small for gestational age (SGA) have a higher risk of remaining short in adulthood. The insulin-like growth factors 1 and 2 (IGF-1 and IGF-2) are the main factors determining endocrine fetal growth. GH is the main promoter of linear growth in the postnatal life, exerting its effects mostly through the IGF-1. The vast majority of known actions of IGF-1 and IGF-2 are mediated by the insulin-like growth factor type 1 receptor (IGF-1R), a member of the tyrosine kinase receptors family. The aim of this study was to investigate IGF1 and IGF1R genes mutations in children born small for gestational age without catch up growth in postnatal life. We selected 145 patients born SGA, 72 without catch-up and 73 with catch up. The whole coding region of the IGF1 gene was sequenced in 54 patients without catchup. In the other SGA children without catch-up and in 73 SGA with catch-up, only the exon 6 of IGF1 was sequenced to assess the influence of allelic variants present in this region. In patients with normal IGF1 sequence and IGF-1 and IGFBP-3 serum levels above the mean for age and sex (n = 23) total RNA was extracted from peripheral blood lymphocytes followed by cDNA synthesis with random primers. The IGF1R cDNA was amplified using specific primers followed by direct sequencing. IGF1R expression was analyzed by real-time PCR. No mutations were found in the IGF1 gene. However a highly polymorphic sequence was identified in the upstream core polyadenylation signal (UCPAS) located in IGF1 3\' UTR at exon 6. The frequency of the identified allelic variants was similar in SGA children with and without catch-up and in controls. Furthermore, children homozygous for the wild-type allele and those carrying the allelic variants in homozygous or heterozygous state presented similar weight and length at birth, as well as serum IGF-1 levels and postnatal growth features. Two novel nonconservative allelic variants were identified in IGF1R in 23 SGA children (8.7%) in the heterozygous state. The first variant (c.16G>A) was located in the exon one, leading to a substitution of glicine by arginine in the pro-IGF-1R signaling peptide (p.G6R). The second variant was located in exon 7 (c.1531 C>T), leading to a substitution of arginine by tryptophan in the amino acid 511 of the IGF1-R (p.R511W). Moreover, a decreased IGF1R expression was observed in 5 of the 23 patients with elevated serum IGF-1 concentrations. We conclude that the UCPAS allelic variants did not significantly influence the birth and postnatal characteristics of children born SGA, neither the adult height of normal individuals born adequate for gestational age. The IGF1R study identified two novel allelic variants in two patients and a reduced expression of the IGF1R was observed in five patients. Patients with alterations in IGF1R did not have a distinctive phenotype when compared with other children born SGA without changes in this gene, indicating the importance of molecular studies.

INTRODUÇÃO: A restrição do crescimento intrauterino (RCIU) é conhecida como uma condição na qual o feto não consegue desenvolver todo o seu potencial de crescimento intrínseco. Crianças com RCIU em idade escolar têm prejuízos no aprendizado, memória, atenção e cognição em geral, e maior predisposição a transtornos psicológicos como Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH), quando comparados com crianças não restritas. OBJETIVO: este estudo busca encontrar modificações neurobiológicas encefálicas, em ratos Wistar adolescentes, que possam explicar os efeitos, em parâmetros comportamentais, de neuroplasticidade e memória, da RCIU por redução da pressão de perfusão uterina (RPPU). MÉTODOS: ratas Wistar prenhes de 75 dias de idade foram submetidas à RPPU no dia gestacional 14, período que corresponde ao inicio da fase de rápido crescimento, diferenciação e maturação em ratos, por meio da colocação de um clipe na artéria aorta abdominal descendente antes da bifurcação para as artérias ilíacas e um clipe em cada artéria ovariana. O grupo Sham foi submetido à laparotomia exploratória sem a RPPU e o grupo controle não foi submetido a nenhum procedimento cirúrgico. Ratos Wistar de 30 dias, provenientes de mães submetidas à RPPU, Sham ou Controles, foram submetidos ao Teste de Campo Aberto, para avaliação da atividade locomotora e exploratória, e no 32º dia pós-natal (DPN) foram submetidos ao teste de Reconhecimento do Novo Objeto para avaliar a memória de longo prazo. Os encéfalos da prole foram coletados no 34º DPN e conservados para análise. A Técnica de imunoistoquímica foi realizada para mensurar a expressão de marcadores celulares neurais: NeuN (neurônios maduros) GFAP (astrócito) no córtex pré-frontal e estriado da prole. RESULTADOS: a RPPU causou diminuição no peso ao nascimento no grupo RCIU e Sham, porém não houve diferença no peso entre os grupos no 30º DPN. A RPPU aumentou significativamente a duração da gestação no grupo RCIU em um dia. Os animais restritos apresentaram aumento na atividade exploratória no teste de campo aberto. RCIU e Sham apresentaram déficit de memória no teste de reconhecimento do novo objeto. Associado a essas alterações comportamentais, a RCIU levou a o aumento significativo na expressão de NeuN no CPF e de GFAP no estriado no 34º DPN. CONCLUSÃO: a RPPU produz alterações na gravidez causando maior duração da ges-tação e RCIU na prole, conduzindo a modificações comportamentais e de memória, assim como a nível encefálico celular, promovendo novas perspectivas sobre as consequências do modelo em ratos de RCIU-RPPU. São necessários mais estudos para desvendar se essas modificações continuam presente na vida adulta dos ratos. / INTRODUCTION: Intrauterine growth restriction (IUGR) is known as a condition where the fetus cannot develop its intrinsic growth potential. IUGR Children in early scholar age have impaired learning abilities, memory, attention and cognitive deficit in general; also, they are in higher risk of psychological disorders as Attention Deficit and Hyperactivity Disorder (ADHD) when compared with non-IUGR children. OBJECTIVE: The study aims to find neurobiologi-cal brain modifications, in adolescent Wistar rats, that could clarify these memory and behav-ioral impairments in a rat animal model of IUGR by Reduced Uterine Perfusion Pressure (RUPP). METHODS: 75 days-old pregnant Wistar rats were underwent to RUPP procedure on 14th gestational day, period where the fast growing, differentiation and maturation phase begins in rats, by putting one clip at the abdominal descendent aorta before iliac bifurcation and one clip in each ovarian artery. The Sham group underwent exploratory laparotomy procedure without the RUPP and the control group was not exposed to any surgical procedure. 30 days old Wistar rats from RUPP, Sham, and Control mothers were exposed to the Open Field Test to assess the locomotor and exploratory activity and, at 32th postnatal day (PND), to the Novel Object Recognition test to assess the long-term memory. Offspring brains were collected at 34th PND and preserved for analysis. Immunohistochemistry technique was performed to measure the expression of neural cells markers: NeuN (mature neurons) and GFAP (astrocytes) in prefrontal cortex and striatum on the offspring. RESULTS: RUPP caused a decreased birth weight in IUGR and Sham group, however there was no difference between birth weight at 30th PND. RUPP significantly increased gestation in 1 day in IUGR rats. IUGR animals had greater exploratory, locomotor activity in the Open Field test. IUGR and Sham showed memory deficit in the Novel Object Recognition test. Associated to those behavioral modifications, the RUPP leaded to a significant increase in expression of NeuN and GFAP marker in prefrontal cortex and striatum at PND34. CONCLUSIONS: The RUPP dis-turbs pregnancy increasing gestation length and inducing IUGR in the offspring; which leads to behavioral and memory modifications, also, in a brain cellular level, promoting new insight about the IUGR-RUPP rat model consequences. Further analysis are needed to find whether this changes are still present in adult life.

As doenças que comprometem o crescimento humano apresentam uma forte influência genética. O objetivo geral do projeto atual é desenvolver e aplicar a tecnologia de sequenciamento paralelo em larga escala para compreensão desses distúrbios de crescimento, com foco principal em crianças nascidas pequenas para idade gestacional (PIG), definida como criança com Escore-Z de comprimento e/ou peso ao nascimento menor ou igual a -2. PIG é uma condição heterogênea, que inclui como causa fatores maternos, placentários e fetal, dentre o qual, destacam-se as alterações genéticas. Crianças nascidas PIG e que não recuperaram seu déficit estatural espontaneamente nos primeiros anos de vida apresentam uma alta probabilidade de serem adultos baixos e costumam evoluir com quadros clínicos complexos, envolvendo retardo de crescimento persistente na vida pós-natal, dismorfismos, anomalias congênitas e distúrbios de desenvolvimento neuropsicomotor. Foi utilizada a tecnologia de sequenciamento Sure Select (Agilent Technologies, CA, USA) para estudar aproximadamente 390 genes escolhidos por pertencerem à via IGFs/IGF1R, principal eixo regulador hormonal do crescimento, genes sabidamente envolvidos em doenças associadas com distúrbio de crescimento, além de genes candidatos identificados em estudos prévios do laboratório, associados à regulação do crescimento, em um grande número de pacientes. Foram sequenciados 80 pacientes, obtendo uma cobertura média de 354 vezes e com mais de 99% da região alvo com cobertura > 10 reads. Nestas amostras foram identificadas 58 variantes, 18 consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas em 19 pacientes, 32 de significado incerto, 7 provavelmente benigna e 1 provavelmente patogênica para condição não associada a distúrbio de crescimento (\"achado acidental\"). Dentre as variantes consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas houve uma grande heterogeneidade entre os genes, sendo identificadas variantes nos genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL e deleção 22q11. Podemos concluir que a técnica de sequenciamento paralelo em larga escala de genes alvo é eficiente em estabelecer o diagnóstico molecular de crianças nascidas PIG. Foi possível identificar a etiologia genética em 23,75% da casuística estudada, em sua maior parte, de pacientes com síndromes reconhecidas clinicamente. Contudo, defeitos no sistema IGFs/IGF1R não foram frequentes nesta condição / Diseases affecting human growth are most likely caused by genetic factors. The main goal of this project is to apply the technology of massive parallel sequencing to comprehend growth disturbs in children born small for gestational age (SGA), known as the children with Z-score of height and/or weight at birth less or equal -2. SGA is a heterogeneous condition, and as its causes we can find maternal, placental and fetal factors, of which, the most important are the genetic alterations. Children born SGA that do not have catch-up growth spontaneously up to the second year of life may remain with short stature when adults and they usually present other clinical features, such as dimorphisms, congenital anomalies and neuropsychomotor developmental delay. We used the Sure Select technology (Agilent Technologies, CA, USA) to study approximately 390 genes chosen by participate of the IGFs/IGF1R system, or genes already associated with growth disorders, or candidate genes found in previous studies of aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization) or exome sequencing. We sequenced 80 patients, and had a mean coverage of 354x, with more than 99% of the target region with > 10 reads. We found 58 variants, 18 classified as pathogenic or probably pathogenic in 19 patients, 32 variants of unknown significance and 7 probably benign and 1 probably pathogenic for a condition non associated to short stature (``incidental finding``) Among the probably pathogenic and pathogenic we found a great heterogeneity in genes, with variants identified in 10 different genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL and a 22q11 deletion. In conclusion, the technique of targeted gene panel sequencing is a useful tool to establish the molecular diagnose in children SGA. We could identify the molecular cause in 23.75% of the casuistic, mostly patients with clinically recognized syndromes. However, variants at IGFs/IGF1R system are not frequently associated with the studied condition

Introdução: Crianças nascidas pequenas para a idade gestacional (PIG) apresentam maior risco de permanecerem com baixa estatura na vida adulta. Os fatores de crescimento insulino-símile tipo 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) são os principais fatores endócrinos determinantes do crescimento fetal. A maioria das ações conhecidas do IGF-1 e 2 é mediada via um receptor tirosina quinase, conhecido como IGF-1R. Recentemente, a insensibilidade ao IGF-1 foi identificada como uma das causas de retardo de crescimento em crianças nascidas PIG que não apresentaram recuperação espontânea do crescimento na vida pós-natal. Crianças afetadas apresentavam níveis elevados de IGF-1, IGFBP-3 além de microcefalia. O papel de defeitos pósreceptor na sinalização do IGF-1 como causa de retardo de crescimento pré e pós-natal ainda não foi investigado. Objetivo: Analisar in vitro a ação do IGF-1 em fibroblastos de crianças nascidas PIG. Material e métodos: Desenvolvemos cultura de fibroblastos de 2 controles (C1 e C2) e de 4 pacientes nascidos PIG (SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4) com suspeita de insensibilidade ao IGF-1 por ausência de recuperação do crescimento na vida pós natal, resposta insatisfatória ao tratamento com hGH apesar de níveis normais/elevados de IGF-1. Foi confirmado do ponto de vista molecular que um dos pacientes (SGA1) apresenta Síndrome de Sílver- Russell com perda da metilação do alelo paterno da região ICR1 (imprinting center region 1) importante para a expressão do IGF-2. Defeitos no gene do IGF1 e IGF1R foram afastados por sequenciamento direto. As ações do IGF- 1 foram determinadas por ensaios de proliferação, análise da produção de IGFPB-3 em meio de cultura e estudos de fosforilação de proteínas da via de sinalização do IGF-1 em fibroblastos (AKT e ERK). Resultados: As linhagens SGA1, SGA2 e SGA3 proliferaram respectivamente 31%, 60% e 78% a menos sob estímulo de IGF-1 em relação ás linhagens controles. Já a linhagem SGA4 apresentou comportamento semelhante ás linhagens controles. No estudo da expressão do RNAm do IGF1R por PCR em tempo real, não foi observada diferença significativa na expressão do IGF1R nas diversas linhagens PIG em relação aos controles, assim como o conteúdo total da proteína IGF-1R. Em relação á ativação da via MAPK, todas as linhagens dos pacientes PIGs apresentaram menor fosforilação ERK1/2 basal e após estímulo com IGF-1, quando comparadas com as linhagens controles (p < 0.001) apesar do conteúdo total de ERK1/2 ser semelhante. Já em relação a ativação da via PI3K, as linhagens SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4 não diferiram significantemente em relação aos fibroblastos controles quanto à ativação de AKT pelo IGF-1. O conteúdo total de AKT também foi semelhante em todas as linhagens estudadas. O estudo da expressão de IGFBP3 mostrou um aumento da expressão deste peptídeo na linhagem de fibroblastos do paciente SGA1 (14X). O conteúdo de IGFBP-3 intracelular não sofreu alteração, porém comprovamos que a linhagem SGA1 secretava 2x mais IGFBP-3 para o meio de cultura. Apesar de apresentarem estrutura, expressão e conteúdo de IGF1R normais, essas mesmas 3 linhagens celulares que apresentaram menor proliferação também apresentaram diminuição na fosforilação de ERK após tratamento com IGF-1. Mesmo sob o estímulo com desIGF-1 (um análogo do IGF-1 com baixa afinidade por IGFBPs mas que preserva sua capacidade de ativar o receptor IGF-1R) a ativação de ERK e a proliferação celular se manteve abaixo dos das linhagens controles. O estudo do conteúdo total de GRB10 foi semelhante em todas as linhagens celulares. Conclusão: Três dos 4 pacientes PIG estudados apresentaram insensibilidade pós-receptor ao IGF-1. A linhagem celular SGA1, obtida de um paciente com hipometilação do ICR1 11p15 causando SSR, demonstramos um aumento da expressão e secreção de IGFBP-3, o qual não se mostrou responsável por inibir a ação do IGF-1 nestes fibroblastos. Novos estudos devem ser desenvolvidos para identificar o defeito molecular responsável pela insensibilidade ao IGF-1 a nível pósreceptor observada nestes pacientes. / Introduction: Children born small for gestational age (SGA) have a higher risk of staying with short stature in adulthood. The insulin-like growth factors (IGF-1 and IGF-2) are the main endocrine factor determining fetal growth. Most of the known actions of IGFs are mediated by IGF-1R, a tyrosine kinase receptor. Recently, the IGF-1 insensitivity was identified causing growth retardation in children born SGA who who did not present spontaneous catch-up growth in postnatal life. Affected children had elevated IGF-1 and IGFBP-3 levels in addition to microcephaly. The role of post receptor defects in IGF-1 signaling on the deficit of growth is still unclear. Objective: To assess IGF-1 action and signaling in vitro in fibroblasts from SGA children. Methods: Fibroblasts cell cultures were developed from 2 controls (C1 and C2) and 4 patients with pre- and post-natal growth retardation (SGA1, SGA2, SGA3 and SGA4). IGF-1 insensitivity was demonstrated by severe pre and postnatal growth impairment without any evident cause, IGF1 SDS > 0 and poor growth response during high doses of hGH treatment. Three SGA patients presented microcephaly. Defects in the gene of the IGF1 and IGF1R were excluded by direct sequencing. One patient (SGA1) presents the Silver- Russell syndrome (SRS) with loss of methylation of the paternal allele in the ICR1 (imprinting center region 1) chromosome 11p15, important for IGF-2 expression. IGF-1 action was assessed by cell proliferation by colorimetric assay. IGF-1 signaling was assessed by AKT and ERK phosphorylation after IGF-1 stimulation through SDS-PAGE of intracellular extract followed by immunoblotting with specific antibodies. The expression of IGF1R and IGFBP3 gene was determined by Real-time quantitative PCR and the levels of the IGF-1R and IGBP-3 protein by direct immunoblotting. Results: The SGA1, SGA2 and SGA3 cell lines proliferated 31%, 60% and 78% less under IGF-1 stimulation in comparison of controls fibroblasts, respectively. The expression of IGF1R mRNA and the level of total amount of IGF-1R protein were similar in all SGA and control cell lines. Despite normal IGF-1R structure and quantity, the same 3 SGA cell lines that presented low proliferation response also had 50 to 85% lower ERK phosphorylation after IGF-1 treatment (p <0.001), although the similar total content of ERK1/2. In relation to PI3K pathway activation, all SGA cell cultures presented normal AKT phosphorilation. Fibroblasts from the SGA1 patient presented a 14x increase in IGFBP3 mRNA and 2x more IGFBP-3 secretion to culture serum medium. Treatment with desIGF-1, an IGF-1 analogue with low affinity for IGFBPs although retains its ability to activate the IGF-1R, did not recover cell proliferation or ERK phosphorylation. All cell lines presented similar amount of GRB10 protein Conclusion: Three of 4 SGA patients showed evidence of post-receptor IGF-1 insensitivity. The cell line SGA1, obtained from a SRS patient with ICR1 hypomethylation, showed increased expression and secretion of IGFBP-3, which was not directly responsible for inhibition in IGF- 1 action. Further studies should be developed to identify the molecular cause of IGF-1 post-receptor insensitivity observed in our patients.

Introdução: Polimorfismos na região promotora dos genes da insulina, IGF2 e IGF1 podem estar relacionados a uma diminuição da expressão desses genes na vida fetal que, por sua vez, pode causar restrição do crescimento intra-uterino e maior risco de hipospádia. Na vida pós-natal, perda completa ou parcial da expressão desses genes pode resultar em ausência de recuperação estatural e menores concentrações séricas de IGF1 na criança, além de um maior risco de diabetes melito tipo 2 e síndrome de resistência à insulina no adulto. Objetivos: Analisar em crianças nascidas pequenas para idade gestacional (PIG) com ou sem recuperação estatural (RE): 1) a freqüência alélica e genotípica dos polimorfismos VNTR-INS e das repetições CA do gene IGF1; 2) a região promotora P4 do gene IGF2; 3) a influência do VNTR INS e das repetições CA do gene IGF1 na sensibilidade à insulina e nas concentrações séricas de IGF1, respectivamente. Pacientes: Foram estudados 142 indivíduos nascidos PIG com (n= 66) e sem recuperação (n= 76) estatural selecionados de três diferentes centros (HC-FMUSP, Santa Casa de São Paulo e HC-UFPR) e um grupo controle constituído de 297 indivíduos nascidos adequados para idade gestacional (AIG). Métodos: Extração de DNA genômico; amplificação por PCR das regiões contendo os polimorfismos VNTR INS e repetições CA do IGF1 e da região promotora P4; digestão por enzima de restrição; software Genescan; seqüenciamento automático; avaliação bioquímica e hormonal da glicemia, insulina e IGF1, extração de RNA, PCR em tempo real e análise estatística com SPSS 13.0 (Statistical Package fo Social Sciences). Resultados: A média do Z-altura, Z-IMC (índice de massa corpórea), Z-altura paterno e ZEA (estatura alvo) foram maiores nas crianças PIG que tiveram recuperação estatural, com o Z-PC (perímetro cefálico) maior nas crianças sem recuperação estatural. O Z-IGF1 sérico foi significantemente mais elevado em crianças que apresentaram RE (p<0,05). A distribuição e genotipica das repetições CA do gene IGF1 e do VNTR INS foi semelhante estatisticamente entre os grupos AIG e PIG, e entre os PIG com e sem RE; não foi observada associação entre esse polimorfismo e as variáveis clínicas e laboratoriais do estudo. O estudo da região promotora P4 do gene IGF2 identificou um novo polimorfismo de 9-12 repetições C na posição -1982, antes do sítio de início de transcrição do exon 2, e este apresentou distribuição semelhante entre os grupos PIG e AIG. Foi identificada também uma troca C/T em heterozigose no nono nucleotídeo do alelo 11C em quatro crianças nascidas PIG. Contudo, a quantificação da expressão do gene IGF2 em duas dessas crianças não demonstrou perda da expressão desse gene. Conclusões: Não observamos influência dos polimorfismos acima descritos no crescimento pré e pós-natal, na presença de resistência à insulina, nem em concentrações séricas de IGF1 dos indivíduos nascidos PIG. Identificamos uma nova variante na região promotora P4 do gene IGF2, contudo estudos preliminares não demonstraram influência desse polimorfismo sobre o crescimento intra-uterino. / Introduction: Polymorphisms in the promoter region of insulin (INS), IGF2 and IGF1 genes may decrease their expression during fetal life and afterward could be related to intra-uterine fetal growth retardation and greater risk of hypospadia development. In post-natal life, decreased expression of these genes can result in lack of stature recovery and in lower IGF1 serum levels in children, as well as in higher risk for type 2 diabetes mellitus and metabolic syndrome in adults. Objectives: The aims of the present study were: (1) to analyze the allelic and the genotypic frequency of the insulin (INS) gene variable number of tandem repeats (VNTR) and the IGF1 gene CA repeats; (2) to analyze the P4 promoter region of IGF2 gene (3) to test the contribution of INS VNTR, IGF1 gene CA repeats on insulin sensitivity and IGF1 serum levels in children born SGA with and without catch up, respectively. Patients: We studied 142 individuals born SGA with catch up (n = 66) and without catch up (n = 76) selected from three different centers (HCFMUSP, Santa Casa de Sao Paulo and HC-UFPR). The control group consisted of 297 children born appropriate for gestational age (AGA). Methods: Extraction of genomic DNA, PCR-amplification of the VNTR of insulin gene, CA repeats of IGF1 and IGF2 gene P4 promoter region; restriction analysis; Genescan software; automatic sequencing. Blood measurements of serum level of glucose, insulin and IGF1. Statistical analysis (Statistical Package for Social Sciences software). Results: Regarding birth parameters, the average of Z-height, Z-BMI (body mass index) and Z-height paternal and Z- EA (target height) were higher in children born SGA who had catch up. Interestingly, we observed that the Z-PC was higher in children born SGA without catch up. In addition, the Z-IGF1 serum levels were significantly higher in children who had catch up (p <0.05). The molecular analysis of IGF1 gene CA repeats and of INS gene VNTR locus did not show a statistically significant difference in the allelic and genotypic distribution of these polymorphisms between adequate for gestational age (AGA) and SGA groups nor between SGA with and without catch up. Similarly, we have not found an association of these polymorphisms with clinical or laboratory variables of this study. A novel polymorphism in the P4 promoter region of the IGF2 gene was identified. It was characterized by cytosine repeats (9-12) at position -1982 before transcription initiation site of exon 2 of IGF2 gene. Yet, we have identified a heterozygous substitution of cytosine for thymine at the nucleotide position 9 in the allele 11C in four children born SGA. This change was also absent in the control population. Quantization of IGF2 gene expression in two of these children did show loss of expression of this gene in patients carrying the variant 9C/T. Conclusions: We have not observed an association of the above described polymorphisms with pre and post natal growth, or with the occurrence of insulin resistance in individuals born SGA. IGF-1 levels did not seem to be associated with the polymorphisms either. A new variant in the P4 promoter region of IGF2 gene was identified, however preliminary studies showed no influence on intra-uterine growth.

Introdução: Crianças nascidas pequenas para a idade gestacional (PIG) apresentam maior risco de permanecerem com baixa estatura na vida adulta. Os fatores de crescimento insulino-símile tipo 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) são os principais fatores endócrinos determinantes do crescimento fetal. A maioria das ações conhecidas do IGF-1 e 2 é mediada via um receptor tirosina quinase, conhecido como IGF-1R. Recentemente, a insensibilidade ao IGF-1 foi identificada como uma das causas de retardo de crescimento em crianças nascidas PIG que não apresentaram recuperação espontânea do crescimento na vida pós-natal. Crianças afetadas apresentavam níveis elevados de IGF-1, IGFBP-3 além de microcefalia. O papel de defeitos pósreceptor na sinalização do IGF-1 como causa de retardo de crescimento pré e pós-natal ainda não foi investigado. Objetivo: Analisar in vitro a ação do IGF-1 em fibroblastos de crianças nascidas PIG. Material e métodos: Desenvolvemos cultura de fibroblastos de 2 controles (C1 e C2) e de 4 pacientes nascidos PIG (SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4) com suspeita de insensibilidade ao IGF-1 por ausência de recuperação do crescimento na vida pós natal, resposta insatisfatória ao tratamento com hGH apesar de níveis normais/elevados de IGF-1. Foi confirmado do ponto de vista molecular que um dos pacientes (SGA1) apresenta Síndrome de Sílver- Russell com perda da metilação do alelo paterno da região ICR1 (imprinting center region 1) importante para a expressão do IGF-2. Defeitos no gene do IGF1 e IGF1R foram afastados por sequenciamento direto. As ações do IGF- 1 foram determinadas por ensaios de proliferação, análise da produção de IGFPB-3 em meio de cultura e estudos de fosforilação de proteínas da via de sinalização do IGF-1 em fibroblastos (AKT e ERK). Resultados: As linhagens SGA1, SGA2 e SGA3 proliferaram respectivamente 31%, 60% e 78% a menos sob estímulo de IGF-1 em relação ás linhagens controles. Já a linhagem SGA4 apresentou comportamento semelhante ás linhagens controles. No estudo da expressão do RNAm do IGF1R por PCR em tempo real, não foi observada diferença significativa na expressão do IGF1R nas diversas linhagens PIG em relação aos controles, assim como o conteúdo total da proteína IGF-1R. Em relação á ativação da via MAPK, todas as linhagens dos pacientes PIGs apresentaram menor fosforilação ERK1/2 basal e após estímulo com IGF-1, quando comparadas com as linhagens controles (p < 0.001) apesar do conteúdo total de ERK1/2 ser semelhante. Já em relação a ativação da via PI3K, as linhagens SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4 não diferiram significantemente em relação aos fibroblastos controles quanto à ativação de AKT pelo IGF-1. O conteúdo total de AKT também foi semelhante em todas as linhagens estudadas. O estudo da expressão de IGFBP3 mostrou um aumento da expressão deste peptídeo na linhagem de fibroblastos do paciente SGA1 (14X). O conteúdo de IGFBP-3 intracelular não sofreu alteração, porém comprovamos que a linhagem SGA1 secretava 2x mais IGFBP-3 para o meio de cultura. Apesar de apresentarem estrutura, expressão e conteúdo de IGF1R normais, essas mesmas 3 linhagens celulares que apresentaram menor proliferação também apresentaram diminuição na fosforilação de ERK após tratamento com IGF-1. Mesmo sob o estímulo com desIGF-1 (um análogo do IGF-1 com baixa afinidade por IGFBPs mas que preserva sua capacidade de ativar o receptor IGF-1R) a ativação de ERK e a proliferação celular se manteve abaixo dos das linhagens controles. O estudo do conteúdo total de GRB10 foi semelhante em todas as linhagens celulares. Conclusão: Três dos 4 pacientes PIG estudados apresentaram insensibilidade pós-receptor ao IGF-1. A linhagem celular SGA1, obtida de um paciente com hipometilação do ICR1 11p15 causando SSR, demonstramos um aumento da expressão e secreção de IGFBP-3, o qual não se mostrou responsável por inibir a ação do IGF-1 nestes fibroblastos. Novos estudos devem ser desenvolvidos para identificar o defeito molecular responsável pela insensibilidade ao IGF-1 a nível pósreceptor observada nestes pacientes. / Introduction: Children born small for gestational age (SGA) have a higher risk of staying with short stature in adulthood. The insulin-like growth factors (IGF-1 and IGF-2) are the main endocrine factor determining fetal growth. Most of the known actions of IGFs are mediated by IGF-1R, a tyrosine kinase receptor. Recently, the IGF-1 insensitivity was identified causing growth retardation in children born SGA who who did not present spontaneous catch-up growth in postnatal life. Affected children had elevated IGF-1 and IGFBP-3 levels in addition to microcephaly. The role of post receptor defects in IGF-1 signaling on the deficit of growth is still unclear. Objective: To assess IGF-1 action and signaling in vitro in fibroblasts from SGA children. Methods: Fibroblasts cell cultures were developed from 2 controls (C1 and C2) and 4 patients with pre- and post-natal growth retardation (SGA1, SGA2, SGA3 and SGA4). IGF-1 insensitivity was demonstrated by severe pre and postnatal growth impairment without any evident cause, IGF1 SDS > 0 and poor growth response during high doses of hGH treatment. Three SGA patients presented microcephaly. Defects in the gene of the IGF1 and IGF1R were excluded by direct sequencing. One patient (SGA1) presents the Silver- Russell syndrome (SRS) with loss of methylation of the paternal allele in the ICR1 (imprinting center region 1) chromosome 11p15, important for IGF-2 expression. IGF-1 action was assessed by cell proliferation by colorimetric assay. IGF-1 signaling was assessed by AKT and ERK phosphorylation after IGF-1 stimulation through SDS-PAGE of intracellular extract followed by immunoblotting with specific antibodies. The expression of IGF1R and IGFBP3 gene was determined by Real-time quantitative PCR and the levels of the IGF-1R and IGBP-3 protein by direct immunoblotting. Results: The SGA1, SGA2 and SGA3 cell lines proliferated 31%, 60% and 78% less under IGF-1 stimulation in comparison of controls fibroblasts, respectively. The expression of IGF1R mRNA and the level of total amount of IGF-1R protein were similar in all SGA and control cell lines. Despite normal IGF-1R structure and quantity, the same 3 SGA cell lines that presented low proliferation response also had 50 to 85% lower ERK phosphorylation after IGF-1 treatment (p <0.001), although the similar total content of ERK1/2. In relation to PI3K pathway activation, all SGA cell cultures presented normal AKT phosphorilation. Fibroblasts from the SGA1 patient presented a 14x increase in IGFBP3 mRNA and 2x more IGFBP-3 secretion to culture serum medium. Treatment with desIGF-1, an IGF-1 analogue with low affinity for IGFBPs although retains its ability to activate the IGF-1R, did not recover cell proliferation or ERK phosphorylation. All cell lines presented similar amount of GRB10 protein Conclusion: Three of 4 SGA patients showed evidence of post-receptor IGF-1 insensitivity. The cell line SGA1, obtained from a SRS patient with ICR1 hypomethylation, showed increased expression and secretion of IGFBP-3, which was not directly responsible for inhibition in IGF- 1 action. Further studies should be developed to identify the molecular cause of IGF-1 post-receptor insensitivity observed in our patients.

As doenças que comprometem o crescimento humano apresentam uma forte influência genética. O objetivo geral do projeto atual é desenvolver e aplicar a tecnologia de sequenciamento paralelo em larga escala para compreensão desses distúrbios de crescimento, com foco principal em crianças nascidas pequenas para idade gestacional (PIG), definida como criança com Escore-Z de comprimento e/ou peso ao nascimento menor ou igual a -2. PIG é uma condição heterogênea, que inclui como causa fatores maternos, placentários e fetal, dentre o qual, destacam-se as alterações genéticas. Crianças nascidas PIG e que não recuperaram seu déficit estatural espontaneamente nos primeiros anos de vida apresentam uma alta probabilidade de serem adultos baixos e costumam evoluir com quadros clínicos complexos, envolvendo retardo de crescimento persistente na vida pós-natal, dismorfismos, anomalias congênitas e distúrbios de desenvolvimento neuropsicomotor. Foi utilizada a tecnologia de sequenciamento Sure Select (Agilent Technologies, CA, USA) para estudar aproximadamente 390 genes escolhidos por pertencerem à via IGFs/IGF1R, principal eixo regulador hormonal do crescimento, genes sabidamente envolvidos em doenças associadas com distúrbio de crescimento, além de genes candidatos identificados em estudos prévios do laboratório, associados à regulação do crescimento, em um grande número de pacientes. Foram sequenciados 80 pacientes, obtendo uma cobertura média de 354 vezes e com mais de 99% da região alvo com cobertura > 10 reads. Nestas amostras foram identificadas 58 variantes, 18 consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas em 19 pacientes, 32 de significado incerto, 7 provavelmente benigna e 1 provavelmente patogênica para condição não associada a distúrbio de crescimento (\"achado acidental\"). Dentre as variantes consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas houve uma grande heterogeneidade entre os genes, sendo identificadas variantes nos genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL e deleção 22q11. Podemos concluir que a técnica de sequenciamento paralelo em larga escala de genes alvo é eficiente em estabelecer o diagnóstico molecular de crianças nascidas PIG. Foi possível identificar a etiologia genética em 23,75% da casuística estudada, em sua maior parte, de pacientes com síndromes reconhecidas clinicamente. Contudo, defeitos no sistema IGFs/IGF1R não foram frequentes nesta condição / Diseases affecting human growth are most likely caused by genetic factors. The main goal of this project is to apply the technology of massive parallel sequencing to comprehend growth disturbs in children born small for gestational age (SGA), known as the children with Z-score of height and/or weight at birth less or equal -2. SGA is a heterogeneous condition, and as its causes we can find maternal, placental and fetal factors, of which, the most important are the genetic alterations. Children born SGA that do not have catch-up growth spontaneously up to the second year of life may remain with short stature when adults and they usually present other clinical features, such as dimorphisms, congenital anomalies and neuropsychomotor developmental delay. We used the Sure Select technology (Agilent Technologies, CA, USA) to study approximately 390 genes chosen by participate of the IGFs/IGF1R system, or genes already associated with growth disorders, or candidate genes found in previous studies of aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization) or exome sequencing. We sequenced 80 patients, and had a mean coverage of 354x, with more than 99% of the target region with > 10 reads. We found 58 variants, 18 classified as pathogenic or probably pathogenic in 19 patients, 32 variants of unknown significance and 7 probably benign and 1 probably pathogenic for a condition non associated to short stature (``incidental finding``) Among the probably pathogenic and pathogenic we found a great heterogeneity in genes, with variants identified in 10 different genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL and a 22q11 deletion. In conclusion, the technique of targeted gene panel sequencing is a useful tool to establish the molecular diagnose in children SGA. We could identify the molecular cause in 23.75% of the casuistic, mostly patients with clinically recognized syndromes. However, variants at IGFs/IGF1R system are not frequently associated with the studied condition

Introdução: Polimorfismos na região promotora dos genes da insulina, IGF2 e IGF1 podem estar relacionados a uma diminuição da expressão desses genes na vida fetal que, por sua vez, pode causar restrição do crescimento intra-uterino e maior risco de hipospádia. Na vida pós-natal, perda completa ou parcial da expressão desses genes pode resultar em ausência de recuperação estatural e menores concentrações séricas de IGF1 na criança, além de um maior risco de diabetes melito tipo 2 e síndrome de resistência à insulina no adulto. Objetivos: Analisar em crianças nascidas pequenas para idade gestacional (PIG) com ou sem recuperação estatural (RE): 1) a freqüência alélica e genotípica dos polimorfismos VNTR-INS e das repetições CA do gene IGF1; 2) a região promotora P4 do gene IGF2; 3) a influência do VNTR INS e das repetições CA do gene IGF1 na sensibilidade à insulina e nas concentrações séricas de IGF1, respectivamente. Pacientes: Foram estudados 142 indivíduos nascidos PIG com (n= 66) e sem recuperação (n= 76) estatural selecionados de três diferentes centros (HC-FMUSP, Santa Casa de São Paulo e HC-UFPR) e um grupo controle constituído de 297 indivíduos nascidos adequados para idade gestacional (AIG). Métodos: Extração de DNA genômico; amplificação por PCR das regiões contendo os polimorfismos VNTR INS e repetições CA do IGF1 e da região promotora P4; digestão por enzima de restrição; software Genescan; seqüenciamento automático; avaliação bioquímica e hormonal da glicemia, insulina e IGF1, extração de RNA, PCR em tempo real e análise estatística com SPSS 13.0 (Statistical Package fo Social Sciences). Resultados: A média do Z-altura, Z-IMC (índice de massa corpórea), Z-altura paterno e ZEA (estatura alvo) foram maiores nas crianças PIG que tiveram recuperação estatural, com o Z-PC (perímetro cefálico) maior nas crianças sem recuperação estatural. O Z-IGF1 sérico foi significantemente mais elevado em crianças que apresentaram RE (p<0,05). A distribuição e genotipica das repetições CA do gene IGF1 e do VNTR INS foi semelhante estatisticamente entre os grupos AIG e PIG, e entre os PIG com e sem RE; não foi observada associação entre esse polimorfismo e as variáveis clínicas e laboratoriais do estudo. O estudo da região promotora P4 do gene IGF2 identificou um novo polimorfismo de 9-12 repetições C na posição -1982, antes do sítio de início de transcrição do exon 2, e este apresentou distribuição semelhante entre os grupos PIG e AIG. Foi identificada também uma troca C/T em heterozigose no nono nucleotídeo do alelo 11C em quatro crianças nascidas PIG. Contudo, a quantificação da expressão do gene IGF2 em duas dessas crianças não demonstrou perda da expressão desse gene. Conclusões: Não observamos influência dos polimorfismos acima descritos no crescimento pré e pós-natal, na presença de resistência à insulina, nem em concentrações séricas de IGF1 dos indivíduos nascidos PIG. Identificamos uma nova variante na região promotora P4 do gene IGF2, contudo estudos preliminares não demonstraram influência desse polimorfismo sobre o crescimento intra-uterino. / Introduction: Polymorphisms in the promoter region of insulin (INS), IGF2 and IGF1 genes may decrease their expression during fetal life and afterward could be related to intra-uterine fetal growth retardation and greater risk of hypospadia development. In post-natal life, decreased expression of these genes can result in lack of stature recovery and in lower IGF1 serum levels in children, as well as in higher risk for type 2 diabetes mellitus and metabolic syndrome in adults. Objectives: The aims of the present study were: (1) to analyze the allelic and the genotypic frequency of the insulin (INS) gene variable number of tandem repeats (VNTR) and the IGF1 gene CA repeats; (2) to analyze the P4 promoter region of IGF2 gene (3) to test the contribution of INS VNTR, IGF1 gene CA repeats on insulin sensitivity and IGF1 serum levels in children born SGA with and without catch up, respectively. Patients: We studied 142 individuals born SGA with catch up (n = 66) and without catch up (n = 76) selected from three different centers (HCFMUSP, Santa Casa de Sao Paulo and HC-UFPR). The control group consisted of 297 children born appropriate for gestational age (AGA). Methods: Extraction of genomic DNA, PCR-amplification of the VNTR of insulin gene, CA repeats of IGF1 and IGF2 gene P4 promoter region; restriction analysis; Genescan software; automatic sequencing. Blood measurements of serum level of glucose, insulin and IGF1. Statistical analysis (Statistical Package for Social Sciences software). Results: Regarding birth parameters, the average of Z-height, Z-BMI (body mass index) and Z-height paternal and Z- EA (target height) were higher in children born SGA who had catch up. Interestingly, we observed that the Z-PC was higher in children born SGA without catch up. In addition, the Z-IGF1 serum levels were significantly higher in children who had catch up (p <0.05). The molecular analysis of IGF1 gene CA repeats and of INS gene VNTR locus did not show a statistically significant difference in the allelic and genotypic distribution of these polymorphisms between adequate for gestational age (AGA) and SGA groups nor between SGA with and without catch up. Similarly, we have not found an association of these polymorphisms with clinical or laboratory variables of this study. A novel polymorphism in the P4 promoter region of the IGF2 gene was identified. It was characterized by cytosine repeats (9-12) at position -1982 before transcription initiation site of exon 2 of IGF2 gene. Yet, we have identified a heterozygous substitution of cytosine for thymine at the nucleotide position 9 in the allele 11C in four children born SGA. This change was also absent in the control population. Quantization of IGF2 gene expression in two of these children did show loss of expression of this gene in patients carrying the variant 9C/T. Conclusions: We have not observed an association of the above described polymorphisms with pre and post natal growth, or with the occurrence of insulin resistance in individuals born SGA. IGF-1 levels did not seem to be associated with the polymorphisms either. A new variant in the P4 promoter region of IGF2 gene was identified, however preliminary studies showed no influence on intra-uterine growth.