Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-01T22:07:36Z No. of bitstreams: 1 Andressa Moraes Guimarães da Silva.pdf: 6335373 bytes, checksum: a2c35eb3696b4a81ce4e63f9767befbf (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-01T22:07:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andressa Moraes Guimarães da Silva.pdf: 6335373 bytes, checksum: a2c35eb3696b4a81ce4e63f9767befbf (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A silicose é uma doença pulmonar, de caráter restritivo, causada pela inalação de partículas de sílica cristalina. Se caracteriza pela indução de uma inflamação crônica associada à intensa proliferação de fibroblastos e acúmulo exacerbado de componentes de matriz extracelular, e para a qual não há um tratamento eficaz. Os fibroblastos são considerados alvos cruciais em doenças de natureza fibrótica e o desenvolvimento de sistemas que permitam avaliar a reatividade destas células é de fundamental importância na busca por terapias anti-fibróticas. No presente estudo foi desenvolvido um sistema de cultura primária em 3D (esferóides), utilizando fibroblastos provenientes do pulmão de camundongos normais e silicóticos objetivando analisar comparativamente os aspectos morfológicos/funcionais de ambas as populações celulares. Os fibroblastos foram obtidos a partir da dissociação mecânica/enzimática dos pulmões de camundongos Swiss-Webster 7 dias após a instilação intranasal de salina (controle) ou sílica (10 mg/animal). Após a terceira passagem, as células foram cultivadas em placas de 96 poços, revestidas com agarose, na ausência ou presença de IL-13 (40 ng/mL), sendo os esferóides avaliados quanto a aspectos morfológicos (tamanho/diâmetro médio/constituição), e funcionais tais como: proliferação, produção de citocinas (TGF-b e quimiocinas (MCP-1)) e de colágeno. Através da análise por microscopia de luz invertida, verificamos que os esferóides contendo fibroblastos de animais normais e silicóticos mostraram progressiva diminuição do tamanho/diâmetro, e maior densidade, ao longo do tempo analisado (1 – 4 dias), com os silicóticos apresentando valores sempre superiores aos dos controles. A estimulação com IL-13 induziu claro aumento de tamanho/diâmetro em ambas as populações de esferóides. A análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV) revelou haver diferenças morfológicas importantes entre os grupos normal e silicótico, no que tange ao formato e à constituição celular, com expressivo aumento no conteúdo de matriz extracelular detectado na condição de estimulação com IL-13. De forma interessante, foi observado que os esferóides silicóticos apresentaram níveis basais aumentados de proliferação celular e secreção de TGF-b, assim como de colágeno, em comparação aos dos controles. Tanto esferóides normais quanto silicóticos foram sensíveis à estimulação com IL-13, sendo verificado aumento equivalente na taxa de proliferação e nos níveis de TGF-b e MCP-1 em ambos os grupos. No que tange a produção de colágeno, os esferóides normais mostraram-se responsivos à IL-13 enquanto os silicóticos não. Em conjunto, nossos achados mostraram que os fibroblastos pulmonares de camundongos adultos são: (i) passíveis de serem cultivados em sistema de cultura 3D; (ii) responsivos à estimulação com IL-13 e que; (iii) os esferóides silicóticos apresentam características de ativação em comparação aos normais. Além disso, este modelo mostrou-se reprodutível e promissor quanto a possibilidade de utilização futura na busca por compostos com atividade antifibrótica. / Silicosis is a restrictive pulmonary disease caused by inhalation of crystalline silica particles, which is characterized by chronic inflammation associated with intense fibroblast proliferation and exacerbated accumulation of extracellular matrix components. There is no effective treatment for this disease. Fibroblasts are considered crucial cells in fibrosis, and the development of systems which lead to evaluate their reactivity is important in the search for anti-fibrotic therapy. In this study we aimed to establish a system of primary cell culture in 3D (spheroids) using lung fibroblasts from normal and silicosis mice, in order to perform a comparative analysis of morphological/functional aspects of both cell populations. Fibroblasts were obtained after mechanical/enzymatic dissociation of the lung tissue from Swiss- Webster mice, 7 days after intranasal instillation of saline (control) or silica (10 mg / animal). After the third passage, the cells were cultured in 96-well plates coated with agarose, in the absence or presence of IL-13 (40 ng/ml) and the spheroids were evaluated regarding the morphological (size/diameter/constitution) and functional parameters (proliferation and generation of cytokine (TGF-b), chemokine (MCP-1) and collagen. By means of inverted light microscopy, we noted that spheroids containing fibroblasts from normal and silicotic animals showed a progressive reduction in size/ diameter and increase in density when analyzed for 1 - 4 days of culture. Those from silicotic mice showed themselves bigger as compared to controls. Stimulation with IL-13 induced an increase in size/diameter of both cell populations. The analysis by scanning electron microscopy (SEM) revealed significant morphological differences between normal and silicotic groups, with a significant increase in the content of extracellular matrix being detected under condition of stimulation with IL-13. Interestingly, we observed that spheroids with cells from silicotic mice showed increased basal levels of cell proliferation and secretion of TGF-b and collagen as compared to the controls. Both spheroid populations were sensitive to IL-13 stimulation as attested by increased cell proliferation as well as TGF-b and MCP-1 levels. Increased collagen production was detected only in the case of normal cells. Altogether, our findings show that adult mouse lung fibroblasts grow in a 3D culture system, that they are responsive to IL-13 stimulation and that those from silicotic mice showed an activated phenotype as compared to the controls. Thus, this experimental model seems to be reproducible and promising in the case of searching for anti-fibrotic compounds.

A endometriose é caracterizada pela presença de tecido endometrial fora do útero. No estudo, utilizou-se um sistema de co-cultivo 3D contendo células do estroma e endotélio endometrial. O sistema foi exposto ao soro de mulheres saudáveis ou com endometriose, que fazem ou não o uso de anticoncepcional. Posteriormente, foi avaliada a resposta do sistema no que diz respeito ao perfil de citocinas. Nossos resultados mostraram que o perfil sérico das mulheres com endometriose sem anticoncepcional apresentaram elevados níveis séricos de IL2 e IL10 com relação às saudáveis. Enquanto que as mulheres com endometriose, que fazem uso de anticoncepcional, apresentaram altos níveis de IL6 e IL8. O perfil de citocinas encontrado no homogenato das mulheres com endometriose induziu a produção exacerbada de IL2 e IL10 além de IFN-γ, TNF-α, IL6. Quando as células eram incubadas com soro de mulheres com endometriose que fazem tratamento, os níveis de IL6 e IL8 aumentaram. Os achados sugerem que o uso de co-cultivos 3D de células estromais e endoteliais endometriais é um bom modelo para novos estudos. / Endometriosis is characterized by the presence of endometrial tissue outside the uterus. In this study, we used a 3D co-culture system with stromal and endothelium endometrial cells. The system was exposed to serum of healthy women or with endometriosis do or not use contraceptive. Subsequently, he studied the response of endometrial cells with respect to the cytokine profile. Our results showed that the serum profile of women with endometriosis without contraceptive had high serum levels of IL2 and IL10 regarding healthy women. While women with endometriosis who use contraceptive, showed high levels of IL6 and IL8. The cytokine profile seen in homogenate of women with endometriosis induced high production of IL2 and IL10, in addition IFN-γ, TNF-α, IL6. When cells were incubated with serum from women with endometriosis under treatment, the levels of IL6 and IL8 increased. The findings suggest that the use of co-cultivation 3D stromal cells and endometrial endothelial is a good model for further studies.

O desenvolvimento de novas terapias para o câncer envolve um processo longo e custoso no qual apenas 5% dos candidatos a fármacos em ensaios clínicos são aprovados. Os ensaios celulares são um importante pilar neste processo, no entanto, eles são geralmente feitos em células cultivadas em monocamada, o que apresenta algumas limitações. Assim, o desenvolvimento e aplicação de modelos tridimensionais (3D) para ensaios pré-clínicos tem sido cada vez mais investigado, devido a suas maiores similaridades com tumores in vivo em relação a características físicas, espaciais e bioquímicas. A via PI3K-AKT-mTOR, que está frequentemente desregulada em diversos cânceres, é uma rota metabólica essencial por integrar fatores de crescimento e sinais internos com a expressão de proteínas relacionadas ao crescimento celular. Sendo assim, novos compostos inibitórios dessa via têm sido estudados pelo grupo NEQUIMED como alternativa terapêutica para essas doenças. Dessa forma, este trabalho teve o objetivo de avaliar o potencial citostático e citotóxico de novos inibidores da via da mTOR em culturas celulares bi e tridimensionais de câncer de próstata e hepatocarcinoma. Para isso, o modelo de cultura 3D foi padronizado para ambas linhagens usando duas técnicas diferentes, além da padronização da técnica de redução da resazurina para a determinação da viabilidade celular em 2D e 3D. No ensaio citotóxico, células em monocamada e esferoides foram tratadas com diferentes concentrações dos fármacos de referência e dos novos inibidores e tiveram sua viabilidade determinada pelo ensaio de redução da resazurina. Já para o ensaio citostático, baixas concentrações de células foram plaqueadas em monocamada e tratadas por até 6 dias, tendo sua viabilidade medida a cada 48 h pelo ensaio de MTT. Os esferoides foram tratados por 9 dias com as mesmas substâncias, tendo seu volume medido a cada 3 dias. No geral, os novos compostos não apresentaram efeitos citotóxicos relevantes, contudo, os compostos Neq0438 e seu análogo, Neq0679, tiveram maior efeito citostático que a Rapamicina em culturas 2D e 3D de HepG2. Além disso, os compostos tiveram maior efeito citostático em esferoides do que em células cultivadas em monocamada para as duas linhagens. Isso pode ser justificado pela alteração na expressão de proteínas da via da mTOR em relação ao modelo de cultura, já que foi demonstrado sua maior ativação nos modelos tridimensionais. Futuramente esses compostos poderão ser testados sozinhos, ou em terapia combinada em modelos animais para melhor avaliação de sua segurança e sua evolução no estudo pré-clínico. / The development of new cancer therapies involves a long and expensive process in which only 5% of the clinical trial candidates for new drugs get approval. Cell assays are an essential pillar in this process; however, they are usually carried out in cells grown as a monolayer, which have some limitations. Thus, the development and application of new tridimensional (3D) models for preclinical trials has been deeply investigated, due to their higher similarities with in vivo tumors, regarding physical, spatial and biochemical features. The PI3K-AKT-mTOR pathway, which integrates growth factors and the expressions of proteins for the cellular growth, is often upregulated in several types of cancer. Hence, the NEQUIMED group is studying new pathway inhibitors as a therapeutic alternative for cancer. Here, the cytotoxic and cytostatic effects of the new PI3K-AKT-mTOR inhibitors were assessed in two and three-dimensional cells models of prostate cancer and hepatocarcinoma. To that end, the 3D culture model was standardized for both cell lines using two different techniques. The resazurin reduction assay was also standardized to determine cell viability in 2D and 3D models. For the cytotoxic assay, cells grown in a monolayer and 3D spheroids were treated with a range of concentrations of the reference drugs and new mTOR inhibitors and had their viability assessed by the resazurin assay. For the cytostatic assay, low cell density was plated on 2D and treated for 6 days, having their viability determined every 48 h using the MTT assay. Spheroids were treated for 9 days with the same substances and had their volume measured every 3 days. Overall, the new mTOR inhibitors did not show relevant cytotoxic effects, however, Neq0438 and its analog Neq0679, had a higher cytostatic effect than Rapamycin for both 2D and 3D cultures of HepG2. Besides, all mTOR inhibitors had a higher cytostatic effect on 3D cultures when compared to monolayers, which can be related to the overexpression of the mTOR pathway in this culture system, already reported on the literature. Based on these results, Neq0438 and Neq0679 should now be used alone or in combination using in vivo models to investigate their antitumoral effects.

O desenvolvimento de novas terapias para o câncer envolve um processo longo e custoso no qual apenas 5% dos candidatos a fármacos em ensaios clínicos são aprovados. Os ensaios celulares são um importante pilar neste processo, no entanto, eles são geralmente feitos em células cultivadas em monocamada, o que apresenta algumas limitações. Assim, o desenvolvimento e aplicação de modelos tridimensionais (3D) para ensaios pré-clínicos tem sido cada vez mais investigado, devido a suas maiores similaridades com tumores in vivo em relação a características físicas, espaciais e bioquímicas. A via PI3K-AKT-mTOR, que está frequentemente desregulada em diversos cânceres, é uma rota metabólica essencial por integrar fatores de crescimento e sinais internos com a expressão de proteínas relacionadas ao crescimento celular. Sendo assim, novos compostos inibitórios dessa via têm sido estudados pelo grupo NEQUIMED como alternativa terapêutica para essas doenças. Dessa forma, este trabalho teve o objetivo de avaliar o potencial citostático e citotóxico de novos inibidores da via da mTOR em culturas celulares bi e tridimensionais de câncer de próstata e hepatocarcinoma. Para isso, o modelo de cultura 3D foi padronizado para ambas linhagens usando duas técnicas diferentes, além da padronização da técnica de redução da resazurina para a determinação da viabilidade celular em 2D e 3D. No ensaio citotóxico, células em monocamada e esferoides foram tratadas com diferentes concentrações dos fármacos de referência e dos novos inibidores e tiveram sua viabilidade determinada pelo ensaio de redução da resazurina. Já para o ensaio citostático, baixas concentrações de células foram plaqueadas em monocamada e tratadas por até 6 dias, tendo sua viabilidade medida a cada 48 h pelo ensaio de MTT. Os esferoides foram tratados por 9 dias com as mesmas substâncias, tendo seu volume medido a cada 3 dias. No geral, os novos compostos não apresentaram efeitos citotóxicos relevantes, contudo, os compostos Neq0438 e seu análogo, Neq0679, tiveram maior efeito citostático que a Rapamicina em culturas 2D e 3D de HepG2. Além disso, os compostos tiveram maior efeito citostático em esferoides do que em células cultivadas em monocamada para as duas linhagens. Isso pode ser justificado pela alteração na expressão de proteínas da via da mTOR em relação ao modelo de cultura, já que foi demonstrado sua maior ativação nos modelos tridimensionais. Futuramente esses compostos poderão ser testados sozinhos, ou em terapia combinada em modelos animais para melhor avaliação de sua segurança e sua evolução no estudo pré-clínico. / The development of new cancer therapies involves a long and expensive process in which only 5% of the clinical trial candidates for new drugs get approval. Cell assays are an essential pillar in this process; however, they are usually carried out in cells grown as a monolayer, which have some limitations. Thus, the development and application of new tridimensional (3D) models for preclinical trials has been deeply investigated, due to their higher similarities with in vivo tumors, regarding physical, spatial and biochemical features. The PI3K-AKT-mTOR pathway, which integrates growth factors and the expressions of proteins for the cellular growth, is often upregulated in several types of cancer. Hence, the NEQUIMED group is studying new pathway inhibitors as a therapeutic alternative for cancer. Here, the cytotoxic and cytostatic effects of the new PI3K-AKT-mTOR inhibitors were assessed in two and three-dimensional cells models of prostate cancer and hepatocarcinoma. To that end, the 3D culture model was standardized for both cell lines using two different techniques. The resazurin reduction assay was also standardized to determine cell viability in 2D and 3D models. For the cytotoxic assay, cells grown in a monolayer and 3D spheroids were treated with a range of concentrations of the reference drugs and new mTOR inhibitors and had their viability assessed by the resazurin assay. For the cytostatic assay, low cell density was plated on 2D and treated for 6 days, having their viability determined every 48 h using the MTT assay. Spheroids were treated for 9 days with the same substances and had their volume measured every 3 days. Overall, the new mTOR inhibitors did not show relevant cytotoxic effects, however, Neq0438 and its analog Neq0679, had a higher cytostatic effect than Rapamycin for both 2D and 3D cultures of HepG2. Besides, all mTOR inhibitors had a higher cytostatic effect on 3D cultures when compared to monolayers, which can be related to the overexpression of the mTOR pathway in this culture system, already reported on the literature. Based on these results, Neq0438 and Neq0679 should now be used alone or in combination using in vivo models to investigate their antitumoral effects.