En 1997, le caractère culard, un phénotype hypermusclé chez le bovin, est attribué à des mutations dans le gène de la myostatine (MSTN). Depuis, il a été confirmé qu’une baisse de l’activité de la MSTN conduisait à une augmentation de la masse musculaire chez d’autres espèces, y compris chez l’Homme. L’identification de ce facteur et des conséquences de son invalidation sur le développement musculaire ouvre de nombreuses perspectives en médecine humaine comme, par exemple, chez des personnes ayant eu une fonte musculaire importante suite à une immobilisation prolongée ou en conséquence du vieillissement ou d’une maladie chronique. L’objectif majeur de ce projet de recherche a consisté à évaluer de nouvelles stratégies permettant d’augmenter la masse musculaire chez la souris. Pour ce faire, nous nous sommes intéressés à une métalloprotéine de la matrice extracellulaire (MEC), la décorine (DCN), dont l’interaction avec la MSTN a été caractérisée comme étant zinc dépendante. Suite à l’injection de ce Small Leucine Rich Proteoglycan (SLRP) chez la souris dystrophique mdx et Gamma-sarcoglycan-/-, nous avons constaté une augmentation de la masse musculaire consécutive à un phénomène d’hypertrophie associé ou non à de l’hyperplasie. Des études de dose/cinétique ont montré que l’effet positif de la décorine sur la croissance musculaire était maximal 21 jours après administration. Nous avons également découvert qu’un fragment peptidique de 41 acides aminés du domaine N-terminal de la protéine DCN murine conservait une activité anti-myostatine et induisait une hypertrophie musculaire chez la souris dystrophique. Ce domaine, site de l’interaction directe entre la MSTN et la DCN, présente un motif CX3CXCX6C, caractéristique des SLRPs de classe I, dont le cluster de cystéines et son interaction avec le zinc ont été décrits comme indispensables à l’activité anti-MSTN de la DCN. Différentes études concernant les mécanismes induits lors de la séquestration de la MSTN par la DCN dans la MEC ont également été conduites afin d’expliquer les phénomènes observés chez la souris. Enfin, nous avons étudié le potentiel de la DCN pour favoriser la greffe de cellules myogéniques et développé différentes approches de thérapie génique. / In 1997, the double-muscling phenotype, a marked hypermuscularity in cattle, was related to mutations in the myostatin (MSTN) gene. Since, it was confirmed that a decrease of the myostatin’s activity drives an increase of the muscular mass in others species, including Human. The identification of this factor and the consequences of its invalidation on the muscular development open many perspectives in human medicine, as, for example, for people whom have an important muscular loss fallow up an extended immobilization or in consequence of old age or a chronic disease. The main purpose of this research project was to evaluate some new strategies permitting the increase of the muscular mass in mice. To achieve that, we investigated in detail the decorin (DCN), a metalloprotein of the extracellular matrix (ECM), interacting with MSTN in a zinc-dependent manner. After intramuscular injection of this Small Leucine Rich Proteoglycan (SLRP) in mdx and Gamma-Sarcoglycan-/- dystrophic mice, we observed a significant increase of the muscle mass conducted by hypertrophy associated or not with hyperplasia. Dose and cinetic studies showed that the positive effect of the decorin on muscular growth was maximal 21 days after administration. Furthermore, we showed that a peptide encompassing the 31-71 sequence retains full myostatin binding capacity and intramuscular injection of this peptide induces muscle hypertrophy in dystrophic mice. This direct interaction site between MSTN and DCN contains a conserved CX3CXCX6C pattern of class I SLRPs, whose cluster of cysteins and its interaction with zinc were shown to be crucial in the anti-MSTN activity of DCN. Various studies of the mechanism resulting of the sequestration of MSTN by DCN in ECM were conducted in order to explain the phenomenom observed in mice. Al last, we have studied the potential of DCN in the cellular transplantation and developped different anti-myostatin strategies of genetic therapy.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La myostatine est un membre de la superfamille du TGF-β (transforming growth factor-β) impliqué dans la régulation négative de la masse musculaire. En effet, l’absence de myostatine (MSTN) chez la souris est responsable d’un phénotype hypermusclé. Depuis, il a été confirmé qu’une baisse de l’activité de la MSTN conduit à une augmentation de la masse musculaire chez d’autres espèces, y compris l’Homme. L’identification de la MSTN et des conséquences de son invalidation sur le développement musculaire ouvre de nombreuses perspectives en médecine humaine. Il existe de nombreuses situations pathologiques qui conduisent à une fonte musculaire importante : c’est le cas pour des maladies génétiques telles que les dystrophies musculaires ou pour d’autres pathologies comme le cancer et le sida. Différentes approches anti-MSTN ont été développées au cours des dernières années, par exemple un anticorps anti-MSTN ou des ligands de la MSTN. L’objectif majeur de ce projet de recherche a consisté à identifier de nouveaux inhibiteurs de la MSTN, en particulier appartenant à la famille de protéines appelées SLRP (Small Leucine Rich Proteoglycans). Il a été mis en évidence que des membres de cette famille, notamment la décorine (DCN) ainsi que des fragments issus de la DCN dont le peptide 31-71, sont capables de se lier à la MSTN en présence de zinc. La DCN peut alors empêcher l’activité de la MSTN en s’opposant à la liaison de cette dernière à son récepteur. Dans ce contexte, nous avons étudié des séquences peptidiques plus restreintes de la DCN murine pouvant interagir efficacement avec la MSTN et des peptides dérivés d’autres SLRP pour leur aptitude à lier la MSTN. Afin de faciliter le criblage in vitro de ces composés, nous avons tout d’abord créé une lignée cellulaire HEK293T exprimant stablement une cassette inductible par la MSTN fusionnée au gène de la luciférase (pCAGA-Luc). Parmi les candidats testés, le peptide mDCN48-71 a été le plus intéressant de par sa forte activité anti MSTN in vitro comparée aux autres, avec un IC50 de 7 µM. Notons également que le peptide mDCN48-71 n’a pas inhibé d’autres membres de la superfamille du TGF-β : TGF-β2, activine A et GDF-11 – ce qui suggère une spécificité d’action du peptide. En outre, des études d’anisotropie de fluorescence ont permis de prouver l’interaction directe du peptide mDCN48 71 avec la MSTN et la dépendance au zinc de cette liaison. Pour finir, nous avons montré que des injections intramusculaires répétées de ce peptide chez le modèle murin dystrophique mdx, conduisent à une augmentation significative de la masse des muscles tibiaux antérieurs injectés de l’ordre de 21 % par rapport aux muscles contrôles. / Myostatin is a member of the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily and a negative regulator of skeletal muscle growth. In 1997, lack of myostatin (MSTN) was related to increased muscle mass in mice. Since then, MSTN has been found in other species including humans. Inhibition of this protein offers opportunities in human medicine for many pathological conditions leading to a significant muscle loss: genetic disorders such as muscular dystrophy as well as other diseases like cancer and AIDS. Recently, several anti-MSTN approaches have been developed such as antibodies against MSTN or naturally occurring proteins that bind to and inactivate MSTN. The aim of this research was to identify novel inhibitors of MSTN, especially belonging to the SLRP (Small Leucine Rich Proteoglycans) family of proteins. Members of this family, including decorin (DCN) and fragments thereof (murine derived peptide mDCN31-71) can bind to MSTN in a zinc-dependent manner. In this context, smaller peptide sequences of mouse DCN and peptides from other SLRP have been studied for their ability to bind MSTN. First, we created a HEK293T stable cell line expressing the luciferase gene under control of a MSTN-inducible promoter (pCAGA-Luc) so as to screen these compounds in vitro. Here we report that the peptide mDCN48-71 shows the stronger activity anti MSTN in vitro among all the peptides tested (IC50 = 7 µM). Furthermore, other members of the TGF β superfamily: TGF β2, activin A and GDF-11 are not inhibited by the mDCN48-71 peptide - which suggests a specificity of its action. By performing fluorescence anisotropy studies, we proved the direct and zinc dependent interaction between peptide mDCN48-71 and MSTN. Finally, we showed that repeated intramuscular injections of this peptide in the dystrophic mdx mouse model led to a significant increase of the injected tibialis anterior muscle mass (21 %) compared to control muscles.