Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-24T19:12:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 264160.pdf: 2865891 bytes, checksum: cb44ee2073dbe211f744f1d28d47c283 (MD5) / A mucosa bucal funciona como um sítio atrativo para a liberação sistêmica de fármacos, que incluem peptídeos e proteínas, em função da sua permeabilidade considerável e por evitar os efeitos hepáticos e intestinais de primeira passagem. A pele representa outra via alternativa, podendo também ser direcionada para efeitos locais ou sistêmicos, com a vantagem de conveniência na administração/aplicação, além de também evitar o metabolismo de primeira passagem. Para a avaliação do potencial destas vias como sítio de liberação de fármacos e para a estimativa de efeitos tóxicos de compostos utilizados no desenvolvimento de formulações, o modelo da câmara de Franz foi selecionado para este propósito. A mucosa esofágica suína tem mostrado ser um substituto útil e prático da mucosa bucal suína nos estudos de permeabilidade ex vivo por oferecer uma maior área de superfície e facilidade no preparo do tecido. Além disto, estes tecidos demonstraram características histológicas similares. Assim, parâmetros de permeabilidade tais como fluxo, tempo de latência e coeficiente de permeabilidade da carbamazepina (CBZ) e do acetonido de triancinolona (AT) foram estimados nestas mucosas, para fins de comparação. Além disto, o efeito do congelamento (-80oC) sobre a permeabilidade ex vivo destes fármacos nas mucosas bucal e esofágica suínas também foi avaliado. Para os estudos de permeação ex vivo, através da pele de orelha de porco, selecionou-se o metil, etil, propil e butilparabeno, tendo em vista os questionamentos recentes sobre a segurança dos mesmos, decorrente das suas absorções sistêmicas. O efeito das interações destes adjuvantes farmacêuticos na permeação cutânea foi avaliado através de delineamento fatorial. As amostras testadas foram veiculadas em soluções e, como meio de dissolução da fase receptora, soluções tampões em presença de solubilizante, geralmente o etanol (estabelecimento da condição sink) foram utilizadas. Métodos analíticos, previamente validados, tais como cromatografia líquida de alta eficiência, espectrofotometria na região do ultravioleta e eletroforese capilar foram selecionados para a quantificação dos fármacos e adjuvantes. Os resultados indicaram que as mucosas esofágicas suínas poderiam substituir as bucais nos estudos de permeabilidade ex vivo da CBZ, tendo em vista a semelhança estatística (p>0,05; SNK) entre os parâmetros de permeabilidade calculados a partir das cinéticas de permeação da CBZ. Já para o AT, os resultados desta comparação foram estatisticamente diferentes (p<0,05; SNK) e, neste caso, a mucosa esofágica suína não seria recomendada como substituto da mucosa bucal suína. Mesmo que o congelamento não tenha alterado os parâmetros de permeabilidade para a CBZ, observou-se maior retenção deste fármaco em tecidos congelados, provavelmente devido à formação de vacúolos, fato observado durante a avaliação histológica destes tecidos. Para o AT, não foi observada diferença estatística significante (p>0,05; SNK) entre os parâmetros de permeabilidade dos tecidos frescos e congelados. Assim sendo, os tecidos congelados poderiam ser utilizados nas situações em que a avaliação da retenção não é desejada. A ordem de permeação dos parabenos (BP=PP<EP<MP), através da pele de orelha de porco, foi contrária a ordem de lipofilicidade dos mesmos (BP>PP>EP>MP), notando-se maior retenção dos parabenos na epiderme do que na derme, provavelmente pelas diferenças no conteúdo lipídico destas camadas. No delineamento fatorial, efeitos estatisticamente significantes foram observados apenas para as combinações MP e EP, bem como para MP e PP, com redução nos fluxos de permeação e, assim sendo, estas associações seriam recomendadas até a definição de protocolos de segurança mais confiáveis, tendo em vista que efeitos nocivos destes adjuvantes seriam observados quando das suas absorções sistêmicas, conforme literatura. The buccal mucosa serves as an attractive site for the systemic delivery of drugs, including peptides and proteins, because of its considerable permeability and the avoidance of intestinal and hepatic first-pass effects. The skin represent another alternative, can be directed to local or systemic effects, with the advantage of administration convenience, and also it avoid the first-pass metabolism. To assess the potential of these routes as a drugs delivery site and to estimate the toxic effects of compounds used in the formulations development, the model of Franz diffusion cell was selected for this purpose. The porcine esophageal mucosa has been shown be a useful and practical substitute for porcine buccal mucosa ex vivo permeability studies in that it offers a larger surface area and it is much easier to prepare. Further, these tissues demonstrated similar histological characteristics. Thus, permeability parameters such as flux, lag time and permeability coefficient of carbamazepine (CBZ) and triamcinolone acetonide (AT) were estimated in these mucosae, for comparison purposes. In addition, the freezing effect (-80oC) on the ex vivo permeability of these drugs in the porcine buccal and esophageal mucosae was also evaluated. To evaluate the ex vivo permeation through pig ear skin were selected methyl- (EP), ethyl- (EP), propyl- (PP) and butyl- (BP) paraben due the recent questions about safety, resulting from systemic absorption of these parabens. The interactions effect of pharmaceutical adjuvants in skin permeation was assessed by factorial design. The tested samples were incorporated in solutions and as dissolution mean of the receptor phase were used buffer solutions in the solubilising presence, usually ethanol (establishment of sink condition). Analytical methods, previously validated, such as high performance liquid chromatography, UV/Vis spectrophotometry and capillary electrophoresis were selected to the drugs and adjuvants quantification. The results indicated that the esophageal could replace the buccal mucosa in CBZ permeability studies, considering the statistical similarity (p> 0.05, SNK) between the calculated permeability parameters from CBZ diffusion kinetics. For the AT, results of this comparison were statistically different (p <0.05, SNK) and in this case the swine esophageal mucosa would not be recommended as a substitute for porcine buccal mucosa. Although freezing has not changed the CBZ permeability parameters, there was greater drug retention in frozen tissue probably due to the formation of vacuoles, fact shown during the histological evaluation of these tissues. For the AT, there was no significant statistically difference (p> 0.05, SNK) between the permeability parameters of fresh and frozen tissues. Therefore, the frozen tissue could be used when retention evaluation is not required. The parabens permeation order (BP = PP <EP <MP) through the pig ear skin was contrary to the lipophilicity order of these (BP> PP> EP> MP), presenting higher parabens retention in epidermis than dermis, probably due lipid content differences of these layers. In the factorial design, significant statistically effects were shown only for MP and EP as well as MP and PP combinations with reduction in permeation fluxes. In this way, these associations would be recommended until definition of security protocols more reliable, by consider that harmful adverse effects of these adjuvants would be shown when of their systemic absorption, according literature.

Baseado na técnica de Microextração Liquido-Líquido Dispersiva (DLLME) desenvolveu-se uma metodologia de extração para analisar, por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector ultravioleta (HPLC-UV), a presença do propilparabeno (PrP) e do butilparabeno (BuP) nas águas da Bacia do Rio Pardo. O método proposto apresentou um limite de detecção e de quantificação de 62,60 e 187,60 &micro;g/L para o Prp e de 58,40 e 175,20 &micro;g/L para o BuP. Análise das amostras coletadas (18 amostras) apresentou um teor de 2,2 a 6,8 &micro;g/L para o PrP e de 1,9 a 4,9 &micro;g/L para o Bup. Além de analisar a presença dos parabenos nas águas do Rio Pardo, estudou-se também a degradação do PrP, do BuP e da mistura PrP mais BuP ( PrP + BuP) pelas técnicas de fotólise e fotoeletrocatálise em solução de água deionizada e em água de rio (Rio Pardo) em diferentes concentrações (5, 10, 20 e 30 mg/L) e pH (4, 7 e 10). A remoção dos parabenos em ambas as técnicas foi superior a 99%. Na fotólise, o tempo de degradação da menor para a maior concentração variou de 25 a 85 minutos enquanto na fotoeletrocatálise ele foi de 12 a 55 minutos, sendo as melhores condições em água deionizada e em meio ácido e neutro (pH 4 e 7). Análise do Carbono Orgânico Total (TOC) das soluções fotolisadas em água deionizada e em diferentes pH\'s (4, 7 e 10) revelou, para o PrP, uma remoção de 16,3 a 25,25 %. Para o BuP, na mesma sequência de pH, a remoção foi de 15 a 23,55%. Na fotoeletrocatálise a remoção de TOC para o PrP nos pH 4, 7 e 10 variou de 33,3 a 36,5 % enquanto para o BuP ela foi de 35,2 a 38,3 %. Teste de citotoxicidade mostrou que o PrP, o BuP e a mistura PrP-BuP são atóxico para as células de fibroblastos Balb/c 3T3 clone A31 antes e após as degradações, todavia são estrogênicos para as células de adenocarcinoma mamário MCF-7. Para o PrP, após ambos os processos de degradação, a estrogenicidde foi completamente abolida, enquanto que para o BuP e para mistura (PrP+BuP) ela foi reduzida, porém não totalmente eliminada. / Based on the dispersive Liquid-Liquid Microextraction technique (DLLME) developed an extraction methodology to analyze by High Performance Liquid Chromatography with Ultraviolet detection (HPLC-UV), the presence of propylparaben (PrP) and butylparaben (BuP) in the waters of the Pardo River Basin. The proposed method has a limit of detection and quantification of 62,60 and 187,60 &micro;g /L of PrP and 58.40 and 175.20 &micro;g /L for BuP. Analysis of the samples (18 samples) showed a content of 2.2 to 6.8 &micro;g / L for the PrP and 1.9 to 4.9 &micro;g / L for the Bup. In addition to analyzing the presence of parabens in the waters of the Pardo River, studied also the degradation of PrP, BuP and mixture PrP more BuP (PrP + BuP) for photolysis and photoelectrocatalysis techniques in deionized water solution and river water (Pardo River) at different concentrations (5, 10, 20 and 30 mg / L) and pH (4, 7 and 10). Removal of parabens in both techniques was greater than 98%. The degradation time in the photolysis ranged from 25 to 85 minutes while in photoelectrocatalysis was of 12 to 55 minutes, being the best conditions in deionized water and in acidic and neutral medium (pH 4 and 7). Analysis of Total Organic Carbon (TOC) of the solution photolysed in deionized water at different pHs (4, 7 and 10) showed to PrP, a removal of 16.3 25.25%. For BuP in the same sequence pH, the removal was 15 to 23.55%. In photoelectrocatalysis TOC removal for PrP in pH 4, 7 and 10 ranged from 33.3 to 36.5% whereas for BuP it was 35.2 to 38.3%.Cytotoxicity test showed that PrP, BUP and PrP-BuP mixture is nontoxic to the cells fibroblasts Balb / c 3T3 clone A31 before and after degradation, however are estrogenic for breast adenocarcinoma cells MCF-7. For the PrP, after photolysis and photoelectrocatalysis, it was completely abolished whereas for BuP and mixture (PrP + BuP), it was reduced but not completely eliminated.

Baseado na técnica de Microextração Liquido-Líquido Dispersiva (DLLME) desenvolveu-se uma metodologia de extração para analisar, por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector ultravioleta (HPLC-UV), a presença do propilparabeno (PrP) e do butilparabeno (BuP) nas águas da Bacia do Rio Pardo. O método proposto apresentou um limite de detecção e de quantificação de 62,60 e 187,60 &micro;g/L para o Prp e de 58,40 e 175,20 &micro;g/L para o BuP. Análise das amostras coletadas (18 amostras) apresentou um teor de 2,2 a 6,8 &micro;g/L para o PrP e de 1,9 a 4,9 &micro;g/L para o Bup. Além de analisar a presença dos parabenos nas águas do Rio Pardo, estudou-se também a degradação do PrP, do BuP e da mistura PrP mais BuP ( PrP + BuP) pelas técnicas de fotólise e fotoeletrocatálise em solução de água deionizada e em água de rio (Rio Pardo) em diferentes concentrações (5, 10, 20 e 30 mg/L) e pH (4, 7 e 10). A remoção dos parabenos em ambas as técnicas foi superior a 99%. Na fotólise, o tempo de degradação da menor para a maior concentração variou de 25 a 85 minutos enquanto na fotoeletrocatálise ele foi de 12 a 55 minutos, sendo as melhores condições em água deionizada e em meio ácido e neutro (pH 4 e 7). Análise do Carbono Orgânico Total (TOC) das soluções fotolisadas em água deionizada e em diferentes pH\'s (4, 7 e 10) revelou, para o PrP, uma remoção de 16,3 a 25,25 %. Para o BuP, na mesma sequência de pH, a remoção foi de 15 a 23,55%. Na fotoeletrocatálise a remoção de TOC para o PrP nos pH 4, 7 e 10 variou de 33,3 a 36,5 % enquanto para o BuP ela foi de 35,2 a 38,3 %. Teste de citotoxicidade mostrou que o PrP, o BuP e a mistura PrP-BuP são atóxico para as células de fibroblastos Balb/c 3T3 clone A31 antes e após as degradações, todavia são estrogênicos para as células de adenocarcinoma mamário MCF-7. Para o PrP, após ambos os processos de degradação, a estrogenicidde foi completamente abolida, enquanto que para o BuP e para mistura (PrP+BuP) ela foi reduzida, porém não totalmente eliminada. / Based on the dispersive Liquid-Liquid Microextraction technique (DLLME) developed an extraction methodology to analyze by High Performance Liquid Chromatography with Ultraviolet detection (HPLC-UV), the presence of propylparaben (PrP) and butylparaben (BuP) in the waters of the Pardo River Basin. The proposed method has a limit of detection and quantification of 62,60 and 187,60 &micro;g /L of PrP and 58.40 and 175.20 &micro;g /L for BuP. Analysis of the samples (18 samples) showed a content of 2.2 to 6.8 &micro;g / L for the PrP and 1.9 to 4.9 &micro;g / L for the Bup. In addition to analyzing the presence of parabens in the waters of the Pardo River, studied also the degradation of PrP, BuP and mixture PrP more BuP (PrP + BuP) for photolysis and photoelectrocatalysis techniques in deionized water solution and river water (Pardo River) at different concentrations (5, 10, 20 and 30 mg / L) and pH (4, 7 and 10). Removal of parabens in both techniques was greater than 98%. The degradation time in the photolysis ranged from 25 to 85 minutes while in photoelectrocatalysis was of 12 to 55 minutes, being the best conditions in deionized water and in acidic and neutral medium (pH 4 and 7). Analysis of Total Organic Carbon (TOC) of the solution photolysed in deionized water at different pHs (4, 7 and 10) showed to PrP, a removal of 16.3 25.25%. For BuP in the same sequence pH, the removal was 15 to 23.55%. In photoelectrocatalysis TOC removal for PrP in pH 4, 7 and 10 ranged from 33.3 to 36.5% whereas for BuP it was 35.2 to 38.3%.Cytotoxicity test showed that PrP, BUP and PrP-BuP mixture is nontoxic to the cells fibroblasts Balb / c 3T3 clone A31 before and after degradation, however are estrogenic for breast adenocarcinoma cells MCF-7. For the PrP, after photolysis and photoelectrocatalysis, it was completely abolished whereas for BuP and mixture (PrP + BuP), it was reduced but not completely eliminated.

Unidad de práctica para optar al título de Químico Farmacéutico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / En el siguiente informe se desarrolló la validación e implementación de una metodología para el análisis microbiológico de un producto líquido, preservado con parabenos, elaborado en laboratorio MINTLAB Co. S.A. Basándose en las técnicas de análisis propuestas por la United States Pharmacopeia (USP 36). Para el desarrollo de la presente validación secundaria, se procedió a trabajar con un producto farmacéutico líquido; Ibuprofeno suspensión oral 5 mg/100 mL, preservado con metilparabeno; uno de los agentes utilizados en formulaciones. Para el desarrollo de éste trabajo se utilizaron microorganismos estándares sugeridos por la USP 36; para los ensayos cuantitativos se trabajó con: Escherichia coli, Salmonella tiphymurium, Staphylococcus aureus, Pseudomona aeruginosa, Bacillus subtillis. Candida albicans y Aspergillus brasilensis Para los ensayos de ausencia/presencia (cualitativos), se utilizaron: Escherichia coli, y Salmonella tiphymurium Previo al desarrollo de la validación, se realizó un test de promoción de crecimiento, esto con el fin de comprobar, la aptitud e idoneidad de los medios de cultivos, utilizados. Los resultados obtenidos estuvieron conforme a los esperados basándose en la teoría y con la metodología seguida de la USP 36, logrando el cumplimiento de los criterios establecidos por la USP 36. Es decir, se obtuvieron porcentajes de recuperación mayores al 70%, además de coeficiente de variación entre los grupos de ensayo menores al 15%. Confiriendo así la aprobación de la validación de la técnica de análisis microbiológico para el control de calidad de un producto líquido preservado con metilparabeno

Os parabenos são conservantes largamente utilizados na indústria cosmética, em produtos farmacêuticos e como aditivos alimentares. Têm uma longa história de utilização, uma vez que são economicamente muito rentáveis e pensa-se que são relativamente atóxicos para o homem. No entanto, recentes estudos apontam que os parabenos podem ter atividade estrogênica. O batom é um cosmético amplamente utilizado pelas mulheres e os componentes dele podem ser absorvidos tanto pela mucosa oral, quanto pelo trato digestório. A Cosmetotoxicologia é uma nova especialidade, dentro da Toxicologia, que surgiu graças às demandas do setor produtivo e do regulatório, e visa contribuir para a obtenção e/ou liberação para a população de produtos seguros e normatizados. Nesse contexto, é crescente a demanda para o desenvolvimento de métodos analíticos capazes de quantificar os parabenos nos cosméticos com confiabilidade, para fins de fiscalização e controle de qualidade. Além disso, como não são conhecidos os dados cinéticos dessas substâncias, faz-se necessário também desenvolver métodos para quantificar esses analitos em matrizes biológicas. Desse modo esse trabalho propõe, pela primeira vez, estudar a correlação entre o uso do batom e a concentração de parabenos no soro de mulheres que fazem uso desse cosmético labial. As metodologias de análise de parabenos tanto em batom quanto em sangue foram desenvolvidas e validadas seguindo protocolos de validação e os resultados foram satisfatórios para todos os parâmetros avaliados, tais como seletividade, detectabilidade, linearidade, precisão e exatidão. Foram analisadas amostras de 18 voluntárias em 3 fases, nas quais, em uma delas, as mulheres usaram batom contendo uma concentração conhecida de parabenos. Após tratamento estatístico dos dados, com aplicação de testes não-paramétricos, foi possível concluir que há absorção de parabenos por meio do uso de batom, uma vez que foi demonstrada diferença estatisticamente significativa (p < 0,05, no teste de Friedman) entre as concentrações de parabenos no soro de mulheres que utilizaram batom, contendo essas substâncias, em relação ao não uso do cosmético labial, e foi demonstrada forte correlação (coeficiente de Spearman com r= 0,7205) entre a quantidade usada desse batom e a concentração de parabenos no soro. / Parabens preservatives are widely used in the cosmetic, pharmaceuticals and food industry as additives. They have a long history of use since they are economically very advantageous and it is thought that they are relatively nontoxic to humans. However, recent studies indicate that parabens may have estrogenic activity. Lipstick is a cosmetic widely used by women and the components of it can be absorbed by both the oral mucosa, as the digestive tract. The Cosmetotoxicology is a new specialty within the Toxicology, which came about thanks to the demands of the productive and the regulatory sector, and aims to obtain and release of safe and standardized products to the public. In this context, there is a growing demand for the development of analytical methods to quantify parabens in cosmetics with reliably for inspection and quality control. Furthermore, since the kinetic data of these substances are not known, is also necessary to develop methods to quantify these analytes in biological matrices. Thus this paper proposes, for the first time a correlation between the use of lipstick and the amount of parabens in women who make use of this cosmetic. Methodologies of parabens analysis both in lipstick and in blood were developed and validated following validation protocols and the results were satisfactory for all parameters such as selectivity, detectability, linearity, precision and accuracy. Samples of 18 volunteers were analyzed in three stages, which in one of these stages, they made use of lipstick with parabens in a known concentration. After statistical processing of data, using a non-parametric tests, it was concluded that there is absorption of parabens through the use of lipstick, as was demonstrated statistically significant difference (p <0.05, the Friedman test) between the concentrations of parabens in the serum of women who used lipstick containing these substances, in relation to the non-use of cosmetic lip and was demonstrated strong correlation (Spearman coefficient r = 0.7205) between the used amount of lipstick and the concentration of parabens in serum. / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Os parabenos utilizados como conservantes nas indústrias de cosméticos, alimentos e fármacos não são removidos por completo nas estações de tratamento de água e esgoto, além disso, podem causar danos a biota aquática. O presente estudo teve como finalidade aplicar um método analítico novo para quantificar o metil (MP), etil (EP), propil (PP), butil (BP), benzilparabeno (BzP) e a mistura (metil e propilparabeno) em amostras de água dos aquários com tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus). A técnica analítica usada foi a cromatografia líquida com detector de arranjo de diodo (HPLC-DAD). Avaliou-se a toxicidade dos parabenos em tilápias e os efeitos nos biomarcadores bioquímicos dos animais após 6 e 12 dias dos testes de exposição e por administração via injeção intraperitoneal. A concentração dos parabenos utilizada em todos os testes foi de 4,0 mg L-1 (de cada parabeno individualmente) e de 6,0 mg L-1 do metil e de 1,7 mg L-1 do propilparabeno para a mistura. Foram feitas análises nos biomarcadores superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), glutationa reduzida(GSH-t) e peroxidação lipídica (MDA). O limite de detecção dos parabenos foi de 0,03 mg L-1 (MP e EP), 0,05 mg L-1 (PP) e 0,10 mg L-1 (BP e BzP), e o limite de quantificação foi de 0,13 mg L-1 (MP, EP, PP), 0,18 mg L-1 (BP) e 0,25 mg L-1 (BzP). Foi possível quantificar somente o PP e a mistura (MP + PP) nas amostras de água dos aquários que continham peixe, no máximo 30 h após a exposição. Nas amostras de água sem a presença dos peixes, foi possível quantificar o BP e a mistura, metil e propilparabeno, durante os 12 dias de exposição. Os testes de toxicidade mostraram que a concentração letal para 50% dos indivíduos após 48 h de exposição foi de 67,11 mg L-1 do MP, 24,08 mg L-1 do EP, 17,34 mg L-1 do PP, 7,98 mg L-1 do BzP e 7,80 mg L-1 do BP, sendo que estes dois últimos compostos podem ser considerados os mais tóxicos da classe. Outro modo de ação tóxica também observada dos parabenos foi a narcose, ou seja, a perda temporária da consciência e da mobilidade. À medida que aumenta o comprimento da cadeia, aumenta a lipofilicidade destas substâncias, que está relacionada com o coeficiente de partição octanol/água (Kow) das mesmas e consequentemente aumenta a toxicidade. Estes dados indicaram que quanto mais lipofílico mais tóxico é o composto. Relacionando as atividades enzimáticas testadas com os níveis de peroxidação lipídica, o metilparabeno foi o único composto capaz de provocar danos aos tecidos testados por meio das espécies reativas de oxigênio. Isso foi comprovado através da inibição da atividade das enzimas analisadas com o aumento nos níveis de MDA. Por outro lado, mesmo com as enzimas antioxidantes apresentando atividades elevadas isso não foi suficiente para impedir a redução nos níveis de GSH-t. Tais resultados indicam que os parabenos podem agir negativamente nas tilápias. / Parabens, used as preservatives in cosmetics, foodstuffs and pharmaceuticals are not completely removed from water in sewage treatments, which may cause damage to aquatic biota. The present study addresses a new methodology to measure the quantity of methyl (MP), ethyl (EP), propyl (PP), butyl (BP), benzyl (BzP) parabens and a mixture of methyl and propylparaben in water. Aquarium water of experiments with tilapia samples was analyzed for 12 days by liquid chromatography with a doide array detector (HPLC-DAD). The toxicity of parabens in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and its effects on biochemical biomarkers were also evaluated after 6 and 12 days of exposure and intraperitoneal injection. The concentrations of parabens used in all tests were 4.0 mg L-1 (alone) and to mixture was 6.0 mg L-1 of methyl and 1.7 mg L-1 of propylparaben. Biomarkers, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), glutathione reduced (GSH-t) and lipid peroxidation (MDA) were analyzed. The results show the detection limits for the analysis of parabens were 0.03 mg L-1 (MP and EP), 0.05 mg L-1 (PP) and 0.10 mg L-1 (BP and BzP), and the quantification limits were 0.13 mg L-1 (MP, EP, PP), 0.18 mg L-1 (BP) and 0.25 mg L-1 (BzP). In the water sample with fish, the compounds PP and the mixture (MP + PP) could be quantified up to 30h after exposure. In the water sample without fish, the compounds BP and the mixture were quantified for 12 days of exposure. Toxicity test revealed the lethal concentrations for 50% of individuals after 48 h of exposure were 67.11 mg L-1 for MP, 24.08 mg L-1 for EP, 17.34 mg L-1 for PP, 7.98 mg L-1 for BzP and 7.80 mg L-1 for BP. Therefore, BzP and BP can be considered the most toxic of the class. As the chain length grows, the lipophilicity of the substances increases. Such an increase is related to their octanol/water (Kow) partition coefficient and, consequently, increases toxicity. Another toxic action observed for the parabens was the temporary loss of consciousness and mobility of the organisms. According to the enzymatic activity tested and the lipid peroxidation levels, the methylparaben was the only compound that caused damage by reative oxidative species, supported by the inhibition of the activities of the enzymes and the increase in the MDA levels. However, the high activity of the antioxidant enzymes to exposure and intraperitoneal injections could not prevent the reduction in the levels of GSH-t. Such results indicate parabens can cause negative effects on tilapia.

Os parabenos utilizados como conservantes nas indústrias de cosméticos, alimentos e fármacos não são removidos por completo nas estações de tratamento de água e esgoto, além disso, podem causar danos a biota aquática. O presente estudo teve como finalidade aplicar um método analítico novo para quantificar o metil (MP), etil (EP), propil (PP), butil (BP), benzilparabeno (BzP) e a mistura (metil e propilparabeno) em amostras de água dos aquários com tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus). A técnica analítica usada foi a cromatografia líquida com detector de arranjo de diodo (HPLC-DAD). Avaliou-se a toxicidade dos parabenos em tilápias e os efeitos nos biomarcadores bioquímicos dos animais após 6 e 12 dias dos testes de exposição e por administração via injeção intraperitoneal. A concentração dos parabenos utilizada em todos os testes foi de 4,0 mg L-1 (de cada parabeno individualmente) e de 6,0 mg L-1 do metil e de 1,7 mg L-1 do propilparabeno para a mistura. Foram feitas análises nos biomarcadores superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), glutationa reduzida(GSH-t) e peroxidação lipídica (MDA). O limite de detecção dos parabenos foi de 0,03 mg L-1 (MP e EP), 0,05 mg L-1 (PP) e 0,10 mg L-1 (BP e BzP), e o limite de quantificação foi de 0,13 mg L-1 (MP, EP, PP), 0,18 mg L-1 (BP) e 0,25 mg L-1 (BzP). Foi possível quantificar somente o PP e a mistura (MP + PP) nas amostras de água dos aquários que continham peixe, no máximo 30 h após a exposição. Nas amostras de água sem a presença dos peixes, foi possível quantificar o BP e a mistura, metil e propilparabeno, durante os 12 dias de exposição. Os testes de toxicidade mostraram que a concentração letal para 50% dos indivíduos após 48 h de exposição foi de 67,11 mg L-1 do MP, 24,08 mg L-1 do EP, 17,34 mg L-1 do PP, 7,98 mg L-1 do BzP e 7,80 mg L-1 do BP, sendo que estes dois últimos compostos podem ser considerados os mais tóxicos da classe. Outro modo de ação tóxica também observada dos parabenos foi a narcose, ou seja, a perda temporária da consciência e da mobilidade. À medida que aumenta o comprimento da cadeia, aumenta a lipofilicidade destas substâncias, que está relacionada com o coeficiente de partição octanol/água (Kow) das mesmas e consequentemente aumenta a toxicidade. Estes dados indicaram que quanto mais lipofílico mais tóxico é o composto. Relacionando as atividades enzimáticas testadas com os níveis de peroxidação lipídica, o metilparabeno foi o único composto capaz de provocar danos aos tecidos testados por meio das espécies reativas de oxigênio. Isso foi comprovado através da inibição da atividade das enzimas analisadas com o aumento nos níveis de MDA. Por outro lado, mesmo com as enzimas antioxidantes apresentando atividades elevadas isso não foi suficiente para impedir a redução nos níveis de GSH-t. Tais resultados indicam que os parabenos podem agir negativamente nas tilápias. / Parabens, used as preservatives in cosmetics, foodstuffs and pharmaceuticals are not completely removed from water in sewage treatments, which may cause damage to aquatic biota. The present study addresses a new methodology to measure the quantity of methyl (MP), ethyl (EP), propyl (PP), butyl (BP), benzyl (BzP) parabens and a mixture of methyl and propylparaben in water. Aquarium water of experiments with tilapia samples was analyzed for 12 days by liquid chromatography with a doide array detector (HPLC-DAD). The toxicity of parabens in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and its effects on biochemical biomarkers were also evaluated after 6 and 12 days of exposure and intraperitoneal injection. The concentrations of parabens used in all tests were 4.0 mg L-1 (alone) and to mixture was 6.0 mg L-1 of methyl and 1.7 mg L-1 of propylparaben. Biomarkers, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), glutathione reduced (GSH-t) and lipid peroxidation (MDA) were analyzed. The results show the detection limits for the analysis of parabens were 0.03 mg L-1 (MP and EP), 0.05 mg L-1 (PP) and 0.10 mg L-1 (BP and BzP), and the quantification limits were 0.13 mg L-1 (MP, EP, PP), 0.18 mg L-1 (BP) and 0.25 mg L-1 (BzP). In the water sample with fish, the compounds PP and the mixture (MP + PP) could be quantified up to 30h after exposure. In the water sample without fish, the compounds BP and the mixture were quantified for 12 days of exposure. Toxicity test revealed the lethal concentrations for 50% of individuals after 48 h of exposure were 67.11 mg L-1 for MP, 24.08 mg L-1 for EP, 17.34 mg L-1 for PP, 7.98 mg L-1 for BzP and 7.80 mg L-1 for BP. Therefore, BzP and BP can be considered the most toxic of the class. As the chain length grows, the lipophilicity of the substances increases. Such an increase is related to their octanol/water (Kow) partition coefficient and, consequently, increases toxicity. Another toxic action observed for the parabens was the temporary loss of consciousness and mobility of the organisms. According to the enzymatic activity tested and the lipid peroxidation levels, the methylparaben was the only compound that caused damage by reative oxidative species, supported by the inhibition of the activities of the enzymes and the increase in the MDA levels. However, the high activity of the antioxidant enzymes to exposure and intraperitoneal injections could not prevent the reduction in the levels of GSH-t. Such results indicate parabens can cause negative effects on tilapia.

Este trabalho descreve o desenvolvimento de novos métodos cromatográficos em conjunto com técnicas de microextração para determinação de parabenos em produtos cosméticos e leite humano e rifampicina em amostras de plasma. Destaca-se também o desenvolvimento da fase extratora molecularmente impressa para extração em fase sólida (SPE) de parabenos em amostras de leite humano. O capítulo I descreve a avaliação da extração sortiva em barra de agitação (SBSE) em conjunto com a cromatografia líquida (LC) com detecção espectrofotométrica (LC-UV) para análises de parabenos em produtos cosméticos para fins de controle de qualidade. As variáveis do processo de extração SBSE, tais como tempo e temperatura de extração, pH e força iônica da amostra e condições de dessorção foram otimizadas para aumentar a sensibilidade analítica do método e diminuir o tempo de análise. O método SBSE/LC-UV desenvolvido apresentou faixa linear correspondente ao limite de quantificação (LQ) a 2,50 µg. mg-1 e coeficientes de determinação maiores que 0,993. Os valores de coeficiente de variação resultantes das análises de precisão interensaios foram 5,0% para todos os parabenos analisados e a exatidão variou de 90 a 100%. O método desenvolvido foi aplicado para análises de amostras de produtos cosméticos comerciais (cremes hidratantes, antitranspirantes em creme e filtros solares). O método SBSE/LC-UV padronizado e validado resultou nas seguintes vantagens em relação aos métodos convencionais: simplicidade no preparo de amostra, redução do volume de solvente orgânico e da quantidade de amostra utilizada. O capítulo II descreve o desenvolvimento da fase extratora molecularmente impressa para SPE de parabenos em amostras de leite humano e análises por cromatografia em fase líquida com detecção espectrofotométrica (SPE/LC-UV). Os polímeros de impressão molecular, materiais sintéticos baseados em sistemas biomiméticos, foram sintetizados através do processo sol-gel tendo como molde, o benzilparabeno. Após a remoção do molde, cavidades seletivas (sítios de reconhecimento molecular) ao benzilparabeno e análogos estruturais foram reveladas. O método SPE/LC desenvolvido apresentou faixa linear correspondente ao limite de quantificação a 150 ng. mL-1 e coeficientes de determinação 0,992. Os valores de coeficiente de variação resultantes das análises de precisão interensaios foram 13% e a exatidão variou de 86 a 117%. A aplicabilidade do método SPE/LC foi demonstrada através das análises de amostras de leite humano de lactantes. Segundo os parâmetros de validação analítica avaliados, o método padronizado SPE/LC-UV é adequado para análises de parabenos em amostras de leite humano. O capítulo III descreve a avaliação da microextraçao em fase sólida no capilar (in-tube SPME) acoplada à cromatografia líquida (LC) com detecção espectrofotométrica (LC-UV) para análises de rifampicina em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. As variáveis in-tube SPME, tais como fase estacionária da coluna capilar, volume de amostra, ciclos aspirar/dispensar e vazão foram otimizadas visando obter maior eficiência do processo. O método in-tube SPME/LC desenvolvido apresentou faixa linear correspondente ao limite de quantificação (0,1 µg. mL-1) a 100 µg. mL-1 e coeficientes de determinação igual a 0,998. Os valores de coeficiente de variação resultantes das análises de precisão interensaios foram 2% e a exatidão variou de 83 a 92%. A aplicabilidade do método in-tube SPME/LC, padronizado e validado foi comprovada através das análises de amostras de plasma de pacientes em tratamento com rifampicina. O método in-tube SPME/LC resultou na automação do processo de análise, maior precisão analítica, menor tempo de análise, menor volume de solvente orgânico e de fluido biológico. / This work describes the development of chromatographic methods in combination with microextraction techniques for the determination of parabens in cosmetic and human milk samples and of rifampicin in plasma samples. The design of a molecularly imprinted extraction phase for the solid-phase extraction (SPE) analysis of parabens in human milk samples is also reported. Chapter I describes the evaluation of the stir bar sorptive extraction (SBSE) in combination with liquid chromatography (LC) with UV detection (LC-UV) for the analysis of parabens in cosmetics aiming at quality control. The SBSE variables such as extraction time, temperature, pH of the matrix, ionic strength, and desorption conditions have been optimized, in order to establish the parabens partition equilibrium in a short analysis time. The linear range of the SBSE/LC method lay from LOQ to 2.5 µg. mg-1, with a coefficient of determination higher than 0.993. The interday precision of the SBSE/LC method presented a coefficient of variation lower than 5%, and the accuracy ranged from 90 to 99%. The effectiveness of the proposed method for the analysis of commercial cosmetic products such as body creams, antiperspirant creams, and sunscreens has been proven. Therefore, the combination of SBSE with liquid desorption, followed by LC analysis, provides a simple, and selective tool for the analysis of parabens in cosmetic products using minimized volume of organic solvent as well as very small amount of the target sample. Chapter II presents the development of a molecularly imprinted extraction phase for the SPE analysis of parabens in human milk samples. The molecularly imprinted polymers, which are synthetic materials based on biomimetic systems, were synthesized by the sol-gel technology in the presence of the template (benzilparaben). After template removal, selective cavities (benzilparaben) were revealed for parabens selective extraction. The linear range of the SPE/LC method lay from LOQ to 150 ng. mL-1, with a coefficient of determination higher than 0.992. The interday precision of the SPE/LC method presented a coefficient of variation lower than 13%, and the accuracy ranged from 86 to 117%. The effectiveness of the proposed method for the analysis of human milk samples has been demonstrated. According to the evaluated analytical validation parameters, the SPE/LC-UV method is suitable for the analysis of parabens in human milk samples. Chapter III depicts the evaluation of solid-phase microextraction in the capillary (in-tube SPME) in combination with liquid chromatography (LC) with UV detection (LC-UV) for the analysis of rifampicin in plasma samples for therapeutic drug monitoring. The in-tube SPME/LC method was linear over the LOQ (0.1) to 100 g. mL-1 range, with a linear coefficient value (r2) of 0.998. The inter-assay precision presented coefficient of variation 2%, and the accuracy ranged from 83 to 92%. The effectiveness and practicability of the proposed method have been by analysis of plasma samples from ageing patients undergoing therapy with rifampicin. The in-tube SPME/LC method allowed for automated continuous sample preparation (extraction, concentration, desorption, and injection of analytes) and minimized the analysis time as well as the volumes of organic solvent and biological fluid.

Bisfenóis, filtros UV de benzofenona, parabenos e antimicrobianos como triclocarban são amplamente utilizados em produtos alimentares, farmacêuticos, cosméticos e de cuidados pessoais e também são encontrados como contaminantes. A maioria destes compostos apresentam possíveis efeitos adversos à saúde, principalmente devido ao fato de sua potencial atividade desreguladora endócrina. Neste sentido, é crescente o interesse pelo desenvolvimento de métodos analíticos que sejam mais simples e que possam ter a capacidade de detecção do maior número de analitos possíveis simultaneamente para uso em estudos de biomonitoramento humano. O objetivo deste projeto foi desenvolver um novo método de preparo de amostras em microextração em sorvente empacotado (MEPS, do inglês \"microextraction by packed sorbent\") para a extração simultânea de substâncias potencialmente desreguladoras endócrinas (parabenos, bisfenóis, benzofenonas e triclocarban). Em 250 ?L de urina sintética (pH 5,3) foram adicionados os analitos a uma concentração de 20 ng/mL e diluídos com 250 ?L de água. Após este procedimento, os compostos foram extraídos manualmente da amostra de urina usando MEPS C18 com 5 ciclos de aspirar-dispensar de 100 ?L. A eluição dos analitos foi realizada utilizando 100 ?L (metanol/água 80:20), seguido de análise em LC-MS/MS. O cartucho MEPS, após a limpeza, foi reutilizado para extrações múltiplas sem a presença de efeito de memória. As separações cromatográficas foram conduzidas em uma coluna C18 a 40 °C. A fase móvel foi composta por um gradiente de metanol e água a uma vazão de 500 ?L/min. Os dados foram adquiridos no modo MRM com íons negativos como precursores. O método MEPS-LC-MS/MS proposto apresentou curva de calibração linear para todos os analitos com coeficiente de correlação (r) maior que 0,99 no intervalo do limite inferior de quantificação (LIQ) a 20,0 ng/mL. Os LODs variaram de 0,005-0,1 ng/mL e os LIQ variaram de 0,5-2,5 ng/mL. Além disso, a precisão foi expressa como o coeficiente de variação, onde os valores obtidos foram menores que 20% (n=3) nos LIQ e menores que 15% (n=3) nas concentrações de 10,0 e 20,0 ng/mL. A exatidão foi expressa na forma de erro padrão relativo, onde os valores obtidos não foram superiores a ±20% (n=3) para os LIQ e ±15% (n=3) nas concentrações 10,0 e 20,0 ng/mL. O procedimento MEPS proposto apresentou vantagens que incluem a possibilidade de extração e determinação simultânea de 16 analitos em urina, com redução dos volumes de amostra e solvente utilizados, além de vantagens como tempo reduzido de preparo de amostra, clean up da matriz e dispensa etapa prévia ao preparo de amostra / Bisphenol, benzophenone UV filters, parabens and antimicrobials as triclocarban are widely used in food, pharmaceuticals products, cosmetic and personal care products or they are fond as contaminants. Most of these compounds show possible health adverse effects, mainly due to the fact of its potential endocrine disrupting activity. Thus, there is an increasing interesting in new analytical method development that will be simple and able to detect largest number of analytes possible simultaneously to be used in human biomonitoring studies. The project goal was developed a new sample preparation methody in Microextraction in packed sorbent (MEPS) to simultaneous extraction followed by liquid chromatography coupled to mass spectrometry in tandem analysis (LC-MS/MS) of 16 substances potentially endocrine disrupting (parabens, bisphenols, benzophenones and triclocarban). In 250 ?L of synthetic urine (pH 5.3) were spiked with compounds at a concentration of 20 ng/mL and diluted with 250 ?L of water. After this procedure, the compounds were extracted manually from urine sample using MEPS C18 with 5 draw-eject 100 ?L cycles. The elution was performed using 100 ?L (methanol/water 80:20) followed by LC-MS/MS analysis. The MEPS cartridge, after cleaned, was used for multiple extractions without any carry-over effect. Chromatographic separations were carried out on a C18 column at 40 oC. The Mobile phase was composed by a gradient methanol and water at a flow rate of 500 ?L/min. Data were acquired the MRM mode with negative ions as precursors. The proposed MEPS-LC-MS/MS method showed calibration curve linear to all analytes with correlation coefficient higher than 0,99 in the range from low limit of quantification (LIQ) to 20,0 ng/mL. The LODs range from 0,005-0,1 ng/mL and LIQ range from 0,5 to 2,5 ng/mL. Moreover, the precision was reported as variation coefficient, where the values were less than 20% (n=3) to the LIQ and less than 15% (n=3) to 10,0 and 20,0 ng/mL concentrations. The accuracy was reported as relative standard error, where the values were less than ±20% to the LIQ and less than ±15% (n=3) to 10,0 and 20,0 ng/mL concentrations. The MEPS procedure proposed showed advantages including possibility to extraction and simultaneous determination of 16 analytes in urine, with sample and solvents volume reduction besides it shows advantages as time reducing in sample preparation, matrix clean up and dispense previous sample preparation step.

Este trabalho descreve o desenvolvimento de novos métodos cromatográficos em conjunto com técnicas de microextração para determinação de parabenos em produtos cosméticos e leite humano e rifampicina em amostras de plasma. Destaca-se também o desenvolvimento da fase extratora molecularmente impressa para extração em fase sólida (SPE) de parabenos em amostras de leite humano. O capítulo I descreve a avaliação da extração sortiva em barra de agitação (SBSE) em conjunto com a cromatografia líquida (LC) com detecção espectrofotométrica (LC-UV) para análises de parabenos em produtos cosméticos para fins de controle de qualidade. As variáveis do processo de extração SBSE, tais como tempo e temperatura de extração, pH e força iônica da amostra e condições de dessorção foram otimizadas para aumentar a sensibilidade analítica do método e diminuir o tempo de análise. O método SBSE/LC-UV desenvolvido apresentou faixa linear correspondente ao limite de quantificação (LQ) a 2,50 µg. mg-1 e coeficientes de determinação maiores que 0,993. Os valores de coeficiente de variação resultantes das análises de precisão interensaios foram 5,0% para todos os parabenos analisados e a exatidão variou de 90 a 100%. O método desenvolvido foi aplicado para análises de amostras de produtos cosméticos comerciais (cremes hidratantes, antitranspirantes em creme e filtros solares). O método SBSE/LC-UV padronizado e validado resultou nas seguintes vantagens em relação aos métodos convencionais: simplicidade no preparo de amostra, redução do volume de solvente orgânico e da quantidade de amostra utilizada. O capítulo II descreve o desenvolvimento da fase extratora molecularmente impressa para SPE de parabenos em amostras de leite humano e análises por cromatografia em fase líquida com detecção espectrofotométrica (SPE/LC-UV). Os polímeros de impressão molecular, materiais sintéticos baseados em sistemas biomiméticos, foram sintetizados através do processo sol-gel tendo como molde, o benzilparabeno. Após a remoção do molde, cavidades seletivas (sítios de reconhecimento molecular) ao benzilparabeno e análogos estruturais foram reveladas. O método SPE/LC desenvolvido apresentou faixa linear correspondente ao limite de quantificação a 150 ng. mL-1 e coeficientes de determinação 0,992. Os valores de coeficiente de variação resultantes das análises de precisão interensaios foram 13% e a exatidão variou de 86 a 117%. A aplicabilidade do método SPE/LC foi demonstrada através das análises de amostras de leite humano de lactantes. Segundo os parâmetros de validação analítica avaliados, o método padronizado SPE/LC-UV é adequado para análises de parabenos em amostras de leite humano. O capítulo III descreve a avaliação da microextraçao em fase sólida no capilar (in-tube SPME) acoplada à cromatografia líquida (LC) com detecção espectrofotométrica (LC-UV) para análises de rifampicina em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. As variáveis in-tube SPME, tais como fase estacionária da coluna capilar, volume de amostra, ciclos aspirar/dispensar e vazão foram otimizadas visando obter maior eficiência do processo. O método in-tube SPME/LC desenvolvido apresentou faixa linear correspondente ao limite de quantificação (0,1 µg. mL-1) a 100 µg. mL-1 e coeficientes de determinação igual a 0,998. Os valores de coeficiente de variação resultantes das análises de precisão interensaios foram 2% e a exatidão variou de 83 a 92%. A aplicabilidade do método in-tube SPME/LC, padronizado e validado foi comprovada através das análises de amostras de plasma de pacientes em tratamento com rifampicina. O método in-tube SPME/LC resultou na automação do processo de análise, maior precisão analítica, menor tempo de análise, menor volume de solvente orgânico e de fluido biológico. / This work describes the development of chromatographic methods in combination with microextraction techniques for the determination of parabens in cosmetic and human milk samples and of rifampicin in plasma samples. The design of a molecularly imprinted extraction phase for the solid-phase extraction (SPE) analysis of parabens in human milk samples is also reported. Chapter I describes the evaluation of the stir bar sorptive extraction (SBSE) in combination with liquid chromatography (LC) with UV detection (LC-UV) for the analysis of parabens in cosmetics aiming at quality control. The SBSE variables such as extraction time, temperature, pH of the matrix, ionic strength, and desorption conditions have been optimized, in order to establish the parabens partition equilibrium in a short analysis time. The linear range of the SBSE/LC method lay from LOQ to 2.5 µg. mg-1, with a coefficient of determination higher than 0.993. The interday precision of the SBSE/LC method presented a coefficient of variation lower than 5%, and the accuracy ranged from 90 to 99%. The effectiveness of the proposed method for the analysis of commercial cosmetic products such as body creams, antiperspirant creams, and sunscreens has been proven. Therefore, the combination of SBSE with liquid desorption, followed by LC analysis, provides a simple, and selective tool for the analysis of parabens in cosmetic products using minimized volume of organic solvent as well as very small amount of the target sample. Chapter II presents the development of a molecularly imprinted extraction phase for the SPE analysis of parabens in human milk samples. The molecularly imprinted polymers, which are synthetic materials based on biomimetic systems, were synthesized by the sol-gel technology in the presence of the template (benzilparaben). After template removal, selective cavities (benzilparaben) were revealed for parabens selective extraction. The linear range of the SPE/LC method lay from LOQ to 150 ng. mL-1, with a coefficient of determination higher than 0.992. The interday precision of the SPE/LC method presented a coefficient of variation lower than 13%, and the accuracy ranged from 86 to 117%. The effectiveness of the proposed method for the analysis of human milk samples has been demonstrated. According to the evaluated analytical validation parameters, the SPE/LC-UV method is suitable for the analysis of parabens in human milk samples. Chapter III depicts the evaluation of solid-phase microextraction in the capillary (in-tube SPME) in combination with liquid chromatography (LC) with UV detection (LC-UV) for the analysis of rifampicin in plasma samples for therapeutic drug monitoring. The in-tube SPME/LC method was linear over the LOQ (0.1) to 100 g. mL-1 range, with a linear coefficient value (r2) of 0.998. The inter-assay precision presented coefficient of variation 2%, and the accuracy ranged from 83 to 92%. The effectiveness and practicability of the proposed method have been by analysis of plasma samples from ageing patients undergoing therapy with rifampicin. The in-tube SPME/LC method allowed for automated continuous sample preparation (extraction, concentration, desorption, and injection of analytes) and minimized the analysis time as well as the volumes of organic solvent and biological fluid.