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Avaliação de fungos na obtenção do metabólito quiral e ativo O-desmetilvenlafaxina / Evaluation of fungi in obtaining the chiral and active metabolite O-desmethylvenlafaxine.

Marcela Armelim Bortoleto 28 July 2014 (has links)
A venlafaxina é um fármaco quiral utilizado no tratamento da depressão e da ansiedade associada à depressão. A ação farmacológica desse fármaco está associada principalmente ao enantiômero (+)-(S)-venlafaxina, que inibe a recaptação da serotonina enantiosseletivamente. Quando metabolizada pelas enzimas da citocromo P450 dois metabólitos são produzidos, também quirais, a O-desmetilvenlafaxina (ODV) e a N-desmetilvenlafaxina (NDV). O estudos mostram que o metabólito ODV é farmacologicamente ativo, apresentando ação farmacológica semelhante a venlafaxina. Fungos são micro-organismos capazes de mimetizar o metabolismo de mamíferos, produzindo, muitas vezes, os mesmos metabólitos. Além disso, esse processo pode ser enantiosseletivo. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar a capacidade de fungos em biotransformar a venlafaxina em seus metabólitos ODV e NDV de uma maneira enantiosseletiva. A separação quiral dos analitos foi realizada por cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) e eletroforese capilar (CE). Como técnica de preparação de amostra foi empregada a microextração liquido-liquido dispersiva (DLLME). Essa técnica recente de preparação de amostra possui alta eficiência na extração, permitindo a obtenção de altos valores de recuperação e um consumo mínimo de solvente orgânico. Anterior aos estudos de biotransformação, o método foi validado para análise por CLAE e CE, empregando, em ambos os casos, a DLLME como técnica de preparação de amostras. A validação foi realizada de acordo com as recomendações da ANVISA para análise de fármacos em material biológico. Todos os parâmetros avaliados (linearidade, precisão, exatidão, estabilidade, seletividade e limite de quantificação) apresentaram valores dentro das exigências da ANVISA. Os estudos de biotransformação foram realizados empregando os seguintes fungos: Mucor rouxii, Cunninghamella echinulata ATCC 8688A, Cunninghamella elegans 10028B, Beuveria bassiana ATCC 7159, Phomopsis sp (TD2), Chaetomiun globosun (VR10) e Glomerela cingulata (VA1). Entre esses, o fungo Cunninghamella elegans mostrou-se promissor na biotransformação da venlafaxina. Dessa forma, diversos fatores foram avaliados na tentativa de melhorar a biotransformação, sendo esses: troca de fonte de carbono do meio de cultura, alteração de meios de biotransformação e adição de cofatores ao meio de cultura. Os resultados mostraram fortes indícios de biotransformação enantiosseletiva da venlafaxina em seu metabólito (+)-(S)-N-desmetilvenlafaxina. / Venlafaxine is a chiral drug used in the treatment of depression and anxiety associated with depression. The pharmacological activity of this drug is mainly associated to the enantiomer (+)-(S)-venlafaxine, which inhibits the reuptake of serotonin with enantioselectivity. When metabolized by the cytochrome P450 enzymes, two metabolites, also chiral, are produced, O-desmethylvenlafaxine (ODV) and N-desmethylvenlafaxine (NDV). The studies have demonstrated that the ODV metabolite is pharmacologically active, with similar pharmacological activity of venlafaxine. Fungal are microorganisms capable of mimicking the mammalian metabolism, often producing the same metabolites. Moreover, this process can be enantioselective. Thus, the aim of this study was to evaluate the ability of fungi to biotransform, with enantioselectivity, the venlafaxine in its metabolites ODV and NDV. The chiral separation of the analytes was performed by high performance liquid chromatography (HPLC) and capillary electrophoresis (CE). As sample preparation was employed the dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME). This recent technique of sample preparation has high extraction efficiency, allowing obtaining high values of recovery and minimal consumption of organic solvent. Before the biotransformation studies, the method was validated employing CE and HPLC with the DLLME technique as sample preparation. The validation was performed according to ANVISA recommendations. All parameters (linearity, precision, accuracy, stability, selectivity and limit of quantification) were acceptable as required by ANVISA. The biotransformation studies were conducted using the following fungal: Mucor rouxii, Cunninghamella echinulata ATCC 8688A, Cunninghamella elegans 10028B, Beuveria bassiana ATCC 7159, Phomopsis sp (TD2), Chaetomiun globosun (VR10) and Glomerela cingulata (VA1). Among these, the fungus Cunninghamella elegans was promising in the biotransformation of venlafaxine. Thus, several factors were evaluated in an attempt to improve the biotransformation: carbon source exchange in the liquid culture medium, changes of the biotransformation medium and addition of cofators in the culture medium. The results provides strong evidences of enantioselective biotransformation of venlafaxine in its metabolite (+)-(S)-N-desmethylvenlafaxine.
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Avaliação de fungos na biotransformação estereosseletiva da Hidroxizina e obtenção do metabólito quiral e ativo Cetirizina / Evaluation of fungi in the stereoselective biotransformation of hydroxyzine and obtention of the active and chiral metabolite cetirizine.

Simone Silveira Fortes 24 May 2013 (has links)
Modelos microbiológicos tem sido usado na biotransformação de fármacos para a obtenção de metabólitos. Fungos de diversos gêneros têm sido amplamente utilizados para mimetizar o metabolismo hepático de mamíferos. O uso de fungos é vantajoso uma vez que apresentam um crescimento rápido e de fácil formação do sistema multienzimático. Além disso, hoje, a biotransformação é considerada como uma tecnologia econômica e competitiva, na busca de novas rotas de produção farmacêutica e de compostos agrotóxicos. Em muitos casos a transformação biológica é enantiosseletiva, permitindo a produção de enantiômeros puros a partir de misturas racêmicas. Devido à ausência de um método de extração com baixo consumo de solventes orgânicos para a determinação enantiosseletiva da hidroxizina (HZ) e cetirizina (CTZ), foi desenvolvido um método que combina a microextração liquido-liquido dispersiva (DLLME) e eletroforese capilar (CE) para estudar a biotransformação enantiosseletiva da HZ pelos fungos Penicillium crustosum, Mucor rouxii, Cunnonghamella echinulata var. elegans ATCC 8688, Cunnonghamella echinulata var. elegans ATCC 10028, Nigrospora sphaerica e Fusarium oxysporum. Um método por CE foi desenvolvido para a análise enanatiosseletiva da hidroxizina e cetirizina em meio de cultura Czapek. As análises por CE foram realizadas utilizando um capilar de sílica fundida não revestida, 50 mmol L-1 de borato de sódio como solução tampão de análise (pH 9,0) contendo 0,8% p/v de ciclodextrina--sulfatada como seletor quiral. A tensão aplicada e temperatura foram de +6 kV e 15 ºC, respectivamente. O detector UV foi ajustado no comprimento de onda 214 nm. As condições da DLLME envolvidas foram: clorofórmio (300 µL) como solvente extrator, etanol (400 µL) como solvente dispersante. Após a formação da solução turva, as amostras foram submetidas a agitação por vórtex durante 30 segundos a 2000 rpm e centrifugação durante 5 minutos a 3000 rpm. As recuperações foram na faixa de 87,4 91,7%. O método se mostrou linear na faixa de concentração 250 12500 ng mL-1 para cada enantiômero da HZ (r > 0.998) e de 125 6250 ng mL-1 para cada enantiômero da CTZ (r > 0.998). Os limites de quantificação foram 125 e 250 ng mL-1 para CTZ e HZ, respectivamente. Dentre os seis fungos estudados, três foram capazes de converter a HZ em CTZ enantiosseletivamente, especialmente o fungo Cunninghamella elegans ATCC 10028 que converteu 19% de (E1)-HZ em (S)-CTZ com excesso enantiomérico de 65%. / Microbial models have been used in biotransformation studies of many drugs aiming their metabolite production. Fungi of various genera have been extensively used to mimic the mammals hepatic metabolism. The use of fungi is advantageous because they present fast growth and easy formation of the multienzymatic system. Moreover, the biotransformation is, nowadays, considered an economically and competitive technology, in the search of new production routes for fine chemical, pharmaceutical and agrochemical compounds. In many cases, the biological transformation is enantioselective, allowing the production of pure enantiomers from racemic mixtures. In light of the above considerations and due to the absence of a low consuming organic solvent extraction method for the enantioselective determination of hydroxyzine (HZ) and cetirizine (CTZ), it was developed a method combining dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) and capillary electrophoresis (CE) to study the enantioselective biotransformation of HZ through the fungi Penicillium crustosum, Mucor rouxii, Cunnonghamella echinulata var. elegans ATCC 8688, Cunnonghamella echinulata var. elegans ATCC 10028, Nigrospora sphaerica e Fusarium oxysporum. A CE method was developed for the enantioselective analysis of hydroxyzine (HZ) and cetirizine (CTZ) in Czapek liquid culture medium. The CE analyses were performed using an uncoated fused-silica capillary and 50 mmol/L sodium borate buffer (pH 9.0) containing 0.8% (w/v) sulfated--cyclodextrin. The applied voltage and temperature used were +6 kV and 15 °C, respectively. The UV detector was set at 214 nm. The DLLME conditions involved: chloroform (300 µL) as extraction solvent and ethanol (400 µL) as dispersive solvent. After the formation of the cloudy solution, the samples were subjected to vortex agitation during 30 s at 2000 rpm and centrifugation for 5 min at 3000 rpm. The recoveries were in the range of 87.4 91.7%. The method was linear over the concentration range of 250 12500 ng/mL for each enantiomer of HZ (r > 0.998) and of 125 6250 ng/mL for each enantiomer of CTZ (r > 0.998). The quantification limits were 125 and 250 ng/mL for CTZ and HZ, respectively. Among the six studied fungi three were able to convert HZ to CTZ enantioselectively, especially the fungus Cunninghamella elegans ATCC 10028B that converted 19% of (E1)-HZ to (S)-CTZ with an enantiomeric excess of 65%.
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Avaliação de fungos no metabolismo enantiosseletivo da Zopiclona e análise por eletroforese capilar / Evaluation of fungi in enantioselective metabolism of Zopiclone and analysis by Capillary Electrophoresis.

Nayara Cristina Perez de Albuquerque 15 August 2014 (has links)
A zopiclona (ZO) é um fármaco quiral extensivamente metabolizado em N-desmetilzopiclona (N-Des) e zopiclona-N-óxido (N-Ox). A (S)-N-Des apresenta atividade ansiolítica, o que indica que este metabólito possui potencial para ser empregado no tratamento da ansiedade. Uma alternativa para obtenção deste metabólito pode ser a biotransformação empregando fungos como agentes catalisadores. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial de fungos em realizar o metabolismo da ZO em seu metabólito N-Des assim como verificar a enantiosseletividade desse processo. A análise da ZO e seus metabólitos em meio de cultura líquido proveniente do estudo de biotransformação foi realizada por eletroforese capilar (CE) e a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) foi empregada como técnica de preparo de amostras. As análises por CE foram realizadas empregando uma solução tampão fosfato de sódio 50 mmol L-1 pH 2,5 acrescido de 0,5% (m/v) de carboximetil--cilcodextrina com tensão constante de +25 kV e temperatura do capilar de 20ºC. A condição estabelecida para extração por DLLME foi: 2 mL de meio de cultura líquido Czapek, 2 mL de solução tampão tris-HCl 0,1 mol L-1 pH 9,5, clorofórmio (100 µL) e metanol (300 µL) como solventes extrator e dispersor, respectivamente. Anterior aos estudos de biotransformação, o método foi validado seguindo as exigências do EMA e ANVISA para análise de fármacos em matrizes biológicas. O método foi linear no intervalo de concentração de 90-6000 ng mL-1 para cada enantiômero da ZO (r > 0,999) e 50-1000 ng mL-1 para cada enantiômero da N-Des (r > 0,998); a recuperação absoluta média foi de 52% para N-Des e 83% para ZO. Os demais parâmetros, como precisão, exatidão, seletividade e estabilidade apresentaram-se dentro das normas exigidas. O estudo de biotransformação foi realizado com os fungos Penicillium crustosum, Aspergillus fumigatus, Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason, Fusarium oxysporum, Mucor rouxii, Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Cunninghamella echinulata var elegans ATCC 8688A. Entre esses fungos avaliados, os fungos Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Cunninghamella echinulata var elegans ATCC 8688A foram capazes de biotransformar a ZO para seu metabólito ativo N-Des. Utilizando o fungo Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A, após 360 horas de incubação foi obtida uma concentração máxima de (-)-(R)-N-Des e (+)-(S)-N-Des de 508 ng mL-1 e 221 ng mL-1, respectivamente com excesso enantiomérico de 39%. O fungo Cunninghamella elegans ATCC 10028B formou preferencialmente o metabolito (+)-(S)-N-Des. Após 240 horas de incubação, a concentração dos metabólitos (-)-(R)-N-Des e (+)-(S)-N-Des foi 120 ng mL-1 e 228 ng mL-1, respectivamente com excesso enantiomérico de 35%. / Zopiclone (ZO) is a chiral drug extensively metabolized into N-desmethylzopiclone (N-Des) and zopiclone-N-oxide (N-Ox). Pharmacological studies showed that the metabolite (S)-N-Des presents anxiolytic activity, which indicates that this metabolite has a potential to be used in the treatment of anxiety. An alternative way for obtaining this metabolite may be the biotransformation employing fungi as catalytic agent. Therefore, the aim of this study was to evaluate if fungi are able to biotransform ZO into its active metabolite N-Des and to verify if this process is enantioselective. To perform ZO and its metabolites analysis from liquid culture medium, an enantioselective method by capillary electrophoresis (CE) and dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) was developed. The CE analyses were carried out in 50 mmol L-1 sodium phosphate buffer pH 2.5 containing 0.5% (w/v) carboxymethyl--CD with a constant voltage of +25 kV and capillary temperature of 20ºC. The extraction conditions established for DLLME were: 2 mL of sample (pH adjusted using 2 mL of 0.1 mol L-1 tris-HCl buffer pH 9.5), chloroform (100 µL) and methanol (300 µL) as extraction and disperser solvent, respectively. Before the biotransformation study, the method was validated according to EMA and ANVISA guidelines for analysis of drug and metabolites in biological matrices. The method was linear over a concentration range of 90-6000 ng mL-1 for each ZO enantiomer (r > 0.999) and 50-1000 ng mL-1 for each N-Des enantiomer (r > 0.998); the absolute recovery was 52% for N-Des and 83% for ZO. Other parameters, such as: accuracy, precision, selectivity and stability were all in agreement with guideline. The developed method was employed in biotransformation studies using the following fungi: Penicillium crustosum, Aspergillus fumigatus, Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason, Fusarium oxysporum, Mucor rouxii, Cunninghamella elegans ATCC 10028B and Cunninghamella echinulata var elegans ATCC 8688A. Among all evaluated fungi, Cunninghamella elegans ATCC 10028B and Cunninghamella echinulata var elegans ATCC 8688A were able to biotransform the ZO to its active metabolite N-Des. Using the fungus Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A, after 360 hours of incubation it was obtained a maximum concentration of (-)-(R)-N-Des and (+)-(S)-N-Des of 508 ng mL-1 and 221 ng mL-1, respectively with an enantiomeric excess of 39%. The fungus Cunninghamella elegans ATCC 10028B formed preferentially the metabolite (+)-(S)-N-Des. After 240 hours of incubation, the concentration of metabolites (-)-(R)-N-Des and (+)-(S)-N-Des was 120 ng mL-1 and 228 ng mL-1, respectively with enantiomeric excess of 35%.
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Avaliação de fungos e complexos de salen na obtenção do metabólito quiral e ativo terbutalina / Evaluation of fungi and salen complexes in the obtention of the chiral and active metabolite terbutaline

Lídia Renata Zanão 27 September 2013 (has links)
Enantiômeros podem interagir de maneira diferenciada no organismo, ocasionando efeitos farmacológicos variados. Dessa forma, metodologias para a obtenção de fármacos enantiomericamente puros são importantes para a indústria farmacêutica. Modelos sintéticos empregando reagentes quirais, como complexos de salen e modelos biológicos utilizando fungos estão sendo muito estudados neste contexto. O uso de fungos apresenta como principais vantagens o crescimento rápido, baixo custo e fácil operação, além da produção de metabólitos em grande quantidade. Complexos de salen são eficientes e estáveis, possuindo ampla aplicabilidade e possibilidade de produzir reações enantiosseletivas. O objetivo deste trabalho foi avaliar fungos e complexo de salen como alternativas na produção enantiosseletiva de terbutalina, o metabólito quiral e ativo de seu pró-fármaco, o bmbuterol. A separação enantiosseletiva dos analitos foi realizada empregando a cromatografia líquida de alta eficiência com detector UV-Vis (LC/UV). A validação da metodologia analítica e os estudos de biotransformação foram executados por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). A resolução do bambuterol e da terbutalina por LC/UV foi realizada utilizando como fase estacionária a coluna Chirobiotic T e como fase móvel acetonitrila:metanol (80:20, v/v) + 0,3% de ácido fórmico e 0,1% de trietilamina, numa vazão de 1,5 mL min-1 e por LC-MS utilizando a mesma fase estacionária e a fase móvel composta por 96% de metanol em água + 0,2% de ácido acético e 0,1% de acetato de amônio na vazão de 1 mL min-1. A extração dos analitos em meio de cultura líquido (Czapek, 2 mL) foi feita empregando a microextração liquido-liquido dispersiva (DLLME), nas condições: solvente dispersor,isopropanol (600 µL); solvente extrator, diclorometano (50 µL); reagente par iônico, di(2-etil-hexil)fosfato (100µL); e solução tampão fosfato de sódio (2 mL, pH 7,6). A recuperação do bambuterol foi de 92% e a da terbutalina foi estimada em 55%. O método foi validado para a análise do bambuterol no meio de cultura e se mostrou linear na faixa de concentração 500 17500 ng mL-1 para cada enantiômero (r > 0.998).O limite de quantificação foi igual a 500 ng mL-1. Dentre os fungos avaliados neste trabalho, nenhum foi capaz de realizar a biotransformação do bambuterol em terbutalina nas condições empregadas. Nos estudos feitos utilizando catálise assimétrica também não foi possível observar esse metabólito. Dada a complexidade do metabolismo do bambuterol (reações de hidrólise e/ou oxidação) e da formação de vários intermediários anterior a etapa de formação da terbutalina, as condições avaliadas nesse estudo não foi capaz de produzir o metabólito ativo do bambuterol, terbutalina. / Enantiomers may interact differently in the organism causing pharmacological sundry effects. For these reason, enantiomeric pure drugs are very important for the pharmaceutical industries. Synthetic models employing chiral reagents, like salen complexes, and biological models using fungi are been very studied in this context. Fungi present as main advantage the fast growing up, low costs and easily application, moreover, their metabolites are produced in huge quantities. Salen complexes are efficient and stable. They have a wide application and the possibility of production of high enantiomeric excess. The aim of this work was to evaluate fungi and salen complex as alternatives to the enantioselective production of terbutaline, the chiral and active metabolite of your prodrug, bambuterol. The analytes enantioselective separation was done employing high performance liquid chromatography with UV-Vis detector (LC/UV). The method validation and the studies of biotransformation were done using high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS). The resolution of bambuterol and terbutaline by LC/UV was accomplished using the Chirobiotic T column and acetonitrile: methanol (80:20, v/v) + 0.3% formic acid and 0.1% triethylamine as mobile phase at a flow rate of 1.5 mL min-1 and by LC-MS employing the same column and the mobile phase was composed by 96% of methanol in water + 0,2% acetic acid and 0,1% ammonium acetate at a flow rate of 0.1 mL min-1. The analytes extraction of the culture medium (Czapek, 2 mL) was done using the dispersive liquid liquid microextraction (DLLME), in the following conditions: dispersive solvent, isopropanol (600 µL); extractor solvent, dichloromethane (50 µL); ionic-pair reagent; di(2-ethylhexyl)phosphate (100 µL); and sodium phosphate buffer (2 mL, pH 7.6). The recoveries were 92% for the bambuterol and estimated in 55% for terbutaline. The method was validated for the analysis of bambuterol in the culture medium and was linear over the concentration range of 500 17500 ng mL-1 for each enantiomer (r > 0.998). The quantification limit was 500 ng mL-1. Among the evaluated fungi, none was able to do the biotransformation process of bambuterol at terbutaline in the employed conditions and so do the studies employing asymmetric catalyses. Because the complexity of bambuterols metabolism for producing terbutaline (hydrolysis and/or oxidation reactions) and the formation of several intermediates before the terbulalines formation step, the evaluated conditions in this study were not able to produce the chiral active metabolite, terbutaline.
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Avaliação de fungos na obtenção do metabólito quiral e ativo fexofenadina / Evaluation of fungi in obtaining chiral active metabolite fexofenadine

Gisele Maria Metta 06 December 2013 (has links)
A fexofenadina (FEX) tem sido o fármaco de primeira escolha no tratamento sintomático de manifestações alérgicas, por ser um anti-histamínico dos receptores H1 de 2ª geração não sedativo. É o metabólito ativo e quiral da terfenadina (TERF), medicamento cuja produção e comercialização foram suspensas em função dos eventos adversos apresentados. Fungos têm se apresentado como uma alternativa promissora na produção de compostos com atividade biológica. Dessa forma, o objetivo desse projeto foi avaliar a capacidade de fungos em biotransformar enantiosseletivamente a terfenadina em seu metabólito ativo, a fexofenadina empregando fungos como agentes catalisadores. Para a análise enantiosseletiva da fexofenadina foi desenvolvido um método de separação cromatográfica empregando a coluna quiral Lux® cellulose-1, fase móvel constituída de água: metanol (35:65, v/v) + 0,3% trietilamina + 0,4% ácido acético, vazão de 0,5 mL min-1, com detecção em 220nm. Duas microtécnicas de preparação de amostras foram avaliadas na extração dos analitos do meio de cultura: a microextração liquido-liquido dispersiva (DLLME) e a microextração em fase liquida empregando membranas cilíndricas ocas (HF-LPME). Entre essas, a DLLME foi a microtécnica de escolha, pois forneceu melhores resultados tais como, maior valor de recuperação, cromatogramas sem picos de possíveis interferentes, maior rapidez e facilidade de preparação das amostras. As condições otimizadas da DLLME foram: clorofórmio (300 ?L) como solvente extrator, isopropanol (300 ?L) como solvente dispersor. Após a formação do ponto nuvem, as amostras foram submetidas à agitação por vórtex durante 15 segundos e centrifugação durante 10 minutos a 3000 rpm. As recuperações foram de 43% para ambos enantiômeros. O método se mostrou linear na faixa de concentração 2.0 - 15.0 ?g mL-1 para cada enantiômero da FEX (r > 0,990). O limite de quantificação foi de 2 ?g mL-1 para os enantiômeros da FEX. Dentre os sete fungos estudados (Papulaspora immersa Hotson SS13, Penicillium crustosum VR4, Mucor rouxii, Nigrospora sphaerica SS67, Fusarium oxysporum SS50, Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A e Cunninghamella elegans NRRL 1393 ATCC 10028B) somente o fungo Fusarium oxysporum SS50 e Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A apresentaram potencial para biotransformação da terfenadina em fexofenadina nas condições de incubação empregadas nesse trabalho. / Fexofenadine (FEX) has been the drug of choice for the symptomatic treatment of allergic manifestations, being an antihistamine H1 receptor 2nd generation non-sedating. It is the active and chiral metabolite of terfenadine (TERF), a drug whose production and marketing was suspended as a result of adverse events. Fungi have been presented as a promising alternative for the production of compounds with biological activity. Thus, the goal of this project was to evaluate the ability of fungi to biotransform asymmetric terfenadine to its active metabolite, fexofenadine using fungi as agents catalysts. For enantioselective analysis of fexofenadine a method for chromatographic separation was developed employing a chiral column Lux® cellulose -1, mobile phase water : methanol (35:65,v/v) + 0.3% triethylamine + 0.4% acetic acid, flow rate of 0.5 mL min-1, with detection at 220nm. Two sample preparation microtechnology were evaluated in the extraction of analytes from the culture medium: the dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) and hollow fiber liquid phase microextraction (HF- LPME). Between the two, the DLLME was the microtechnic chosen because it provided better results such as higher recovery values, chromatograms with no possible interfering peaks, greater speed and ease of sample preparation. The optimized conditions of DLLME were: chloroform (300 ?L) as extractor solvent, isopropanol (300 ?L) as disperser solvent. After the formation of the cloud point, the samples were subjected to agitation by vortexing for 15 seconds and centrifuging for 10 minutes at 3000 rpm. The recoveries were 43 % for both enantiomers. The method was linear in the concentration range from 2.0 -15.0 ?g mL-1 for each enantiomer of FEX (r > 0.990). The limit of quantification was 2 ?g mL-1 for the enantiomers of FEX. Among the seven fungi studied (Papulaspora immersa Hotson SS13, Penicillium crustosum VR4, Mucor rouxii, Nigrospora sphaerica SS67, Fusarium oxysporum SS50, Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A e Cunninghamella elegans NRRL 1393 ATCC 10028B), only the fungi Fusarium oxysporum SS50 e Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A showed potential for biotransformation of terfenadine in fexofenadine in the incubation conditions employed in this work.
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Desenvolvimento de um método para determinação de disruptores endócrinos em saliva por microextração líquido-líquido dispersiva e cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas / Method development for determination of endocrine disrupting in saliva by dispersive liquid-liquid microextraction and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

Oliveira, Mariana Lepri de 11 May 2018 (has links)
A crescente demanda por novos compostos químicos sintéticos para atender as necessidades médicas, agrícolas e industriais da população resultou no surgimento de novos contaminantes, denominados emergentes. Com a intensa utilização destes compostos em diversos produtos e o consequente aumento da concentração destes no meio ambiente, a população passou a estar exposta e sujeita aos seus possíveis efeitos deletérios. Os disruptores endócrinos fazem parte do grupo de contaminantes emergentes que tem a capacidade de interferir na ação natural dos hormônios por diferentes mecanismos, podendo agravar o quadro de doenças pré-existentes e causar diversos outros danos à saúde humana. Apesar de serem largamente utilizados na vida cotidiana, a regulamentação do uso desses compostos ainda é quase inexistente, aumentando a preocupação quanto à sua segurança. Comumente, os estudos de biomonitoramento humano para avaliar a exposição da população em geral são realizados utilizando amostras de sangue e urina. Neste sentido, o presente estudo teve como objetivo desenvolver um método alternativo para determinação simultânea de 17 compostos classificados como disruptores endócrinos: bisfenóis, parabenos, benzofenonas e triclocarban em saliva, empregando a microextração líquido-liquido dispersiva (DLLME) no preparo da amostra e cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS) para a determinação. Os seguintes parâmetros foram avaliados na otimização da DLLME: volume e tipo de solvente extrator e dispersor, força iônica, pH e agitação. Após a otimização, o processo de extração foi realizado adicionando-se 500 ?L de água deionizada à 500 ?L da amostra de saliva. Os solventes extrator e dispersor selecionados foram triclorometano e acetona, respectivamente (volume de 2 mL da mistura na proporção 1:3). Foi adicionada a etapa de agitação manual por dez segundos. As curvas de calibração de todos os analitos apresentaram linearidade, com coeficiente de correlação superiores a 0,99 no intervalo de concentração de 1-20 ng mL-1. O coeficiente de variação (CV) intra e interdias foram inferiores a 20% para o primeiro ponto da faixa linear e inferiores a 15% para as demais concentrações. O erro padrão relativo intra e interdias foram inferiores a 20% para o primeiro ponto da faixa linear e inferiores a 15% nas demais concentrações. Os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) encontrados variaram de 0,01 - 0,15 ng mL-1 e 0,05 - 0,40 ng mL-1, respectivamente. Para avaliar a aplicabilidade do método, dez amostras de saliva foram analisadas e apresentaram concentrações detectáveis de bisfenol S (BPS), bisfenol AF (BPAF) e propilparabeno (PrP) ( <LOQ). O bisfenol A (BPA) e a benzofenona-3 (BP3) foram encontrados em concentrações que variaram entre 1,01-3,14 e 1,00-2,50 ng mL-1, respectivamente. O metilparabeno (MeP) foi detectado em todas as amostras, atingindo, nos níveis quantificáveis, a concentração de 17,8 ng mL-1. Portanto, o método aqui proposto é uma alternativa simples e rápida para estudos de biomonitoramento humano, capaz de determinar 17 analitos multi-classes simultaneamente com uso de baixo volume de solventes. / The growing demand of new synthetic chemical compounds to attend the medical, agricultural and industrial needs of the population has resulted in the emergence of new contaminants, known as emerging contaminants. The presence of these contaminants in several products, and its consequent concentration increase in the environment, exposed the population and subject them to possible deleterious effects. Endocrine disruptors are a group of these contaminants that have the ability to interfere at the natural action of hormones by different mechanisms, wich can worsen preexistent diseases and cause other damages to humam health. Despite the widely utilization of these compounds in everyday life, regulation of its use is almost non-existent, raising concerns about their safety. Mostly human biomonitoring studies to assess the exposure of the population are performed in urine and blood samples. In these sense, the present study aimed to develop an alternative method for simultaneous determination of 17 endocrine disrupting compounds: bisphenols, parabens, benzophenones and triclocarban in saliva, using dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) at sample preparation and high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS) for determination. The evaluated parameters in the optimization of DLLME were: volume and type of extraction and disperser solvents, ionic strength, pH and agitation. After the optimization, the extraction procedure was performed by adding 500 ?L of deionized water to 500 ?L of saliva sample. The extraction and disperser solvents selected were trichloromethane and acetone, respectively (2 mL of the mixture in 1:3 ratio). The manual agitation for ten seconds. The matrix-matched calibration curves of all analytes were linear, with correlation coefficients higher than 0.99 in the range level of 1 - 20 ng mL-1. The intra and interday coefficient of variation (CV) was less than 20% for the first point of the linear range and less than 15% for the other concentrations. The intra and interday relative standard deviation (RSD) was less than 20% for the first point of the linear range and less than 15% for the other concentrations. The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) ranged from 0,01 - 0,15 ng mL-1 and 0,05 - 0,4 ng mL-1, respectively. To evaluate the applicability of the method, ten saliva samples were analyzed, showing detectable concentrations (<LOQ) of bisphenol S (BPS), bisphenol AF (BPAF) and propylparaben (PrP). Bisphenol A (BPA) and benzophenone-3 (BP3) were found in ranging concentrations from 1,01 - 3,14 and 1,00 - 2,50 ng mL-1, respectively. Methylparaben (MeP) was detected in all samples, reaching, at the quantifiable levels, the concentration of 17,8 ng mL-1. Thus, the proposed method is a simple and fast alternative for human biomonitoring studies, capable of determining 17 multi-class analytes simultaneously using low volume of solvent.
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Determinação multirresíduo de agrotóxicos em água empregando microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) E GC-MS/MS / Multiresidue determination of pesticides in water using dispersive liquid-liquid microextration (DLLME) e GC-MS/MS

Floss, Vagner Medeiros 19 June 2015 (has links)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The use of pesticides is related to effectiveness in pest control, as well as productivity in food production in agriculture. However, the use of these substances in high amounts is directly affecting water resources, essential for the maintenance of human life. In Brazil, the Ministry of Health through Ordinance 2914, as well as the Secretariat of the Rio Grande do Sul State Health, by Ordinance 320, stipulate maximum permissible values (VMPs) for pesticides in water. Thus, rapid, sensitive, efficient and generate small amounts of toxic waste analytical methods should be developed to determine the presence and concentration of pesticides and other chemicals in water in order to ensure they are in accordance with current legislation. This study aimed to optimize and validate an analytical method aiming at the extraction and determination of residues of 32 pesticides in water samples by applying the DLLME technical and quantification by gas chromatography coupled to Mass Spectrometry in Triple Quadrupole series (GC-MS / MS). We evaluated the different extractor solvents and dispersor, different volumes of solvents, addition salts, pH variation and time of agitation. The results were satisfactory, with recovery values between 71 and 113% for the tested levels. The coefficients of determination for the curves drawn in the matrix, presented values between 0.9900 to 0.9996. Precision data for the methodology were satisfactory, with values between 1 and 13%. The intermediate precision was RSD values in the range of 5 to 15%, with recoveries in the range 70 to 101% for the level of 0.25 ug L-1. The method presented quantification limit of 0.1 ug L-1 providing the determination of water in pesticide residues with high reliability and security. After validation of this methodology, it was applied to real water samples, in order to evaluate the method developed. / O uso de agrotóxicos se relaciona com a efetividade no controle de pragas, como também com a produtividade na produção de alimentos na agricultura. Porem, o uso dessas substâncias em altas quantidades vem afetando diretamente os recursos hídricos, essenciais para a manutenção da vida humana. No Brasil, o Ministério da Saúde através da Portaria 2914, como também, a Secretaria da Saúde do Estado do Rio Grande do Sul, pela Portaria 320, estipulam valores máximos permitidos (VMPs) para agrotóxicos em água. Dessa forma, métodos analiticos rápidos, sensíveis, eficientes e que geram pequenos volumes de resíduos tóxicos, devem ser desenvolvidos para a determinação de resíduos de agrotóxicos e demais substâncias químicas em água afim de verificar se estão de acordo com as legislações vigentes. Este estudo teve por objetivo otimizar e validar um método analítico visando a extração e determinação de resíduos de 32 agrotóxicos em amostras de água, aplicando a técnica DLLME e quantificação por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas em série com analisador do tipo Triplo Quadrupolo (GC-MS/MS). Foram avaliados diferentes solventes extratores e dispersores, volumes de solventes, adição de sais, variação do pH e tempo de agitação. Os resultados obtidos foram satisfatórios, apresentando valores de recuperação entre 71 e 113 % para os níveis avaliados. Os coeficientes de determinação para as curvas extraídas, apresentaram valores entre 0,99 e 0,9996. Os resultados de precisão do metodologia foram satisfatórios, apresentando valores entre de 1 e 13 %. A precisão intermediária apresentou valores de RSD situados na faixa de 5 e 15 %, com recuperações na faixa de 70 à 101 % para o nível de 0,25 μg L-1. O método apresentou limite de quantificação 0,1 μg L-1. A determinação de resíduos de agrotóxicos em água com alta confiabilidade e segurança. Após a validação do método desenvolvido, o mesmo foi aplicado a amostras reais de água, que indicaram presença de Alacoro, Endussulfan Alfa e 4,4 DDE.
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Avaliação da microextração líquido-líquido dispersiva para determinação do levetiracetam e da risperidona por técnicas cromatográficas acopladas a espectrometria de massas / Evaluation of the dispersive liquid liquid microextraction for the determination of levetiracetam and risperidone by chromatographic techniques coupled mass spectrometry

Alcantara, Greyce Kelly Steinhorst 06 June 2016 (has links)
A microextração líquido-líquido dispersiva baseada no uso de solventes orgânicos (OS-DLLME) vem recebendo grande destaque devido a facilidade de operação, baixo custo, rapidez e um consumo mínimo de solventes. Previamente a OS-DLLME um pré-tratamento do plasma se faz necessário a fim de propiciar a formação de uma adequada fase sedimentada. O levetiracetam (LEV) é um dos fármacos mais prescritos para o tratamento de crises epilépticas parciais e com generalizações secundárias. Assim, foi desenvolvido e validado um método bioanalítico para a quantificação do LEV em amostras de plasma por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC/MS). O pré-tratamento das amostras de plasma empregou ultrafiltros Amicon® (poros com tamanho de 10 kDa) que formavam um permeado adequado para a realização da OS-DLLME. A adição de 130 ?L de clorofórmio (solvente extrator) e 400 ?L de isopropanol (solvente dispersor), sem alteração na força iônica e agitação da amostra, proporcionaram 33 % de recuperação do LEV nas amostras de plasma. Tal análise foi realizada usando uma coluna de sílica fundida recoberta com Rtx-5MS (30 m × 0,25 mm x 0,25 ?m) empregando uma rampa de aquecimento. O tempo total de corrida cromatográfica foi de 9 minutos. O método apresentou-se linear no intervalo de concentração de 2 - 80 ?g mL-1 (r >= 0,99), onde os resultados foram ponderados (peso =1/x). A validade da regressão foi confirmada aplicando o teste da falta de ajuste linear. O limite inferior de quantificação (LIQ) foi de 2 ?g mL-1. Os parâmetros de precisão, exatidão, efeito matriz, efeito carry-over e estabilidade demonstraram-se em conformidade com o European Medicines Agency. Outro método foi desenvolvido e validado para a quantificação da risperidona (RSP) e seu metabólito 9-hidroxi-risperidona (9-OH-RSP) em amostras de plasma. A RSP e 9-OH-RSP correspondem a \"fração ativa\" do medicamento responsável pela atividade anticonvulsivante. As amostras de plasma foram pré-tratadas com ácido tricloroacético (TCA 30 %). O sobrenadante límpido foi diluído com solução de NaCl (10 %) e ajustado para o valor de pH 12, no qual foi desenvolvido a OS-DLLME. Foi adicionado um volume de 500 ?L de acetona (solvente dispersor) e 80 ?L de clorobenzeno (solvente extrator). Após otimização da extração, foi alcançado 89 % e 42 % de recuperação da RSP e 9-OH-RSP, respectivamente. Para tais análises foi empregada a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial com ionização por eletrospray (LC-MS/MS). Uma coluna Ascentis® C18 (10 cm x 4,6 mm x 2,7 ?m), fase móvel composta por tampão acetato de amônio e acetonitrila, em modo de eluição gradiente, vazão de 500 ?L min-1 e temperatura da coluna de 40 ºC foram empregados. O tempo total da corrida cromatográfica foi de 8 minutos. O método foi linear na faixa de concentração de 5 - 80 ng mL-1 (r >= 0,99), para ambos os analitos. O LIQ foi de 5 ng mL-1. Todos os demais parâmetros estavam em conformidade com a agência regulatória. Ambos os métodos foram aplicados com sucesso em amostras de plasma de paciente em tratamento com LEV ou RSP. Desta forma foi possível demonstrar aplicabilidade dos métodos bioanalíticos desenvolvidos e averiguar a concentração plasmática dos devidos fármacos no paciente / Dispersive liquid-liquid microextraction technique based on the use of organic solvents (OS-DLLME) has received highlighted due to the easily, rapidity, low cost and low consumption of organic solvent. Prior to OS-DLLME, plasma pretreatment is necessary to provide the formation of a suitable settled phase. Levetiracetam (LEV) is one of the most prescribed drugs for the treatment-refractory partial onset seizures with or without secondary generalization. So, it was developed and validated a bioanalytical method for the quantification of LEV in plasma samples by Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC/MS). The pretreatment of the plasma samples employed tubes of ultrafiltration Amicon® (pore size 10 kDa) in order to form a suitable permeated to carry out the OS-DLLME. The addition of 130 ?L of chloroform (extraction solvent) and 400 ?L of isopropanol (disperser solvent), without ionic strength and agitation of samples, have reached 33 % of recovery of LEV from plasma samples. This analysis was carried out using a fused silica coated Rtx-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 ?m) and a heating ramp. The run time was 9 minutes. The method was linear in the concentration range of 2 - 80 ?g mL-1 (r >= 0.99) and the results were weighted (1/x). The linear regression was confirmed by applying the lack of fit test. The lower limit of quantitation (LLOQ) was 2 ?g mL-1. The precision, accuracy, matrix effect, carry-over and stability were in agreement with European Medicines Agency. Another method was developed and validated for the quantification of risperidone (RSP) and its 9-hydroxy-risperidone metabolite (9-OH-RSP) from plasma samples. The RSP and 9-OH-RSP constitutes the total active moiety responsible for the anticonvulsant activity. Plasma samples were pretreated with trichloroacetic acid (TCA 30%). The clear supernatant was diluted with NaCl solution (10%) and adjusted to pH 12, where was developed the OS-DLLME. It was added 500 ?L of acetone (dispersing solvent) and 80 ?L of chlorobenzene (extraction solvent). After the parameters optimization, the recovery was 89% and 42% for RSP and 9-OH-RSP, respectively. It was employed liquid chromatography-electrospray-tandem-mass spectrometry (LC/ MS/MS). Ascentis® C18 column (10 cm x 4.6 mm x 2.7 ?M), ammonium acetate buffer and acetonitrile as mobile phase in gradient elution mode, at flow rate 500 ?L min-1 and column temperature of 40 °C for this analysis. The run time was 8 minutes. The method was linear in the concentration range 5 - 80 ng mL-1 (r >= 0.99) for both analytes. The LLOQ was 5 ng mL-1. All other parameters were in agreement with the regulatory agency. Both methods have been successfully applied in plasma samples from patient that receive diary doses of LEV or RSP. In this way, it was possible to present the applicability of developed bioanalytical methods and the quantitation of plasmatic concentration of these studied drugs.
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Determinação de resíduos de compostos orgânicos em água por microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) E GC-(TQ)MS/MS / Simultaneous determination of organic compound residues in water samples by dispersive liquidliquid microextraction (DLLME) AND GC-(TQ)MS/MS

Martins, Manoel Leonardo 29 November 2010 (has links)
The use of chemicals, which generates a lot off benefits, is responsible for the contamination of soil, water and foods. The concern about contamination of surface and ground water systems by pesticides has grown in scientific circles, especially by the presence of pesticides and other compounds in water sources. Thus, rapid analytical methods, sensitive and efficient must be developed in order to verify the concentration levels of pesticides and other organic compounds in water samples agree with those established by law to protect human health and the environment media. This study aimed to optimize, validate and implement an extraction method to determine residues of mononitro, ketones, trifluralin, oxirane, lindane, 2,4-D ester, chlorpyrifos, bromoketal, α-endosulfan, β-endosulfan and endosulfan sulfate in samples of tap water, industrial wastewater and groundwater by Dispersive Liquid-Liquid Microextraction (DLLME) modified and Gas Chromatography with Mass Spectrometry Tandem using Triple Quadrupole type (GC-(TQ)MS/MS). The method is based on the rapid injection, with a syringe, of a mixture of an extractor solvent (50 μL of carbon tetrachloride) and an dispersor solvent (2.0 mL acetone) previously cooled (ice batch, 0 - 4 °C) in an aqueous sample (5.0 mL), contained in a 10 mL graduated glass tube with conical bottom, with no pH correction and cooled (ice batch, 0 - 4 °C). It is not necessary to stir the sample in this step. Remove 25 μL of the sedimented phase separated by simple sedimentation for 10 min. from the bottom of conical tube with a microsyringe and transferred to a vial of 200 μL for GC- (TQ)MS/MS determination. The preconcentration factor obtained was 100 times. The method was validated by determining the limits of detection and quantification limits (LOD and LOQ), linearity, precision and accuracy. The calibration curves showed adequate linearity between 0.05 e 10 μg L-1 with coefficients of determination higher than 0.993. The method showed good recovery values between 70 and 115%, RSD(%) ranged from 10.9 to 17.2%, LOQs between 0.02 and 0.09 μg L-1, and was considered adequate for the analysis of pesticide residues and other organic compounds evaluated in water samples. After validation, the method was applied to samples of drinking water, industrial wastewater and groundwater. No pesticide residues and other organic compounds evaluated were found in the water samples tested. / A utilização de substâncias químicas, que por um lado gera benefícios, por outro é responsável pela contaminação do solo, água e alimentos.A preocupação com a contaminação de sistemas aquáticos superficiais e subterrâneos por pesticidas tem crescido no meio científico, em especial pela presença de pesticidas e outras susbtâncias químicas em mananciais de água. Dessa forma, métodos analíticos rápidos, sensíveis e eficientes têm de ser desenvolvidos para verificar se os níveis de concentração dos pesticidas e outras substâncias químicas em amostras de água estão de acordo com os estabelecidos pela legislação, a fim de resguardar a saúde humana e o meio ambiente. Este estudo teve como finalidade otimizar, validar e aplicar um método de extração e determinação de resíduos de mononitro, ketona, trifluralina, oxirano, lindano, 2,4-D-éster, clorpirifós, bromoketal, α-endosulfan, β-endosulfan e endosulfan sulfato em amostras água de torneira, efluente industrial e água subterrânea, aplicando a técnica DLLME modificada e quantificação por Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas Sequencial tipo Triplo Quadrupolo (GC-(TQ)MS/MS). A técnica de extração DLLME está baseada na injeção rápida, com auxílio de uma seringa, de uma mistura dos solventes extrator (50 μL de tetracloreto de carbono) e dispersor (2,0 mL de acetona) previamente resfriada em banho de gelo a uma temperatura entre 0 e 4 °C, em uma amostra aquosa (5,0 mL) contida em um tubo de vidro, com fundo cônico, graduados com volume de 10 mL, sem correção de pH e mantida resfriada em banho de gelo entre 0 e 4 °C. O procedimento não requer agitação da amostra. Retira-se a fase sedimentada separada por sedimentação simples após 10 min., do fundo do tubo cônico com auxílio de uma microseringa de 25 μL e transfere-se para um frasco de 200 μL, para determinação no sistema GC-(TQ)MS/MS. O fator de pré-concentração obtido é de 100 vezes. Na validação do método determinaram-se os limites de detecção e limites de quantificação (LOD e LOQ), linearidade, precisão e exatidão. As curvas analíticas apresentaram linearidade adequada entre 0,05 e 10 μg L-1 com valores de coeficiente de determinação superior a 0,993. O método apresentou bons valores de recuperação, entre 70 e 115% e RSD(%) entre 10,9 e 17,2%, com LOQs entre 0,02 e 0,09 μg L-1. O método foi considerado adequado para a análise de resíduos dos pesticidas em estudo em amostras de água. Após a validação, o método foi aplicado em amostras de água de potável, efluente industrial e água subterrânea. Não foram encontrados resíduos dos pesticidas e outras substâncias químicas estudados nas amostras analisadas.
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Desenvolvimento de procedimento analítico para a determinação dos íons Ni2+ e Co2+ em bebidas não alcoólicas após a DLLME

Antelmo, Vanessa Soares Utchuk January 2014 (has links)
Orientadora: Profa. Dra. Ivanise Gaubeur / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Graduação em Ciência & Tecnologia/Química, 2014. / O preparo de amostra e uma das etapas mais importantes e criticas da sequencia analitica por interferir diretamente na exatidao, precisao, seletividade e confiabilidade dos resultados obtidos. Varios procedimentos tem sido desenvolvidos e propostos com o objetivo de proporcionar rapidez, simplicidade, baixo custo e menor consumo de reagentes e amostra. Este trabalho propoe o desenvolvimento de procedimento analitico utilizando a micro extracao liquido-liquido dispersiva (DLLME) como etapa previa de extracao e pre-concentracao visando eliminar a matriz e melhorar a sensibilidade do metodo de espectrometria de absorcao atomica com chama (FAAS). Utilizou-se a ferramenta de planejamentos experimentais StatisticaR com o objetivo de avaliar as variaveis mais significativas do metodo que sao volumes de solvente extrator e dispersor, tempo de extracao e adicao de NaCl. Estas variaveis influenciam diretamente na eficiencia do metodo. Um estudo univariado foi realizado para avaliar o tipo dos solventes extrator e dispersor, adicao de NaCl e concentracao do ligante DPKBH. Selecionou-se as seguintes condicoes apos o desenvolvimento do procedimento: 100 / Sample preparation is one of the most important and critical stages of an analytical sequence because it interferes directly in the accuracy, precision, selectivity and confiability of results. Several procedures have been developed to obtain rapidity, simplicity, low cost and lower sample and reagents consumption. This work aim the development of an analytical procedure using dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) as a previous step of extraction and preconcentration to eliminating the matrix and improve the sensibility of the flame atomic absorption spectrometry (FAAS). We used factorial designs with the software StatisticaR to evaluate the interaction of variables: extracting and dispersing solvent volumes, extraction time, NaCl addition, because these variables influence directly the efficiency of DLLME procedure. A univariable study was made to measure influences of disperser and extractor solvents, NaCl addition and concentration of DBKBH, the following conditions have been selected: 100

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