Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2017-06-22T19:34:05Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Talita Cristina Mamedes - 2013.pdf: 960382 bytes, checksum: 686077b9e4ff166f99426931ebddf7e2 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2017-07-07T20:21:23Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Talita Cristina Mamedes - 2013.pdf: 960382 bytes, checksum: 686077b9e4ff166f99426931ebddf7e2 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-07T20:21:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Talita Cristina Mamedes - 2013.pdf: 960382 bytes, checksum: 686077b9e4ff166f99426931ebddf7e2 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2013-04-02 / Handroanthus impetiginosus (Mart. ex DC.) Mattos is widely distributed woody species in Brazil. It has economic importance for its use as wood, medicinal, ecological and ornamental tree. There is great variation in the production of fruits and seeds over the years, many of the seeds are attacked by fungi and insects, and finally, the remaining intact seeds lose viability very quickly. Techniques of plant tissue culture can increase the rate of germination in woody species. The cultivation in nutrient medium under aseptic conditions, provides great production of seedlings in reduced time and space and at any time of year. Furthermore, in vitro propagation acts as a tool in the identification of microorganisms, studying their relationships and interactions with the host plant at genetic, cellular and physiological levels. The aim of this study was to establish a protocol for in vitro propagation of H. impetiginosus developed in three steps: decontamination and seed germination, induction of new shoots and roots. The protocol was based on direct organogenesis using plant material from seedlings germinated in vitro. For in vitro germination, seed surface contamination was controlled using 2 min. in 70% ethanol and 10 min. sodium hypochlorite with 2 % active chlorine. The germination rate was 99 % on MS medium. Induction and multiplication of new shoots were carried out with the aid of growth regulators 6 - benzylaminopurine (BAP) and naphthalene acetic acid (NAA) in different combinations. The results showed that for explants of H. impetiginosus all the tested amounts of BAP and NAA have the ability to regenerate shoots, callus and adventitious roots, it is necessary to improve the regeneration protocol to obtain greater number of new shoots. For in vitro rooting, cuttings responded positively to 6.0 mg L - 1 butyric acid (IBA), with 92 % rooting. However, the methods of decontamination of seeds did not control fungi of the genus Oidium. In order to identify the fungus and study the fungus - host relationship in H. impetiginosus cuts were made in vitro leaf fragments and the anatomical structure analyzed by optical microscope and scanning electron microscope. After the emergence of Oidium sp. on seedlings developed in vitro, methods of seeds disease control were tested for germination using different times and concentrations of ethanol, sodium hypochlorite, Chlorothalonil + tiophanate Methyl (systemic fungicid ) and Neem oil assessing the incidence and severity of each disease treatment. No treatment was effective in the control of powdery mildew, indicating the need for further studies. However, reduction of severity was observed in seeds treated with 70 % ethanol and sodium hypochlorite (2% active chlorine) and Neem oil immersion to 1.5 % for 10 minutes. / Handroanthus impetiginosus (Mart. ex DC.) Mattos é uma espécie arbórea de ampla distribuição no território brasileiro. Possui importância econômica por seu uso madeireiro, medicinal, ecológico e ornamental. Há grande variação na produção de frutos e sementes no decorrer dos anos, muitas das sementes produzidas são atacadas por fungos e insetos e, finalmente, as sementes que restam intactas perdem a viabilidade muito rapidamente. Técnicas de cultura de tecidos vegetais podem aumentar esta taxa de germinação em espécies arbóreas. O cultivo em meio nutritivo sob condições assépticas, proporciona grande produção de mudas em tempo e espaço reduzidos e em qualquer época do ano. Além disso, a propagação in vitro atua como ferramenta na identificação de microorganismos, estudando suas relações e interações com a planta hospedeira em níveis genético, celular e fisiológico. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo de propagação in vitro de H. impetiginosus, desenvolvido em três etapas: descontaminação e germinação das sementes, indução de novos brotos e enraizamento. O protocolo foi baseado na organogênese direta, utilizando material vegetal de plântulas germinadas in vitro. Na germinação in vitro a contaminação superficial das sementes foi controlada utilizando 2 min. em etanol 70% e 10 min. em hipoclorito de sódio com 2% de cloro ativo. A taxa de germinação foi de 99 % em meio MS. A indução e multiplicação de novos brotos foram realizadas com o auxílio dos reguladores de crescimento 6-benzilaminopurina (BAP) e ácido naftalenoacético (ANA) em diferentes combinações. Os resultados mostraram que, para explantes de H. impetiginosus, todas as quantidades testadas de BAP e de ANA possuem a capacidade de regenerar brotos, calos e raízes adventícias, sendo necessário aperfeiçoar o protocolo de regeneração para obter número maior de novas brotações. No enraizamento in vitro, estacas caulinares responderam de maneira positiva a 6,0 mg.L-1 de ácido indolbutírico (AIB), com 92% de enraizamento. Porém, os métodos de descontaminação de sementes não controlaram fungos do gênero Oidium sp. Com o objetivo de identificar o fungo e estudar a relação fungo-hospedeiro em H. impetiginosus in vitro foram feitos cortes anatômicos de fragmentos foliares analisados com microscópio óptico e microscópio eletrônico de varredura. Após o aparecimento de Oidium sp. nas plântulas desenvolvidas in vitro, métodos de controle da doença em sementes foram testados para a germinação in vitro utilizando diferentes tempos e concentrações de etanol, hipoclorito de sódio, Clorotalonil + Tiofanato Metílico (fungicida sistêmico) e óleo de Nim avaliando a incidência e severidade desta doença em cada tratamento. Em nenhum tratamento houve o controle efetivo do oídio, indicando a necessidade de novos estudos. Porém, a redução da severidade foi observada em sementes tratadas com etanol 70% e hipoclorito de sódio (2% de cloro ativo) e imersão em óleo de Nim a 1,5% por 10 minutos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The camu-camu is a fruit... / O camu-camu é uma fruta...

As condições divergentes do ambiente in vitro, como elevadas concentrações de sacarose, de reguladores de crescimento, de substâncias tóxicas, quando comparadas com o ambiente ex vitro, refletem-se em um desequilíbrio da relação entre compostos antioxidantes versus compostos oxidantes, resultando em elevada formação de espécies reativas de oxigênio, culminando no estabelecimento de um estresse oxidativo in vitro. No entanto, mesmo sendo capazes de conduzirem a morte celular, as espécies reativas de oxigênio atuam como importantes sinalizadoras do crescimento e desenvolvimento vegetal, por alterarem o padrão de expressão gênica, o metabolismo e a competência celular, sendo nesse aspecto considerado benéfico um nível moderado de estresse oxidativo para desencadear uma determinada rota morfogênica. Diante disso, o presente trabalho objetivou induzir o estresse oxidativo, suplementando o meio de cultura com reguladores de crescimento do grupo das citocininas e auxinas, com a finalidade de compreender a atuação deste evento nas respostas morfogênicas in vitro do pinhão manso (Jatropha curcas L.). Para tanto, utilizou-se sementes de pinhão manso de três procedências (CNPAE 101: Rio Verde, GO; CNPAE 115: Xambrê, PR e CNPAE 224: São Francisco do Glória, MG), as quais foram germinadas in vitro para a obtenção das plântulas e utilização do terço mediano do hipocótilo como explante nos experimentos de indução de estresse oxidativo in vitro. A análise morfofisiológica permitiu selecionar os tratamentos que induziram respostas organogênicas, que juntamente com o grupo controle, tiveram a quantificação da peroxidação lipídica, as atividades das enzimas antioxidantes catalase, superóxido dismutase e ascorbato peroxidase, determinadas, assim como o estabelecimento do perfil proteico de cada tratamento e a realização de análises histológicas e histoquímicas. Os resultados evidenciaram que as respostas morfogênicas foram dependentes do tipo e combinação de regulador de crescimento presente no meio de cultura; e ficou evidente pela quantificação da peroxidação lipídica e das atividades das enzimas antioxidantes, que a ausência de regulador de crescimento no meio de cultura foi o principal indutor do estresse oxidativo, permitindo constatar que quanto mais suave o estresse oxidativo, mais promissoras eram as respostas organogênicas constatadas nos explantes hipocotiledonares. Desta forma, o maior nível de estresse oxidativo constatado no grupo controle, relacionou-se negativamente com a resposta morfogênica obtida neste grupo, quando comparado aos demais tratamentos que apresentaram um nível de estresse oxidativo mais ameno e, consequentemente, uma resposta morfogênica mais promissora. O perfil proteico evidenciou o padrão existente de algumas bandas, independentemente da procedência considerada, confirmando a proximidade genética dos diferentes acessos de pinhão manso no Brasil. As análises histológicas demonstraram a ocorrência de organogênese indireta, com o desenvolvimento de calos organogênicos, ao passo que nas análises histoquímicas somente a presença de lipídios não foi detectada, enquanto proteínas totais, compostos fenólicos e amido foram constatados em pelo menos um dos três materiais analisados, para as três procedências de pinhão manso. Os resultados obtidos possibilitaram estabelecer uma relação entre o estresse oxidativo in vitro, a resposta morfogênica e o efeito dos reguladores de crescimento presentes no meio de cultura, além do potencial sucesso de produção de pinhão manso pela cultura de tecidos. / The environmental divergent conditions in vitro culture , such as high concentrations of saccharose , growth regulators, toxic substances, and others, when compared with the ex vitro conditions, reflected in an imbalance of antioxidants versus oxidant compounds relationship, resulting in an elevated formation of reactive oxygen species, which culminates in the establishment of an oxidative in vitro stress. However, even being able to conduce cell death, reactive oxygen species act as an important signaling of plant growth and development by altering the pattern of gene expression, cellular metabolism and cellular competence, being considerate beneficial in this context in which a moderate level of oxidative stress is required to trigger a morphogenetic route. Therefore, this study aimed to induce oxidative stress, supplementing the culture medium with growth regulators group of cytokines and auxin, with the purpose of understand the role of these event in vitro morphogenetic responses of physic nut (Jatropha curcas L.). Hence, were used physic nut´s seeds of three provenances (CNPAE 101: Rio Verde, GO; CNPAE 115: Xambrê, PR and CNPAE 224: São Francisco do Glória, MG ), which were in vitro germinated to obtain the seedlings and the middle third of hypocotyls that was used as explant in experiments to induction in vitro oxidative stress. The morphophysiological analysis allowed to select the treatments that induced the organogenic responses, which along with the control group, had the quantification of lipid peroxidation, activities of antioxidant enzymes catalase, superoxide dismutase and ascorbate peroxidase, determined as well as the establishment of the protein profile of each treatment and the realization of histological and histochemical analyses. The results showed that the morphogenic responses were dependent on the type and combination of growth regulators present in the culture medium; and with the lipid peroxidation quantification as well as antioxidant enzyme activities, it became evident that the oxidative stress was mainly caused by the absence of growth regulators in the culture medium, allowing noted that the softer oxidative stress, were the most promising responses organogenic found in hypocotyls. Thus, the higher level of oxidative stress observed in the control group correlated negatively with the morphogenic response obtained in this group when compared to the other treatments that showed a level of milder oxidative stress and, consequently, a more promising morphogenic response. The protein profile showed some band pattern, regardless of the provenances considered, confirming the low genetic distance between different accessions of Jatropha in Brazil. Histological analysis demonstrated the occurrence of indirect organogenesis, with the development of organogenic calli, whereas in histochemical analyzes only the presence of lipids was not detected while total proteins, phenolic compounds and starch were found in at least one of the three materials analyzed for the three provenances of physic nut. Taking together all the obtained data, it was possible to establish a relationship between oxidative stress, the morphogenic response in vitro and the effect of growth regulators in the culture medium as well as prove the potential success of the production of jatropha tissue culture.

Diferentes explantes vegetativos de Bauhinia jorticata Link foram inoculados in vitro para se estabelecer um protocolo de micropropagação com o uso de técnicas de cultura de tecidos. Para tanto, foi avaliado o efeito de diferentes fitorreguladores sobre estes explantes. Estabeleceu-se que os melhores explantes foram aqueles retirados a partir de tecidos da parte aérea (segmentos nodais e de entrenós) tanto para a indução de calos como para micropropagação. Os fitorreguladores ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e 6-Benzilaminopurina (BAP) nas concentrações de 0,25 mg/L e 0,50 mg/L, respectivamente, foram eficientes na indução de calos em 30 dias após a inoculação. BAP na concentração de 0,25 mg/L foi eficaz na indução de micropropagação em 60 dias de cultivo e ácido indolbutírico (IBA) na concentração de 1,0 mg/L foi efetivo na indução do enraizamento em 40 dias de cultivo / Different vegetative explants of Bauhinia forficata Link were inoculated in vitro in order to stablish a micropropagation protocol. The effect of different plant growth regulators was evaluated in the explants. Explants from shoot (nodal segments and internode) showed the best responses for callus induction as well as for micropropagation. The phytoregulators 2,4-dichlorophenoxiacetic (2,4-D) acid and 6- benzilaminopurine (BAP) efficientely induced callus on concentrations of 0,25 mg/L and 0,50 mg/L, respectiveIy, within 30 days after the inoculation. The BAP in a concentration of 0,25 mg/L was effective on the shoots induction within 60 days of cuIture. Indolbutiric acid (IBA) used on a concentration of 1,0 mg/L was effictive on the root induction within 40 days of cuIture

A cultura da laranja doce é muito importante ao redor do mundo, em especial no Brasil, maior produtor mundial dessas frutas. A produção citrícola sempre esteve ameaçada por muitas doenças de grande importância, tais como, o cancro cítrico, a clorose variegada dos citros (CVC) e pinta preta. Entretanto, em 2004, surgiu o huanglongbing (HLB) ou greening, que tem devastado pomares, e para a qual ainda não foi encontrada uma solução definitiva. A transgenia pode ser uma técnica auxiliar no manejo desta doença com a busca de cultivares mais tolerantes, em especial ao HLB. Neste trabalho, as pesquisas de transgenia não envolveram genes exógenos à planta como, por exemplo, genes de outros organismos ou genes sintéticos, ou seja, foi baseado em tecnologias mais recentes já aplicadas em outras espécies vegetais, nas quais a transgenia é utilizada para super-expressar genes dos sistemas de defesa da própria planta. Estudos indicam que a super-expressão de genes do sistema de Resistência Sistêmica Adquirida (SAR - do inglês, \"Systemic Acquired Resistance\") promove a resistência de plantas a doenças. Um gene importante para esse sistema é o gene npr1 que controla a expressão das proteínas relacionadas à patogênese (PR), em especial a PR1. Junto do gene npr1, os genes npr3 e npr4 também são reguladores desse sistema, atuando sobre o gene npr1 de acordo com os níveis de ácido salicílico presentes na célula, nível este que varia de acordo com o nível de infecção de cada célula. Porém, a avaliação de um evento transgênico de citros pode levar muitos anos. Desta forma, para diminuir esse tempo de avaliação, pensou-se em usar plantas modelos. O sistema escolhido foi o tomateiro Micro-Tom (Solanun lycopersicum L. cv. Micro-Tom). Para a obtenção das construções gênicas, foram identificados os genes Csnpr1, Csnpr3 e Csnpr4 de Citrus sinensis L. Osbeck a partir dos genes Atnpr1, Atnpr3 e Atnpr4 de Arabidopsis thaliana L.. Os genes de citros foram obtidos a partir de uma planta de laranja doce por RT-PCR e clonados no vetor pCambia 2201, que foi então inserido em Agrobacterium tumefaciens para a transformação genética. Foi feita a transformação genética de plantas de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck) e do tomateiro Micro-Tom. Após o crescimento dos brotos regenerados, foi feita a avaliação das plantas obtidas por meio de PCR. As plantas geneticamente modificadas foram aclimatizadas. As plantas de citros foram enxertadas e mantidas em casa de vegetação. As plantas de tomateiro Micro-Tom foram propagadas por sementes. A progênie foi avaliada aplicando o antibiótico de seleção canamicina, obtendo-se assim uma linhagem transgênica homozigota. / The sweet orange industry is very important worldwide, specially in Brazil, considered the world´s largest producer. The citrus production has always been threatened by several diseases of great importance, such as canker, CVC, and black spot. However, in 2004, the huanglongbing (HLB) or greening has been detected and devastated many citrus groves, and no definitive solution has been found yet. Transgenes may be a helpful tool for the management of this diseases, leading to the production of tolerant cultivars, especially to HLB. In this work, research on transgenic did not include the use of exogenous genes to the plant, such as genes from other organism or synthetic genes, i.e, it was based on new emerging technologies, already used on other crops, in which transgeny is used to super express genes from the plants own defense system. Studies indicate that a super expression of genes from the system called Systemic Acquired Resistance (SAR) promotes disease resistance. One important gene to this system is the npr1 gene, which controls the expression of the pathogen related proteins (PR), in special the PR1. Together with the npr1 gene, the genes npr3 and npr4 are also regulators of this system, regulating the action of the npr1 gene according to the levels of salicylic acid present in the cell, this level varies with the level of infection in each cell. Nevertheless, evaluating a citrus transgenic event may take several years. In order to shorten this time, model plants were used. The model chosen was the Micro-Tom tomato (Solanun lycopersicum L. cv. Micro-Tom). In order to obtain the genetic constructions, the genes Csnpr1, Csnpr3 e Csnpr4 were identified in Citrus sinensis L. Osbeck from the genes, Atnpr1, Atnpr3 and Atnpr4 present in the Arabidopsis thaliana L. genome. The citrus genes were obtained from the citrus genome using RT-PCR procedure and cloned separately into the pCambia 2201 vector, which was inserted into Agrobacterium tumefaciens in order to perform the genetic transformation. Sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) and Micro-Tom plants were genetically modified. After the growth of the regenerated shoots, the evaluation of the obtained plants was done through PCR analysis. The genetically modified plants were acclimatized, the citrus plants were grafted and kept in the greenhouse, the Micro-Tom plants were propagated trough seeds and its progeny was evaluated by applying the selection antibiotic kanamycin, thus obtaining a homozygous transgenic line.

As atividades que envolvem a floricultura vêm se destacando positivamente no cenário econômico do agronegócio brasileiro. Dentre as espécies de plantas utilizadas para este fim ressaltam-se as espécies pertencentes à família botânica Asteraceae, principalmente as do gênero Chrysanthemum. A espécie C. cinerariaefolium Vis. (Piretro da Dalmácia) é mundialmente cultivada visando à produção de aleloquímicos que apresentam atividades de inseticidas naturais (piretrinas). No Brasil chegou a ser produzida para esse fim em larga escala, no município de Taquara-RS na década de 30 a 40. Recentemente o interesse de seu cultivo tem aumentado como uma alternativa natural de manejo de pragas como planta ornamental, principalmente para jardins. Contudo, o fato de não produzir sementes férteis limita sua capacidade de propagação massal. Visando aperfeiçoar sua micropropagação foram realizados dois experimentos. No experimento 1 foi avaliado aos 30 dias de cultivo a influência de cinco concentrações de hipoclorito de sódio (10, 20, 30, 40 e 50% do produto comercial Mazzarolo) e cinco tempos de permanência na solução durante a desinfestação dos explantes (5, 10, 15, 20, 25 min.). Ao todo foram isolados 125 meristemas totalizando 25 tratamentos com cinco repetições. Os explantes isolados foram inoculados no meio de isolamento, o qual foi constituído de MS + 1,0 mg.L-1 de BAP + 0,1 mg.L-1 de GA3 + 0,01 mg.L-1 ANA + 30 g.L-1 de Sacarose em 7,0 g.L-1 de Agar. No experimento 2 foi avaliado a influência das diferentes concentrações de hipoclorito e dois tempos de permanência na solução desinfetante sobre a porcentagem de necrose, estruturas amorfas, plântulas formadas e comprimento de brotos. As plântulas regeneradas do experimento 1 foram inoculadas no meio de multiplicação que constou do MS + 0,4 mg.L-1 de Thiamina HCl + 100 mg.L-1 de Mio-Inositol + 0,05 mg.L-1 de ANA + 1,0 mg.L-1 de BAP + 40 g.L-1 de Sacarose e 7,0 g.L-1 de Agar. O pH dos meios foi ajustado em 5,9 antes da autoclavagem. Os resultados obtidos no experimento 1 indicaram que quanto maior o tempo de permanência na solução, maior a porcentagem de necrose. Porém, quanto menor a permanência maior a taxa de contaminação microbiana. No experimento 2, observou-se que a porcentagem de necrose é maior na concentração de 50%. Não houve influência dos fatores analisados na produção de estruturas amorfas. Para o número de brotos/explante e comprimento de brotos, o melhor desempenho se deu na solução 30%. Porém, a taxa de brotos por explante diminuiu à medida que aumentou o tempo de permanência na solução. Com relação ao comprimento dos brotos, os melhores resultados foram observados até o tempo de 15 minutos de permanência. Assim conclui-se que C. cinerariaefolium Vis. responde positivamente ao cultivo in vitro. A taxa de necrose aumenta à medida que aumenta a concentração de hipoclorito. Por outro lado, a taxa de contaminação aumenta à medida que diminui a concentração da solução desinfetante. A concentração de hipoclorito de sódio e o tempo de permanência na solução desinfetante afetam o número e o comprimento de brotos produzidos nos subcultivos. / The activities that involve floriculture have distinguished positively in the economic scenario of the Brazilian agribusiness. Among the plant species used for that purpose it can be distinguished the species belonging to the botanical family Asteraceae, mainly from the genus Chrysanthemum. The species C. cinerariaefolium Vis. is worldwide cultivated in order to produce the alelochemicals, which have activities of natural insecticides (pyretrine). In Brazil it was produced in large scale, in the Taquara-RS County in the decade of 30 to 40. Recently the interest on its cultivation has increased as natural alternative of pest management as ornamental plant, mainly in yards. However, the fact of no seed is produced by the plant that limits its capacity of massal production. In order to optimize its micropropagation two experiments were developed. In the experiment 1 it was evaluated 30 days after cultivation the influence of five concentrations of sodium hipochlorine (10, 20, 30, 40 and 50% of the commercial product Mazzarolo), and five time lengths of the explants permanence in the disinfecting solution (5, 10, 15, 20 and 25 min.). It was isolated 125 meristems, 25 treatments with five replications. The isolated explants were inoculated in isolation media, that was constituted of MS + 1.0 mg.mL-1 of BAP + 0.1 mg.L-1 of GA3 + 0.01 mg.L-1 ANA + 30 g.L- 1 of sucrose in 7.0 g.L-1 of Agar. In the experiment 2 it was evaluated the influence of different concentrations of hipochlorine and two length of time in disinfection solution measuring the percentage of necrosis, amorphous structures, seedlings formed and length of the sprouts. The regenerated seedlings from experiment 1 were inoculate in a medium of multiplication that was of MS + 0.4 mg.L-1 of Thiamine HCl + 100 mg.L-1 of Mio-Inositol 0.05 mg.L-1 of ANA + 1.0 mg.L-1 of BAP + 40 g.L-1 of sucrose and 7.0 g.L-1 of Agar. The pH of the medium was adjusted to 5.9 before the autoclaving process. The results obtained in the experiment 1 indicated that the higher the time length in the solution, the higher is the percentage of necrosis. However, the higher is the permanence of higher rate of microbial contamination. In the experiment 2; it was observed that the percentage of necrosis is higher at the concentration of 50%. There was no influence of the analyzed factors in the yield of amorphous structures. For the number of sprouts/explants and length of sprouts, the better performance was in the solution of 30%. However, the rate of sprouts per explants diminished as the length of time in the solution increased. The best results for sprout length were obtained up to 15 minutes of permanence. Therefore, it can be concluded that C. cinerariaefolium Vis. responds positively to in vitro culture. The rate of necrosis increases as the hipochlorine concentration is higher. On the other hand, the contamination rate increases as the disinfection solution diminishes. The concentration o hipochlorine sodium as the length of time of permanence in the initial disinfecting solution used during the explants disinfection affects the number and the sprout length produced during the subculture.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-04-18T11:03:26Z No. of bitstreams: 1 christianedovalleribeiro.pdf: 1049142 bytes, checksum: 98e994d5887430998d905b84484671d5 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-04-24T03:08:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 christianedovalleribeiro.pdf: 1049142 bytes, checksum: 98e994d5887430998d905b84484671d5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-24T03:08:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 christianedovalleribeiro.pdf: 1049142 bytes, checksum: 98e994d5887430998d905b84484671d5 (MD5) Previous issue date: 2015-07-27 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Lippia alba é uma planta medicinal que pertence à família Verbenaceae e é conhecida popularmente como erva cidreira. A espécie possui duas características que merecem destaque, é rica em óleos essenciais de interesse econômico e apresenta-se como um complexo poliploide, com números cromossômicos de 2n= 30, 38, 45, 60 e 90. Dessa maneira, L. alba é uma espécie interessante, tanto para a ciência aplicada, quanto para a ciência básica. Este trabalho teve como objetivo produzir plantas poliploides artificiais de L. alba para serem utilizadas em futuros estudos de melhoramento e evolução. Foi utilizado o acesso BGEN02 (2n=2x=30) para a produção de plantas autotetraploides (2n=4x=60). As plantas foram propagadas em meio de cultura MS livre de hormônios e a exposição à colchicina foi realizada misturando-a ao meio MS e inoculando os segmentos nodais. As plantas foram lavadas 3 vezes em água destilada e reinoculadas em meio MS livre de colchicina para posterior análise de nível de ploidia por citometria de fluxo. Foram realizados três experimentos de indução de poliploidia: experimento 1, experimento 2 e experimento 3. Nos dois primeiros, a análise de ploidia foi feita após a organogênese do explante (40 DAI) e no terceiro, a citometria de fluxo foi feita imediatamente após a exposição à colchicina, em curtos intervalos de tempo, para monitorar as alterações de ploidia nesse período. No experimento 1, foram utilizadas diversas concentrações de colchicina, para obter informações sobre as melhores concentrações para realizar os experimentos seguintes. A concentração de melhor resultado (0,2%) juntamente com uma concentração 10 vezes menor (0,02%) foram utilizadas no experimento 2 de indução de poliploidia, para comparar efeitos de baixa e alta concentração. Essas duas concentrações foram utilizadas também no experimento 3, no qual se utilizou dos percentuais de células em 4C e 8C para inferir a ploidia. Poliploides com aproximadamente 6 cm de comprimento foram aclimatizados utilizando substrato para plantio BioPlant ®. No experimento 1, as análises por citometria de fluxo revelaram poliploides nas concentrações de 0,2% e 0,5%, sendo que a primeira produziu maior número de plantas com ploidia alterada. Embora os tratamentos mais fortes tenham causado maior alteração de ploidia, os mesmos causaram maior mortalidade. Com os resultados do experimento 3, foi possível concluir que a concentração 0,2% aumentou os percentuais de células em 4C e 8C, ou seja, produziu células poliploides. Esse resultado corrobora os achados nos experimentos 1 e 2, em que o tratamento de 0,2% foi o que mais produziu plantas poliploides e mixoploides. Portanto, conclui-se que (1) o presente estudo obteve êxito em induzir autotetraploides artificiais de L. alba utilizando a colchicina e as técnicas de cultura de tecidos vegetais in vitro; (2) que as concentrações de 0,2% e 0,5% de colchicina foram capazes de produzir plantas autotetraploides nessa espécie e (3) que as concentrações altas apresentaram maior efeito de alteração de ploidia nos explantes de L. alba. / L. alba is an important medicinal plant that belongs to the family Verbenaceae and is popularly known as falsa melissa or erva cidreira. This species has two features that are very important, it is rich in essential oils of economic interest and is a polyploid complex, with chromosome numbers 2n= 30, 38, 45, 60 and 90. Thus, L. alba is an interesting species, for both the applied and basics research, for plant breeding (improving essential oils) and for evolutionary studies. The aim of this work was to induce artificial polyploid L. alba plants for improvement and evolutionary studies. Biological material was constituted by an accession of L. alba (BGEN02 2n=2x=30). This accession was employed to produce autotetraploid plants (2n=4x=60). Plants were propagated by in vitro tissue culture in MS hormone free culture medium. For the colchicine treatment, colchicine solution was mixed with MS medium and the nodal segments were inoculated. The explants were washed three times in distilled water and inoculated in MS medium colchicine free to after ploidy analysis by flow cytometry. Three polyploidy induction experiments were made: experiment 1, experiment 2 and experiment 3. In 1 and 2 experiments the ploidy analysis were made after explant organogenesis (40 DAI) and in experiment 3, flow cytometry was made immediately after colchicine exposure at short time intervals to monitoring the ploidy changes in this initial period. In experiment 1, several colchicine concentrations were used to obtaining information about the best concentrations to perform following experiments. The best result was obtained by 0,2%. This concentration and a ten times low concentration (0,02%) were used in experiment 2, to compare the effects of high and low concentrations. These two colchicne concentrations were used also in experiment 3 in which 4C and 8C percentiles were used to inferring the ploidy level. Polyploids with a length of approximately 6 cm were acclimatized in substrate for planting BioPlant®. In experiment 1, the ploidy analysis by flow cytometry of polyploidy induction experiments revealed polyploids in treatments with colchicine at concentrations of 0.2% and 0.5%, and the concentration that produced a greater number of plants with altered ploidy was 0.2%.Although the strongest treatments caused more ploidy changes, they caused higher mortality too. From the results of experiment 3, we concluded that 0.2% concentration caused increasing in the percentage of cells in 4C and 8C, which means polyploidy. This result corroborates the findings in experiment 1 and 2, in which the treatment of 0.2% produced more polyploids and mixoploids plants. Therefore, it is concluded that (1) this study was successful in inducing L. alba artificial autotetraploids using colchicine and the plant tissue culture techniques; (2) the concentrations of 0.2% and 0.5% colchicine were able to produce autotetraploids plants of this species, and (3) the high concentrations exhibited higher ploidy change effect on the explants L. alba than the low concentrations.

The objective this present study was developed a protocol of surface disinfection of marigold seeds; through immersion of seeds in etanol solution 70%, for 30 s. followed by different times of immersion in 2,5% sodium hypoclorite solution (0, 10, 20 e 30 min) plus one drop of detergent commercial; selected a methodology by break barries to germination of marigold seeds of calendula in vitro (immersion in sulfuric acid absolute during 5 min; immersion in cloridric acid absolute during 5 min; removal of tegument and imbibiton of seeds in water destilled, during 12 h; imbibiton of seeds in water destilled, during 12 h; control). Beyond tested growth regulators concentrations (absence of growth regulators; 0,01 mg L-1 of ANA; 0,5 mg L-1 of BAP; 1 mg L-1 of BAP; 1,5 mg L-1 of BAP, in a factorial model) what induce the induction of calli in leaf segments from ex vitro and in vitro culture; evaluate the regeneration potential in vitro culture from marigold seeds in presence and absence of growth regulators (absence of growth regulators; 0,5 μ mol of ANA; 2μ mol of BAP; 3μ mol of BAP; 4 μ mol of BAP; 5 μ mol of BAP; 6μ mol of BAP; 7μ mol of BAP, in a factorial model); evaluate the influences of in vitro culture time in calli regeneration formed under growth regulators concentrations and different concentration of growth regulators (absence of growth regulators; 2μ mol of BAP and 0,5 μ mol of ANA; 5 μ mol of BAP and 0,5 μ mol of ANA; 6 μ mol of BAP and 0,5 μ mol of ANA; 7μ mol de BAP and 0,5 μ mol of ANA; containing old calli; containing young calli, in a factorial model) in regeneration and type formed. Verified was that the immersion in 2,5% sodium hypoclorite solution for 30 min coupled with the removal of tegument promoted the in vitro germination of marigold seeds and making a surface disinfection satisfactory of seeds; not is necessary of supplementation with cytokinins to promote the rhizogenesis in marigold; is necessary the addiction of BAP the nutrient medium to occur calogenesis in leaf segments from the in vitro culture and in seeds, need to be great concentration that growth regulator if the culture is made in the ANA presence; for calogenesis in leaf segments coming of ex vitro culture, not is necessary increase the BAP concentration in ANA presence; for regeneration of aerial parts from seeds not is necessary the BAP supplementation or ANA; for regeneration of roots from seeds not is necessary BAP presence or ANA, however with ANA addiction become necessary BAP supplementation; the calogenesis is favored the use of BAP; calli more tumid were verified in growth regulators presence; young calli in ANA and BAP absence and presence induced formation of spongy calli and of green calli; young calli are more efficient to regenerate aerial parts. / Constituíram objetivos desse trabalho: desenvolver um protocolo de desinfestação superficial de sementes, através da imersão das sementes em solução de etanol a 70%, por 30 s.,seguido de diferentes tempos de imersão em solução de hipoclorito de sódio a 2,5% (0, 10, 20 e 30 min) acrescida de uma gota de detergente comercial; selecionar uma metodologia para a superação da barreira para a germinação de sementes de calêndula in vitro; utilizando-se diferentes métodos de superação dessa barreira (imersão em Ácido Sulfúrico absoluto durante 5 min; imersão em Ácido Clorídrico absoluto durante 5 min; retirada do tegumento e embebição das sementes em água destilada, durante 12 h; embebição das sementes em água destilada, durante 12 h; controle). Além de testar concentrações de fitorreguladores (ausência de fitorreguladores; 0,01 mg L-1 de ANA; 0,5 mg L-1 de BAP; 1 mg L-1 de BAP; 1,5 mg L-1 de BAP, em esquema bifatorial)que induzam à formação de calos em segmentos foliares oriundos de cultivo in vitro e ex vitro de calêndula; avaliar o potencial de regeneração no cultivo in vitro a partir de sementes de calêndula utilizando diferentes concentrações de fitorreguladores (ausência de fitorreguladores; 0,5 μ mol de ANA; 2μ mol de BAP; 3μ mol de BAP; 4 μ mol de BAP; 5 μ mol de BAP; 6μ mol de BAP; 7μ mol de BAP, em esquema bifatorial) e avaliar a influência do tempo de cultivo e das diferentes concentrações de fitorreguladores (ausência de fitorreguladores; 2μ mol de BAP e 0,5 μ mol de ANA; 5 μ mol de BAP e 0,5 μ mol de ANA; 6 μ mol de BAP e 0,5 μ mol de ANA; 7μ mol de BAP e 0,5 μ mol de ANA; contendo calos velhos; contendo calos jovens, em esquema bifatorial) na regeneração e no tipo de calo formado. Foi verificado que a imersão em solução de hipoclorito de sódio a 2,5% por 30 min aliada à remoção do tegumento promovem a germinação in vitro de sementes de calêndula efetuando uma desinfestação superficial satisfatória das sementes utilizadas; não há necessidade de suplementação com citocininas para promover a rizogênese em calêndula; é necessária a adição de BAP ao meio nutritivo para ocorrer a calogênese em segmentos foliares oriundos de cultivo in vitro e em sementes, devendo ser maior a concentração desse fitorregulador se o cultivo for efetuado na presença de ANA; no caso de calogênese em segmentos foliares advindos de cultivo ex vitro, não é necessário aumentar a concentração de BAP na presença de ANA; para a regeneração de partes aéreas a partir de sementes não é necessária a suplementação de BAP nem de ANA; para a regeneração de raízes a partir de sementes não é necessária a presença de BAP nem de ANA, contudo com a adição de ANA torna-se necessária a suplementação com BAP; a calogênese é favorecida pela utilização de BAP; calos mais intumescidos foram verificados na presença de fitorreguladores; calos, na presença de ANA e de BAP, induzem à formação de calos esponjosos e de calos verdes; calos jovens são mais eficientes para regenerar partes aéreas.

Made available in DSpace on 2016-01-26T18:56:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciana Midori Takamori.pdf: 833111 bytes, checksum: 9cc8e066771c7d927c3b5a8b15bc398c (MD5) Previous issue date: 2014-11-05 / The establishment of an efficient methodology for regeneration in Urochloa spp via somatic embryogenesis is an essential step for genetic engineering works and to support the breeding programs of the signal grass. The aim of this study was to evaluate different concentrations of growth regulators on callus induction, somatic embryogenesis and plant regeneration of Urochloa spp. using mature seeds as the initial explant. Firstly, eight treatments were tested containing different concentrations (1, 2, 4 and 8 mg L-1) of 2,4-D or picloram, using Marandu cultivar. After, the same concentrations of picloram were tested for others genotypes: cultivars Xaraés and Piata of U. brizantha, U. decumbens cv. Basilisk, U. humidicola. cv. Llanero and U. ruziziensis cv. Ruziziensis. The experiments were conducted in a completely randomized design with four replications per treatment, and each replicate consisted of a petri dish containing 10 seeds each. The experiments were repeated three times. Seeds were sterilized in 5% NaOCl containing three drops of Tween 20, washed five times in sterile distilled water and inoculated onto MS medium containing the treatments described above. The experiments were maintained in growth chamber at 25 ° C ± 2 ° C in the dark, and sub-cultured every 14 days until the emergence of embryogenic calluses. To induce plant regeneration, these calluses were transferred to hormone-free MS medium for 14 days in indirect light followed by transfer to MS/2 medium containing 2 mg/L-BA in direct light with a photoperiod of 16 hours. The number of seeds that produced primary calluses, the number of calluses with shoots and the number of regenerated plants were analyzed in each treatment. To demonstrate embryogenic competence, the different calluses types were cyto-chemically analyzed by double staining with acetic carmine and Evans blue. There was no significant difference between concentration of 2,4D or picloram for production of primary calluses of U. brizantha Marandu ranging from 58.5% to 69.2%. Calluses induced under picloram showed the highest percentage of shoot formation differing significantly from those induced under 2.4D. The genotypes U. decumbens cv. Basilisk, U. brizantha cv. Marandu and Xaraés showed the significant highest number of regenerated plants at 1 mg/L picloram. Green and morphologically normal plants were regenerated and acclimatized, opening the possibility of using this protocol to obtain transgenic plants in Urochloa spp. / O estabelecimento de uma metodologia eficiente para regeneração in vitro de Urochloa spp. via embriogênese somática é essencial para trabalhos de manipulação genética e, para dar suporte ao melhoramento do capim braquiária. O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes concentrações de reguladores de crescimento na indução de calos, embriões somáticos e na regeneração de plantas de Urochloa spp., utilizando sementes maduras como explante inicial. Inicialmente, foram testados quatro tratamentos contendo 2,4-D ou picloram, nas concentrações de 1, 2, 4 e 8 mg/L usando a cultivar Marandu (1cultivar x 2 reguladores x 4 concentrações x 12 repetições). Posteriormente, as mesmas concentrações de picloram foram testadas para as cultivares Xaraés e Piatã de U. brizantha e para as espécies de U. decumbens cv. Basilisk, U. humidicola cv. Llanero e U. ruziziensis cv. Ruziziensis (6 cultivares x 1 regulador x 4 concentrações x 12 repetições). Os experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado, com quatro repetições por tratamento, sendo que cada repetição foi composta por uma placa contendo 10 sementes cada. Os experimentos foram repetidos três vezes. As sementes foram desinfestadas em NaOCl a 5% contendo três gotas de Tween 20, lavadas cinco vezes em água destilada esterilizada e inoculadas em meio MS contendo as diferentes concentrações dos reguladores de crescimento. Os experimentos foram mantidos em câmara de crescimento a 25 ºC ± 2 ºC, na ausência de luz, sendo sub-cultivados a cada 14 dias até o surgimento de calos embriogênicos. Estes calos foram transferidos para o meio MS sem adição de fitorreguladores por 14 dias, em luz indireta e, em seguida, transferidos para o meio MS/2 contendo 2 mg/L de BA, sob luz direta, com fotoperíodo de 16 horas para regeneração de plantas. Foram analisados o número de sementes que produziram calos primários, número de calos que produziram brotos e número de plantas regeneradas. Os diferentes tipos de calos produzidos foram avaliados citoquimicamente por meio da dupla coloração com Carmim acético e azul de Evans para certificar a competência embriogênica. Para a U. brizantha cv Marandu não houve diferença significativa entre os tratamentos para o percentual médio de sementes que produziram calos primários variando de 58,5% a 69,2%. Calos embriogênicos induzidos com o regulador de crescimento picloram certificaram o maior percentual de formação de brotos diferindo significativamente daqueles induzidos sob 2,4-D. O maior número de plantas regeneradas foi observado na concentração de 1 mg/L de picloram para os genótipos U. decumbens cv. Basilisk, U. brizantha cv. Marandu e Xaraés e não apresentando diferença significativa entre eles. Plantas verdes e morfologicamente normais foram regeneradas e aclimatizadas, abrindo a possibilidade do uso deste protocolo para obtenção de plantas transgênicas em Urochloa spp.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:51:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciana Midori Takamori.pdf: 833111 bytes, checksum: 9cc8e066771c7d927c3b5a8b15bc398c (MD5) Previous issue date: 2014-11-05 / The establishment of an efficient methodology for regeneration in Urochloa spp via somatic embryogenesis is an essential step for genetic engineering works and to support the breeding programs of the signal grass. The aim of this study was to evaluate different concentrations of growth regulators on callus induction, somatic embryogenesis and plant regeneration of Urochloa spp. using mature seeds as the initial explant. Firstly, eight treatments were tested containing different concentrations (1, 2, 4 and 8 mg L-1) of 2,4-D or picloram, using Marandu cultivar. After, the same concentrations of picloram were tested for others genotypes: cultivars Xaraés and Piata of U. brizantha, U. decumbens cv. Basilisk, U. humidicola. cv. Llanero and U. ruziziensis cv. Ruziziensis. The experiments were conducted in a completely randomized design with four replications per treatment, and each replicate consisted of a petri dish containing 10 seeds each. The experiments were repeated three times. Seeds were sterilized in 5% NaOCl containing three drops of Tween 20, washed five times in sterile distilled water and inoculated onto MS medium containing the treatments described above. The experiments were maintained in growth chamber at 25 ° C ± 2 ° C in the dark, and sub-cultured every 14 days until the emergence of embryogenic calluses. To induce plant regeneration, these calluses were transferred to hormone-free MS medium for 14 days in indirect light followed by transfer to MS/2 medium containing 2 mg/L-BA in direct light with a photoperiod of 16 hours. The number of seeds that produced primary calluses, the number of calluses with shoots and the number of regenerated plants were analyzed in each treatment. To demonstrate embryogenic competence, the different calluses types were cyto-chemically analyzed by double staining with acetic carmine and Evans blue. There was no significant difference between concentration of 2,4D or picloram for production of primary calluses of U. brizantha Marandu ranging from 58.5% to 69.2%. Calluses induced under picloram showed the highest percentage of shoot formation differing significantly from those induced under 2.4D. The genotypes U. decumbens cv. Basilisk, U. brizantha cv. Marandu and Xaraés showed the significant highest number of regenerated plants at 1 mg/L picloram. Green and morphologically normal plants were regenerated and acclimatized, opening the possibility of using this protocol to obtain transgenic plants in Urochloa spp. / O estabelecimento de uma metodologia eficiente para regeneração in vitro de Urochloa spp. via embriogênese somática é essencial para trabalhos de manipulação genética e, para dar suporte ao melhoramento do capim braquiária. O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes concentrações de reguladores de crescimento na indução de calos, embriões somáticos e na regeneração de plantas de Urochloa spp., utilizando sementes maduras como explante inicial. Inicialmente, foram testados quatro tratamentos contendo 2,4-D ou picloram, nas concentrações de 1, 2, 4 e 8 mg/L usando a cultivar Marandu (1cultivar x 2 reguladores x 4 concentrações x 12 repetições). Posteriormente, as mesmas concentrações de picloram foram testadas para as cultivares Xaraés e Piatã de U. brizantha e para as espécies de U. decumbens cv. Basilisk, U. humidicola cv. Llanero e U. ruziziensis cv. Ruziziensis (6 cultivares x 1 regulador x 4 concentrações x 12 repetições). Os experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado, com quatro repetições por tratamento, sendo que cada repetição foi composta por uma placa contendo 10 sementes cada. Os experimentos foram repetidos três vezes. As sementes foram desinfestadas em NaOCl a 5% contendo três gotas de Tween 20, lavadas cinco vezes em água destilada esterilizada e inoculadas em meio MS contendo as diferentes concentrações dos reguladores de crescimento. Os experimentos foram mantidos em câmara de crescimento a 25 ºC ± 2 ºC, na ausência de luz, sendo sub-cultivados a cada 14 dias até o surgimento de calos embriogênicos. Estes calos foram transferidos para o meio MS sem adição de fitorreguladores por 14 dias, em luz indireta e, em seguida, transferidos para o meio MS/2 contendo 2 mg/L de BA, sob luz direta, com fotoperíodo de 16 horas para regeneração de plantas. Foram analisados o número de sementes que produziram calos primários, número de calos que produziram brotos e número de plantas regeneradas. Os diferentes tipos de calos produzidos foram avaliados citoquimicamente por meio da dupla coloração com Carmim acético e azul de Evans para certificar a competência embriogênica. Para a U. brizantha cv Marandu não houve diferença significativa entre os tratamentos para o percentual médio de sementes que produziram calos primários variando de 58,5% a 69,2%. Calos embriogênicos induzidos com o regulador de crescimento picloram certificaram o maior percentual de formação de brotos diferindo significativamente daqueles induzidos sob 2,4-D. O maior número de plantas regeneradas foi observado na concentração de 1 mg/L de picloram para os genótipos U. decumbens cv. Basilisk, U. brizantha cv. Marandu e Xaraés e não apresentando diferença significativa entre eles. Plantas verdes e morfologicamente normais foram regeneradas e aclimatizadas, abrindo a possibilidade do uso deste protocolo para obtenção de plantas transgênicas em Urochloa spp.