Fibulin-4 is an extracellular matrix protein which plays an essential function in the assembly of elastic fibres, and may be involved in the modulation of TGFβ bioavailability and smooth muscle cell differentiation. Mutations in fibulin-4 can cause autosomal recessive cutis laxa, a frequently lethal connective tissue disorder. Although patient studies have provided some insights into the pathological mechanisms of this disease, a detailed analysis of the consequences of fibulin-4 mutations on a molecular and cellular level was required.The findings presented in this thesis demonstrate that cutis laxa-causing fibulin-4 mutations may lead to reduced extracellular levels of fibulin-4 due to its increased susceptibility to protease degradation and misfolding/aggregation. An accumulation of autophagic vesicles was observed, indicating a blockage of autophagy, possibly due to intracellular accumulation of aggregated/misfolded mutant protein. In the extracellular matrix, mutations affected the ability of fibulin-4 to interact with the major components of the elastic fibre assembly, heparin, LTBP-1 and fibronectin. In addition, fibulin-4 mutations generally reduced expression levels of elastic fibre assembly components. In summary, these findings contribute to the understanding of fibulin-4 associated cutis laxa, and provide a basis upon which future therapeutic interventions may be developed.

Made available in DSpace on 2016-03-22T17:27:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissert marcelo rocha cutis laxa.pdf: 3934539 bytes, checksum: 0cae748a5eb1aeff8680c47c0189a4f6 (MD5) Previous issue date: 2006-06-29 / Cutis Laxa é uma rara doença, congênita ou adquirida, localizada ou generalizada, do tecido conectivo. Existem três padrões hereditários distintos definidos da doença: autossômico dominante, autossômico recessivo e outro ligado ao cromossoma X.16,52,93-104 A doença caracteriza-se clinicamente por apresentar pele pendular, inelástica. A face do paciente com Cutis Laxa é característica com aparência senil, pele enrugada, com ectrópio palpebral, inclinação das comissuras palpebrais, nariz alargado, achatado e com columela curta, lábio superior alargado e orelhas grandes.16,52,99,101,105-114 A Cutis Laxa Congênita tem aparecimento precoce, na criança recém nascida ou na infância, costuma ter envolvimento sistêmico grave e cutâneo extenso, podendo levar ao óbito ainda na infância. Esta forma está ligada a herança autossômica recessiva. As alterações sistêmicas encontradas nessa forma congênita são: cardiovasculares ( ectasia de aorta e grandes vasos, cardiomegalia, insuficiência cardíaca congestiva, estenose de artéria pulmonar, dilatação do seio de valsalva e prolapso de válvulas cardíacas); respiratórias( enfisema pulmonar, pneumotórax, traqueobroncomegalias e bronquiectasias);digestivas( presença de divertículos no tubo digestivo, dilatação esofágica, hepatomegalia e má rotação intestinal); gênito-urinárias( divertículos, cistocele, prolapso retal e uterino, genitália infantil e esterilidade); podem também ocorrer o aparecimento de diversos tipos de hérnias e alterações osteoarticulares.16,52,97-98,101-104,106-107,115 A forma adquirida da Cutis Laxa, tem sido descrita após processos inflamatórios, exposição solar prolongada, reações alérgicas, urticária, picada de artrópodes, após uso de drogas ( isoniazida, penicilina), eritema multiforme e outras dermatoses inespecíficas. Também pode estar associada a outras doenças como: lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatóide, amiloidose, sarcoidose, síndrome nefrótica, sífilis, deficiência de alfa 1 antitripsina, dermatite herpetiforme, linfoma, mieloma múltiplo e infecção por Borrelia burgdorferi,. Essa forma costuma ser localizada, sem comprometimento sistêmico, com aparecimento no adulto jovem e seu curso costuma ser benígno.16,52,98,100,105-106,108-114 Histologicamente existe fragmentação, encurtamento e degeneração das fibras elásticas. Encontra-se infiltrado linfocítico e neutrofílico. A lesão mostra predominância de fagócitos e histiócitos, que resultam em fibras elásticas anormais e conseqüente diminuição do tecido elástico.16,52,92-115

GORAB is a protein that localises to the trans-Golgi network (TGN) and is known to interact with Rab6. The loss of GORAB leads to gerodermia osteodysplastica (GO), an autosomal recessive disorder which results in lax skin, precocious skin aging, osteoporosis, susceptibility to fractures and joint hyperelasticity. Both the function of GORAB and the mechanism of pathogenesis in GO patients are poorly defined. In this study, the cellular functions of GORAB have been investigated. Using a variety of approaches (yeast two-hybrid assays, pull-downs with recombinant proteins, proximity biotinylation assays combined with mass spectrometry and co-immunoprecipitations) it was possible to establish a network of interactions with Golgi-localised proteins, including Arf GTPases and the COPI-associated protein Scyl1, that suggests a possible role of GORAB in COPI-mediated trafficking. Consistent with this hypothesis, ultrastructural changes of the Golgi apparatus were observed as were abnormal protein glycosylation in primary skin fibroblasts derived from GO patients, detected using both lectin binding assays and mass spectrometric glycan profiling. Moreover, immuno-electron microscopy studies revealed unequal distribution of GORAB within the TGN and fluorescence recovery after photobleaching experiments show GORAB being very stably associated with Golgi membranes. These properties of GORAB seem to result from its ability to oligomerise and to interact with vimentin filaments. Based on these data, a model of GORAB acting as a scaffolding protein that organises sites of COPI budding at the TGN has been proposed. Additionally, analysis of both published and newly identified GORAB mutations found in GO patients revealed that they affect various properties of GORAB including its interaction with small GTPases and GORAB ability to oligomerise, which suggests that these features are important for GORAB cellular functions. Together, these data suggest that the underlying cause of the skin and bone defects observed in GO patients is impaired COPI trafficking at the Golgi apparatus resulting in abnormal glycosylation of extracellular matrix proteins.

Orientadores: Carlos Eduardo Steiner, Edi Lucia Sartorato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T07:50:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scherrer_DanielZanetti_M.pdf: 2073780 bytes, checksum: 5690d67c200b80bd6e6b14beca0d0f07 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Cutis laxa é um distúrbio raro do tecido conectivo em que a pele perde sua firmeza, cedendo excessivamente e conferindo ao indivíduo um aspecto envelhecido. Dentre as formas geneticamente determinadas, há uma de herança autossômica dominante, uma de herança ligada ao X e três de herança autossômica recessiva. Sugere-se que cutis laxa autossômica recessiva tipo II ou cutis laxa com déficit de crescimento e de desenvolvimento seja a mesma entidade descrita com as denominações de ¿síndrome da pele enrugada¿ e gerodermia osteodisplástica. Tal confusão quanto à nomenclatura é, em parte, causada pelo desconhecimento de suas bases biológicas. Recentemente se definiu que a cutis laxa autossômica recessiva tipo I é causada por mutações nos genes FBLN4 e FBLN5, localizados nos cromossomos 11q13.1 e 14q32.1, respectivamente. Por outro lado, dois indivíduos com cutis laxa descritos na literatura apresentaram alterações da lisil oxidase, codificada pelo gene LOX localizado em 5q23. Deste modo, o presente estudo visou analisar três famílias não aparentadas com quadro típico de cutis laxa autossômica recessiva tipo II, ¿síndrome da pele enrugada¿ ou gerodermia osteodisplástica para mutações nos genes LOX, FBLN4 e FBLN5. Para tanto, foram obtidas amostras de DNA genômico a partir de linfócitos do sangue periférico, utilizando métodos descritos na literatura pertinente. Todos os genes candidatos tiveram suas regiões codificantes amplificadas e submetidas à análise de seqüenciamento direto. Nenhuma mutação que caracterizasse o fenótipo foi encontrada nesses genes. Assim, o presente estudo excluiu os genes LOX, FBLN4 e FBLN5 como responsáveis para essa forma de cutis laxa nessas famílias / Abstract: Cutis Laxa is a rare disorder of connective tissue in which the skin sags excessively, giving to the individual an aged aspect. Concerning the genetic forms, there is an autosomal dominant, an X-linked recessive, and three autosomal recessive conditions. It has been suggested that type II autosomal recessive cutis laxa or cutis laxa with growth and developmental delay is the same entity described with the denominations of wrinkly skin syndrome and gerodermia osteodysplastica. Such confusion is caused, in part, by the fact that its biological basis remains unknown. Recently, type I autosomal recessive cutis laxa has been associated with mutations in FBLN4 and FBLN5 genes located on 11q13 and 14q32, respectively. On the other hand, some patients with cutis laxa show abnormalities in lysyl oxidase, coded by the LOX gene located on 5q23. In this way, the present study analyzed three unrelated families with typical picture of type II autosomal recessive cutis laxa, ¿wrinkly skin syndrome¿ or gerodermia osteodysplastica for mutations in LOX, FBLN4, and FBLN5 genes. Molecular studies were performed in genomic DNA samples from peripheral blood. All codifier regions of the three candidate genes were amplified and submitted to direct sequence analysis. No mutation that characterized the phenotype was found in the genes. Thus, the present study excluded LOX, FBLN4 and FBLN5 as responsible for this form of cutis laxa in these families / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientadores: Carlos Eduardo Steiner, Claudia Vianna Maurer Morelli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T22:10:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scherrer_DanielZanetti_D.pdf: 3629453 bytes, checksum: 18c59f0316e08a663d1352236ede8f6e (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Cutis laxa autossômica tipo II (CLAR tipo II) é um distúrbio raro do tecido conectivo em que a pele perde sua firmeza, cedendo excessivamente e conferindo ao indivíduo um aspecto envelhecido. Sugere-se que CLAR tipo II seja a mesma entidade descrita como "síndrome da pele enrugada" e gerodermia osteodisplástica. Tal confusão quanto à nomenclatura é, em parte, causada pelo conhecimento limitado de suas bases biológicas. O presente estudo visou analisar três famílias não aparentadas com quadro típico de CLAR tipo II para mutações nos genes ATP6V0A2, SCYL1BP1 e PYCR1. Nenhuma mutação foi identificada nos genes ATP6V0A2 e SCYL1BP1. Por outro lado, a triagem de mutações por sequenciamento direto do DNA no gene PYCR1, que desempenha um papel crítico na biossíntese de prolina, revelou duas novas variantes (p.Q10X e p.A241V), com efeito patogênico predito por análises de bioinformática. Em complementação, foi determinado o perfil de expressão gênica em tecido de pele e fibroblasto a partir de dois indivíduos com CLAR tipo II pela investigação de microarranjos, identificando os genes e as vias metabólicas possivelmente alteradas em tal condição, com a finalidade de entender os mecanismos subjacentes a este tipo de cutis laxa. Foi utilizado o Human Genome U133 Plus 2.0 array (Affymetrix¿), e analisados por meio dos pacotes Affy e RankProd do BioConductor. O perfil transcricional apresentado por pele fresca pela análise de microarranjos nos indivíduos com CLAR tipo II detectou 542 genes diferencialmente expressos em comparação com controles saudáveis pareados por sexo, idade e topografia anatômica. A análise de enriquecimento das categorias de ontologia gênica, utilizando o programa DAVID, incluiu a diferenciação e desenvolvimento epidérmico, ectodérmico e de queratinócitos. As vias de sinalização mais ativadas analisadas por software Ingenuity foram relacionadas a doenças e condições dermatológicas, além de "câncer, desenvolvimento e função do tecido conjuntivo, esquelético e muscular", bem como o metabolismo lipídico. Este é o primeiro estudo utilizando investigação de microarranjos na doença CLAR tipo II. Os resultados incluíram duas novas alterações genéticas (p.Q10X e p.A241V), além de fornecer uma visão completa das vias celulares diferencialmente expressas em tal condição. Desta forma, estes resultados contribuem para uma melhor compreensão da CLAR tipo II quanto aos mecanismos moleculares e nosologia / Abstract: Autosomal recessive cutis laxa, type 2 (ARCL2), is a rare disorder of connective tissue in which the skin sags excessively, giving to the individual an aged aspect. It has been suggested that ARCL2 is the same entity described under the denominations of wrinkly skin syndrome and gerodermia osteodysplastica. Such confusion is caused, in part, due to limited knowledge of its molecular basis. In the present study three unrelated families with ARCL2 were analyzed for mutations in ATP6V0A2, SCYL1BP1, and PYCR1. No causative mutations were identified in ATP6V0A2 and SCYL1BP1. However, screening for mutations in PYCR1 revealed two new variant (p.Q10X and p.A241V) by direct DNA sequencing, with predicted pathogenic effect on bioinformatic analysis. In complementation, in order to shed some light into the molecular mechanisms underlying this type of cutis laxa, gene expression profile in skin tissue and fibroblast were studied in two patients with ARCL2 using microarray investigation. This study was performed using the Human Genome U133 Plus 2.0 array (Affymetrix¿), and analyzed using Affy and RankProd packages from Bioconductor. Transcriptional profiling in skin tissue by microarray analysis from ARCL2 patients detected 542 differentially expressed genes compared to healthy controls matched by gender, age, and anatomic region. The top enriched gene ontology categories analyzed by DAVID included the differentiation and development of keratinocytes, epidermis and ectoderm. Among the most activated signaling pathways analyzed by Ingenuity software were related diseases and dermatological conditions and "cancer, connective tissue development and function, skeletal and muscular systems" as well as lipid metabolism. This is the first study using microarray investigation in the ARCL2 disease. Our results include two new genetic alterations (p.Q10X and p.A241V) and also provide a complete view of cellular pathways differentially expressed in such condition. The present study contributed to a better understanding of ARCL2 molecular mechanisms and nosology of this group / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Molekulargenetische Feinanalyse der Cutis laxa assoziierten Kandidatengene ELN und FBLN5 bei der Divertikelerkrankung. Bei Unterformen der Cutis laxa, einer genetisch heterogenen Gruppe von Bindegewebserkrankungen, fanden sich Mutationen des Elastin-Gens und des Fibulin-5-Gens ursächlich für die Erkrankung. Bei diesen Unterformen kommt es gehäuft zum Auftreten einer Divertikelerkrankung. Es wurden Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) in diesen Genen genotypisiert und auf eine Risikoassoziation mit der Divertikelerkrankung getestet. Mit Hilfe von statistischen Analysen wurde die Genotyp- und Allelfrequenz zwischen Personen, die an Divertikulose oder Divertikulitis erkrankt sind, mit denen gesunder Personen aus der Kontrollgruppe verglichen. Falls eine genetische Variante die kausale Ursache der Divertikulose oder Divertikulitis sein sollte oder mit einer kausalen Variante im Kopplungsungleichgewicht stehen sollte, dann wäre ein signifikanter Unterschied der Genotyp- bzw. Allelfrequenzen zwischen Patienten mit Divertikulose und Personen ohne Divertikel zu erwarten. In die Fallgruppe konnten insgesamt 2.871 Patienten mit Divertikelerkrankung eingeschlossen werden. Die Kontrollgruppe umfasste 1.167 Personen. Untersucht wurden 77 SNPs des ELN-Gens und 123 SNPs der stromabwärts angrenzenden Region inklusive des Nachbargens LIMK1. Zwölf dieser SNPs erreichten jeweils die Signifikanzschwelle (p-Wert < 0,05). Die Signifikanz der Ergebnisse konnte auch in der Bonferroni-Korrektur für multiples Testen bestätigt werden. Somit ergab die Untersuchung der SNPs für das ELN- und LIMK1-Gen eine Assoziation zum Auftreten einer Divertikulose. Allerdings war eine genaue Diskriminierung zwischen dem Kandidatengen ELN und dessen Nachbargen LIMK1 nicht möglich, da das Assoziationssignal beide Gene überspannte. Die Ergebnisse der gewebespezifischen Genexpressionsanalyse legen nahe, dass der SNP rs34208922 im 3´UTR Bereich des ELN-Genes signifikant mit alternativem Spleißen (sQTL) des Genes ELN assoziiert ist. Es wurden 315 repräsentative SNPs des FBLN5-Gens untersucht. Es konnte kein Zusammenhang zwischen der Divertikelerkrankung und den genetischen Varianten im FBLN5-Gen nachgewiesen werden.:Abkürzungsverzeichnis 4 Abbildungsverzeichnis 8 Tabellenverzeichnis 9 1. Einleitung 10 1.1 Definitionen der Divertikelerkrankung 10 1.2 Divertikulose des Kolons 12 1.2.1 Epidemiologie 12 1.2.2 Anatomische Voraussetzungen 13 1.2.3 Lokalisation 15 1.2.4 Klinik 15 1.2.5 Diagnostik 17 1.2.6 Therapie 17 1.3 Divertikulitis 17 1.3.1 Klinik 19 1.3.2 Diagnostik 20 1.3.3 Therapie 21 1.4 Ätiologie und Risikofaktoren der Divertikulose 23 1.4.1 Beeinflussbare Risikofaktoren 23 1.4.2 Nicht-beeinflussbare Risikofaktoren 27 1.5 Möglicher Einfluss genetischer Risikofaktoren auf die Divertikelerkrankung 31 1.5.1 Familiäre Risikofaktoren 32 1.5.2 Assoziation der Divertikulose mit genetischen Erkrankungen 34 1.5.3 Mögliche Kandidatengene für die Divertikulose 39 1.5.4 Bereits bekannte Risikogene für die Divertikulose 39 1.5.5 Die Gene ELN und FBLN5 40 1.5.6 Komplexe genetische Erkrankungen 42 1.5.7 Hypothesengesteuerte Studien - Kandidatengenstudien 44 1.5.8 Einzelnukleotid-Polymorphismus 45 2. Zielsetzung 47 3. Material und Methoden 48 3.1 Patientenrekrutierung 48 3.1.1 Überregionale Patientenrekrutierung 50 3.1.2 Rekrutierungsplattform PopGen 50 3.1.3 Ein und Ausschlusskriterien für das Patientenkollektiv 51 3.2 Datenschutz und Ethik 53 3.3 Genotypisierung 54 3.3.1 Labortechnische Methoden - DNA-Extraktion 54 3.3.2 Labortechnische Methoden - Genotypisierungsverfahren 55 3.3.3 Imputation der Daten 56 3.4 Kandidatengenansatz 57 3.5 Genetische Assoziationsstudien 58 3.6 Metaanalysen 59 3.7 Kopplungsungleichgewicht 59 3.8 Odds-Ratio 60 3.9 Chi-Quadrat-Test 61 3.10 Power-Schätzung 62 3.11 Bonferroni-Korrektur 62 4. Ergebnisse 64 4.1 Demographie des Patientenkollektivs 64 4.2 Ergebnisse der Analyse der ELN-Genregion 69 4.2.1 Genetische Varianten des ELN-Gens und ihre Assoziation zur Transkriptionsrate und zum alternativen Spleißen 73 4.3 Ergebnisse der Analyse des FBLN5-Gens 75 5. Diskussion 79 5.1 Gegenwärtiger Kenntnisstand zu identifizierten Risikoloci der Divertikelerkrankung 79 5.2 Ergebnisse für die Analysen der Kandidatengene ELN und FBLN5 80 5.2.1 Quantitative Trait Locus 85 5.3 Limitationen der Untersuchung 87 5.4 Ausblick und medizinethische Schlussfolgerungen 89 6. Zusammenfassung 92 6.1 Hintergrund 92 6.2 Zielsetzung 92 6.3 Material und Methoden 93 6.4 Ergebnisse 93 6.5 Diskussion 94 7. English summary 96 7.1 Background 96 7.2 Objective 96 7.3 Material and methods 97 7.4 Results 97 7.5 Discussion 98 8. Literaturverzeichnis 99 9. Anlagen 121 9.1 Anlage 1: Fragebogen der Fallgruppe 122 9.2 Anlage 2: Einverständniserklärung und Merkblatt 133 9.3 Anlage 3: Fragebogen der Kontrollgruppe 135 9.4 Anlage 4: Ergebnisse der Assoziationsanalyse des Gens ELN 143 9.5 Anlage 5: Ergebnisse der Assoziationsanalyse des Gens FBLN5 148 9.6 Anlage 6: Bekannte Risikoloci für die Divertikelerkrankung 156 Danksagung Erklärung zur Eröffnung des Promotionsverfahrens Erklärung zur Einhaltung rechtlicher Vorschriften Verzeichnis der wissenschaftlichen Veröffentlichungen

Eine Defizienz des LTBP4-Gens ruft schwerwiegende Erkrankungen wie das human autosomal-rezessive Cutis laxa Syndrom Typ 1C (ARCL1C) hervor. Die Interaktion zwischen LTBP4 und TGF-β ist hierbei von pathogenetisch relevanter Bedeutung. Durch fehlende Synthese bzw. Sekretion des TGF β (bedingt durch die LTBP4-Defizienz) kann es zu einer verminderten TGF-β-Aktivität im Lungenparenchym kommen, woraus insgesamt eine fehlerhafte Produktion elastischer Fasern resultiert. Phänotypisch zeigen Patienten Multimorbidität und besonders schwere Defekte in der Lungenentwicklung. Emphyseme infolge fehlerhafter Alveolarisierung und Septierung führen zu früher Mortalität der Patienten innerhalb der ersten Wochen bis Monate. Als Tiermodell wurde die Ltbp4-/- Mauslinie generiert, die nahezu den gleichen Phänotyp aufweist, den auch Patienten mit ARCL1C zeigen. Ziel der Untersuchungen war es, den Einfluss der Pneumozyten Typ I und II auf die gestörte Alveolarisierung, Septierung sowie Angiogenese der Lunge von Ltbp4-/- Mäusen im Vergleich zu WT Mäusen zu überprüfen. Zusätzlich sollte erforscht werden, ob das Sekretom von murinen Ltbp4-/- Lungenfibroblasten (MLF) in vitro die Homöostase der Pneumozyten im Vergleich zu WT MLF hemmt bzw. deren Expression und Sekretion pro- und anti-angiogenetischer Faktoren beeinflusst. In dieser Studie konnte nachgewiesen werden, dass die Defizienz des Ltbp4-Gens postnatal zu schwerwiegenden Lungenmissbildungen und gestörter Alveologenese der Maus führt, wobei sowohl die Pneumozyten Typ I als auch die Pneumozyten Typ II nachweislich in reduzierter Anzahl in Ltbp4-/- Mäusen vorhanden waren. Weiter wurde bestätigt, dass die Pneumozyten Typ II verantwortlich für eine erhöhte Tgf-β-Aktivität sind und somit präfibrotische Prozesse im Lungenparenchym von Ltbp4-/- Mäusen begünstigt werden. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die Defizienz des Ltbp4 Gens erheblichen Einfluss auf das Sekretom der MLF hat. Da das humane ARCL1C Syndrom ebenfalls ein dysfunktionales LTBP4-Gen aufweist, konnten durch dieses Projekt weitere Erkenntnisse der Pathogenese einer fehlerhaften Alveolarisierung in der Lungenentwicklung gewonnen werden. Von großer Bedeutung ist auch, dass dieses Mausmodell den Phänotyp pädiatrischer Lungenerkrankungen aufweist, sodass diese Erkenntnisse zum Verständnis der Pathogenese der prä- und neonatalen Entwicklung pädiatrischer Lungenerkankungen beitragen.:Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 2. Literaturübersicht 3 2.1 Die Lunge 3 2.2 Morphologie der Lunge 4 2.3 Alveolarepithel 4 2.4 Die Blut-Gas-Schranke 6 2.5 Embryologie der Lunge 6 2.6 Anatomie der Lunge von Maus und Mensch im Vergleich 9 2.7 LTBP – latent TGF-β bindende Proteine 10 2.8 Isoformen des LTBPs 13 2.9 Ltbp4 in der Lunge 15 2.10 Angiogenese 15 2.11 Autosomal-rezessives Cutis laxa Syndrom Typ 1C 17 3. Tiere, Material und Methoden 19 3.1 Tiere 19 3.2 Material 20 3.2.1 Geräte 20 3.2.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien 22 3.2.3 Kits und Assays 25 3.2.4 Puffer und Lösungen 26 3.2.5 Gele 28 3.2.6 Antikörper 28 3.2.7 Primer 29 3.3 Zelllinien 30 3.4 Methoden 31 3.5 Organentnahme der Versuchstiere 31 3.6 Histologie 33 3.7 Zellkultur 34 3.7.1 Isolierung primärer muriner Lungenfibroblasten 35 3.7.2 MLE 12-Zellkultivierung 36 3.7.3 Tube Formation Assay 36 3.7.4 TGF-β Minc Lung Assay 37 3.7.5 Proliferations Assay 39 3.7.6 Viabilitäts Assay 40 3.7.7 Caspase-3 Assay 40 3.7.8 Fluoreszenz Activating Cell Sorting (FACS) 41 3.8 Molekularbiologische Methoden 44 3.8.1 Genotypisierung 44 3.8.2 Polymerase-Ketten-Reaktion 45 3.8.3 Western Blot 47 3.8.4 RNA-Isolierung mit konditioniertem Medium MLF stimulierter MLE 12-Zellen 50 3.8.5 cDNA-Synthese und Aktin-Kontroll-PCR 51 3.8.6 Real time quantitative PCR 53 3.9 Statistische Auswertung 55 4. Ergebnisse 56 4.1 Lungen von Ltbp4-/- Mäusen weisen eine reduzierte Anzahl von Pneumozyten Typ II auf 56 4.2 Lungen von Ltbp4-/- Mäusen weisen eine reduzierte Anzahl von Pneumozyten Typ I auf 59 4.3 Aktivierung von Tgf-β nach Stimulation mit konditioniertem Medium von Ltbp4-/- MLF in MLE 12-Zellen 61 4.4 Konditioniertes Medium von Ltbp4-/- MLF vermindert die Proliferation von MLE 12-Zellen und erhöht die Viabilität 63 4.5 Die Apoptoserate (Casp3/7) der MLE 12-Zellen nach Stimulation mit konditio-niertem Medium von Ltbp4-/- MLF wird nicht beeinflusst 64 4.6 mRNA Expression von Sp-C und Sp-B in MLE 12-Zellen nach Stimulation mit konditioniertem Medium von Ltbp4-/- MLF 64 4.7 MLE 12-Zellen weisen eine erhöhte mRNA Expression von Ltbp1 und eine unveränderte mRNA Expression von Ltbp4 nach Stimulation mit konditioniertem Medium von Ltbp4-/- MLF auf 65 4.8 Die angiogene Stimulation von Endothelzellen und die mRNA Expression angiogener Faktoren von MLE 12-Zellen, die mit konditioniertem Medium von Ltbp4-/- MLF vergleichend zum WT MLF stimuliert wurden, wird stark beeinflusst 66 5. Diskussion 69 6. Zusammenfassung 80 7. Summary 82 8. Literaturverzeichnis 84 9. Anhang 91

There are more than 7000 described rare genetic disorders; however, the molecular basis underlying approximately half of these disorders is unknown, and the majority are currently untreatable. Stature and growth abnormalities are a common clinical feature of many rare disorders including: Floating-Harbor syndrome (FHS), a short stature syndrome characterized by delayed osseous maturation, language deficits, and unique dysmorphic facial features; Weaver syndrome, an overgrowth syndrome characterized by advanced osseous maturation, developmental delay, and macrocephaly; and Sotos syndrome with cutis laxa, an overgrowth syndrome with marked tissue laxity in addition to the typical Sotos characteristics of developmental delay, macrocephaly, and a unique facial gestalt. The genetic basis underlying these three rare stature conditions were unknown at the outset of this study. We utilized high-throughput exome sequencing approaches to investigate the molecular etiology of these rare disorders and identified truncating mutations in the final exon of SRCAP as the genetic cause underlying FHS, missense mutations in EZH2 in Weaver syndrome, and novel mutations in the Sotos syndrome gene NSD1 in Sotos syndrome with cutis laxa. Next, we investigated the spectrum of SRCAP mutations in FHS and established the clustering of truncating SRCAP mutations in the final exon as being highly suggestive of a non-haploinsufficiency mutational mechanism in FHS. Finally, global methylation array analysis identified a unique methylation ‘epi-signature’ in FHS individuals, providing further insight into FHS disease mechanism and a diagnostic signature. These studies have delineated the molecular etiology of these three rare stature/growth disorders, furthered our understanding of the associated clinical spectrum, and provided biological insight into disease pathogenesis.