Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-12-19T13:49:30Z No. of bitstreams: 1 carinadealmeidabastos.pdf: 468720 bytes, checksum: 78859652a23edd11dab2d4bd91534807 (MD5) / Approved for entry into archive by Diamantino Mayra (mayra.diamantino@ufjf.edu.br) on 2016-12-19T14:28:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 carinadealmeidabastos.pdf: 468720 bytes, checksum: 78859652a23edd11dab2d4bd91534807 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-19T14:28:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carinadealmeidabastos.pdf: 468720 bytes, checksum: 78859652a23edd11dab2d4bd91534807 (MD5) Previous issue date: 2008-08-01 / Uma metodologia alternativa por cromatografia líquida em fase reversa por pareamento iônico para a análise simultânea de paracetamol e cloridrato de fenilefrina (associação 1) e paracetamol e maleato de carbinoxamina (associação 2) em comprimidos foi proposta. Fase móvel consistindo de 60% de metanol e 40% de solução aquosa de fosfato de potássio monobásico anidro (62,46 mM) adicionada com 0,5 mL de trietilamina, 0,25 g de lauril sulfato de sódio e 1 mL de ácido fosfórico foi usada, com volume de injeção de 50 µL, fluxo da fase móvel de 1,0 mL/min, coluna cromatográfica C18 de dimensões 300 x 3,9 mm e tamanho das partículas de 5 µm mantida a 27°C, detector UV em 220 e 300 nm, e tempo de análise de 6 min. O método proposto para a análise dos comprimidos foi aplicado na análise de medicamentos na forma farmacêutica de solução oral, que contém os três fármacos em associação. Devido à presença de interferentes nestas formulações, o método foi então reotimizado e nova fase móvel consistindo de 480 mL de acetonitrila, 3520 mL de heptanossulfonato de sódio 0,005 M em água, e 4 mL de ácido fosfórico foi usada, com volume de injeção de 100 µL e fluxo de 2,0 mL/min. Os parâmetros avaliados na validação analítica para as associações 1 e 2 foram: seletividade, linearidade, repetibilidade, precisão intermediária, limite de detecção, limite de quantificação, exatidão e robustez. Devido à simplicidade, seletividade, precisão, exatidão e rapidez, a metodologia é uma alternativa interessante para assegurar a qualidade dessas drogas na indústria farmacêutica. / An alternative methodology by ion-pair reversed phase liquid chromatography for simultaneous analysis of acetaminophen and phenylephrine hydrochloride (association 1) and acetaminophen and carbinoxamine maleate (association 2) in tablets was proposed. Mobile phase consisting of 60% methanol and 40% potassium monobasic phosphate aqueous solution (62.46 mM) added with 0.5 mL trietilamine, 0.25 g sodium lauryl sulfate and 1 mL of phosphoric acid was used, with injection volume of 50 µL, mobile phase flow of 1.0 mL/min, chromatographic column C18 of dimensions 300 x 3.9 mm and particle size of 5 µm maintained at 27°C, UV detection at 220 and 300 nm, within 6 min. The proposed method for the analysis of tablets was applied in the analysis of drugs in the pharmaceutical form of oral solution, which contains the three drugs in combination. Due to the presence of interfering in these formulations, the method was again optimized and new mobile phase consisting of 400 mL of acetonitrile, 3520 mL of sodium heptane sulfonate 0.005 M in water, and 4 mL of phosphoric acid was used, with injection volume of 100 µL and flow of 1.0 mL/min. The analytical validation parameters evaluated for association 1 and 2 were: selectivity, linearity, repeatability, intermediate precision, limit of detection, limit of quantification, accuracy and robustness. Due to its simplicity, selectivity, precision, accuracy and rapidity, the methodology can be an interesting alternative for quality assurance in the pharmaceutical industry of these drugs.

INTRODUÇÃO: Os polimorfismos do gene da proteína priônica (PRNP) podem estar associados a doenças neurológicas não priônicas. Estudos em pacientes com doença de Alzheimer (DA) apontam para possível associação entre os polimorfismos do códon 129 do PRNP e DA. Essa associação não foi estudada na população brasileira. Neste estudo, descrevemos a associação entre os diferentes polimorfismos do PRNP e DA. MÉTODOS: Foi estudada amostra composta por 100 pacientes com DA, acompanhados no Ambulatório de Neurologia Cognitiva e do Comportamento e no Centro de Referência em Distúrbios Cognitivos do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, pareados para grupo controle com 111 indivíduos, em relação à frequência dos diferentes polimorfismos do PRNP e o desempenho cognitivo. Os polimorfismos do PRNP foram estudados pelo método de cromotografia líquida de fase reversa desnaturante (DHPLC). Foi realizada extratificação da amostra pelo genótipo da apolipoproteína E (apoE). RESULTADOS: A frequência dos polimorfismos do códon 129 foi: 45,5% M/M, 42,4% M/V e 12,2% V/V nos pacientes com DA; e 39,6% M/M, 50,5% M/V e 9,9% V/V nos indivíduos controles (p=0,503). O códon 117 apresentou variante alélica silenciosa em 5% dos pacientes com DA e 3% dos controles (p=0,780). A deleção de um ocatapeptídeo repetido ocorreu em 5% dos pacientes com DA e 4% dos controles (p=0,738). Todos os pacientes com DA e os controles eram N171N. Uma paciente do grupo com DA apresentou a mutação V180I. A análise bivariada e regressão logística não mostraram associação entre os diferentes polimorfismos do códon 129 e o desempenho cognitivo nos pacientes com DA, assim como nos indivíduos cognitivamente normais. A extratificação segundo genótipo da apoE não revelou diferença em relação aos polimorfismos do códon 129 do PRNP entre os grupos DA e controles. CONCLUSÕES: Não houve diferença de frequência dos diferentes polimorfismos do códon 129 do PRNP entre os pacientes com DA e idosos cognitivamente normais, bem como em relação aos demais códons polimórficos do gene. Não houve diferença em relação ao desempenho cognitivo nos pacientes com DA e nos controles segundo o polimorfismo do códon 129 do PRNP. Um paciente apresentou mutação do códon 180 (V180I), e recebeu o diagnóstico de doença de Creutzfeldt-Jakob genética / INTRODUCTION: The polymorphism in the prion protein gene (PRNP) may influence non prion neurological diseases. Some reports associate Alzheimers disease (AD) and the polymorphic codon 129 of the PRNP. This association has not been studied in Brazilian population. In this study we aimed to describe the association between the polymorphisms of codon 129 of the PRNP and AD. METHODS: One hundred AD patients were evaluated in the Cognitive and Behavioral Neurology Unit and Cognitive Disorders Reference Center of the Hospital das Clínicas of the University of São Paulo School of Medicine, matched for 111 controls, regarding to the PRNP polymorphism and cognitive measures. The PRNP polymorphisms were analyzed using denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC). Analyzes stratifying by apoE genotype was performed. RESULTS: The distribution of the codon 129 polymorphisms were: 45.5% M/M, 42.4% M/V and 12.2% V/V in AD patients; 39.6% M/M, 50.5% M/V and 9.9% V/V in the control group (p=0.503). The 117 codon analysis revealed silent allelic variant in 5% of AD patients and 3% of controls (p=0.780). The octarepeat deletion occurred in 5% of AD and 4% of controls (p=0.738). All AD patients and controls were N171N. One AD patient had a point mutation at codon 180 (V180I). Logistic regression failed to confirm any association between AD cognitive performance and the codon 129 of PRNP, as well as in the control group. There was no association between the codon 129 genotypes and genotypes and AD according to the apoE stratification. CONCLUSIONS: There were no differences in the frequency of the codon 129 polymorphism between AD. control group, according to the codon 129 polymorphisms. A point mutation at the codon 180 (V180I) was diagnosed in one patient

INTRODUÇÃO: Os polimorfismos do gene da proteína priônica (PRNP) podem estar associados a doenças neurológicas não priônicas. Estudos em pacientes com doença de Alzheimer (DA) apontam para possível associação entre os polimorfismos do códon 129 do PRNP e DA. Essa associação não foi estudada na população brasileira. Neste estudo, descrevemos a associação entre os diferentes polimorfismos do PRNP e DA. MÉTODOS: Foi estudada amostra composta por 100 pacientes com DA, acompanhados no Ambulatório de Neurologia Cognitiva e do Comportamento e no Centro de Referência em Distúrbios Cognitivos do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, pareados para grupo controle com 111 indivíduos, em relação à frequência dos diferentes polimorfismos do PRNP e o desempenho cognitivo. Os polimorfismos do PRNP foram estudados pelo método de cromotografia líquida de fase reversa desnaturante (DHPLC). Foi realizada extratificação da amostra pelo genótipo da apolipoproteína E (apoE). RESULTADOS: A frequência dos polimorfismos do códon 129 foi: 45,5% M/M, 42,4% M/V e 12,2% V/V nos pacientes com DA; e 39,6% M/M, 50,5% M/V e 9,9% V/V nos indivíduos controles (p=0,503). O códon 117 apresentou variante alélica silenciosa em 5% dos pacientes com DA e 3% dos controles (p=0,780). A deleção de um ocatapeptídeo repetido ocorreu em 5% dos pacientes com DA e 4% dos controles (p=0,738). Todos os pacientes com DA e os controles eram N171N. Uma paciente do grupo com DA apresentou a mutação V180I. A análise bivariada e regressão logística não mostraram associação entre os diferentes polimorfismos do códon 129 e o desempenho cognitivo nos pacientes com DA, assim como nos indivíduos cognitivamente normais. A extratificação segundo genótipo da apoE não revelou diferença em relação aos polimorfismos do códon 129 do PRNP entre os grupos DA e controles. CONCLUSÕES: Não houve diferença de frequência dos diferentes polimorfismos do códon 129 do PRNP entre os pacientes com DA e idosos cognitivamente normais, bem como em relação aos demais códons polimórficos do gene. Não houve diferença em relação ao desempenho cognitivo nos pacientes com DA e nos controles segundo o polimorfismo do códon 129 do PRNP. Um paciente apresentou mutação do códon 180 (V180I), e recebeu o diagnóstico de doença de Creutzfeldt-Jakob genética / INTRODUCTION: The polymorphism in the prion protein gene (PRNP) may influence non prion neurological diseases. Some reports associate Alzheimers disease (AD) and the polymorphic codon 129 of the PRNP. This association has not been studied in Brazilian population. In this study we aimed to describe the association between the polymorphisms of codon 129 of the PRNP and AD. METHODS: One hundred AD patients were evaluated in the Cognitive and Behavioral Neurology Unit and Cognitive Disorders Reference Center of the Hospital das Clínicas of the University of São Paulo School of Medicine, matched for 111 controls, regarding to the PRNP polymorphism and cognitive measures. The PRNP polymorphisms were analyzed using denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC). Analyzes stratifying by apoE genotype was performed. RESULTS: The distribution of the codon 129 polymorphisms were: 45.5% M/M, 42.4% M/V and 12.2% V/V in AD patients; 39.6% M/M, 50.5% M/V and 9.9% V/V in the control group (p=0.503). The 117 codon analysis revealed silent allelic variant in 5% of AD patients and 3% of controls (p=0.780). The octarepeat deletion occurred in 5% of AD and 4% of controls (p=0.738). All AD patients and controls were N171N. One AD patient had a point mutation at codon 180 (V180I). Logistic regression failed to confirm any association between AD cognitive performance and the codon 129 of PRNP, as well as in the control group. There was no association between the codon 129 genotypes and genotypes and AD according to the apoE stratification. CONCLUSIONS: There were no differences in the frequency of the codon 129 polymorphism between AD. control group, according to the codon 129 polymorphisms. A point mutation at the codon 180 (V180I) was diagnosed in one patient

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Interleukin 11 (IL-11) is a multifunctional cytokine in the IL-6 type family of long-chain helical cytokines, which modulates the proliferation, differentiation and maturation of various types of hematopoietic cells. Recombinant human interleukin-11 (rhIL-11) produced by DNA technology in Escherichia coli is currently being used worldwide for the prevention of thrombocytopenia and to reduce the need for platelet transfusions after myelosuppressive chemotherapy in patients with nonmyeloid malignancies. A stability-indicating reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) method was validated for the assessment of recombinant human interleukin-11 (rhIL-11) in biopharmaceutical formulations. The RP-LC method was carried out on a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 25ºC. The mobile phase A consisted of 0.1% TFA and the mobile phase B was acetonitrile with 0.1% TFA, run as follows: time 0 to 0.1 min 40% of B; from 0.1 to 30 min linear up to 65% of B; from 30.01 to 31 min linear down to 40% of B, maintained up to 40 min. The flow rate was 1 mL/min, and using photodiode array (PDA) detection at 214 nm. Chromatographic separation was obtained with a retention time of 27.6 min, and was linear over the concentration range of 1 200 μg/mL (r2 = 0.9995). The limits of detection and quantitation were 0.34 and 1.12 μg/mL, respectively. Specificity was established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. The accuracy was 100.22% with bias lower than 1.25%. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of the degraded products showed non-significant differences (p>0.05). The proposed method was applied to the assessment of rhIL-11 and related proteins in biopharmaceutical dosage forms, and the results were correlated to those of a bioassay, showing a higher mean difference of the estimated content/potencies of 2.60% for the RP-LC method, aiming to establish new alternatives to monitor stability, improve quality control and thereby assure therapeutic efficacy of the biological medicine. / A interleucina 11 (IL-11) é uma citocina multifuncional que pertence a família da interleucina- 6 e estimula a proliferação, diferenciação e maturação de células hematopoiéticas. A interleucina-11 humana recombinante (rhIL-11) é produzida pela tecnologia do DNA em Escherichia coli e é usada clinicamente para a prevenção de trombocitopenia grave e redução da necessidade de transfusão de plaquetas após quimioterapia mielossupressiva em pacientes com neoplasias malignas não mielóides. No presente trabalho foi desenvolvido e validado método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) para a avaliação de rhIL-11 em formulações de produtos farmacêuticos. Utilizou-se coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 25ºC. A fase móvel A foi constituída de TFA 0,1% e a fase móvel B de acetonitrila com 0,1% TFA, eluídas no seguinte gradiente: 0 0,1 min, 40% de B; 0,1 30 min, 40 65% de B; 30,01 a 31 min, 65 40% de B, mantendo-se nesta proporção até 40 min. Utilizou-se vazão de 1 mL/min e detector de arranjo de diodos (DAD) a 214 nm. A eluição cromatográfica foi obtida no tempo de 27,6 min, sendo linear na faixa de concentração de 1 200 μg/mL (r2 = 0,9995). Os limites de detecção e quantificação foram 0,34 e 1,12 μg/mL, respectivamente. A especificidade foi avaliada em estudos de degradação, que também demonstraram que não houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,20%, com bias inferior a 1,25%. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, as quais não apresentaram diferença significativa em relação a forma intacta (p>0,05). O método proposto foi aplicado para a avaliação da potência de rhIL-11 e de proteínas relacionadas em formulações farmacêuticas, e os resultados foram comparados com o bioensaio, observando-se diferenças das médias de conteúdo/potência 2,60% superiores para o método por CL-FR. Contribuíu-se assim para estabelecer procedimentos que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biotecnológico.

Febuxostat is a novel non purine drug indicated for the treatment of hyperuricemia in gout. A reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) method was validated for the determination of febuxostat in pharmaceutical dosage forms. The LC method was carried out on a XTerra C18 column (150 mm x 3.9 mm I.D.), maintained at 25 ºC. The mobile phase consisted of water (pH 3.5) acetonitrile (40:60, v/v), run at a flow rate of 0.8 mL/min and using photodiode array (PDA) detection at 316 nm. The chromatographic separation was obtained with retention time of 3.9 min, and was linear over the range of 0.25 - 30 μg/mL (r2=0.9995). The specificity and stability-indicating capability of the method was proven through degradation studies were carried out by LC and MS and showing also, that there was no interference of the excipients and degradation products in the quantification of the drug. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of the degraded products showed significant differences (p<0.05). The accuracy was 100.54% with bias lower than 0.65%. The limits of detection and quantitation were 0.08 and 0.28 μg/mL, respectively. The procedure was validated evaluating parameters such as the specificity, linearity, precision, accuracy, limits of detection and quantitation, robustness, and system suitability test, giving results within the acceptable range. The proposed method was applied for dissolution studies and the analysis of tablet dosage forms, contributing to assure the safety and therapeutic efficacy. / Febuxostate é um novo fármaco, não purínico, indicado para o tratamento da hiperuricemia em pacientes com gota. No presente trabalho foi desenvolvido e validado método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) para determinação de febuxostate em produtos farmacêuticos. No método por CL-FR foi utilizada coluna XTerra C18 (150 mm x 3,9 mm d.i), mantida a 25 oC. A fase móvel foi composta de água ultra-pura (pH 3,5): acetonitrila (40:60, v/v), eluída na vazão de 0,8 mL/ min com detecção no ultravioleta a 316 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 3,9 min, sendo linear na faixa de concentração de 0,25-30 μg/mL (r2=0,9995). A especificidade do método foi comprovada através de estudos de degradação realizados por cromatografia líquida e espectrometria de massas, demonstrando que não houve interferência dos excipientes e dos produtos de degradação na quantificação do fármaco. Além disso, o teste de citotoxicidade in vitro das amostras degradadas, apresentou diferenças significativas (p <0,05) em relação à forma intacta. A precisão foi de 100,54%, com bias menor do que 0,65%. Os limites de detecção e de quantificação foram de 0,08 e 0,28 μg/mL, respectivamente. O procedimento foi validado, avaliando-se os parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, limite de detecção e quantificação, robustez e teste de adequabilidade do sistema, cujos resultados estão de acordo com os requisitos preconizados. O método proposto foi aplicado no estudo de dissolução e análise de formas farmacêuticas de comprimidos, contribuindo, assim, para aprimorar o controle da qualidade de medicamentos, bem como garantir a segurança e eficácia no uso terapêutico.

The adulteration of phytotherapic formulations has been increasing considerably in the recent years in several countries, by the fact that there is not an established efficient monitoring for the control of the manipulation and commercialization of the so called natural medicines . As the possibility of adulteration is relatively wide in terms of compound classes, the need of analytical methods with good sensitivity and selectivity, which are able to identify and quantify simultaneously more than one pharmaceutical in the same phytotherapic formulation, is very important. Considering the well known effects of these adulterants and its use and abuse in the formulations for weigh loss, two separations methods were developed in this study to enable the study of benzodiazepines alprazolam, clonazepam, chlordiazepoxide, diazepam, flurazepam, lorazepam, medazepam and midazolam as possible adulterants in phytotherapic formulations. For the electrophoretic method the optimized conditions were: buffer phosphate 100 mM, 15% acetonitrile (pH 2,0) as an electrolyte; fused silica capillary coated with a 60 cm layer of polymida (9,5 cm to the detector window) with 75 Um of internal diameter, operating at 25 °C; 15 kV of applied voltage, UV detection at 200 nm and anodic hydrodynamic injection for 2 seconds with a pressure of 30 mbar. The chromatographic method was optimized as the following conditions: eluent acetonitrile: water 40:60 (v / v) (pH 4,0) at flow 0,5 mL/min, UV detection at 230 nm and injection of 20 μL. The adulteration in these phytotherapic formulations occurs usually with the use of only one pharmaceutical class: a benzodiazepine, a anorexic and a antidepressant. It is not expected to find in the same sample more than one benzodiazepine. Therefore, the eletroforetic and chromatography proposed methods do not have the objective to detect all of benzodiazepines together in a same sample, but rather to promote the individual identification of all in a sample. The RP-HPLC method was validated for the determination of these benzodiazepines and applied for the determination of the adulterants in phytotherapic formulations used in the treatment of obesity, which have been commercialized as natural medicines by Brazilian pharmacies. The recovery experiments promoted recoveries values higher than 84,25 % for all the analyzed adulterants. The developed methods introduced high sensitivity, analytical precision, low cost and rapid analysis, confirming the applicability of the methods as an alternative for the control and monitoring of abuse use of these pharmaceuticals in phytotherapic formulations passible of adulteration. / A adulteração de formulações fitoterápicas tem aumentado consideravelmente nos últimos anos em alguns países, pelo fato de que ainda não há uma fiscalização eficiente estabelecida para o controle da manipulação e comercialização dos chamados medicamentos naturais . Como a possibilidade de adulteração é relativamente ampla em termos de classes de compostos, surge assim, a necessidade de métodos analíticos de boa seletividade e sensibilidade, capazes de identificar e quantificar simultaneamente mais de um fármaco na mesma formulação fitoterápica. Sabendo-se dos efeitos indesejados que esses adulterantes podem causar, além da necessidade de alertar a sociedade sobre os perigos do uso e abuso desses adulterantes nas formulações para emagrecimento, desenvolveu-se neste trabalho dois métodos de separação, para possibilitar o estudo da presença dos benzodiazepínicos alprazolam, clonazepam, clordiazepóxido, diazepam, flurazepam, lorazepam, medazepam e midazolam como possíveis adulterantes em produtos fitoterápicos: eletroforese capilar de zona (CZE) e cromatografia líquida de alta eficiência por fase reversa (RP-HPLC). Para o método eletroforético as condições otimizadas foram: eletrólito de trabalho tampão fosfato 100 mM, 15% acetonitrila (pH 2,0); capilar de sílica fundida revestido de poliimida de 60 cm de comprimento (com 9,5 cm da janela do detector) com diâmetro interno de 75 Um, operando a 25°C; voltagem aplicada de 15 kV; detecção UV em 200 nm e injeção hidrodinâmica anódica durante 2 segundos com pressão de 30 mBar. O método cromatográfico foi otimizado na seguinte condição: eluente acetonitrila:água 40:60 (v/v) (pH 4,0) em fluxo 0,5 mL/min; detecção UV em 230 nm e injeção de 20 μL. As adulterações nestas formulações fitoterápicas ocorrem, geralmente, com o uso de somente uma classe de fármacos: um benzodiazepínico, um anorexígeno e um antidepressivo. Não se espera encontrar em uma mesma amostra mais de um benzodiazepínico, portanto, os métodos eletroforéticos e cromatográficos propostos não têm como objetivo detectar todos os benzodiazepínicos juntos em uma mesma amostra e sim, promover a identificação individual de todos em uma amostra. O método de RP-HPLC foi validado para a determinação desses benzodiazepínicos e empregado na análise de formulações fitoterápicas utilizadas no tratamento da obesidade, as quais são comercializadas como medicamentos naturais por farmácias de manipulação brasileiras. Os ensaios de recuperação realizados promoveram recuperações acima de 84,25 % para todas as espécies de adulterantes analisadas. Os métodos desenvolvidos apresentaram alta sensibilidade, precisão analítica, baixo custo e análises rápidas, comprovando a aplicabilidade dos mesmos como uma alternativa para o controle e fiscalização do uso abusivo destes fármacos presentes em formulações fitoterápicas passíveis de adulteração.

Botulinum toxin type A (BTTA) is a polypeptide with 1296 amino acids and its used in some pathologies like hyperhidrosis and migraine, but the cosmetic area is the most important application. BTTA is produced from broth-culture synthesized by the Clostridium botulinum as a single peptide with 150 kDa. Reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) method was developed and validated for the assessment of botulinum toxin type A in biopharmaceutical formulations. A RP-LC method was carried out on a Zorbax 300 SB C18 column (150 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 45 ºC. The mobile phase A consisted of 0.05 M sodium sulphate buffer, pH 2.8, and the mobile phase B was acetonitrile, run isocratically at flow rate 0.3 mL/min. Cromatographic separation was obtained with retention time of 11.4 min, and was linear over the concentration range of 0.2-100 IU/mL (r2 = 0.9999) with photodiode array (PDA) detection at 214 nm. The limits of detection and quantitation were 0.04 and 0.16 IU/mL, respectively. Specificity was established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. Equally, the accuracy was 100.31% with bias lower than 0.80%. The method was correlated with in vivo and in vitro bioassays. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of related proteins and higher molecular weight forms showed significant differences (p <0.05) compared to intact molecule. The validated methods were applied for the determination of BTTA in biopharmaceutical-derived products, giving mean values of the estimated content/potencies 1.16% lower compared to the in vivo bioassay. It is concluded that represents a contribution to establish new alternatives to monitor stability, quality control and thereby assure efficacy of the biotechnology-derived product. / A toxina botulínica tipo A (BTTA) é um polipeptídio constituído de 1296 aminoácidos e é recomendada para patologias, como hiperhidrose e enxaqueca, mas é especialmente usada como cosmético. A toxina botulínica é produzida através do processo de fermentação bacteriana e após sucessivas etapas de purificação resulta em uma proteína com 150 kDa responsável pelo seu efeito biológico. No presente trabalho foi desenvolvido e validado método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) para a avaliação de potência de BTTA em formulações de produtos biofarmacêuticos. No método foi utilizada coluna Zorbax 300 SB C18 (150 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 45 ºC. A fase móvel A foi constituída por tampão sulfato de sódio 0,05 M, pH 2,8, e a fase móvel B por acetonitrila, eluídas em vazão isocrática de 0,3 mL/min. O método utilizou detector de arranjo de diodos (DAD) a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida em 11,4 min, sendo linear na faixa de concentração de 0,2-100 UI/mL (r2 = 0,9999). Os limites de detecção e quantificação foram 0,04 e 0,16 UI/mL, respectivamente. A especificidade foi avaliada em estudos de degradação, que também demonstraram que não houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,31 com bias inferior a 0,80. O método validado foi correlacionado com bioensaios in vivo e in vitro. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, as quais apresentaram diferença significativa em relação a forma intacta (p <0,05). O método proposto foi aplicado para avaliação da potência de BTTA em formulações biofarmacêuticas, e os resultados foram comparados com o bioensaio in vivo, observando-se diferença das médias de teor/potência de 1,16% inferior para o método cromatográfico. Contribuíu-se assim para estabelecer procedimentos que aprimoram a caracterização ou o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia do produto biotecnológico.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul - FAPERGS / The human parathyroid hormone (hPTH) is a polypeptide secreted by the parathyroid glands that is essential for the maintenance of the calcium ion homeostasis in the blood. The recombinant DNA technology has enabled the expression of hPTH gene in Escherichia coli, and thus the large-scale production of recombinant human parathyroid hormone (rhPTH 1-34), teriparatide, which contain the active amino-terminal fragment of the full length hPTH. The rhPTH is clinically used to treat osteoporosis at high risk of fractures in postmenopausal women, men with osteoporosis primary or hypogonadal and adults with glucocorticoid-induced osteoporosis (GIO). Cappilary zone electrophoresis (CZE) method was developed and validated for the assessment of rhPTH in biopharmaceutical formulations. The analysis for CZE method was performed on a fused-silica capillary (effective length, 40 cm; 50 μm i.d.), using electrolyte solution consisted of 50 mM dihydrogen phosphate solution at pH 3.0. The capillary was maintained at 25º C, the applied voltage was 20 kV. Injections were performed using a pressure mode at 50 mbar for 45 s, with detection by photodiode array detector set at 200 nm. Separation was obtained with a migration time of 5.3 min, and was linear over the concentration range of 0.25-250 μg mL-1 (r2 = 0.9992). The limits of detection and quantitation were 0.12 and 0.40 μg/mL, respectively. Specificity and stability-indicating capability were established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. The accuracy was 100.28% with bias lower than 0.85%. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of acidic, photolytic and thermal degradated forms showed significant differences (p<0.05) compared to intact molecule. The cell proliferation and alkaline phosphatase activity bioassays in UMR-106 cells were developed and applied to assess the biological activity of rhPTH in biopharmaceutical formulations The results of content/potency were correlated to those of the validated reversed-phase liquid chromatography (RP-LC), size-exclusion liquid chromatography (SE-LC) and CZE methods, showing significant correlation (p> 0.05) Thus, the application of the validated physico-chemical methods together with in vitro bioassays, was suggested to improve quality control of rhPTH biotechnology-derived product and to support studies of biosimilars. / O hormônio da paratireóide humano (hPTH) é um polipeptídeo produzido e secretado pelas glândulas paratireóides, e é fundamental para a manutenção da homeostase dos íons cálcio no sangue. A tecnologia do DNA recombinante possibilitou a expressão do gene do hPTH em Escherichia coli, e a produção em grande escala do hormônio da paratireóide humano recombinante (rhPTH 1-34), também denominado Teriparatida, o qual apresenta a sequência de aminoácidos responsável pela porção biologicamente ativa do paratôrmonio natural. O rhPTH é clinicamente indicado para o tratamento da osteoporose de alto risco de fraturas em mulheres pós-menopausa, de homens com osteoporose primária ou hipogonadal, e da osteoporose associada à terapia sistêmica com glicocorticóides. Neste trabalho foi desenvolvido e validado método por eletroforese capilar de zona (ECZ) para a avaliação de rhPTH em produtos biofarmacêuticos. No método por ECZ, utilizou-se capilar de sílica fundida (40 cm de comprimento efetivo x 50 μm d.i.) e solução eletrolítica composta de fosfato de sódio dihidrogenado 50 mM, pH 3,0. O capilar foi mantido a temperatura de 25ºC, e a tensão aplicada foi de 20 kV. O tempo de injeção foi de 45 s, com pressão de 50 mBar, e detecção por arranjo de diodos (DAD), em 200 nm. A separação eletroforética foi obtida com tempo de migração de 5,3 min, sendo linear na faixa de concentração de 0,25-250 μg/mL (r2 = 0,9992). Os limites de detecção e quantificação foram de 0,12 e 0,40 μg/mL, respectivamente. A especificidade foi avaliada através de análises com os excipientes da formulação biofarmacêutica e estudos de degradação, demonstrando a seletividade do método. A exatidão foi 100,28% com bias inferior a 0,85%. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, apresentando, para as amostras submetidas às condições ácida, fotolítica e térmica, diferença significativa (p< 0,05) em relação à molécula íntegra. Os bioensaios de proliferação celular e da atividade da fosfatase alcalina em células UMR-106 foram desenvolvidos e aplicados para avaliação da atividade biológica de rhPTH em formulações biofarmacêuticas. Os resultados de teor/potência foram correlacionados com os métodos já validados por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR), cromatografia líquida por exclusão molecular (CL-EM) e ECZ, apresentando correlação significativa (p> 0,05). Assim, sugere-se que o métodos físico-químicos validados sejam aplicados paralelamente aos bioensaios in vitro para aprimorar o controle da qualidade do produto biotecnológico de rhPTH, e para avaliação da biossimilaridade de rhPTH.