La criptosporidiosis es una enfermedad ocasionada por varias especies del género Cryptosporidium, se caracteriza por producir diarrea, sobre todo en neonatos y, dependiendo de la especie involucrada, puede ser zoonótica, llegándose a considerar un problema de salud pública. Diversos estudios fueron realizados en el Perú para poder determinar la prevalencia del Criptosporidium sp. encontrándose los mayores casos en los lugares que contaban con la mayor cantidad de animales. / Cryptosporidiosis is a disease caused by different species of the Cryptosporidium genus it overall produces diarrhea in newborns and depending on the specie involved, these can be involved in a problem of public health. Many studies were performed in Peru to determine the prevalence of Cryptosporidium and they showed that a major number of cases were in an area with a higher number of animals. The aim of this study was to establish if presence of Cryptosporidium parvum in mothers is a risk factor for presentation of Cryptosporidium parvum in offsprings.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La criptosporidiosis es una enfermedad parasitaria del tracto digestivo producida por protozoos del género Cryptosporidium. Aunque las especies de este agente se describieron desde comienzos del siglo veinte, solo a fines de éste, se ha reconocido como un patógeno ampliamente distribuido en diferentes animales y como una amenaza para la salud pública. Infecciones por este protozoario se encuentran descritas en todos los continentes, incluida la Antártica. En los humanos y otras especies, es considerada una zoonosis re-emergente. El primer brote de criptosporidiosis transmitido a través del agua, fue descrito en 1984, desde ese año numerosos autores han evidenciado la presencia de este endoparásito en aguas de superficie y residuales no tratadas, sugiriendo su rol como agente etiológico de diarrea. La persistencia y diseminación de éste protozoo en el ambiente, se sustenta en tres hechos biológicos: (1) Sus ooquistes son inmediatamente infectantes; (2) resiste condiciones medio ambientales y (3) al medir 4,5-5,4 μm, resistir a la acción de desinfectantes convencionales y al no ser es afectado por los procesos físicos de tratamientos de aguas, puede sobrevivir en ella por varios meses. A pesar de que existen diversas metodologías descritas en el mundo, para detectar este parásito en muestras de este tipo, el presente estudio sería el primer intento de desarrollar un protocolo estandarizado, hasta la fecha en Chile. Por lo anterior, el principal objetivo de este estudio estuvo dirigido a estandarizar en Chile un protocolo que permita la recuperación, concentración y detección de ooquistes de Cryptosporidium de origen animal y humano en muestras de aguas, usando las tinciones de Ziehl-Neelsen y Aureamina. Para esto, ooquistes de C. parvum aislados de heces de terneros y humanos diarreicos, previamente estudiados mediante Crypto-Strip® (inmunocromatografia) y PCR especie-específica, fueron artificialmente inoculados en muestras de aguas en concentraciones decrecientes. Se comparó la sensibilidad analítica de ambas tinciones, obteniéndose la mínima concentración de ooquistes de Cryptosporidium que son requeridos para dar una muestra como positiva. Los resultados, expresados en ooquistes/mL, muestran que ambas tinciones tienen una sensibilidad analítica similar, ya que son capaces de detectar hasta la concentración de 1.953 ooquistes en 250 mL, es decir, 7,8 ooquistes /mL. A partir de esto, se puede concluir que el uso de una u otra tinción en la pesquisa de este parásito en muestras de aguas, no se debe basar en la sensibilidad de las mismas, sino en ventajas y desventajas metodológicas para su implementación / Finaciamiento: Proyecto FIV 12101401.9102.006

Orientador: Marcelo Vasconcelos Meireles / Banca: Fernando de Almeida Borges / Banca: Caris Maroni Nunes / Resumo: A infecção por Cryptosporidium parvum em bovinos se manifesta como enfermidade subclínica ou com presença de morbidade e mortalidade, particularmente quando há associação com outros agentes infecciosos. Cryptosporidium parvum apresenta ainda grande importância em saúde pública. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) para detecção de C. parvum em amostras fecais de bezerros e sua comparação com a reação em cadeia da polimerase (nested PCR), rotineiramente utilizada para diagnóstico de Cryptosporidium spp.. Duzentas e nove amostras fecais de bezerros entre um dia e seis meses de idade foram examinadas pela qPCR para amplificação de fragmentos do gene da actina e pela nested PCR para o gene da subunidade 18S do rRNA. A qPCR apresentou positividade para C. parvum em 73,21% (153/209) das amostras, enquanto a nested PCR apresentou amplificação positiva para Cryptosporidium spp. em 56,5% (118/209) das amostras. A sensibilidade analítica da qPCR foi de aproximadamente um oocisto de C. parvum. Não se observou amplificação inespecífica de DNA Cryptosporidium bovis, Cryptosporidium andersoni, Cryptosporidium ryanae, Cryptosporidium canis, Cryptosporidium serpentis, Cryptosporidium galli, Cryptosporidium baileyi e Cryptosporidium genótipo II de aves. Desta forma, conclui-se que a qPCR para o gene da actina é uma técnica sensível e específica para detecção de C. parvum em amostras fecais de bezerros / Abstract: The infection with Cryptosporidium parvum in cattle results in subclinical disease or in the presence of morbidity and mortality, particularly when associated with other infectious agents. This species is also an important public health problem. The aim of this research was to develop a real time polymerase chain reaction (qPCR) for detection of C. parvum DNA in fecal samples of calves, in comparison to a nested PCR routinely used for Cryptosporidium spp. diagnosis. Two hundred and nine fecal samples from calves aged between one day and six weeks were screened by qPCR specific for the actin gene of C. parvum and using nested PCR targeting the 18S rRNA gene of Cryptosporidium spp.. The qPCR showed positivity for C. parvum in 73,21% (153/209) of the samples, and nested PCR was positive for Cryptosporidium spp. in 56.5% (118/209) of the samples. The analytical sensitivity of qPCR foi de aproximadamente one oocyst C. parvum per reaction tube. Evaluation of analytical specificity did not reveal inespecific amplification for DNA of the following Cryptosporidium species and genotypes: C. bovis, C. andersoni, C. ryanae, C. canis, C. serpentis, C. galli, C. baileyi and avian genotype II. These results allowed the conclusion that qPCR for actin gene is a sensitive and specific technique for detection of C. parvum in fecal samples from calves / Mestre

El documento digital no refiere asesor / Manifiesta que la criptosporidiosis es una enfermedad parasitaria de distribución cosmopolita que es causante de severos brotes de diarrea en los rumiantes domésticos neonatales. El presente estudio evaluó por primera vez en campo el papel del Cryptosporidium parvum como factor de riesgo en la presentación de diarrea neonatal empleando el diseño epidemiológico de Caso-Control en alpacas del departamento de Puno. El muestreo se realizó entre los meses de Febrero y Marzo del 2006. Se recolectaron muestras fecales (n=487) directamente del recto de crías de alpacas entre 1 a 15 días de edad procedentes de las localidades de Antacalla, La Raya, Quimsachata y Macusani. Los frotis fecales fijados previamente en metanol, fueron procesados según la técnica de tinción de Ziehl-Neelsen Modificado. Se encontró que de los animales diarreicos, el 39 % (130/336) resultaron positivos a la infección por C. parvum. Por otro lado, el 23 % (35/151) de las alpacas sin diarrea estaban infectadas. El análisis de regresión logística demostró que el parásito no representó un factor de riesgo para diarrea neonatal en los animales estudiados (OR: 1.5, IC 95%: 0.9-2.4). Otras variables fueron también evaluadas junto a C. parvum, determinándose que la localidad de La Raya fue estadísticamente significativa (P < 0.05), representando un factor de riesgo para la presentación de diarrea neonatal (OR: 2.5, IC 95%: 1.1-6.1). / Tesis

Manifiesta que la criptosporidiosis es una enfermedad producida por el protozoo Cryptosporidium parvum, que se caracteriza por producir diarrea en los animales neonatos y ocasionar pérdidas económicas en la industria pecuaria. Afecta a un gran número de animales domésticos y silvestres e inclusive al hombre. El presente estudio tuvo como objetivo evaluar si la presencia de Cryptosporidium parvum es un factor de riesgo de diarrea en alpacas neonatas menores de 15 días de edad provenientes de diversas unidades alpaqueras del Departamento de Cuzco. Esta tesis empleó el diseño epidemiológico de Caso-control para establecer si existe una relación causal. Se tomaron 248 y 231 muestras fecales de animales con diarrea y de animales aparentemente sanos (n=497) durante la temporada de parición de alpacas del 2006. Las muestras fueron preservadas en una solución de Bicromato de Potasio al 2%. Para detectar la presencia de C. parvum se utilizó la Técnica de Tinción de Ziehl Neelsen Modificado (ZNM). Los datos se analizaron empleando una regresión logística con el paquete estadístico STATA 8.0. La regresión logística ajustó variables potencialmente confundentes como edad, sexo, raza y lugar de origen de las alpacas neonatas muestreadas. Se encontró un Odds Ratio de 4.3; I.C.= 2.3 – 7.9. Este estudio demuestra que las alpacas en las que se detectó la presencia de C. parvum, tienen 4.2 veces mayor predisposición a sufrir diarreas en relación a las alpacas con diagnostico ZNM negativo. Así mismo, se determinó asociación estadística significativa entre los animales que presentan infección por el parásito y los que manifiestan cuadros de diarrea (23.4%; n=58), en comparación con el grupo aparentemente sanos (8.6%; n=20). / Tesis

La criptosporidiosis es una enfermedad ocasionada por varias especies del género Cryptosporidium, se caracteriza por producir diarrea, sobre todo en neonatos y, dependiendo de la especie involucrada, puede ser zoonótica, llegándose a considerar un problema de salud pública. Diversos estudios fueron realizados en el Perú para poder determinar la prevalencia del Criptosporidium sp. encontrándose los mayores casos en los lugares que contaban con la mayor cantidad de animales. / Cryptosporidiosis is a disease caused by different species of the Cryptosporidium genus it overall produces diarrhea in newborns and depending on the specie involved, these can be involved in a problem of public health. Many studies were performed in Peru to determine the prevalence of Cryptosporidium and they showed that a major number of cases were in an area with a higher number of animals. The aim of this study was to establish if presence of Cryptosporidium parvum in mothers is a risk factor for presentation of Cryptosporidium parvum in offsprings.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-06-08Bitstream added on 2014-06-13T20:55:59Z : No. of bitstreams: 1 homem_cg_me_araca.pdf: 468363 bytes, checksum: b293bfbeab84c1a641ead5f90bd65ab2 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A infecção por Cryptosporidium parvum em bovinos se manifesta como enfermidade subclínica ou com presença de morbidade e mortalidade, particularmente quando há associação com outros agentes infecciosos. Cryptosporidium parvum apresenta ainda grande importância em saúde pública. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) para detecção de C. parvum em amostras fecais de bezerros e sua comparação com a reação em cadeia da polimerase (nested PCR), rotineiramente utilizada para diagnóstico de Cryptosporidium spp.. Duzentas e nove amostras fecais de bezerros entre um dia e seis meses de idade foram examinadas pela qPCR para amplificação de fragmentos do gene da actina e pela nested PCR para o gene da subunidade 18S do rRNA. A qPCR apresentou positividade para C. parvum em 73,21% (153/209) das amostras, enquanto a nested PCR apresentou amplificação positiva para Cryptosporidium spp. em 56,5% (118/209) das amostras. A sensibilidade analítica da qPCR foi de aproximadamente um oocisto de C. parvum. Não se observou amplificação inespecífica de DNA Cryptosporidium bovis, Cryptosporidium andersoni, Cryptosporidium ryanae, Cryptosporidium canis, Cryptosporidium serpentis, Cryptosporidium galli, Cryptosporidium baileyi e Cryptosporidium genótipo II de aves. Desta forma, conclui-se que a qPCR para o gene da actina é uma técnica sensível e específica para detecção de C. parvum em amostras fecais de bezerros / The infection with Cryptosporidium parvum in cattle results in subclinical disease or in the presence of morbidity and mortality, particularly when associated with other infectious agents. This species is also an important public health problem. The aim of this research was to develop a real time polymerase chain reaction (qPCR) for detection of C. parvum DNA in fecal samples of calves, in comparison to a nested PCR routinely used for Cryptosporidium spp. diagnosis. Two hundred and nine fecal samples from calves aged between one day and six weeks were screened by qPCR specific for the actin gene of C. parvum and using nested PCR targeting the 18S rRNA gene of Cryptosporidium spp.. The qPCR showed positivity for C. parvum in 73,21% (153/209) of the samples, and nested PCR was positive for Cryptosporidium spp. in 56.5% (118/209) of the samples. The analytical sensitivity of qPCR foi de aproximadamente one oocyst C. parvum per reaction tube. Evaluation of analytical specificity did not reveal inespecific amplification for DNA of the following Cryptosporidium species and genotypes: C. bovis, C. andersoni, C. ryanae, C. canis, C. serpentis, C. galli, C. baileyi and avian genotype II. These results allowed the conclusion that qPCR for actin gene is a sensitive and specific technique for detection of C. parvum in fecal samples from calves

Orientador: Nelson da S. Cordeiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T23:16:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franco_ReginaMauraBueno_D.pdf: 4951890 bytes, checksum: c694867410e7efcdfef4c8baefeb75f1 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Protozoários intestinais têm distribuição cosmopolita. São importantes agentes patogênicos principalmente entre crianças que fteqientam creches. No caso das crianças brasileiras, os fatores de risco relacionados com a ocorrência das infecções por protozoários intestinais no âmbito das creches, não foram ainda estudados. Para tanto, realizou-se um levantamento parasito lógico e epidemiológico em 13 creches urbanas no município de Campinas, SP, Brasil, com o objetivo de determinar a prevalência de protozooses intestinais entre as crianças e os funcionários. Fatores de risco que possibilitam a aquisição de Giardia duodena/is e Cryptosporidium parvum foram estudados. Os fatores de risco investigados foram as variáveis relacionadas às características das creches, ao histórico familiar e condições sócio-econômicas das crianças. Numa análise inicial, o Risco Relativo (=Razão de Prevalência) e os limites de confiança de cada variável foram primeiramente estimados. Ajustamento por meio de Análise de Regressão Logística foi utilizado para detectar quais variáveis permaneceram estatísticamente associadas com protozoários entéricos. Foram realizados exames de fezes (colhidas 3 amostras fecais por indivíduo) em 307 crianças (com idade entre 2-42 meses) que fteqiientaram creches e em 134 funcionários. Os exames fecais revelaram 55 crianças (17,91%) com os seguintes protozoários: 31 (10,09%) com G. duodena/is; 17 (5,53%) com C. parvum e 5 (1,62%) com outros protozoários intestinais, comensais ou patogênicos. Infecção concomitante envolvendo G. duodena/is e C. parvum foi observada em 2 crianças (0,65%). Teste estatístico não revelou significância estatística entre infecção por G. duodena/is e sexo da criança (z= -0,573) ou ocorrência de diarréia (z= 1,47). Casos de giardiose foram mais fteqientes após 24 meses de vida (z= -2,703; p=O,0032). Não houve significância estatística entre criptosporidiose e sexo (z= - 0,078) ou idade das crianças (z= 1,21). Entretanto, diarréia foi indicativa de parasitismo por C. parvum (z= 5,919). A proporção de creches com uma ou mais crianças infectadas foi de 46,15% (n=6) para C. parvum e 69,23% (n=9) para G. duodena/is. Entre os funcionários, 22 (16,41 %) mostraram positividade para protozoários parasitos e comensais. Somente 8 variáveis permaneceram estatísticamente associadas com parasitos entéricos, após a aplicação do modelo de Regressão Logística. Tempo de freqüência à creche há mais de 6 meses, histórico de giardiose familiar, contato com animais de fazenda, foram as variáveis significativamente associadas à infecção por G. duodena/is. Para C. parvum, os seguintes fatores de risco foram identificados: tipo da creche, proftssão dos pais ligada à área de saúde, doença concomitante excetuando-se diarréia, ingestão de leite não pasteurizado e número de movimentos intestinais por dia durante episódio de diarréia / Abstract: Enteric protozoa have a worldwide distn1mtion. These organisrns are important pathogens in child day-care centres. For brazilian children, risk factors for the occurrence of protozoa infections in day-care settings were not yet studied. A parasitological and epidemiological survey was realized in 13 day-care centres (=DCCs) in a urban area at the municipality of Campinas, São Paulo State, Southeast Brazil to determine the prevalence of enteric protozoa in the children and staff members. Risk factors for G. duodenalis and C. parvum infections among these children were studied. These investigated risk factors wer_ some variables related to the DCCs characteristic and to the child 's history. By initial analysis the relative risk (= ratio of prevalence) and its confidence limits of each variable were first estimated. Adjustment by means of logistic regression analysis was utilized for detect which variables were associated with these protozooses. Stool examinations (3 faecal samples) of 307 children (2-42 months aged) enrolled in DCCs and 134 staff members were carried out. Faecal analysis showed 55 children (17,91 %) with the following parasites: 31 (10,09%) with G. duodenalis, 17 (5,53%) with C. parvum and 5 (1,62%) with other intestinal protozoal parasites. Mixed infection with 2 parasites (G. duodena/is and C. parvum) was observed in 0,65% of the children. There was no significative difference on sex of the child (z= -0,573) or diarrhoea and G. duodena/is infection (z= 1,47). Giardiosis were more frequently in children older than 24 months (z= -2,703; p=0,0032). Also there was no difference between rates of infections by C. parvum and sex (z= -0,078) or age of the children (z=1,21), although diarrhoea showed significance (z=5,919). The proportion of DCC facilities with one or more infected children was 46,15% (n=6) for C. parvum and 69,23% (n=9) for G. duodenalis. Among day-care staff, 22 (16,41%) showed positivity for parasites and commensal protozoa. After aplication of the 10gistic regression mode}, only 8 variables remained statistically associated with enteric parasites. Familiar history of G. duodenalis infections, attendance of DCC for more than 6 months, contact with farm animals were significantly related to G. duodena/is infections. For C. parvum, the following risk factors were identified: type of DCC, profissional status of parents, concomitant disease exceptually diarrhoea, ingestion of unpasteurized cow milk and number of intestinal movements per day during the diarrhoeal disease / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

The human serine protease inhibitor (serpin) alpha-1-antitrypsin (AAT) was studied for potential interaction with components of the protozoan parasite Cryptosporidium parvum. A homogenate prepared from C. parvum oocysts was incubated with purified human AAT, and complexes formed between the serpin and components of the homogenate were detected using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Serpin:parasite infections were effectively blocked by preincubating AAT with a cognate target enzyme, porcine pancreatic elastase, prior to performing the ELISA on the homogenate. Incubation of a mixture of C. parvum oocysts and sporozoites with AAT demonstrated preferential fluorescence labeling of the sporozoite surface membrane by indirect immunofluorescence assay. Localization of serpin complexes on sporozoites was confirmed by immunogold electron microscopy. AAT was evaluated for in vitro anticryptosporidial activity in a bovine fallopian tube epithelial (BFTE) cell culture system using both oocysts and filter purified sporozoites as inocula. Serial dilutions of AAT were mixed with oocysts (or sporozites) and used to inoculate BFTE cell monolayers. Inoculted cells were maintained at 37ºC/5% CO2 and collected at 24-,48-,72-, and 96-hr post-inoculation intervals. The addition of AAT and other select protease inhibitors (i.e.,antipain, aprotinin, leupeptin, soybean trypsin inhibitor, and phenylmethylsulfonyl floride) significantly inhibited parasite infection (P<0.01) in a concentration- and time-dependent manner when bleach-decontaminated oocysts were used in the inoculum. The anticryptosporidial activity of AAT is postulated to be linked to an antagonistic effect on oocyst excystation and, putatively, the forced expenditure of bioenergetic reserves prior to host cell invasion. This postulate was supported by the observations that serpin activity had no statistically significant effect on reducing established in vitro infections (i.e., 24 hr post-inoculation prior to addition of AAT) and did not inhibit infection of BFTE cells when inoculted with sporozoite preparations. The combined application of AAT and the aminoglycoside paromomycin demonstrated a synergistic anticryptosporidial effect on in vitro infection and suggested the basis for a multi-agent therapeutic protocol in preventing cryptosporidosis. These studies collectively demonstrated an inticryptosporidial potential for serine protease inhibitors, in particular for AAT, and suggest an alternative approach to conventional therapeutic strategies.

The purpose of this study was to quan ti tate the populations o f lymphocytes in the s pleens and intestines of normal and immunosuppressed adult C57BL/6N mice that were noninfected or infected with Cryptosporidi um parvum. This was accomplished by using the following methodologies: immunohistochemistry, ELISA-spot assay, and flow cytometry. Mice in groups 1 and 2 were immunosuppressed, but only group 2 was in fected. Mice in group 3 were only infected, whereas group 4 served as the normal control . Mice were immunosuppressed with dexamethasone (DEXI at a dosage of 125~g / mouse/day. Infected mice received 106 oocysts per os . The numbers o f lymphocytes were monitored from day 0 to day 18 postinfect i on. Flow cytometry using antibodies directed against CD4+ and CDS+ T cells (helper and cytotoxic, respectively) and B cells (expressing IgG, IgM, and IgA receptors) revealed that c. parvum did not evoke an alteration in the phenotypic profile of lymphocytes within spleens or Peyer's patches (PP) of mice in groups 2 and 3 that was statist i cally different from groups 1 and 4. Immunosuppressed mice (groups 1 and 2) had significantly fewer lymphocytes (bearing CD4+, IgG, IgM, and IgA receptors) within the spleen when compared with mice in groups 3 and 4 (P