As células-tronco mesenquimais (MSC) foram originalmente isoladas da medula óssea, mas populações semelhantes foram isoladas do tecido adiposo e outros tecidos. A diferenciação das células-tronco derivadas do tecido adiposo (do inglês adipose derived stem cells; ADAS) para células neurais foram realizadas por vários grupos. Um aspecto muito importante relacionado com as células-tronco é a manutenção da integridade genômica durante o processo de diferenciação. Acredita-se que a manutenção da estabilidade genética por meio dos mecanismos de reparação do DNA devem ser particularmente rigorosos em células-tronco adultas, onde qualquer alteração genética pode comprometer a estabilidade genética e a funcionalidade destas células. O objetivo deste estudo foi observar a viabilidade e a integridade genética das células ADAS tratadas com o meio de indução neural, por meio do teste cometa, teste de micronúcleo e teste de viabilidade celular. Além disso, foi analisada a expressão de algumas proteínas relacionadas com a sinalização de danos no DNA, remodelagem de cromatina e proliferação. Os resultados obtidos no presente estudo claramente indicaram que o meio de indução neural pode ser genotóxico para as ADAS. O teste cometa revelou que a indução neural aumenta o índice e a freqüência de danos no DNA. A indução de micronúcleos não foi observada nas mesmas condições, indicando que o meio de indução neural não causa danos clastogênicos. Ao considerar a expressão de MCM3, TIP60, telomerase e a variação na expressão de marcadores neurais, o método de indução neural usada in vitro pode encaminhar a célula a uma transformação tumoral. Estes resultados alertam para a importância dos estudos relacionados com aos protocolos atualmente usados na diferenciação in vitro de células-tronco para fins terapêuticos. / Mesenchymal stem cells (MSC) were originally isolated from the bone marrow, although similar populations have been isolated from adipose and other tissues. The differentiation of ADAS (adipose derived stem cells) to neuronal cells has been accomplished by several groups. One important aspect related to stem cells is the maintenance of genomic integrity during the differentiation process. In this sense, the maintenance of genomic stability by DNA repair mechanisms in adult stem cells should be particularly stringent, where any genetic alteration can compromise the genomic stability and functionality of cell. Thus, the aim of this study was to observe the viability and integrity of ADAS cells treated with neural induction medium by using the comet, micronucleus, and cell viability assays. Moreover, the expression of some proteins and genes related to DNA damage signalling, chromatin remodeling, and cell proliferation was analyzed. The data obtained from the present study clearly indicate that the neuronal medium can be genotoxic to ADAS cells. Our results reveal that neuronal induction increases the damage frequency and damage index observed by comet assay. The induction of micronuclei was not observed for the same assay conditions, indicating that the neuronal induction medium does not cause chromosome loss and breakage. Considering the expression of MCM3, TIP60, telomerase and neuronal marker, it can be speculated that the neural induction conditions used in this work can drives ADAS cells to tumor transformation. These results call for the necessity of new studies related to in vitro stem cell differentiation protocols for therapeutical purposes.

Neuroblastoma é um tumor do sistema nervoso periférico e uma das principais causas de mortalidade infantil por câncer no Brasil e no mundo. A característica marcante desses tumores é sua heterogeneidade clínica – as apresentações variam desde formas benignas e tratáveis até variantes extremamente agressivas, que levam o paciente a óbito em poucos meses. A fim de determinar as melhores estratégias para o tratamento desse câncer, um grande número de pesquisadores tem procurado por novos biomarcadores e alvos terapêuticos. Atualmente, o melhor marcador biológico para a progressão de neuroblastoma é a amplificação do gene MYCN, que ocorre na maioria dos casos mais agressivos. Entretanto, esse marcador não é capaz de discriminar entre todos os tipos de pacientes, demonstrando a necessidade de encontrarmos outros marcadores. Neste trabalho, reconstruímos a rede de regulação gênica de neuroblastoma utilizando ferramentas de bioinformática e biologia de sistemas a fim de buscar novos biomarcadores e alvos terapêuticos para esta doença. Através dessa rede, analisamos uma assinatura de genes diferentemente expressos em metástases agressivas, buscando fatores de transcrição que pudessem estar envolvidos na progressão tumoral. Através dessa análise, observamos que MAX é um dos reguladores mestres do processo, e variações em sua expressão estavam correlacionadas com o desfecho de pacientes, sugerindo seu potencial como biomarcador. Além disso, também observamos o aumento do conteúdo de MAX em células de linhagem de neuroblastoma humano durante um protocolo de diferenciação experimental, sugerindo que essa proteína tem um papel muito mais central no controle do balanço entre proliferação e diferenciação do que previamente descrito. / Neuroblastoma is a peripheral nervous system tumor and one of the main causes of children cancer mortality in Brazil and in the rest of the world. The hallmark of these tumors is their clinical heterogeneity – presentations vary from benign and treatable to extremely aggressive variants, the latter leading the patient to death in just a few months. In order to come up with the best strategies for treatment and management of this cancer, a great number of researchers have been searching for novel biomarkers and therapeutic targets. To this date, the best neuroblastoma biomarker is the amplification of MYCN oncogene, which occurs in the majority of aggressive cases. However, this biomarker alone does not suffice to discriminate among all patients types, illustrating the need for finding other biomarkers. In this work, we reverse engineered the neuroblastoma gene regulatory network using systems biology and bioinformatics tools in order to find novel biomarkers and therapeutic targets. Using this network, we analyzed an aggressive metastasis gene signature to find transcription factors that could be involved in tumor progression. Through this analysis, we observed that MAX was a master regulator of this process, and that changes in its expression were associated with patient survival, suggesting its role as potential biomarker. Additionally, we observed that MAX content was increased in human neuroblastoma cell lines undergoing experimental differentiation. These results suggest that this protein has a much more central role in regulating the balance between proliferation and differentiation than previously described.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12379_Tese - COVRE L.P. 2018.pdf: 30345373 bytes, checksum: ec3dc8e879b3ba71ae62497eaf04c63e (MD5) Previous issue date: 2018-05-28 / As células natural killer (NK) são fundamentais na resposta imune inata. As funções dessas células são reguladas pela sinalização de receptores de ativação ou inibição. Durante seu desenvolvimento, as células NK podem sofrer uma diferenciação terminal progressiva, que está associada a modificações fenotípicas e deficiências funcionais. Neste trabalho, descrevemos aspectos relacionados a estas características decorrentes do envelhecimento ou induzidas durante a leishmaniose cutânea localizada causada por Leishmania braziliensis. Demonstramos que indivíduos idosos apresentaram um aumento na população de células NK expressando alta frequência do receptor inibitório KLRG1. Essas células possuem perfil de diferenciação terminal e ativam espontaneamente o sensor metabólico denominado proteína quinase ativada por AMP (AMPK). O estímulo através do receptor KLRG1 foi capaz de aumentar a fosforilação de AMPK, impedindo a desfosforilação dessa quinase mediada por PP2C. Além disso, a ativação de AMPK suprimiu a citotoxicidade, a produção de granzima B e de IFN-γ nas células NK. Células com a via KLRG1-AMPK ativa apresentaram reduções da capacidade proliferativa, da expressão da subunidade catalítica da telomerase (TERT) e no comprimento dos telômeros, bem como aumento do dano ao DNA. Todos esses fatores são associados a redução no crescimento celular e ao fenótipo de imunosenescência adquirido durante o envelhecimento. Da mesma forma, pacientes com leishmaniose cutânea localizada demonstraram um aumento do fenótipo maduro de células NK, com expansão da subpopulação CD56dim. Além disso, foram observados a diminuição dos marcadores imaturos NKG2A, CD161 e CD27, seguidos pelo aumento na expressão dos receptores NKG2C, KIR (CD158a) e acúmulo de células terminalmente diferenciadas caracterizadas como KLRG1bright e CD57bright. Células NK de pacientes com LCL apresentaram aumento da citotoxicidade, produção de granzima B e de citocinas inflamatórias quando comparadas com controles saudáveis. No entanto, também apresentaram uma baixa capacidade proliferativa, associada à presença de células KLRG1bright e CD57bright e encurtamento significativo dos telômeros quando comparado aos controles saudáveis. Juntos, nossos dados demonstram que o envelhecimento e a infecção causada por Leishmania podem afetar o fenótipo e a função de células NK, levando ao acúmulo de células terminalmente diferenciadas. Assim, a elucidação dos mecanismos que levam a esse comprometimento, como a via KLRG1 / AMPK, podem ser futuramente explorados como forma de retardar ou mesmo reverter as deficiências observadas nestas populações. Além disso, a identificação desses fatores pode ter implicações importantes para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas, que irão auxiliar no processo de maturação funcional de células NK e aprimorar a resposta imunológica durante infecções e câncer.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12379_Tese - COVRE L.P. 2018.pdf: 30345373 bytes, checksum: ec3dc8e879b3ba71ae62497eaf04c63e (MD5) Previous issue date: 2018-05-28 / As células natural killer (NK) são fundamentais na resposta imune inata. As funções dessas células são reguladas pela sinalização de receptores de ativação ou inibição. Durante seu desenvolvimento, as células NK podem sofrer uma diferenciação terminal progressiva, que está associada a modificações fenotípicas e deficiências funcionais. Neste trabalho, descrevemos aspectos relacionados a estas características decorrentes do envelhecimento ou induzidas durante a leishmaniose cutânea localizada causada por Leishmania braziliensis. Demonstramos que indivíduos idosos apresentaram um aumento na população de células NK expressando alta frequência do receptor inibitório KLRG1. Essas células possuem perfil de diferenciação terminal e ativam espontaneamente o sensor metabólico denominado proteína quinase ativada por AMP (AMPK). O estímulo através do receptor KLRG1 foi capaz de aumentar a fosforilação de AMPK, impedindo a desfosforilação dessa quinase mediada por PP2C. Além disso, a ativação de AMPK suprimiu a citotoxicidade, a produção de granzima B e de IFN-γ nas células NK. Células com a via KLRG1-AMPK ativa apresentaram reduções da capacidade proliferativa, da expressão da subunidade catalítica da telomerase (TERT) e no comprimento dos telômeros, bem como aumento do dano ao DNA. Todos esses fatores são associados a redução no crescimento celular e ao fenótipo de imunosenescência adquirido durante o envelhecimento. Da mesma forma, pacientes com leishmaniose cutânea localizada demonstraram um aumento do fenótipo maduro de células NK, com expansão da subpopulação CD56dim. Além disso, foram observados a diminuição dos marcadores imaturos NKG2A, CD161 e CD27, seguidos pelo aumento na expressão dos receptores NKG2C, KIR (CD158a) e acúmulo de células terminalmente diferenciadas caracterizadas como KLRG1bright e CD57bright. Células NK de pacientes com LCL apresentaram aumento da citotoxicidade, produção de granzima B e de citocinas inflamatórias quando comparadas com controles saudáveis. No entanto, também apresentaram uma baixa capacidade proliferativa, associada à presença de células KLRG1bright e CD57bright e encurtamento significativo dos telômeros quando comparado aos controles saudáveis. Juntos, nossos dados demonstram que o envelhecimento e a infecção causada por Leishmania podem afetar o fenótipo e a função de células NK, levando ao acúmulo de células terminalmente diferenciadas. Assim, a elucidação dos mecanismos que levam a esse comprometimento, como a via KLRG1 / AMPK, podem ser futuramente explorados como forma de retardar ou mesmo reverter as deficiências observadas nestas populações. Além disso, a identificação desses fatores pode ter implicações importantes para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas, que irão auxiliar no processo de maturação funcional de células NK e aprimorar a resposta imunológica durante infecções e câncer.

Orientador : Benedicto de Campos Vidal / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-15T12:53:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wada_MariaLuciaFurlan_D.pdf: 5575326 bytes, checksum: 96e75026eea80936efc19fa6427fe7a6 (MD5) Previous issue date: 1985 / Resumo: É amplamente aceito que as características morfológicas e fisiológicas da célula são resultantes da interação genoma + meio ambiente e, portanto, as diferenças observadas entre tipos celulares seriam o resultado da ação diferencial de genes. Nos últimos anos tem-se estudado o quanto da informação contida na célula é codificada pela seqüência primária dos genes e quanto do ambiente influencia esta expressão gênica. O papel da matriz extracelular íntegra, ou de seus componentes isolados, na regulação da expressão final de uma informação genética tem sido constatada por vários autores tanto ¿in vivo" quanto ¿in vitro". Estes trabalhos evidenciam que a matriz extracelular está envolvida nos processo de diferenciação. No nosso trabalho utilizamos uma matriz óssea desmineralizada (MOD) como substrato para a adesão e crescimento de células Vero, uma linhagem celular estabelecida a partir de células renais de macaco. Com os resultados obtidos através de análises citoquímicas, do índice mitótico, de eletroforese e de microscopia de polarização pudemos concluir que a MOD induz um processo de diferenciação que se caracteriza por alterações na forma e no tamanho das células, por alterações no complexo DNP, por aumento de grânulos de secreção contendo substâncias com radicais livres de D. manopiranose e D. glicopiranose, por alterações de constituição do nucléolo e da membrana plasmática. Desta forma, a utilização de MOD, em cultura de células Vero, as quais normalmente apresentam características epitelióides, induz alteração a nível da expressão gênica das mesmas, que se manifestam através de características morfológicas e fisiológicas, fazendo com que estas se assemelhem à condrócitos. Este processo de diferenciação induzido pela MOD ocorre formando um gradiente, sendo o sinal informacional contido na MOD, transmitido de célula a célula, e, provavelmente, o fato indutor de diferenciação presente na MOD não deve ser solúvel no meio de cultivo / Abstract: We studied the demineralized bane matrix, in vitro, used as a substrate for cell adesion and cell growth. The cells used were Vero cells, which are a call line developed from monkey kidney tissue. From the results obtained through cytochemical analysis, mitotic index, eletroforesis, and polarization microscopy we concluded that demineralized bone matrix induces a differentiation process, which modifies the size and shape of the cells. Modifications may be encontered of the DNP complex, the nucleolus, the plasma membrane, as well as an increase in the number of the secretion granules containing substances with free radicals of a-D, mannopyranosyl and a-D. glucopyranosyl In Vero cells cultures, which normally are epithelial, the use of demineralized bone matrix after their level of gene expression, change their morphological and physiological characteristics to the point that the cells appear to be chondrocytes. This differentiation process induced by the demineralized bone matrix is gradually intensified since the informational signal is contained in this matrix and is transmitted from cell to cell. The diferenciation inducing factor of demineralized bone matrix is probably not soluble in the culture medium / Doutorado / Genetica / Doutor em Ciências

Mecanismos redox estão envolvidos em diversos processos, como sobrevivência, proliferação e diferenciação celular, pela modulação da atividade de quinases, fosfatases e fatores de transcrição, entre outros, através da modificação oxidativa e reversível de resíduos de cisteína. Neste trabalho, nós estudamos processos redox subjacentes a diferenciação osteogênica induzida por BMP2, utilizando linhagens de células MC3T3-E1. Nosso objetivo foi investigar modificações redox como possíveis moduladores do processo de diferenciação osteogênica. Para isso, nós primeiramente caracterizamos a diferenciação osteogênica nas células MC3T3-E1 após o tratamento com BMP2, através da expressão do marcador osteogênico Osteocalcina, da fosforilação do complexo Smad 1/5/8 e da deposição de matriz extracelular calcificada. Análises de expressão gênica por qPCR mostraram que o tratamento com BMP2 resultou no aumento de expressão de NOX4, o que provavelmente leva ao aumento na produção de peróxido de hidrogênio intracelular. Nós investigamos também a modulação de peroxiredoxinas nesse processo e análises de expressão gênica mostraram que não há alterações nos níveis de expressão de Prx1 e 2 durante a diferenciação, mas os ensaios de western blot redox indicam que a Prx1 pode ser oxidada após o tratamento com BMP2, de maneira dose dependente. Outras análises in vitro mostram que células expostas a N-acetilcisteína (NAC) e PEG-catalase apresentam diferenciação osteogênica prejudicada, detectada por baixos níveis de deposição de matriz extracelular calcificada, comparado com células não-tratadas. Além disso, a fosforilação de Smad 1/5/8 são reduzidas nessas condições. Nossos dados sugerem que processos redox podem modular a sinalização celular durante o processo de diferenciação osteogência / Redox mechanisms are involved in several processes, such as cell survival, proliferation and differentiation, among other ways by modulating kinases, phosphatases and transcription factors activity that can occur through reversible and oxidative modification of cysteine residues. We were interested in studying redox processes underlying osteogenic differentiation induced by BMP-2, using MC3T3-E1 cell lineage. Our objective was to investigate redox modifications as possible modulators of the osteogenic differentiation process. We first characterized osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells upon BMP2 treatment, through gene expression of the osteogenic marker Osteocalcin, Smad 1/5/8 (belonging to the BMP-2 pathway) protein phosphorylation and extracellular matrix calcification. Gene expression analysis by qPCR showed that BMP2 treatment resulted in NOX4 upregulation, which probably also leads to hydrogen peroxide production. We have investigated peroxiredoxin modulation in this process, and gene expression analysis shows no significant change in peroxiredoxin 1 and 2 expression levels, but redox western blotting assays indicate that Prx1 can be oxidized after BMP2 treatment, in a dose dependent manner. In vitro analysis shows that cells exposed to N-acetyl-L-cysteine (NAC) and PEG-catalase display impaired osteogenic differentiation, detected by lower levels of calcified extracellular matrix deposition compared with non-treated cells. Moreover, phosphorylation of Smad 1/5/8 complex is reduced under these redox treatments. Our data suggest that redox pathways can modulate cell signaling during the osteogenic differentiation process

Neuroblastoma (NB) é a forma mais indiferenciada de tumores neuroblásticos e a principal causa de morte por câncer pediátrico. Alterações epigenéticas interagem em todas as etapas do desenvolvimento do câncer, promovendo a progressão tumoral. A remodelação da cromatina é influenciada pela acetilação de histonas e a metilação de DNA. Acetiltransferases de histona (HATs), desacetilases de histonas (HDAC) e metiltransferase de DNA (DNMTs) são alvos de estratégias terapêuticas em tumores. Os retinoides agem nas vias de diferenciação celular, anti-proliferação e pró-apoptose. Nesse trabalho, é proposto que a combinação desses moduladores epigenéticos e de diferenciação em linhagens de células de NB humano é mais efetiva que os agentes isolados. Os tratamentos induziram mudanças na expressão de marcadores de diferenciação e indiferenciação, como c-Myc, β-3tubulina, NeuN e Bmi1, e alterações morfológicas nas duas linhagens celulares utilizadas, SK-N-BE(2) e SH-SY5Y. Os dados encontrados podem contribuir para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares dos moduladores retinoides e epigenéticos em NB capazes de acrescentar melhorias nas atuais estratégias terapêuticas. / Neuroblastoma (NB) is the most undifferentiated form of neuroblastic tumors and the leading cause of death from pediatric cancer. Epigenetic changes interact at all stages of cancer development, promoting tumor progression. Chromatin remodeling is influenced by histone acetylation and DNA methylation. Histone acetyltransferases (HATs), histone deacetylases (HDAC), and DNA methyltransferase (DNMTs) are targets for therapeutic strategies in cancer. Retinoids act on cell differentiation pathways and display anti-proliferation and pro-apoptotic actions. In the present research we examined the effects of combining epigenetic modulators and a retinoid receptor agonist in human NB cells. The retinoid all trans-retinoic acid (ATRA) combined with inhibitors of either histone deacetylases (HDACs) or DNA methyltransferase was more effective than any drug given alone in impairing the proliferation of SH-SY5Y and SK-N-BE(2) NB cells. In addition, the treatments induced differential changes in the expression of differentiation markers including c-Myc, β-3tubulin, NeuN and Bmi1, and morphological changes in SK-N-BE(2) e SH-SY5Y cell lines. The data contribute to a better understanding of the molecular mechanisms of retinoid modulators and epigenetic in NB able to add improvements in current therapeutic strategies.

Avaliou-se os efeitos do β-caroteno e da vitamina A sobre o processo de proliferação de células ovais em modelo de diferenciação celular hepática. Para tanto, ratos machos Wistar foram tratados com β-caroteno (grupo BC - 70 mg/kg de peso corpóreo [pc]), vitamina A (grupo VA - 10 mg/kg pc) ou óleo de milho (CO - grupo controle) por via intragástrica e em dias alternados, durante 4 semanas consecutivas. Após este período, os animais foram submetidos ao modelo AAF/PH (6 x 20 mg AAF [2-acetilaminofluoreno] / kg pc e hepatectomia parcial) e sacrificados em diferentes dias após a cirurgia (HP). Foram colhidas amostras de fígado para determinação das concentrações de β-caroteno, retinol e palmitato de retinila (por CLAE - cromatografia líquida de alta eficiência); para análises histológica (hematoxilina e eosina) e imuno-histoquímica (com anticorpos anti-GST-P), bem como para avaliação das expressões gênicas (por northern blot) para as conexinas (cx) 43 e 32. Observou-se, através das análises histológica e imuno-histoquímica, que o pico de proliferação das células ovais foi deslocado para dias mais tardios após HP, de forma análoga nos grupos BC e VA, quando comparados ao grupo controle. Além disso, foi constatado que o pico de expressão gênica para cx 43 foi também deslocado para dias mais tardios pós-HP, de forma similar nos grupos BC e VA, e que houve um aumento na expressão gênica para cx 43 entre o 10º e 16º dias após HP no grupo VA, em relação ao controle. Não foi observada diferença na expressão gênica para cx 32 entre os grupos. Conclui-se que o β-caroteno modulou a proliferação de células ovais e a expressão gênica para cx 43, retardando ambos os fenômenos, e que esta ação foi mediada em parte via retinóides ativos. Ainda, o carotenóide mostrou uma tendência em induzir, de forma intrínseca, a diferenciação das células ovais em hepatócitos. / The aim of this work was to investigate the β-carotene and vitamin A effects in the process of oval cells proliferation at hepatic cellular differentiation model. Wistar male rats were treated with β-carotene (BC group - 70 mg/kg body wt), vitamin A (VA group - 10 mg/kg body wt) or com oil (CO - control group) administrated by gavage, on alternate days, during 4 consecutive weeks. Since, the animals were submitted to a AAF/PH model (6 x 20 mg AAF [2-acetylaminofluorene] / kg body wt and partial hepatectomy - PH) and sacrified at different days after PH. Liver samples were picked for analysing β-carotene, retinol and retinyl palmitate concentration (by HPLC); for histology (HE) and immunohistochemistry (with antibody anti-GST-P), and for evaluating connexins 43 and 32 gene expression (by northem blot). Histological and immunohistochemical analysis showed that the oval cells proliferation peak was delayed to the late days after PH, by similar way in the BC and VA groups, when compared with control group. Northem blot evaluation revealed that the cx 43 gene expression was also delayed to the late days after PH, by analogue way in the BC and VA groups, and vitamin A enhanced cx 43 gene expression in the late days after PH. Connexin 32 gene expression did not change among the experimental groups. Thereby, the β-carotene and vitamin A delayed the oval cells proliferation and the cx 43 gene expression. Moreover, β-carotene showed a tendency to induce the oval cells differentiation to hepatocytes.

A Doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa caracterizada por um declínio cognitivo global, incluindo uma perda progressiva de memória, orientação e raciocínio, associada com a degeneração especifica de neurônios colinérgicos. As alterações histopatológicas que definem a DA são protéicos de β-amilóide e tau hiperfosforilada em placas senis e emaranhados neurofibrilares, respectivamente. Porém, os mecanismos moleculares que levam a DA não estão bem caracterizados e ainda não há nenhum tratamento eficaz para prevenir ou reverter os seus sintomas. Parte dessa dificuldade se deve à escassez de modelos experimentais adequados. Previamente nosso grupo estabeleceu condições experimentais para a diferenciação do neuroblastoma humano SH-SY5Y em neurônios dopaminérgicos a partir da adição de ácido retinóico (AR). Alguns estudos sugerem que esta linhagem, quando tratada com AR e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), apresenta uma mudança para um fenótipo colinérgico. Dessa forma, este trabalho tem por objetivo caracterizar a diferenciação colinérgica desta linhagem e estabelecer as melhores condições de tratamento com ácido ocadáico (AO), que promove a hiperfosforilação e deposição da proteína tau, em combinação com oligômeros solúveis de β-amilóide (Aβ1-42), para uso como modelo in vitro ao estudo da DA. As células proliferativas foram cultivadas em meio DMEM/F12 com 10% de soro fetal ( FB). A diferenciação foi induzida com 10μM de AR em meio a cultura com 1% de SFB durante sete dias, sendo o BDNF (10 nM) acrescentado a partir do quarto dia. Determinamos a atividade da Acetilcolinesterase (AChE), da Colina Acetiltransferase (ChAT) e o imunoconteúdo de ChAT como marcadores colinérgicos. O co-tratamento com BDNF resultou em células com notável morfologia neuronal, apresentando aumento na densidade e comprimento de neuritos e nos marcadores colinérgicos. Após o estabelecimento do modelo colinérgico, as células diferenciadas da linhagem de neuroblastoma SH-SY5Y foram desafiadas com uma curva de dose das neurotoxinas Aβ1-42 ou AO, e a neurotoxicidade foi avaliada pelo ensaio do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazolium (MTT) em combinação com a densidade de neuritos. A partir desses resultados, doses subletais das toxinas foram selecionadas para estabelecer o modelo in vitro da Doença de Alzheimer. Esses resultados fazem dessa linhagem celular uma ferramenta útil no campo da neurociência, podendo torná-la um modelo adequado para o estudo da Doença de Alzheimer. / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a global cognitive decline, including progressive loss of memory, orientation and reasoning associated with a specific degeneration of cholinergic neurons. Histopathological changes that define AD are amyloid-β hyperphosphorylated tau deposits in senile plaques and neurofibrillary tangles, respectively. However, the leading molecular mechanisms are not well elucidated and still there is no effective treatment to prevent or reverse the symptoms. Part of this difficulty is due to the lack of suitable experimental models. Our group previously established experimental conditions for the differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into dopaminergic neurons-like with retinoic acid (RA) addition. Some studies suggested that when treated with RA and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) this cell line has a shift to a cholinergic like phenotype. Thus, this study aims to characterize the cholinergic differentiation of SH-SY5Y cell line and to determine the best conditions for okadaic acid (OA) treatment, which promotes the deposition and hyperphosphorylation of tau protein, in combination with solubleoligomers of β- myl (Aβ - 42). Thereby we established a suitable AD in vitro model. Exponentially growing SH-SY5Y cells were maintained in DMEM / F12 medium with 10% fetal bovine serum (FBS). Differentiation was triggered by the combination of 10 μM of RA plus medium with 1% of FBS during 7 days, BDNF was added on 4th day. We determined Acetylcholinesterase (AChE) and Choline Acetyltransferase (ChAT) enzymatic activities and the ChAT immunocontent as cholinergic markers. Once the cholinergic like in vitro model was established, the differentiated SH- Y5Y cells were challeng with of Aβ -42 or AO dose curve, and neurotoxicity was evaluated by an 3-(4,5-dimethylthiazol-2il)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay in combination with neurite density. Hence, sublethal doses of neurotoxins were selected to determine the in vitro model of Alzheimer's disease. Taken together, these results suggested SH-SY5Y cell line as a useful and suitable model in Alzheimer's disease research.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Objetivos: este trabalho objetivou estudar a expressão gênica da família das interleucinas-1 em células células-tronco embrionárias indiferenciadas de camundongos e avaliar se ela se altera após a diferenciação celular. Métodos: Pesquisou-se a expressão gênica dessas substâncias em células-tronco (CT) indiferenciadas e durante a diferenciação celular em cardiomiócitos de camundongos. Colônias na 5a , 10a , 15a , 20a e 25a passagens em meios de cultivo foram removidas para a pesquisa de RT-PCR utilizando-se o kit SuperScript™ III CellsDirect cDNA Synthesis System. A amplificação do DNAc através do PCR foi realizada com a enzima Platinum® Taq DNA Polymerase. Foram utilizados os primers da interleucina-1β (IL- 1F2), antagonista do receptor de IL-1 (IL-1F3) e receptor tipo 1 de IL-1 (IL-1RI). Para estudo da IL-1 em estado diferenciado, foram utilizados corpos embrionários de três e cinco dias de cultivo e cardiomiócitos derivados de CT. Resultados: todas as 45 colônias indiferenciadas de CT mostraram-se negativas para IL-1F2; uma entre 45 (2,2%) foi positiva para IL-1F3 e também para marcadores de ectoderma (FGF5) e endoderma (Gata6) primitivos; uma entre 45 (2,2%) foi positiva para IL-1RI e também para ectoderma e mesoderma. Nenhum dos quatro corpos embrionários estudados foram positivos para IL-1F2. Um deles foi positivo para IL-1F3 e dois positivos para IL-1RI. Todas as quatro biópsias de cardiomiócitos mostraram-se positivas para IL- 1F2 e também para IL-1F3. Duas delas foram positivas para IL-1RI. Pelo que se pôde observar, este é o primeiro estudo que descreve a expressão genética da família da IL-1 em colônias individuais de células-tronco embrionárias de camundongos. Conclusão: as células-tronco indiferenciadas de camundongos estudadas não produziram genes da família da IL-1. / Purpose: this work objectived to study the IL-1 family gene expression in undifferentiated mouse embryonic stem (ES) cells and during diferentiation into cardiomyocytes. Methods: Colonies at 5, 10, 15, 20 and 25th passages were taken to perform RT-PCR using SuperScript™ III CellsDirect cDNA Synthesis System. PCR amplification of cDNA was done with Platinum® Taq DNA Polymerase. We used Interleukin-1β (IL-1F2), IL-1 receptor antagonist (IL-1F3) and IL-1 receptor type I (IL-1RI) primers. Results: all 45 undifferentiated ES cells were negative for IL-1F2; one out of 45 (2,2%) was positive for IL-1F3 and also for primitive ectoderm (FGF5) and endoderm (Gata6) markers; one out of 45 (2,2%) was positive for IL-1RI and also for ectoderm and mesoderm. To further study IL-1 at a late stage of cell differentiation, we used embroyd bodies (EB) at day 3 and 5 and ES cell derived cardiomyocytes. None of four embroid bodies studied were positive for IL-1F2. One out of four EB was positive for IL-1F3 and two out of four EB were positive for IL- 1RI. Four out of 4 ES cells derived cardiomyocytes were positive for IL-1F2 and also for IL-1F3. Two out of 4 ES cells derived cardiomyocytes were positive for IL-1RI. Two out of 4 ES cells derived cardiomyocytes were positive for IL-1RI. To our knowledge this is the first time to describe an IL-1 family gene expression study in undifferentiated single mouse ES cells. Conclusion: undifferentiated mouse ES cells studied didn’t produce major components of IL-1 family. / CAPES: BEX 1475/03-7 / BV UNIFESP: Teses e dissertações