Le cytosquelette représente un élément crucial dans les processus cellulaires essentiels des cellules lymphoïdes. Les différents filaments du cytosquelette et leurs modes de régulation représentent donc des cibles thérapeutiques majeures pour le développement de nouveaux composés pharmacologiques. Au cours de ce travail de thèse, nous avons mis au point une nouvelle méthode d’analyse par cytométrie en flux (CytoFRET) permettant de visualiser simultanément la dynamique de polymérisation des filaments d’actine, des microtubules et des filaments intermédiaires de vimentine dans la lignée leucémique T Jurkat. Cette méthode a été utilisée pour le criblage d’une mini-chimiothèque composée d’inhibiteurs d’enzymes impliquées dans les modifications post-traductionnelles des protéines. Nous avons ainsi identifié deux composés, le WP1130 et le b-AP15, des inhibiteurs d’enzymes de déubiquitination (DUBs), comme puissants inducteurs de la polymérisation/nucléation de l’actine. Nous avons montré que l’effet de ces inhibiteurs sur les microfilaments d’actine est consécutif à une poly-ubiquitination de la Destrine, une protéine de liaison à l’actine. Nous avons également identifié des inhibiteurs des déacétylases HDAC6 et SIRT2 comme inducteurs de la polymérisation des microtubules et de l’assemblage de la vimentine. L’effet de ces inhibiteurs a été corrélé à une acétylation directe de la tubuline mais pas de la vimentine. Ces résultats ouvrent ainsi de nouvelles perspectives à la fois fondamentale et thérapeutique sur la physiopathologie du cytosquelette des cellules lymphoïdes. / Actin, microtubules, and intermediate filaments compose three major cytoskeletal structures of vertebrate cells that are characterized by highly dynamic balances between assembly and de-assembly, underlying critical cellular processes such as mitosis, architecture and movement. Consequently, cytoskeleton dysfunctions have been implicated in several pathological situations including cell transformation and metastasis. Thus, cytoskeletal networks represent major targets for the development of novel anti-cancer and anti-metastatic therapies. However, drug development is currently limited by the availability of high-throughput screening systems allowing the simultaneous monitoring of actin, microtubules and intermediate filaments dynamics in living cells. In this work, we have developed a novel screening assay of cytoskeleton dynamics based on the simultaneous recording by flow cytometry of FRET signals produced by the variation of actin, tubulin and vimentin filaments dynamics in living cells. Our novel method was employed to screen a mini-library of drugs known for their ability to interfere with post-translationnal modifications of proteins. Interestingly, our approach revealed that compounds interfering with lysine acetylation have a dramatic impact on vimentin filaments assembly and microtubules polymerization. In addition, two inhibitors (WP1130 and b-AP15) of deubiquitinating enzymes showed increase of actin polymerization. This effect was attributed to poly-ubiquitnation of Destrin, an actin binding protein. In conclusion, our FRET multiplex flow cytometry assay represents a novel effective method for the future development of new anti-cancer therapies.

La majorité des modèles d’uvéites expérimentales sont médiées par les sous-types lymphocytaires CD4+ T-Helper 1 (Th1) et Th17. Le but de cette thèse est d’étudier les mécanismes immunitaires mis en jeu lors d’une uvéite idiopathique (sans étiologie) chez l’humain. La première partie de cette étude est donc consacrée à l’étude du profil biologique de 30 cytokines/chimiokines/ facteurs de croissance intraoculaires (AqH) et sériques obtenues au laboratoire (technologie Luminex®). Ces médiateurs sont dosés dans le sérum et l’AqH de patients atteints d’uvéites intermédiaires et postérieures activesidiopathiques. Ces résultats sont comparés à une cohorte de patients non inflammatoires et à des groupes de patients atteints d’uvéites de diverses étiologies. Nous avons trouvé que le profil des médiateurs diffère nettement en fonction de la cause de l’inflammation intraoculaire. Une réponse pro-inflammatoire large est observée avec des concentrations accrues des cytokines de type Th1 (IFNγ, IL-12), Th17 (IL-17), TNF-α, IL-6, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, G-CSF et IP-10 dans les uvéites idiopathiques. Les concentrations sériques différent de celles des contrôles par les taux d’IL-17 et IP-10 augmentés. La deuxième partie concerne l’étude des mécanismes immunitaires des uvéites par l’analyse des vascularites en imagerie adaptative (FIOA) et particulièrement l’observation anatomique des modifications liées aux inflammations oculaires. Nous ne trouvons pas de corrélation entre l’aspect de cellularité périvasculaire en FIOA et les cytokines retrouvées dans l’AqH des yeux avec uvéite. Pouvoir déterminer quels médiateurs de l’inflammation interviennent dans les pathologies inflammatoires permettrait de les cibler avec des thérapies adaptées. / Most of experimental models of uveitis are mediated by lymphocytic subtypes CD4+ T-Helper 1 (Th1) et Th17. The aim of this thesis is to study the immune mechanisms in idiopathic uveitis (i.e. unknown etiology) in humans. First, we will determine the biological spectrum of 30 cytokines/ chemokines/ growth factors in aqueous humour and sera by Luminex® technology. Those mediators will be measured in the serum and aqueous humour of patients with active intermediate and posterior uveitis classified as idiopathic. Those results will be compared to a cohort of patients with no inflammation and to patients with uveitis of various causes. We found that the profile of mediators changes regarding to the cause of the intraocular inflammation. The proinflammatory process is related to increased levels of cytokines Th1 (IFNγ, IL-12), Th17 (IL-17), TNF-α, IL-6, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, G-CSF and IP-10 idiopathic uveitis. The sera of the patients with idiopathic uveitis have increased levels IL-17 and IP-10. Secondly, the immune mechanisms of uveitis were studied by adaptive optics imaging (FIOA) and particularly the observation of anatomic changes related to ocular inflammations. We ruled out any correlation betweeen the perivascular cellular opacification in FIOA and the cytokines/ chemokines found in the eyes with uveitis. An understanding of the profile of mediators in inflammation and their determination could help to target idiopathic uveitis with correct therapies.

Le lupus érythémateux disséminé (LED) est une maladie auto-immune systémique dont le diagnostic est très complexe. Le clinicien doit baser son diagnostic sur une liste de 11 critères reliés à des observations cliniques et à des mesures sérologiques. Afin de faciliter ce diagnostic, plusieurs groupes recherchent de nouveaux marqueurs biologiques quantifiables. C'est dans ce but que la cytométrie en flux a été utilisée afin de comparer les cellules du sang des patients et celles de sujets sains. La caractérisation exhaustive des sous-populations cellulaires montre que l'expression de HLA-DR est amplifiée chez les patients même si la maladie est inactive. De plus, l'analyse du contenu sérique en cytokines inflammatoires a montré que la quantité de GM-CSF était plus importante chez les patients LED. Nos travaux suggèrent que HLA-DR et GM-CSF pourraient être considérés comme des candidats intéressants dans les études sur le diagnostic du LED.

La microcirculation est rapidement altérée dans le sepsis et la persistance de ces altérations est associée à un mauvais pronostic. La microcirculation est composée de vaisseaux invisibles à l’œil (< 100 µm), de l’endothélium, du glycocalyx, des cellules musculaires lisses et des éléments sanguins dont les GR. <p>De nombreuses études animales et humaines ont rapporté des altérations rhéologiques des GR dans le sepsis. Ces modifications comprennent une diminution de la déformabilité, une augmentation de l’agrégation et de l’adhérence globulaire. <p>De plus, l’altération de la déformabilité peut induire des altérations du flux microcirculatoire dans des modèles expérimentaux animaux. Ces mêmes altérations rhéologiques sont rapportées dans le diabète. Dans cette pathologie, les GR présentent une diminution du contenu membranaire en AS, comme dans les processus de sénescence. <p>La déformabilité des GR dépend des caractéristiques cellulaires incluant surtout les propriétés de la membrane, la géométrie cellulaire et dans une moindre mesure la viscosité cellulaire. Malgré la connaissance des altérations de la rhéologie dans le sepsis, peu de travaux, au contraire du diabète, s’interessent aux modifications de la membrane.<p>Nous avons étudié, par analogie aux altérations globulaires rapportées dans le diabète, la membrane des GR de patients admis en soins intensifs pour un sepsis, et comparé à des GR de patients non septiques et de volontaires sains. Le contenu membranaire en AS était significativement diminué chez les patients septiques par rapport aux patients non-septiques et aux volontaires sains. De plus, les GR des patients septiques, analysés par une technique de cytométrie en flux indépendante de la température de l’échantillon, étaient rapidement plus sphériques (dans les 24 heures du sepsis) et incapables de modifier leurs formes en hypoosmolalité. Cette technique de cytométrie a par ailleurs aussi été utilisée pour l’analyse de GR de patients diabétiques et en insuffisance rénale terminale. <p> La diminution du contenu en AS est aussi rapidement observée sur la transferrine, suggérant une augmentation de la concentration et/ou de l’activité de la neuraminidase, enzyme clivant l’AS. Dans un modèle de choc septique induit chez l’ovin, nous avons confirmé la rapidité de ce phénomène. En effet, la concentration en AS libre augmente dès la 15ième heure après induction du sepsis.<p>In-vitro, nous avons pu reproduire les modifications de forme des GR observés chez les patients septiques par incubation de GR de volontaire avec de la neuraminidase, et ce en 10 heures, quelles que soient les concentrations utilisées. Ces modifications de forme et de membrane s’accompagnent d’une augmentation significative du contenu en lactate, suggérant une stimulation de la glycolyse érythrocytaire et en 2,3-DPG, facilitant la libération de l’O2 de l’Hb vers les tissus. <p>Toutes ces modifications touchant la membrane des GR des patients de soins intensifs, surtout septiques, peuvent être responsables des altérations de rhéologie que nous avons observé grâce au LORCA sur une large population admis aux soins intensifs.<p>Une meilleure compréhension des mécanismes conduisant aux altérations rhéologiques des GR dans le sepsis, et ses effets potentiellement déletères sur la microcirculation, sont nécessaires avant d’envisager les GR comme cible thérapeutique.<p><p><p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La sclérose latérale amyothrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative charactérisée par la perte des neurones moteurs menant à la paralysie et à la mort. Environ 20% des cas familiaux de la SLA sont causés par des mutations de la superoxyde dismutase 1 (SOD1), conduisant vers un mauvais repliement de la protéine SOD1, ce qui a comme conséquence un gain de fonction toxique. Plusieurs anticorps spécifiques pour la forme mal repliée de la protéine ont été générés et utilisés comme agent thérapeutique dans des modèles précliniques. Comment le mauvais repliement de SOD1 provoque la perte sélective des neurones moteurs demeure non résolu. La morphologie, le bilan énergétique et le transport mitochondrial sont tous documentés dans les modèles de la SLA basés sur SOD1, la détérioration des mitochondries joue un rôle clé dans la dégénération des neurones moteurs. De plus, la protéine SOD1 mal repliée s’associe sélectivement sur la surface des mitochondries de la moelle épinière chez les modèles de rongeurs de la SLA. Notre hypothèse est que l’accumulation de la protéine SOD1 mal repliée sur les mitochondries pourrait nuire aux fonctions mitochondriales. À cette fin, nous avons développé un nouvel essai par cytométrie de flux afin d’isoler les mitochondries immunomarquées avec des anticorps spécifiques à la forme malrepliée de SOD1 tout en évaluant des aspects de la fonction mitochondriale. Cette méthode permettra de comparer les mitochondries portant la protéine SOD1 mal repliée à celles qui ne la portent pas. Nous avons utilisé un anticorps à conformation spécifique de SOD1, B8H10, pour démontrer que la protéine mal repliée SOD1 s’associe avec les mitochondries de la moelle épinière des rat SOD1G93A d’une manière dépendante du temps. Les mitochondries avec la protéine mal repliée SOD1 B8H10 associée à leur surface (B8H10+) ont un volume et une production excessive de superoxyde significativement plus grand, mais possèdent un potentiel transmembranaire comparable aux mitochondries B8H10-. En outre, la présence de la protéine mal repliée SOD1 reconnue par B8H10 coïncide avec des niveaux plus élevés de la forme pro-apoptotique de Bcl-2. L’immunofluorescence de sections de moelle épinière du niveau lombaire avec l’anticorps spécifique à la conformation B8H10 et AMF7-63, un autre anticorps conformationnel spécifique de SOD1, démontre des motifs de localisations distincts. B8H10 a été trouvé principalement dans les neurones moteurs et dans plusieurs points lacrymaux dans tout le neuropile. Inversement, AMF7-63 a marqué les neurones moteurs ainsi qu’un réseau fibrillaire distinctif concentré dans la corne antérieure. Au niveau subcellulaire, SOD1 possèdant la conformation reconnu par AMF7-63 est aussi localisée sur la surface des mitochondries de la moelle épinière d’une manière dépendante du temps. Les mitochondries AMF7-63+ ont une augmentation du volume comparé aux mitochondries B8H10+ et à la sous-population non marquée. Cependant, elles produisent une quantité similaire de superoxyde. Ensemble, ces données suggèrent qu’il y a plusieurs types de protéines SOD1 mal repliées qui convergent vers les mitochondries et causent des dommages. De plus, différentes conformations de SOD1 apportent une toxicité variable vers les mitochondries. Les protéines SOD1 mal repliées réagissant à B8H10 et AMF7-63 sont présentes en agrégats dans les fractions mitochondriales, nous ne pouvons donc pas prendre en compte leurs différents effets sur le volume mitochondrial. Les anticorps conformationnels sont des outils précieux pour identifier et caractériser le continuum du mauvais repliement de SOD1 en ce qui concerne les caractéristiques biochimiques et la toxicité. Les informations présentes dans cette thèse seront utilisées pour déterminer le potentiel thérapeutique de ces anticorps. / Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder characterized by the loss of motor neurons resulting in paralysis and death. Approximately 20% of familial ALS cases are caused by mutations in superoxide dismutase (SOD1), which leads to misfolding of the SOD1 protein, resulting in a toxic gain of function. Several antibodies have been generated that are specific for the misfolded form of the protein, and have been used as therapeutics in pre-clinical models. How misfolded SOD1 provokes a selective loss of motor neurons remains unresolved. Mitochondrial morphology, bioenergetics and transport are all documented is SOD1-mediated ALS models, thus mitochondrial impairment plays a key role in motor neuron degeneration. Moreover, misfolded SOD1 selectively associates with the surface of spinal cord mitochondria in ALS rodent models. We hypothesize that the accumulation of misfolded SOD1 on mitochondria could impair mitochondrial function. To this end, we developed a novel flow cytometric assay to immunolabel isolated mitochondria with misfolded SOD1 antibodies while also evaluating aspects of mitochondrial function. This method will allow for a comparison of mitochondria bearing misfolded SOD1 to those without. We utilized the B8H10 conformation specific SOD1 antibody to demonstrate that misfolded SOD1 associates with SOD1G93A rat spinal cord mitochondria in a in a time dependent manner. Mitochondria with B8H10-reactive misfolded SOD1 associated with their surface (B8H10+) have a significantly larger volume and produce excessive amounts of superoxide, but have a similar transmembrane potential compared to B8H10- mitochondria. In addition, the presence of B8H10-reactive misfolded SOD1 coincides with higher levels of the pro-apoptotic form of Bcl-2. Staining of lumbar spinal cord sections with both B8H10 and another conformation specific SOD1 antibody, AMF7-63, yielded distinct localization patterns. B8H10 was found predominantly in motor neurons and numerous puncta throughout the neuropil. Conversely, AMF7-63 marked motor neurons as well as a distinctive fibrillar network that was concentrated in the anterior horn. At the subcellular level, AMF7-63-reactive misfolded SOD1 also localized to the mitochondrial surface of spinal cord mitochondria in a time-dependent manner. AMF7-63+ mitochondria have an increased volume compared to B8H10+ mitochondria and the unlabelled subpopulation. However, they produce similar amounts of superoxide. Together, these data suggest that there are multiple species of misfolded SOD1 that converge at the mitochondria to cause damage. Moreover, different SOD1 conformations may ellicit varying toxicities towards mitochondria. Both B8H10 and AMF7-63-reactive misfolded SOD1 are present in aggregates in mitochondrial fractions and can therefore not account for any different effects produced in terms of mitochondrial volume. Conformational antibodies are invaluable tools to identify and characterize the continuum of misfolded SOD1 species with regards to biochemical characteristics and toxicity. The information presented in this thesis will be used in determining the future therapeutic potential of these antibodies.

Trois inquiétudes, actuellement, dans le monde de la microbiologie médicale : la fréquence des infections nosocomiales, d'origine bactérienne dans plus de 60% des cas, la multiplication et la dissémination des résistances bactériennes, mais aussi la pénurie annoncée en molécules antibiotiques et antiseptiques. Il est indispensable de trouver de nouvelles molécules antibactériennes, avec un mécanisme d'action innovant. Nous présentons dans cette étude, l'évaluation d'une molécule innovante, calixarène purement synthétique, le para-guanidinoéthylcalix[4]arène (Cx1). Dans une 1ère partie de ce travail, nous avons montré que cette molécule se caractérise par : (i) une activité antibactérienne à large spectre, conservée sur des isolats cliniques tels que les SARM, les ERG ou les EBLSE ; (ii) une activité rapidement bactéricide, concentration-dépendante ; et (iii) une absence de cytotoxicité in vitro. Des interactions de type synergie sont obtenues avec de nombreux antibiotiques (ß-lactamines, fluoroquinolones, rifampicine, acide fusidique, tigécycline…) ; aucun antagonisme n'a été observé. Dans une 2ème partie, nous avons souligné l'absence de sélection de mutants résistants in vitro, après 30 passages, pour S. aureus et P. aeruginosa. Pour E. coli, des mutants résistants stables sont sélectionnés au delà de 15 ou 20 passages, avec un effet inoculum. Enfin, dans une 3ème partie, nous avons recherché la ou les cible(s) du Cx1 par diverses techniques, innovantes (microélectrophorèse, microscopie à force atomique) ou plus classiques (cytométrie en flux, liaison au LPS/LTA). L'ensemble des données recueillies converge vers l'existence d'une cible ou plusieurs cibles pariétales (liaison au LPS et au LTA, à d'autres structures ?). L'activité du Cx1 résulte en une modification des propriétés pariétales (densité de charge de surface, souplesse hydrodynamique, perméabilité membranaire) et en une augmentation de la rigidité bactérienne (pression osmotique). En conclusion, le Cx1 possède un potentiel intéressant en terme de nouvel antibactérien, mais de nombreuses inconnues demeurent encore concernant son mécanisme d'action. Cela laisse ouverte la porte à de nombreuses voies de recherche afin de mieux appréhender les cibles de cette molécule, et d'en optimiser les propriétés. / The progressive reduction of the therapeutic effectiveness of the available antibiotics and antiseptics as a result of the spread of antimicrobial resistance underlines the urgency of the development of new classes of drugs for the treatment of infectious diseases. The major challenge is to find drugs that act against multiple multidrug-resistant strains, with a real new mechanism of action. The work presented here is an evaluation of the potential of the para-guanidinoethylcalix[4]arene (Cx1), as a new innovative antibacterial. In the first part of this work, we have demonstrated that Cx1 possess: (i) a broad-spectrum with an activity conserved against multidrug-resistant isolates such as MRSA, VRE or ESBL-producing Enterobacteriaceae; (ii) a rapid bactericidal and concentration-dependant activity; and (iii) an absence of cytotoxicity in vitro. Checkerboard studies have underlined a large number of synergies with numerous antibiotics (ß-lactamins, fluoroquinolones, rifampicin, fusidic acid, tigecycline…) ; no antagonism have been observed. In the second part, we have showed that Cx1 was not able to select resistant mutants with S. aureus and P. aeruginosa. For E. coli, we have observed resistant mutants beyond 15 or 20 passages, with inoculums effect. In the last part of this work, we have used various techniques in order to elucidate mechanism of action of Cx1: innovative techniques (microelectrophoresis, atomic force microscopy),and other more classical (flow cytometry, LPS/LTA sequestration). All data obtained conduct us to confirm our first hypothesis: Cx1 possess one or many targets on bacterial cell wall, and its activity was translated by wall changes (surface charge density, hydrodynamic properties, membrane permeability), and increase of bacterial rigidity (increase of turgor pressure). In conclusion, Cx1 appears as a good candidate as new antibacterial or adjuvant in anti-infectious therapy, but its real mechanism of action remains unknown. Numerous research ways remain to be investigated in order to better understand of targets of Cx1, and to optimize its antibacterial properties.

L'administration systémique de gènes représente une voie intéressante pour le traitement par thérapie génique de la mucoviscidose ou des cancers pulmonaires. Dans cette optique, les polyplexes (complexes ADN/polymère cationique) doivent atteindre le poumon et traverser les vaisseaux sanguins pour transfecter les cellules épithéliales mutées ou les cellules cancéreuses. Il existe peu de données sur le passage transendothélial de polyplexes. Afin d'en améliorer les connaissances, nous avons mis au point un modèle d'endothélium microvasculaire pulmonaire et étudié l'influence de la polarisation cellulaire sur les voies d'internalisation de polyplexes formés avec la polylysine histidylée (pLK-His) et la polyéthylènimine (PEI), leur efficacité de transfection, leur capacité à traverser la barrière endothéliale et leur adhésion sur la monocouche de cellules endothéliales en conditions de flux. Les travaux réalisés montrent que la polarisation des cellules endothéliales diminue l'internalisation et l'efficacité de transfection des polyplexes pLK-His mais pas celles des polyplexes PEI. Par contre, la polarisation des cellules épithéliales n'a pas d'influence sur l'efficacité des polyplexes pLK-His. Les polyplexes pLK-His et PEI sont capables de traverser la monocouche de cellules endothéliales et transfecter des cellules épithéliales à la fois par leur côté apical et basolatéral. L'incubation des cellules endothéliales avec des cytokines pro-inflammatoires permet d'augmenter ce passage. Enfin, l'adhésion des polyplexes sur les cellules endothéliales est plus importante dans les conditions de flux des microvaisseaux que dans les conditions de flux des veines. L'adhésion des polyplexes PEI est légèrement supérieure à celle des polyplexes pLK-His. Des polyplexes formés avec une PEI sur laquelle a été greffée des motifs de tétraglucose spécifiques des cellules endothéliales adhèrent trois fois plus que les polyplexes formés avec la PEI ce qui montre un ciblage des cellules endothéliales pulmonaires en conditions de flux. L'ensemble des résultats montre qu'il est indispensable de mieux considérer les effets des conditions physiologiques des cellules (polarisation, effets du flux sanguin, conditions d'inflammation) sur la transfection pour concevoir de nouveaux vecteurs synthétiques afin d'améliorer leur efficacité in vivo.

Notre génome, véritable mode d'emploi de chaque cellule et organisme, est constamment menacé par de multiples agents endogènes ou exogènes qui endommagent la biomolécule d'ADN. Ces lésions résultantes, de nature diverse, sont notamment impliquées dans les processus de vieillissement cellulaire, de cancérogénèse et de mort cellulaire. Afin de contrer ces effets néfastes, les organismes ont développé différents systèmes de réparation de l'ADN capables de prendre en charge spécifiquement chaque type de dommages. Parmi ces voies métaboliques, la réparation par excision de base (BER) répare chaque jour des dizaines de milliers de dommages, incluant les bases alkylées, oxydées ou désaminées, les sites abasiques ou encore certaines cassures de brin. Dans le présent travail, nous exposons la mise au point d'un nouveau biocapteur pour la détection des activités enzymatiques du BER. L'outil se caractérise par un set de sondes nucléiques autocomplémentaires, fluorescentes ou pro-fluorescentes, immobilisées sur microbilles paramagnétiques. Chaque sonde est modifiée par l'introduction sélective d'une lésion, substrat d'une activité enzymatique ciblée (ADN N-glycosylase, AP-endonucléase). L'activité d'excision/incision de la lésion, conduit à la coupure de la sonde et à la déshybridation de la structure. L'analyse et la quantification du clivage spécifique est réalisée en fluorescence, soit à partir du surnageant par spectrofluorimétrie, soit des billes par cytométrie en flux. Ce dispositif permet la détection multiplexée des activités enzymatiques de protéines purifiées ou au sein d'extraits nucléaires. Egalement, des applications dans le criblage d'inhibiteurs de la réparation de l'ADN sont envisageables dans le cadre de recherches pré-cliniques. L'adaptation de ces tests in vitro à la détection de la réparation de l'ADN in cellulo a fait l'objet de développements préliminaires. / Our genome, which may be considered as the program of each cell and organism, is constantly threatened by multiple endogenous and exogenous agents that damage the DNA biomolecule. These lesions, that show a wide array of structures, are particularly involved in cell aging, carcinogenesis and cell death. To thwart these negative effects, organisms have developed various DNA repair pathways that take in charge the alterations in a specific manner. Among them, the base excision repair (BER) removes every day dozens of thousands of damages, including alkylated, oxidized or deaminated bases, abasic sites or single strand breaks. In this study, we present the development of a new biosensor for the detection of BER enzymatic activities. The tool is characterized by a set of (pro)fluorescent hairpin-shaped DNA probes, immobilized on paramagnetic beads. Each probe is modified by the selective insertion of a lesion, substrate for the targeted repair enzyme (DNA glycosylase, AP-endonuclease). The excision/incision activity of the lesion leads to the cleavage of the probe together with the dehybridization of the structure. The analysis and quantification of the repair process is carried out by direct fluorescence measurements from the supernatant, or by analysis of the functionalized beads by flow cytometry. This device allows the multiplexed enzymatic activities detection of purified proteins or within nuclear extracts. Applications to the screening of DNA repair inhibitors have been successfully initiated. Finally, the adaptation of these in vitro tests to in cellulo detection of DNA repair activities was investigated in preliminary studies.

Bio-pharmaceutical industry is a vast growing market and recent recommendations of the Food and Drug Administration have put a large emphasis on the characterization of biological processes and models. As a consequence, there is a high incentive on developing modern sensors in order to more accurately monitor and control processes. In that way, Digital Holographic Microscopy (DHM) presents unique features thanks to the refocusing and quantitative phase contrast imaging capabilities. In this thesis we investigate the usage of DHM to monitor yeast cultures that are often used in both the bio-pharmaceutical and bread industries and lay the basis of a methodological framework for the study of in-line cell cultures in the context of process control. We begin with a description of Digital Holography and the microscopy setup used in the thesis as well as a detailed explanation of the image processing required to extract the holographic data and its implementation on GPU with some speed execution figures given for three popular programming paradigms. We then describe the flow setup used and infer the limitations on the dynamic range of the technique due to both Poisson statistics and overlapping phenomena. Finally, we describe an algorithm that extracts the cells position, count and morphological information such as the size, aspect ratio, circularity and refraction index. Some experimental results are presented for yeasts before drawing a general overview of the technology and its dependencies. We further end with some conclusions concerning the technology and a brief comparison with existing competitors. / Doctorat en Sciences de l'ingénieur / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'état viable mais non cultivable (VNC) a été étudiée en détail chez les bactéries. En revanche,l'état VNC chez d'autres micro-organismes, y compris en particulier les eucaryotes, a reçubeaucoup moins d'attention.Pour fournir des preuves concluantes de l'existence d'un état VNC chez la levure, en particulierchez S. cerevisiae, la capacité des différentes souches de S. cerevisiae à devenir viable et noncultivable après un stress sulfite avec différentes concentrations de SO2 a été étudiée parcytométrie de flux (CMF) en utilisant une sonde fluorescente comme un marqueur de viabilité(fluorescéine diacétate (FDA)) et par étalement sur milieu de culture. La capacité des cellules àrécupérer leur cultivabilité après l’élimination du stress en augmentant le pH du milieu a étéétudiée. Pour confirmer l’existence de l'état VNC, le temps de génération de cellules VNC aprèsl’élimination du stress a été comparé aux cellules cultivables et viables dans des conditions deculture identiques. En outre, la comparaison des différentes phases du cycle cellulaire descellules sortent de l'état VNC et les cellules en état VNC a été réalisée par CMF. Par ailleurs,l'implication du gène SSU1 codant pour la pompe SO2 dans l'état VBNC a été étudiée.Après l'application du stress, la comparaison entre la population cultivable déterminée sur milieude culture et la population viable évaluée par FCM met en évidence la présence de cellulesviables mais non cultivables. L'augmentation du pH du milieu permet aux cellules de S.cerevisiae viables mais non cultivables à redeviennent cultivables. Le temps de génération, decellules cultivées dans les mêmes conditions que celles rencontrées au moment de la sortie del’état VNC, est comparé au temps de sortie calculé au cours de la reprise de la cultivabilité. Ladifférence entre ces deux paramètres observés affirme que le temps mis par les cellules poursortir de l’état VNC n’était pas caractéristique d’une multiplication cellulaire.Finalement nous avons étudié l'implication du SSU1 dans l'état VNC. Les résultats montrent quele SSU1 n’est pas impliqué dans le maintien de l'état VNC chez S. cerevisiae / The viable but not culturable (VBNC) state has been studied in detail in bacteria. Bycontrast the VBNC state in other microorganisms, including particularly eukaryotes, has receivedmuch less attention. However, it has been suggested that in wine, Brettanomyces yeast cells mayenter a Viable But Not Culturable State, in particular in the presence of high, sulfur dioxide(SO2) concentration.To provide conclusive evidences for the existence of a VBNC state in yeast, especially in S.cerevisiae as a model organism, the capacity of different S cerevisiae strains to become viableand not cultivable after a sulfite stress with various concentrations of SO2 was studied by flowcytometry (FCM) using fluorescent probe as a viability marker (Fluorescein diacetate (FDA))and by plating on culture medium. The ability of cells to recover cultivability after stress removalby increasing the pH medium was investigated. To confirm the VBNC state, the rate ofgeneration of VBNC cells after stress removal was compared to cultivable and viable cells insame culture conditions. In addition, the comparison of different cell cycle phases of cells exitingthe VBNC state and cells in VBNC state was performed by FMC. Moreover, the involvement ofSSU1 gene coding for the SO2 pump in VBNC state was studied.After stress application, comparison between cultivable population determined on culturemedium and viable population assessed by FCM demonstrated the presence of the viable cellswhich became uncultivable after 24 to 48 hours depending on the strains under study. Increasingthe pH medium allows the viable but uncultivable S. cerevisiae cells to become cultivable again.The generation rate of cells exiting VBNC state was not consistent with growth of residualculturable cells, which support a true VBNC state. The absence of cell proliferation, the stabilityof the population during the increase of the cultivability and the decrease in esterase activity forVBNC cells allows us to conclude the presence of the VBNC state in S. cerevisiae in correlationwith the VBNC state definition.In order to determine whether SSU1 gene, encoding a sulfite pump efflux, was involved inVBNC, we compare a wild type S. cerevisiae strain to its nul mutant Δ ssu1. Our resultsdemonstrate that SSU1 gene does not seem to be involved in VBNC phenotype