Parmi les métabolites secondaires extraits d'éponges marines, les produits présentant dans leur structure un fragment alcool propargylique C3-substitué chiral occupent une place particulière. Ils possèdent en effet des activités biologiques très variées, notamment antibiotiques, antivirales, ou plus généralement cytotoxiques. Dans ces composés, le motif alcool propargylique désigné ici sous le terme " alcynylcarbinol " (englobant plus explicitement les versions à centre carbinol substitué chiral), est la caractéristique principale de ces composés pouvant vraisemblablement jouer le rôle d'unité pharmacophore. Aucune étude systématique permettant de déterminer des relations structure-activité dans cette série de molécules n'avait cependant été entreprise jusqu'à récemment. Dans le but d'identifier un fragment pharmacophore minimal et de dégager des relations structure-activité, une variation structurale systématique a donc été envisagée dans le cadre de ce travail à partir du squelette archétypique d'un produit naturel isolé de l'éponge Cribrochalina Vasculum. Le premier chapitre est un résumé bibliographique décrivant la synthèse et l'activité biologique de molécules présentant un fragment alcool propargylique dans leur structure. Le second chapitre décrit une étude de relation structure-activité dans cette famille de composés à partir de la molécule de référence ((E)-icos-4-en-1-in-3-ol). La variation de quatre paramètres a été étudiée : la nature de chacune des deux insaturations, le configuration du centre asymétrique, et le longueur de la chaîne lipidique saturée. Le troisième chapitre porte sur l'étude complète de la synthèse de lipides à deux têtes pharmacophores de symétrie C2 et sur la caractérisation de composition stéréochimique des produits obtenus. Le quatrième chapitre est consacré à la description de la synthèse de produits dans lesquels une unité C2 acétylénique est remplacée par un fragment C4 butadiyne ou C3 allène. Le cinquième chapitre décrit la synthèse de lipides à pharmacophore dialkynylcarbinol portant des fluorophores pour l'imagerie cellulaire et les premiers tests de marquage cellulaire. Dans le sixième chapitre sont combinés les resultats des mesures d'activité cytotoxique des différentes séries de molécules synthétisées. Les composés synthétisés ont été soumis à des mesures de cytotoxicité vis-à-vis de la lignée cellulaire HCT116 et la plupart ont montré des niveaux d'activité biologique remarquables. Le septième et dernier chapitre réunit les méthodes de synthèse et les characterisations de tous les produits obtenus lors de ce travail. / Among naturally occurring secondary metabolites isolated from marine sponges the compounds with chiral propargyl alcohol unite occupy a special place. They have been shown to display the different types of biological activities, for example: antibiotic, antiviral, and more generally cytotoxic. In these compounds, the propargyl alcohol unit hereinafter as the "alkynylcarbinol" (including substituted chiral carbinol center), is the key characteristic that can have a pharmacophore fragment function. Nevertheless, no systematic study to determine structure-activity relationships in this series of molecules had been carried until recently. In order to identify a minimum pharmacophore unit and identify structure-activity relationships, systematic structural variation was therefore considered as part of this work from the archetypal structure of a natural product isolated from the sponge Cribrochalina vasculum. The first chapter is a bibliographic summary describing the synthesis and biological activity of molecules with a propargyl alcohol moiety in their structure. The second chapter describes a study of structure-activity relationship in a series of compounds from the reference molecule ((E) -icos-4-en-1-in-3-ol). The four parameter variation was studied: the nature of each of the two unsaturations, the configuration of the asymmetric center, and the length of the saturated lipid chain. The third chapter focuses on the complete study of the synthesis of lipids in two symmetrical pharmacophore heads C2 and stereochemical composition characteristics of the obtained products. The fourth chapter is devoted to the description of the synthetic products in which an acetylene C2 unit is replaced by a C4 butadiyne fragment or C3 one of allene. The fifth chapter describes the synthesis of pharmacophore dialkynylcarbinol lipids with fluorophore fragment for cell imaging and the first cell imaging tests. In the sixth chapter has combined the results of measurements of cytotoxic activity of different types of synthesized molecules. The obtained compounds were subjected to measurements of cytotoxicity against the cell line HCT116 and most of them have shown remarkable levels of biological activity. The seventh and final chapter brings together the methods of synthesis and characterizations of all products obtained during this work.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les cellules tueuses naturelles (NK pour Natural Killer) sont une population lymphoïde dotées d’une activité cytotoxique contre les cellules infectées ou les cellules cancéreuses. Les cellules NK ont un potentiel thérapeutique considérable en tant que thérapie cellulaire anti-tumorale, particulièrement dans le cadre des leucémies. Ces approches sont basées sur une amélioration de la production de cellules NK à partir de cellules souches hématopoïétiques (quantitative et qualitative en améliorant leur activité lytique), mais aussi sur une manipulation de la sensibilité des cellules leucémiques à la lyse par les cellules NK. L’amélioration de ces approches nécessite une compréhension plus approfondie des différents mécanismes de résistance leucémique et leur relation avec la sensibilité à la lyse. Dans ce contexte, nous avons étudié le rôle de HOXB4 dans la différenciation des cellules NK et leur fonction lytique. Nous avons montré que les cellules CD34+ différenciées en cellules NK en présence de HOXB4 ont un potentiel lytique plus important par rapport aux cellules différenciées en l’absence de HIOXB4. Cette augmentation est associée à une augmentation de la dégranulation des cellules NK en présence de cellules cibles. L’analyse transcriptionnelle globale basé sur un microréseau d'ADN montre une régulation positive de l’expression de granzyme B par HOXB4. Ces résultats démontrent que HOXB4 est un régulateur crucial dans la différenciation et la fonction des cellules NK. Ils soulignent également l’intérêt de son utilisation dans la production de cellules NK fonctionnelles dotées d’un plus grand potentiel lytique pour les stratégies d'immunothérapie anticancéreuse. Nous avons également essayé de comprendre comment l'acquisition de la résistance aux chimiothérapies par les cellules de leucémie aigüe myéloïde (LAM) influence leur reconnaissance et leur sensibilité aux cellules NK. Nous avons montré que l'acquisition de la résistance in vitro des cellules AML à la cytarabine induit une augmentation de leur susceptibilité à la cytotoxicité dépendante des cellules NK. Cette sensibilité accrue est en corrélation avec l’induction d’ULBP (UL-16 binding proteins) 1/2/3, ligands des récepteurs NKG2D, sur les cellules leucémiques résistantes. Cette induction est régulée par un mécanisme impliquant l'induction de c-Myc. Le test d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) a révélé qu’ULBP1 et ULBP3 sont des cibles directes de c-Myc. L’utilisation de cellules AML primaires résistants à la chimiothérapie comme les cellules cibles, combinée à l'inhibition de c-Myc a entraîné une diminution de l'expression des ligands NKG2D et l'altération de la lyse par les cellules NK. Les propriétés d’alloréactivité des cellules NK pourraient être utilisées pour améliorer les résultats de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques allogéniques chez les patients atteints d’AML. Cependant, la résistance croisée (chimiothérapie et NK) des blastes AML reste un problème majeur. Nous avons étudié la relation entre résistance des cellules leucémiques à la daunorubicine, la susceptibilité de ces cellules à la lyse par les cellules NK et l'expression putative des micro-RNAs. Nos résultats indiquent que l'acquisition de la résistance à la daunorubicine par les lignées de cellules parentales induit une résistance croisée à la cytotoxicité naturelle à médiation cellulaire. L'analyse des microréseaux de microRNAs a révélé que cette résistance croisée est associée à une diminution du miR-181a et une augmentation des gènes de la famille tyrosine kinase (MAP3K10 et MAP2K1) et de la famille Bcl-2 (Bcl-2 et Mcl-1). La surexpression de miR-181a dans les blastes AML entraîne l'atténuation de leur résistance à la daunorobucine et à la lyse par les cellules NK. / Natural Killer (NK) cells are a lymphoid population with potent cytotoxic activity against virus-infected or cancer cells, and which hold considerable potential for cell based therapies targeting human malignancies. Potential approaches include not only enhancing the generation of NK cells in number and improving their lytic activity, but also manipulating the susceptibility of blast cells to NK-mediated killing. Pursuing these approaches will require a more thorough understanding of the different mechanisms of resistance and their relationship with susceptibility to NK-mediated killing. In this context, we studied the role of HOXB4 in NK cells differentiation and lytic function. We showed that HOXB4 transduced MS-5 cells as compared with GFP-transduced MS-5 cells induced highly differentiated cytotoxic NK cells. This difference was associated with an increased induction of granzyme B degranulation in response to stimulation with NK cell susceptible targets. DNA microarray-based global transcriptional profiling confirmed the upregulation of granzyme B. These findings provide further evidence that HOXB4 is a crucial regulator of NK function and that its use in generating functional NK cells with increased lytic potential may be significant for cancer immunotherapy. We attempted to elucidate how acquisition of drug resistance in AML cells influences NK cell recognition and the killing of drug-resistant blasts. We showed that the in vitro acquisition of AML cell resistance to cytarabine resulted in an increase in their susceptibility to NK-mediated cell cytotoxicity. The increased susceptibility correlates with the induction of UL-16 binding proteins (ULBP) 1/2/3 and NK group 2, member (NKG2D) ligands on target cells by a mechanism involving c-Myc induction. More importantly, chromatin immunoprecipitation assay revealed that ULBP1/3 are direct targets of c-Myc. Using drug resistant primary AML blasts as target cells, inhibition of c-Myc resulted in decreased expression of NKG2D ligands and the subsequent impairment of NK cell lysis. This study provides for the first time, the c-Myc dependent regulation of NKG2D ligands in AML. Manipulating NK-cell alloreactivity might improve outcomes after hematopoietic stem-cell transplantation; however, cross-resistance among blasts remains a drawback. We attempted to investigate the relationship between AML to daunorubicin, the susceptibility to NK cellmediated cell lysis and the putative expression of miRs. Our results indicate that the acquisition of resistance to daunorubicin by the parental cell lines resulted in the acquisition of a cross-resistance to natural cell-mediated cytotoxicity. miR microarray analysis revealed that this cross-resistance was associated with miR-181a down regulation and the subsequent regulation of the tyrosine kinase (MAP3K10 and MAP2K1) and the BCL-2 (BCL-2 andMCL-1) families. Overexpression of miR-181a in AML blasts resulted in the attenuation of their resistance to daunorobucin and to NK-cell-mediated killing.

Au cours de cette thèse nous avons étudié les propriétés anticancéreuses du pigment majoritaire de la betterave rouge : la bétanine, ainsi que son mode d’action. Nos travaux reposent sur une approche pluridisciplinaire. Nous avons tout d’abord mis au point un protocole d’extraction et de purification de la bétanine à partir de betteraves rouges fraîches. Plusieurs étapes de purification se terminant par la séparation des molécules d’intérêt sur HPLC semi-préparative sont nécessaires à l’obtention de la bétanine à un degré de pureté de 90 %, une qualité d’extrait jusqu’à présent inégalé. Nous avons ensuite évalué l’effet cytotoxique de notre extrait sur cellules cancéreuses. Nous avons pu démontrer son innocuité sur cellules non cancéreuses et identifier les voies de signalisation pouvant être impliquées. Nous avons ainsi pu avancer des pistes concernant le mode d’action de la bétanine sur les cellules, mais également soumettre pour la première fois l’idée d’une implication de l’autophagie dans la mort cellulaire induite par la bétanine. Enfin, nous avons montré, par des techniques d’analyse biophysique aux interfaces appliquées aux membranes cellulaires et biomimétiques, qu’indépendamment de son insertion jusqu’au cœur hydrophobe des membranes, la bétanine n’influait pas sur la fluidité et la perméabilité membranaire. Ce travail exploratoire confirme l’intérêt à porter à la bétanine qui, compte tenu de sa haute biodisponibilité, présente de nombreuses applications thérapeutiques potentielles. / During this thesis we studied the anticancer properties of the major beetroot’s pigment: betanin. Our work is based on a multidisciplinary approach.First we developed a protocol for the extraction and the purification of betanin from fresh beetroots. Several purification steps ended by separation in semi-preparative HPLC are required to obtain a betanin at 90 % pure, which is the highest purity ever recorded. Then we assessed the cytotoxic effect of our extract on cancer cells and its safety on non-cancer cells. By identifying the signaling pathways that might be involved in these effects, we were thus able to suggest ways concerning the mode of action of betanin on cells, but also propose, for the first time, the idea of an involvement of autophagy in cell death induced by betanin. Finally, we have shown by interfacial biophysical techniques applied on cell and biomimetic membranes that, regarless to its deep insertion in the hydrophobic core of the lipid bilayer, betanin did not affect the physical properties of the membrane such as its fluidity or its permability.This scoping study confirms the interest to bring to betanin which, given its high bioavailability, has many potential therapeutic applications.

Les stratégies thérapeutiques mises en place contre le cancer ont de nos jours besoin de nouveaux médicaments, à la fois plus actifs que ceux déjà existants et induisant moins d’effets secondaires. Ces nouvelles stratégies visent à cibler spécifiquement les cellules cancéreuses. Parmi ces stratégies, ces travaux de thèse concernent la vectorisation active, à l’aide d’un vecteur protéique dérivé de la toxine de Shiga, STxB. STxB reconnait spécifiquement son récepteur biologique Gb3, surexprimé à la surface des cellules cancéreuses humaines. Ce projet de recherche porte sur la conception et la synthèse de conjugués, combinant STxB et un agent cytotoxique. Le linker chimique, qui relie ces deux espèces, a été soigneusement conçu pour respecter les deux critères suivants : être suffisamment stable et néanmoins pouvoir être clivé pour libérer l’agent cytotoxique une fois les cellules cancéreuses atteintes. Un premier linker a été construit autour du motif mercaptoethanol, lié au vecteur STxB par une liaison disulfure. La libération de l’agent cytotoxique peut donc être initiée par un réducteur biologique comme le glutathion, puis par une étape d’auto-immolation. Ce linker a été appliqué à deux composés cytotoxiques très puissants, dérivés de l’auristatine, et a conduit à des résultats prometteurs in vitro. La labilité de la liaison ester à pH acide a également été mise à profit dans l’élaboration de deux linkers, conçus autour de motifs glutamate et thréoninate. L’utilisation d’un agent cytotoxique modérément puissant a été l’occasion de développer une stratégie de multivalence, consistant à augmenter la charge d’agents cytotoxiques sur STxB. Une autre option a été de considérer les nano-batônnets d’or comme une plate-forme nanométrique multimodale, capable de lier plusieurs milliers d’agents cytotoxiques et STxB. Enfin l’incorporation d’une séquence peptidique, connue pour être substrat d’une protéase, a donné lieu à une troisième étude, reposant sur un linker clivable plus sélectivement. Plusieurs linkers ont été étudiées, selon qu’ils libèrent l’agent cytotoxique sous sa forme native ou non. / We need new therapeutic strategies to treat cancerous patients by the discovery of new drugs that would be more active than those existing and especially assigning fewer side effects. These new therapies aim to specifically target cancer cells. Among the strategies for cancer targeting, we investigated drug-targeted strategies using a proteic carrier, STxB, derived from Shiga toxin. This protein recognizes specifically its biological receptor Gb3, which is over-expressed on human cancer cells. This work consisted in the design and synthesis of conjugates combining STxB and a cytotoxic drug. The chemical linker binding these two moieties was carefully designed in order to fit requirements of both stability and ability to trigger a drug-delivery. A first linker was designed around a mercaptoethanol core, able to be conjugated to STxB by a disulfide bond. This constitutes a drug-delivery trigger, activated by a biological reducing agent such as glutathion, and followed by a self-immolative step. Two highly potent conjugates of auristatin derivatives were obtained and showed promising results in vitro. The ester bonds lability in acidic pH was exploited for the design of two amino acid based linker. With the aim of increasing the ratio of drug on STxB, we investigated several multivalent linkers. Another option was to consider gold nanorods as a nanometric platform, able to carry thousands of drugs and STxB. The incorporation of a protease substrate to produce an enzyme-cleavable linker was investigated. Several spacers, which induced release of the drug under native form or under prodrug form, were designed and tested.

Au cours de la réponse immunitaire antitumorale, l’instabilité génétique des tumeurs combinée à la pression de sélection du système immunitaire peut conduire, via l’immunoediting, à l’émergence de variants tumoraux résistants à la lyse par les effecteurs cytotoxiques. Une meilleure compréhension de ces mécanismes potentiellement impliqués dans la susceptibilité tumorale à la lyse naturelle et/ou spécifique pourrait permettre le développement de stratégies d’immunothérapie intégratives plus efficaces. Dans ce cadre nous avons étudié un modèle de résistance à la lyse spécifique impliquant un remaniement du cytosquelette d’actine (i). Nous avons pu mettre en évidence que l’inhibition conjointe de protéines interagissant avec l’actine (caldesmone, ézrine, radixine et moésine) générait une réduction de la susceptibilité des cellules tumorales à la lyse par les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs). Parallèlement, nous avons identifié les microARNs différentiellement exprimés entre le variant résistant et la lignée parentale et étudié leur implication dans la susceptibilité tumorale à la lyse par les CTLs. Dans le but de déterminer le rôle d’une pression de sélection par les cellules tueuses naturelles (NK pour Natural Killer), de l’immunité innée, sur les cellules tumorales et l’émergence de variants résistants, nous avons aussi établi un modèle de coculture continue de cellules tumorales de mélanomes avec des cellules NK (ii). Les cellules tumorales obtenues sont résistantes à la lyse NK (mais toujours sensibles à la lyse spécifique par un clone lymphocytaire T cytotoxique) et établissent moins de contact et de synapse immunologique avec les cellules NK que la lignée parentale. L’analyse transcriptomique a révélé la baisse d'expression de B7-H6 (ligand d'un récepteur activateur des cellules NK) qui contribue partiellement au phénomène de résistance. De nombreux gènes impliqués dans les phénomènes de migration/invasion/adhérence sont également modulés et certaines propriétés cellulaires (croissance en milieu semi-solide, adhérence, migration) semblent refléter l’acquisition d’une agressivité tumorale accrue suite à la coculture. Nous avons finalement analysé l’impact sur la réponse antitumorale de la connexine-43, impliquée dans la formation des jonctions communicantes (GJ pour Gap Junction) (iii). Nous avons montré que sa présence à la synapse entre cellules tumorales et CTL n'exerce aucun impact sur la susceptibilité à la lyse. Néanmoins, les GJs sont impliquées dans l’émergence par stimulation antigénique de lymphocyte T CD8+ spécifique hautement réactif. / During antitumor immune response, cancer cells genetic instability combined with immune system selective pressure may drive to the emergence of tumor variant resistant to lysis by cytotoxic effector cells through a phenomenon called immunoediting. A better understanding of those mechanisms putatively involved in tumor susceptibility to natural and/or specific lysis would enable new integrative and more effective immunotherapeutic strategies. In this context, we studied a model of resistance to specific lysis linked to actin cytoskeleton remodeling (i). We showed that combined inhibition of actin interacting protein (caldesmone, ezrin, radixin and moesin) reduced tumor cells susceptibility to cytotoxic T lymphocytes (CTLs) lysis. Moreover, we identified microRNAs differentially expressed between parental cell line and resistant variant and are currently studying their impact on tumor susceptibility to CTLs lysis. In order to depict the role of innate immunity Natural Killer (NK) cells selective pressure, on tumor cells and on the emergence of resistant variants, we also established a maintained coculture model of melanoma cells with NK cells (ii). Selected cells obtained were resistant to NK cells-mediated lysis (but still susceptible to CTLs-mediated specific lysis) and formed less contact and immune synapse with NK cells than parental cell line. Transcriptomic analysis revealed the reduced expression of B7-H6 (ligand of an NK cells activating receptor) partially contributing to the resistance phenotype. The expression of several genes involved in migration/invasion/adhesion is also modulated and some cell characteristics (cell growth in semi-solid medium, adhesion, migration) tend to reflect the acquisition through coculture of an increased aggressiveness. Finally, we evaluated the impact of connexin-43 (Cx43), involved in the establishment of Gap Junctions (GJs), on antitumor response (iii). We showed that despite localization at the immune synapse between tumor target cell and CTL, Cx43 and GJs do not modulate susceptibility to CTL-mediated specific lysis. Nevertheless, GJs contribute to the emergence of highly reactive specific CD8+ T lymphocytes following antigen stimulation.

Le genre Eryngium L. (Apiaceae, Saniculoideae) comprend plus de 250 espèces utilisées en médecine traditionnelle à travers le monde. En Tunisie il existe seulement huit espèces : E. barrelieri Boiss., E. campestre L., E. dichotomum Desf., E. glomeratum Lamk., E. ilicifolium Lamk., E. maritimum L., E. tricuspidatum L. et E. triquetrum Vahl. ; ces espèces sont en majorité peu étudiées du point de vue phytochimique. La présente étude a été effectuée sur la totalité des Eryngium qui poussent en Tunisie dans le but d’évaluer leurs activités biologiques, essentiellement antimicrobienne contre des microorganismes multirésistants et producteurs de béta-lactamases à spectres étendus (BLSE), mais aussi phototoxique et cytotoxique ainsi que la variabilité chimique par analyse par GC-FID et GC-MS des extraits les plus actifs.Toutes les espèces étudiées étaient dotées d’un pouvoir antimicrobien (1,25 à 0,07 mg/mL) et cytotoxique (24,4 à 0,32 µg/mL) considérable. Le criblage de l’activité phototoxique a permis de mettre en évidence la richesse de ces plantes en composés photoréactifs antimicrobiens potentiellement intéressants pour leur efficacité d’action et l’élargissement du spectre d’activité antimicrobienne.L’analyse des extraits actifs apolaires a permis d’étudier la variabilité chimique entre les différentes espèces et la mise en évidence de la présence majoritaire de composés antimicrobiens notamment des sesquiterpènes oxygénés tels que le spathulénol, le lédol, l’α-bisabolol et le cubénol, et des sesquiterpènes hydrocarbonés comme le β-bisabolène et le copaène ; et cytotoxiques tel que le falcarinol.Une étude phytochimique approfondie a été réalisée sur les racines d’E. triquetrum afin d’extraire, isoler par des essais bio-guidés et identifier les composés actifs. Le fractionnement a été optimisé par des chromatographies sur colonnes, CPC et CLHP. Parmi les composés identifiés deux polyacétylènes, le panaxydiol et le falcarinol, ont montré un fort pouvoir antimicrobien et une spécificité d’action notamment contre les souches de Pseudomonas aeruginosa BLSE et multirésistantes, avec des CMI allant jusqu’à 0,25 ng/mL et une activité en majorité bactéricide. / The genus Eryngium L., (Apiaceae, Saniculoideae) comprises more than 250 flowering plant species, which are commonly used as medicinal plants in different countries. Only eight species are growing in Tunisia: E. barrelieri Boiss., E. campestre L., E. dichotomum Desf., E. glomeratum Lamk., E. ilicifolium Lamk., E. maritimum L., E. tricuspidatum L. et E. triquetrum Vahl. These species are used in traditional medicine and there are relatively few papers on the phytochemical investigations of most of them. This study was performed on all Eryngium species growing in Tunisia in order to evaluate their chemical variability using GC-FID and GC-MS analyses and their biological activities, mainly antimicrobial against multiresistant microorganisms and extended spectrum beta-lactamase producing bacteria (ESBL), and also phototoxic and cytotoxic effects.All investigated species showed considerable antimicrobial effect with MIC value ranging between 1,25 and 0,07 mg/mL and important cytotoxic activity against J774 tumoral cells with IC50 from 24,4 to 0,32 µg/mL. Phototoxic investigation demonstrated a significant photoactive inhibitory effects against tested pathogenic microorganisms.GC–MS analysis of the most active crude extracts (petroleum ether extracts) revealed their high content of antimicrobial agents particularly oxygenated sesquiterpenes such as spathulenol, ledol, α-bisabolol and cubenol, and hydrocarbon sesquiterpenes such as β-bisabolene and copaene; and cytotoxic components such as falcarinol.The chemical investigation and bio-guided isolation of active compounds of the selected crude extract of E. triquetrum roots were performed using column chromatography, centrifugal partition chromatography (CPC) and preparative high-performance liquid chromatography (HPLC). among purified components, two bioactive polyacetylenes, panaxydiol and falcarinol, showed a great antimicrobial activity mainly against multiresistant and ESBL producing Pseudomonas aeruginosa with MIC value up to 0,25 ng/ml and a mostly bactericidal effect.

Plusieurs populations de cellules immunitaires possèdent une activité cytotoxique permettant l'élimination de cellules altérées. Cette fonction cellulaire est ainsi déterminante dans le contrôle des infections, des processus tumoraux, ou encore des maladies inflammatoires chroniques. Mon projet de thèse se concentre sur des aspects fondamentaux de l'activité lytique de deux populations de lymphocytes T cytotoxiques : les lymphocytes T CD8+ et les lymphocytes T CD4+ régulateurs de type 1. Pour cela, l'exploration des mécanismes de cette activité a été conduite au travers de deux modèles, pathologique et thérapeutique, à différentes échelles biologiques : au niveau de la population ou de la cellule individuelle, mais aussi différentes échelles d'organisations moléculaires : cellulaire et nanoscopique. Nous avons pu démontrer que l'activité de lyse de lymphocytes T CD8+ cytotoxiques face à un excès de cellules cibles est efficace sur des temps prolongés, reposant sur une capacité individuelle fortement hétérogène à effectuer une lyse multiple. L'importance de cette activité de lyse soutenue a été renforcée par l'identification d'un défaut lytique particulièrement prononcé sur le long- terme chez des lymphocytes T CD8+ issus de patients atteints du syndrome de Wiskott-Aldrich. Ce défaut est lié à une activation réduite de l'intégrine LFA-1 et un délai dans la délivrance du coup létal. De plus, la protéine WASP permet de restreindre LFA-1 de haute-affinité en nanoclusters denses ainsi que de permettre l'organisation en un ring de LFA-1 et la localisation des granules lytiques à l'intérieur de celui-ci. Par ailleurs, les lymphocytes T CD4+ régulateurs de type 1 développés dans le cadre d'une thérapie cellulaire (Ovasave(r)) démontrent une capacité de lyse envers les cellules myéloïdes, en complément d'une activité immunosuppressive sur les lymphocytes T conventionnels. Cette activité est mise en place sur du long-terme, jusqu'à atteindre une efficacité optimale, lié à un délai dans la délivrance du coup létal. De manière surprenante, malgré une spécificité pour l'ovalbumine, l'activité cytotoxique semble être indépendante de l'activation du TCR. En outre, la lyse est granzyme-dépendante mais perforine-indépendante. Ainsi ces lymphocytes T thérapeutiques manifestent une activité cytotoxique alternative. Pour conclure, mon projet de thèse a permis de caractériser une activité de lyse soutenue basée sur une capacité individuelle hétérogène. Cette habilité à soutenir une lyse sur du long-terme implique une stabilité de la synapse, où WASP joue notamment un rôle clé pour l'activation et l'organisation de LFA-1. Les lymphocytes T régulateurs thérapeutiques démontrent aussi une activité de lyse soutenue, cependant les acteurs moléculaires sont non conventionnels. De manière générale, une activité de lyse soutenue permettrait de calibrer une réponse cytotoxique prolongée en rapport à la taille de la population cible, ainsi que le partage avec d'autres fonctions cellulaires comme la sécrétion de cytokines. / During different pathological conditions such as infections, tumoral processes or chronic inflammation diseases, altered cells are eliminated through a cytotoxic activity mediated by several immune cell populations. This cellular function is therefore crucial for carrying out the action of the immune system. My thesis project focuses on fundamental aspects of the lytic activity of two cytotoxic lymphocyte populations: CD8+ T cells and type-1 CD4+ regulatory T cells. To explore the mechanisms of this activity, this study has been driven on two cases, pathological and therapeutic models, at the population and single-cell levels and also at the cellular and nanoscopic scales of the molecular organisation. We have been able to demonstrate that the CD8+ T cell lysis activity against an excess of target cells is effective over prolonged periods, relying on a highly heterogeneous individual capacity to perform multiple lysis. The importance of this sustained cytotoxic activity was reinforced by the identification of a lytic defect, particularly pronounced on a long time period, of CD8+ T cells from Wiskott-Aldrich syndrome patients. This defect is related to a reduced activation of the LFA-1 integrin and delay in the lethal hit delivery. In addition, the WASP protein allows to restrict high affinity LFA-1 to dense nanoclusters as well as the assembly of LFA- 1 ring and the localization of the lytic granules inside this ring. Moreover, type-1 CD4+ regulatory T cells from a cellular therapy (Ovasave(r)) demonstrated a cytotoxic activity toward myeloid cells, additionally to an immunosuppressive activity on conventional T cells. This activity is implemented over long time periods, until reaching optimal efficiency, and is related to a delay in the lethal hit delivery. Surprisingly, despite a specificity for ovalbumin, the cytotoxic activity measured in absence of the antigen suggests a TCR independence. In addition, lysis is not mediated by perforin but is exclusively granzyme-dependent. Thus, these therapeutic T cells exhibit an alternative cytotoxic activity. To conclude, my thesis project permits to characterize a sustained lysis activity relying on a heterogeneous individual capacity. This ability to sustain a lytic activity involves stability of the synapse, where WASP plays a key role towards the activation and organization of LFA-1. The therapeutic regulatory T lymphocytes also demonstrated a sustained cytotoxic activity, however the molecular actors are unconventional. On the whole, sustained lytic activity would be key to the calibration of cytotoxic responses in relation to the size of the target population, as well as sharing with other cellular functions such as cytokine secretion.

Nectandra membranacea (Lauraceae) est une plante très commune aux Petites Antilles. Aucune utilisation traditionnelle de cette plante n’est connue mais le genre Nectandra, qui représente le deuxième plus important de la famille des Lauraceae avec 114 espèces reconnues, présente des propriétés analgésiques, anti-inflammatoires et énergétiques (Le Quesne et al 1980). Nectandra a également démontré une activité antitumorale (Silva-Filho, 2004). Les nombreuses propriétés du genre et le peu de connaissance chimique sur cette espèce nous ont incités à réaliser une étude phytochimique et à évaluer le potentiel biologique des différentes parties de cette plante. L’analyse des lipides a été effectuée, et les principales classes de métabolites secondaires (terpènes, flavonoïdes, alcaloïdes) ont été recherchées dans les feuilles, les écorces et les fruits de Nectandra membranacea. Afin de suivre les variations de la composition chimique en fonction du cycle de vie du végétal, l’étude a été réalisée sur des échantillons (feuilles, écorces et fruits), récoltés à deux stades du cycle de la plante : la germination (stade A) et la fructification (stade B). N. membranacea, grâce à la présence de nombreuses familles chimiques, possède des activités biologiques intéressantes. Les huiles essentielles ont montré des activités anticancéreuses, anti-inflammatoires, antioxydantes et antiherpétiques. Les extraits polyphénoliques issus des différentes parties de la plante ont montré une très grande activité antioxydante (ORAC et DPPH) et in vitro (cellules saines) ainsi que des propriétés anti-inflammatoires notables. Les extraits d’alcaloïdes totaux issus des trois parties ont été évalués pour la maladie d’Alzheimer et ont révélé de très bons effets neuroprotecteurs, plus particulièrement pour les extraits de feuilles récoltées lors de la germination. Ce travail a permis d’élargir la connaissance des huiles essentielles de l’espèce (composition pour plusieurs parties et activité biologique). Des flavonoïdes ont été identifiés, mais la plante s’est révélée particulièrement riche en alcaloïdes (une quinzaine) de type isoquinoliques et indoliques. N. membranacea se révèle être une plante aux nombreuses propriétés, au regard de ses activités biologiques intéressantes. Des extraits pourraient être utilisés comme principes actifs dans des médicaments mais également en industrie cosmétique. / Nectandra membranacea (Lauraceae) is a very common plant in the French West Indies. No traditional use of this plant is known, but the genus Nectandra, which represents the second most important of Lauraceae family with 114 recognized species, has got analgesic, anti-inflammatory and energizing activities (Le Quesne et al 1980). Nectandra was also identified as a potential antitumor agent (Silva-Filho, 2004). Many properties of the genus, and some chemical knowledge of this species, have prompted us to perform phytochemical and biological study of different parts of the plant. Lipids and the main classes of secondary metabolites (terpenes, flavonoids, alkaloids) were investigated in leaves, bark and fruits of Nectandra membranacea. To determine the monitoring changes in the chemical composition, according to the life cycle of the plant, the study was carried out on samples (leaves, bark and fruits) harvested at two stages of the cycle plant : germination (stage A) and fruit stage (stage B). N. membranacea, thanks to the presence of many chemical families, has interesting biological activities. Essential oils have shown anticancer, anti-inflammatory, antioxidant activities. They revealed antiviral activity on the herpes virus. The polyphenolic extracts from different parts of the plant showed a high antioxidant activity (ORAC and DPPH tests) and in vitro (healthy cells) and significant anti-inflammatory properties. The total alkaloids extracted from the three parts were evaluated for Alzheimer’s disease and were found to have very good protective effects, especially the leaves’ extracts collected during germination. This work has expanded knowledge of the essential oil of the species (composition of several parts and biological activity). Flavonoids have been identified, but the plant was shown to be particularly rich in alkaloids (fifteen were identified) of indolic and isoquinolic type. N. membranacea presents many properties. In view of its interesting biological activities, it could be used for many drugs but also in cosmetic area.