Tecnécio-99m é o radionuclídeo mais utilizado em procedimentos para imagem diagnóstica na Medicina Nuclear, mais de 80 % dos radiofármacos são compostos marcados com 99mTc. 99mTc-DMSA(V) tem sido usado no diagnóstico de tumores de tecidos moles, cabeça e pescoço. Este radiofármaco tem uma alta especificidade para detecção de carcinoma medular de tireóide e metástase óssea em vários tipos de cânceres. Estudos de biodistribuição do 188Re-DMSA(V) tem mostrado que suas propriedades farmacocinéticas são similares ao do 99mTc-DMSA(V), então este agente poderia ser usado para terapia desses tumores. O objetivo desse trabalho é o desenvolvimento de métodos para marcação do DMSA(V) com 99mTc e 188Re. O 99mTc-DMSA(V) pode ser preparado por dois métodos. Um dos métodos é o método indireto, que é através do kit comercial de DMSA(III), ajustando-se o pH de 2,5 para ~8,5 com NaHCO3, que foi estudado e otimizado, apresentando bons rendimentos de marcação. O outro é o método direto, pelo preparo de um kit liofilizado de DMSA(V) pronto para marcação com 99mTc, sendo o método de interesse do trabalho pela maior praticidade no uso clínico. A formulação mais adequada do método direto foi: 1,71 mg de DMSA, 0,53 mg de SnCl2.2H2O e 0,83 mg de ácido ascórbico (pH 9). Marcando-se esse kit com 1 a 2 mL de 99mTc, com atividades de até 4736 MBq (128 mCi), e tempo instantâneo de reação, consegue-se rendimento de marcação maior que 95%. O kit liofilizado foi estável por até 6 meses e estudos de biodistribuição confirmaram a qualidade do DMSA (V) marcado com 99mTc usando este kit. O potencial de redução do Re é mais baixo do que do Tc, com isso as condições de preparação do 188Re-DMSA(V) são diferentes das usadas para o 99mTc-DMSA(V). O 188Re-DMSA(V) é preparado em meio ácido, com isso é possível utilizar o kit comercial de DMSA(III) para marcação com 99mTc, que apresenta pH 2,5, na preparação do 188Re- DMSA(V). Com este método conseguiu-se rendimentos de marcação superiores a 95%, com tempo de reação de 30 minutos à 100 ºC, utilizando no máximo 1 mL de 188ReO4 -. Outro método de preparação do 188Re-DMSA(V) também foi estudado, através de um kit líquido contendo 2,5 mg de DMSA, 1,00 mg de SnCl2.2H2O, 30 mg de oxalato de sódio e pH 5. Este kit marcado com 1 mL de 188ReO4 -, com 15 minutos de reação à temperatura ambiente apresentou rendimento de marcação de aproximadamente 91%. / Technetium-99m is the most useful radionuclide in diagnostic imaging procedures in Nuclear Medicine, more than 80 percent of radiopharmaceuticals are 99mTc-labeled compounds. 99mTc-DMSA(V) has been used for imaging of soft tissue, head and neck tumors. It shows a particularly high specificity for medullary thyroid carcinoma and bone metastases in a variety of cancers. Biodistribution studies of 188Re-DMSA(V) have shown that its general pharmacokinetic properties are similar to that of 99mTc-DMSA(V), so this agent could be used for targeted radiotherapy of these tumors. The aim of this work is the development of methods of labeling DMSA(V) with 99mTc and 188Re. 99mTc-DMSA(V) can be prepared by two methods. One of them is the indirect one, through the use of a commercial kit of DMSA (III), by adjusting the pH from 2.5 to ~8.5 with NaHCO3. This method was evaluated and optmized presenting high labeling yields. The other method is the direct one, through the preparation of a liophylised kit ready for labeling with 99mTc, being the method of interest of this work, due to the easy of its clinical use. The most adequate formulation of the kit was: 1.71mg of DMSA, 0.53mg of SnCl2.2H2O and 0.83 mg of ascorbic acid (pH 9). Labeling yields higher than 95% were achieved labeling this kit with 1 to 2 mL of 99mTc with activities up to 4736 MBq (128 mCi). The kit was stable up to 6 months and biodistribution studies confirmed the quality of the DMSA (V) labeled with 99mTc using this kit. The reduction potential of Re is lower than the one for Tc, so the labeling conditions of 188Re-DMSA(V) are diferent from the ones used for 99mTc- DMSA(V). 188Re-DMSA(V) is prepared in acid solution, that makes it possible to use the DMSA (III) comercial kit developed for labeling with 99mTc, prepared in pH 2.5, for labeling with 188Re. Labeling yields higher than 95% were achieved with this methodology, with a rection time of 30 minutes at 100oC using no more than 1 mL of 188ReO4 -. Another method of preparing 188Re-DMSA(V) was also evaluated, using a liquid kit containing 2.5mg of DMSA, 1.00mg of SnCl2.2H2O and 30mg of sodium oxalate at pH 5. This kit was labeled with 1 mL of 188ReO4 -, with 15 minutes of reaction at room temperature resulting in a labeling yield of about 91%.

Tecnécio-99m é o radionuclídeo mais utilizado em procedimentos para imagem diagnóstica na Medicina Nuclear, mais de 80 % dos radiofármacos são compostos marcados com 99mTc. 99mTc-DMSA(V) tem sido usado no diagnóstico de tumores de tecidos moles, cabeça e pescoço. Este radiofármaco tem uma alta especificidade para detecção de carcinoma medular de tireóide e metástase óssea em vários tipos de cânceres. Estudos de biodistribuição do 188Re-DMSA(V) tem mostrado que suas propriedades farmacocinéticas são similares ao do 99mTc-DMSA(V), então este agente poderia ser usado para terapia desses tumores. O objetivo desse trabalho é o desenvolvimento de métodos para marcação do DMSA(V) com 99mTc e 188Re. O 99mTc-DMSA(V) pode ser preparado por dois métodos. Um dos métodos é o método indireto, que é através do kit comercial de DMSA(III), ajustando-se o pH de 2,5 para ~8,5 com NaHCO3, que foi estudado e otimizado, apresentando bons rendimentos de marcação. O outro é o método direto, pelo preparo de um kit liofilizado de DMSA(V) pronto para marcação com 99mTc, sendo o método de interesse do trabalho pela maior praticidade no uso clínico. A formulação mais adequada do método direto foi: 1,71 mg de DMSA, 0,53 mg de SnCl2.2H2O e 0,83 mg de ácido ascórbico (pH 9). Marcando-se esse kit com 1 a 2 mL de 99mTc, com atividades de até 4736 MBq (128 mCi), e tempo instantâneo de reação, consegue-se rendimento de marcação maior que 95%. O kit liofilizado foi estável por até 6 meses e estudos de biodistribuição confirmaram a qualidade do DMSA (V) marcado com 99mTc usando este kit. O potencial de redução do Re é mais baixo do que do Tc, com isso as condições de preparação do 188Re-DMSA(V) são diferentes das usadas para o 99mTc-DMSA(V). O 188Re-DMSA(V) é preparado em meio ácido, com isso é possível utilizar o kit comercial de DMSA(III) para marcação com 99mTc, que apresenta pH 2,5, na preparação do 188Re- DMSA(V). Com este método conseguiu-se rendimentos de marcação superiores a 95%, com tempo de reação de 30 minutos à 100 ºC, utilizando no máximo 1 mL de 188ReO4 -. Outro método de preparação do 188Re-DMSA(V) também foi estudado, através de um kit líquido contendo 2,5 mg de DMSA, 1,00 mg de SnCl2.2H2O, 30 mg de oxalato de sódio e pH 5. Este kit marcado com 1 mL de 188ReO4 -, com 15 minutos de reação à temperatura ambiente apresentou rendimento de marcação de aproximadamente 91%. / Technetium-99m is the most useful radionuclide in diagnostic imaging procedures in Nuclear Medicine, more than 80 percent of radiopharmaceuticals are 99mTc-labeled compounds. 99mTc-DMSA(V) has been used for imaging of soft tissue, head and neck tumors. It shows a particularly high specificity for medullary thyroid carcinoma and bone metastases in a variety of cancers. Biodistribution studies of 188Re-DMSA(V) have shown that its general pharmacokinetic properties are similar to that of 99mTc-DMSA(V), so this agent could be used for targeted radiotherapy of these tumors. The aim of this work is the development of methods of labeling DMSA(V) with 99mTc and 188Re. 99mTc-DMSA(V) can be prepared by two methods. One of them is the indirect one, through the use of a commercial kit of DMSA (III), by adjusting the pH from 2.5 to ~8.5 with NaHCO3. This method was evaluated and optmized presenting high labeling yields. The other method is the direct one, through the preparation of a liophylised kit ready for labeling with 99mTc, being the method of interest of this work, due to the easy of its clinical use. The most adequate formulation of the kit was: 1.71mg of DMSA, 0.53mg of SnCl2.2H2O and 0.83 mg of ascorbic acid (pH 9). Labeling yields higher than 95% were achieved labeling this kit with 1 to 2 mL of 99mTc with activities up to 4736 MBq (128 mCi). The kit was stable up to 6 months and biodistribution studies confirmed the quality of the DMSA (V) labeled with 99mTc using this kit. The reduction potential of Re is lower than the one for Tc, so the labeling conditions of 188Re-DMSA(V) are diferent from the ones used for 99mTc- DMSA(V). 188Re-DMSA(V) is prepared in acid solution, that makes it possible to use the DMSA (III) comercial kit developed for labeling with 99mTc, prepared in pH 2.5, for labeling with 188Re. Labeling yields higher than 95% were achieved with this methodology, with a rection time of 30 minutes at 100oC using no more than 1 mL of 188ReO4 -. Another method of preparing 188Re-DMSA(V) was also evaluated, using a liquid kit containing 2.5mg of DMSA, 1.00mg of SnCl2.2H2O and 30mg of sodium oxalate at pH 5. This kit was labeled with 1 mL of 188ReO4 -, with 15 minutes of reaction at room temperature resulting in a labeling yield of about 91%.

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:17:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9148_1.pdf: 4473190 bytes, checksum: 885ade50a3ae503aa32fb6e5626cf62f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / As metástases ósseas são uma grande causa de morbidade e mortalidade nos pacientes com câncer, podendo acarretar em dores, hipercalcemia, fraturas patológicas e deficiências neurológicas. A cintilografia óssea, empregada na detecção dessas metástases, é um método sensível à alterações no metabolismo ósseo, no entanto, como as lesões benignas também captam os fármacos 99mTcdifosfonatos, sua especificidade torna-se baixa tendo sido propostas novas alternativas para orientar um diagnóstico mais específico. Radiofármacos marcados com 99mTc para diagnóstico de tumores são limitados quanto a seus propósitos, mas muitos estudos tem se dirigido ao 99mTc(V)DMSA, que é um radiofármaco com afinidade tumoral cuja captação é descrita em metástases ósseas e tumores de tecidos moles. Seu mecanismo de acumulação tem sido investigado para elucidar o comportamento biológico e aplicabilidade clínica, no entanto o 99mTc(V)DMSA ainda não é produzido no Brasil como um kit liofilizado. O objetivo deste trabalho foi obter o 99mTc(V)DMSA a partir de um kit liofilizado nacional de DMSA e avaliar sua utilidade na detecção de metástases ósseas em humanos mediante imagem cintilográfica, com emprego prévio em modelo animal. O 99mTc(V)DMSA foi preparado a partir de kits comercialmente viáveis de DMSA (IPEN), pela redução do pH, o 99mTc-DMSA e o 99mTc-MDP foram preparados segundo as instruções do fabricante. A qualidade dos fármacos foi analisada por testes de pH, pureza radionuclídica e radioquímica. Os ensaios de biodistribuição foram realizados em camundongos: os grupos controle receberam 99mTc-DMSA (veia da cauda), enquanto os grupos experimentais receberam 99mTc(V)DMSA, após 30min ou 1h, os animais foram sacrificados e a atividade específica dos órgãos determinada. Na experimentação humana, dez pacientes com neoplasias malignas comprovadas histologicamente se submeteram à aquisição de imagens de corpo inteiro 3h após a administração de 99mTc-MDP (exame de rotina) assim como 3h e 24h após a administração de 99mTc(V)DMSA, foram analisados ainda outros exames de imagem (TC, RMN, Rx). Os resultados do controle de qualidade indicaram que o 99mTc(V)DMSA apresentou marcação e estabilidade adequadas para o uso clínico. A biodistribuição revelou uma redução na razão rim/osso de 16,30 ± 2,24 (III-DMSA) para 0,77 ± 0,24 (V-DMSA), estando os percentuais de captação/g de acordo com a literatura. Na experimentação humana, as imagens de 99mTc(V)DMSA foram concordantes com as de 99mTc-MDP em 80% dos casos. O 99mTc(V)DMSA não foi captado em lesões provocadas por trauma e houve um caso de falso negativo. Os resultados deste estudo sugerem que o 99mTc(V)DMSA poderia ser útil da diferenciação entre lesões traumáticas e metastáticas, devendo a captação do 99mTc(V)DMSA ser observada quanto às implicações prognósticas

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A utilização de radiofármacos no diagnóstico de doenças do organismo humano tem aumentado de forma significativa nas últimas décadas. O crescente desenvolvimento de novos reagentes liofilizados (RL) para a preparação de radiofármacos, embora proporcionem uma maior variedade para o mercado de radiofármacos, deixa evidente uma das lacunas na pesquisa radiofarmacêutica: a identificação de produtos de degradação. No presente trabalho, foram identificados os principais produtos de degradação dos RL de ácido 2,3-Dimercaptosuccínico (DMSA) e Etilenodicisteína Dietil Éster (ECD) utilizando as técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência com Detecção por Arranjo de Diodos (HPLC-DAD) e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas de múltiplos estágios (LC-MSn). Realizou-se o estudo de degradação forçada do RL de DMSA e do RL de ECD nas condições de estresse hidrolítico, fotolítico, oxidativo e termodegradação. As análises foram realizadas em equipamento HPLC-DAD Shimadzu e espectrômetro de massas Bruker Daltonics. Todas as análises foram desenvolvidas utilizando coluna cromatográfica Shim-Pack VP-ODS (150 mm x 4,6 mm; 5 μm). O DMSA apresentou tempo de retenção de 5,58 minutos e m/z 204,8. A hidrólise ácida do DMSA não apresentou produtos de degradação. O perfil de degradação do DMSA após hidrólise alcalina apresentou três picos cromatográficos com características mais apolares que o DMSA. No espectro de fragmentação do íon de m/z 204,8 (MS2) pode-se observar a presença do fragmento de m/z 172,9, correspondente ao aduto sodiado de ácido mercaptosuccínico (MSA); e o fragmento de m/z 139,0 (MS3), correspondente ao aduto sodiado do ácido fumárico. O íon estanho (Sn) apresentou-se coordenado ao DMSA em todos os produtos de degradação após hidrólise alcalina do RL de DMSA. As amostras submetidas à hidrólise neutra não apresentaram degradação. Nos estudos de fotólise do DMSA, o íon de m/z 267,1 pode ser identificado como o ácido diacetil dimercaptosuccínico (BATSA). O íon de m/z 127,1 foi associado ao ácido hidroximetil fosfônico e observado nos estudos de oxidação. A termodegradação do DMSA e do RL de DMSA, não apresentou uma relação de decaimento da concentração do DMSA em função do tempo. Quanto ao RL de ECD, foi observado o ECD protonado em 5,55 minutos (m/z 325,6). As análises por LC-MSn do ECD sob hidrólise alcalina mostraram que o pico com tempo de retenção de 1,71 minutos foi identificado como o íon protonado do EC ([M+H]+) em m/z 269,2. Os picos com tempo de retenção de 3,34 e 3,69 minutos foram identificados como o íon protonado do ECD na forma monoéster (ECDM). A degradação alcalina do RL de ECD apresentou os íons de m/z 441,9 (ECD-Sn) e m/z 737,9 ([ECD2+Sn]-C2H2-2H). ECD monoester monoácida (ECDM) de m/z 295,2; ECD oxidado de m/z 323,5; ECD oxidado com duas pontes dissulfeto de m/z 389,1 e dímero de ECD de m/z 645,9 foram observados da degradação oxidativa. Conclui-se que as análises por HPLC-DAD e LC-MSn podem ser utilizadas no estudo de estabilidade de RL, identificando suas impurezas e produtos de degradação. / The use of radiopharmaceuticals in the diagnosis of diseases of the human organism has increased significantly in the last decades. The increasing development of new lyophilized reagents (LR) for the preparation of radiopharmaceuticals, although providing a greater variety of radiopharmaceuticals to the market, makes evident a gap in the radiopharmaceutical research: identification of degradation products. In the present work, the main degradation products of the 2,3-Dimercaptosuccinic acid (DMSA) and Ethylenedicysteine Diethyl Ester (ECD) LR were identified, using the techniques of high performance liquid chromatography with diode array detection (HPLC -DAD) and liquid chromatography multiple-stage mass spectrometry (LC-MSn). The study of forced degradation of DMSA and ECD LR was performed in the hydrolytic, photolytic and oxidative stress conditions and thermodegradation. Analyses were performed using an HPLC-DAD Shimadzu and mass spectrometer Bruker Daltonics equipment. All analyzes were carried out using Shim-Pack VP-ODS (150 mm x 4.6 mm; 5 μm) chromatographic column. DMSA showed a retention time of 5.58 minutes and m/z 204.8. Acid hydrolysis of DMSA showed no degradation products. The degradation profile of DMSA after alkaline hydrolysis presented three chromatographic peaks with more nonpolar characteristics than DMSA. In the fragmentation spectrum of the ion m/z 204.8 (MS2), the presence of a fragment of m/z 172.9 was observed, corresponding to sodium adduct of mercaptosuccinic acid (MSA); and a fragment of m/z 139.0 (MS3), corresponding to sodium adduct of fumaric acid. The tin ion was coordinated to DMSA in all degradation products after alkaline hydrolysis of DMSA LR. The samples submitted to neutral hydrolysis showed no degradation. In the studies of photolysis of DMSA, the ion m/z 267.1 can be related to diacetyl dimercaptosuccinic acid (BATSA). The ion of m/z 127.1 observed in the studies of oxidation can be related to phosphonic hydroxymethyl acid. The thermodegradation of DMSA and its LR did not show a relationship between the decrease in the DMSA concentration and the time. The protonated ECD was observed in 5.55 minutes (m/z 325.6). Analysis by LC-MSn of ECD under alkaline hydrolysis showed that the peak with retention time of 1.71 minutes could be identified as the protonated ion of EC ([M+H]+) at m/z 269.2. The peaks with retention times of 3.34 and 3.69 minutes were identified as the protonated ion of ECD in its monoester form (ECDM). The alkaline degradation of ECD LR presented the m/z 441.9 (ECD-Sn) and m/z 737.9 ([ECD2+Sn]-C2H2-2H) ions. ECD monoester monoacid (ECDM) of m/z 295.2; ECD oxidized of m/z 323.5; ECD oxidized with two disulfide bonds of m/z 389.1 and ECD dimer of m/z 645.9 were observed in the oxidative degradation. It was concluded that the analysis by HPLC-DAD and LC-MSn can be used in the stability of LR, identifying and quantifying its impurities and degradation products.

A utilização de radiofármacos no diagnóstico de doenças do organismo humano tem aumentado de forma significativa nas últimas décadas. O crescente desenvolvimento de novos reagentes liofilizados (RL) para a preparação de radiofármacos, embora proporcionem uma maior variedade para o mercado de radiofármacos, deixa evidente uma das lacunas na pesquisa radiofarmacêutica: a identificação de produtos de degradação. No presente trabalho, foram identificados os principais produtos de degradação dos RL de ácido 2,3-Dimercaptosuccínico (DMSA) e Etilenodicisteína Dietil Éster (ECD) utilizando as técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência com Detecção por Arranjo de Diodos (HPLC-DAD) e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas de múltiplos estágios (LC-MSn). Realizou-se o estudo de degradação forçada do RL de DMSA e do RL de ECD nas condições de estresse hidrolítico, fotolítico, oxidativo e termodegradação. As análises foram realizadas em equipamento HPLC-DAD Shimadzu e espectrômetro de massas Bruker Daltonics. Todas as análises foram desenvolvidas utilizando coluna cromatográfica Shim-Pack VP-ODS (150 mm x 4,6 mm; 5 μm). O DMSA apresentou tempo de retenção de 5,58 minutos e m/z 204,8. A hidrólise ácida do DMSA não apresentou produtos de degradação. O perfil de degradação do DMSA após hidrólise alcalina apresentou três picos cromatográficos com características mais apolares que o DMSA. No espectro de fragmentação do íon de m/z 204,8 (MS2) pode-se observar a presença do fragmento de m/z 172,9, correspondente ao aduto sodiado de ácido mercaptosuccínico (MSA); e o fragmento de m/z 139,0 (MS3), correspondente ao aduto sodiado do ácido fumárico. O íon estanho (Sn) apresentou-se coordenado ao DMSA em todos os produtos de degradação após hidrólise alcalina do RL de DMSA. As amostras submetidas à hidrólise neutra não apresentaram degradação. Nos estudos de fotólise do DMSA, o íon de m/z 267,1 pode ser identificado como o ácido diacetil dimercaptosuccínico (BATSA). O íon de m/z 127,1 foi associado ao ácido hidroximetil fosfônico e observado nos estudos de oxidação. A termodegradação do DMSA e do RL de DMSA, não apresentou uma relação de decaimento da concentração do DMSA em função do tempo. Quanto ao RL de ECD, foi observado o ECD protonado em 5,55 minutos (m/z 325,6). As análises por LC-MSn do ECD sob hidrólise alcalina mostraram que o pico com tempo de retenção de 1,71 minutos foi identificado como o íon protonado do EC ([M+H]+) em m/z 269,2. Os picos com tempo de retenção de 3,34 e 3,69 minutos foram identificados como o íon protonado do ECD na forma monoéster (ECDM). A degradação alcalina do RL de ECD apresentou os íons de m/z 441,9 (ECD-Sn) e m/z 737,9 ([ECD2+Sn]-C2H2-2H). ECD monoester monoácida (ECDM) de m/z 295,2; ECD oxidado de m/z 323,5; ECD oxidado com duas pontes dissulfeto de m/z 389,1 e dímero de ECD de m/z 645,9 foram observados da degradação oxidativa. Conclui-se que as análises por HPLC-DAD e LC-MSn podem ser utilizadas no estudo de estabilidade de RL, identificando suas impurezas e produtos de degradação. / The use of radiopharmaceuticals in the diagnosis of diseases of the human organism has increased significantly in the last decades. The increasing development of new lyophilized reagents (LR) for the preparation of radiopharmaceuticals, although providing a greater variety of radiopharmaceuticals to the market, makes evident a gap in the radiopharmaceutical research: identification of degradation products. In the present work, the main degradation products of the 2,3-Dimercaptosuccinic acid (DMSA) and Ethylenedicysteine Diethyl Ester (ECD) LR were identified, using the techniques of high performance liquid chromatography with diode array detection (HPLC -DAD) and liquid chromatography multiple-stage mass spectrometry (LC-MSn). The study of forced degradation of DMSA and ECD LR was performed in the hydrolytic, photolytic and oxidative stress conditions and thermodegradation. Analyses were performed using an HPLC-DAD Shimadzu and mass spectrometer Bruker Daltonics equipment. All analyzes were carried out using Shim-Pack VP-ODS (150 mm x 4.6 mm; 5 μm) chromatographic column. DMSA showed a retention time of 5.58 minutes and m/z 204.8. Acid hydrolysis of DMSA showed no degradation products. The degradation profile of DMSA after alkaline hydrolysis presented three chromatographic peaks with more nonpolar characteristics than DMSA. In the fragmentation spectrum of the ion m/z 204.8 (MS2), the presence of a fragment of m/z 172.9 was observed, corresponding to sodium adduct of mercaptosuccinic acid (MSA); and a fragment of m/z 139.0 (MS3), corresponding to sodium adduct of fumaric acid. The tin ion was coordinated to DMSA in all degradation products after alkaline hydrolysis of DMSA LR. The samples submitted to neutral hydrolysis showed no degradation. In the studies of photolysis of DMSA, the ion m/z 267.1 can be related to diacetyl dimercaptosuccinic acid (BATSA). The ion of m/z 127.1 observed in the studies of oxidation can be related to phosphonic hydroxymethyl acid. The thermodegradation of DMSA and its LR did not show a relationship between the decrease in the DMSA concentration and the time. The protonated ECD was observed in 5.55 minutes (m/z 325.6). Analysis by LC-MSn of ECD under alkaline hydrolysis showed that the peak with retention time of 1.71 minutes could be identified as the protonated ion of EC ([M+H]+) at m/z 269.2. The peaks with retention times of 3.34 and 3.69 minutes were identified as the protonated ion of ECD in its monoester form (ECDM). The alkaline degradation of ECD LR presented the m/z 441.9 (ECD-Sn) and m/z 737.9 ([ECD2+Sn]-C2H2-2H) ions. ECD monoester monoacid (ECDM) of m/z 295.2; ECD oxidized of m/z 323.5; ECD oxidized with two disulfide bonds of m/z 389.1 and ECD dimer of m/z 645.9 were observed in the oxidative degradation. It was concluded that the analysis by HPLC-DAD and LC-MSn can be used in the stability of LR, identifying and quantifying its impurities and degradation products.

Several metals are known to disturb cellular functions by binding to thiol groups of biomolecules. Therefore, a possible therapy for metal intoxication is to remove the toxic metals from the bound functional bioligands by administering strong thiol-containing chelators. However, these compounds could remove endogenous metals, which are essential components of many enzyme systems. Thus, the present study was designed to evaluate the effects of chelating agents, meso-2,3-dimercaptosuccinic acid (DMSA), 2,3-dimercaptopropane 1-sulfonate (DMPS) and 2,3-dimercaptopropanol (BAL) per se on toxicological parameters and models of cadmium intoxication. δ-Aminolevulinate dehydratase (δ-ALA-D) activity from human erythrocytes was inhibited by dithiol chelating agents in a concentration-dependent manner. Dithiotreitol and zinc chloride were able to protect the δ-ALA-D inhibition caused by BAL, DMPS and DMSA in a concentration-dependent manner. Acute treatment with chelating agents caused changes in a number of toxicological parameters in mice. BAL caused a decrease on renal δ-ALA-D activity and an increase on brain and liver enzyme activity. DMPS caused an inhibition in renal δ-ALA-D activity, while animals that received a single dose of DMSA did not present δ-ALA-D activity of tissues modified. All three agents produced an increase in both liver and renal lipid peroxidation. Mice that received DMPS presented an increase in renal zinc concentration and a depletion of hepatic zinc occurred in mice administrated with BAL. Of all the toxic metals found in the environment and used in industry, cadmium occupies a special place because of the generally intractable nature of cadmium intoxication. Several lines of evidence indicate that reactive oxygen species are involved in cadmium-mediated tissue damage. Thus, it is believed that antioxidant should be one of the important components of an effective treatment of cadmium poisoning, as well, combined therapy with antioxidants and chelators can yield better therapeutic outcomes than isolated chelation therapy. Acute cadmium-intoxication caused inhibition of δ-ALA-D and superoxide dismutase (SOD) activities, reduction in ascorbic acid levels and increase of lipid peroxidation in mice testes. Also, an increase on plasmatic lactate dehydrogenase (LDH), aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) activities was observed. DMSA, DMPS and diphenyl diselenide ((PhSe)2) protected against the inhibitory effect of cadmium on δ-ALA-D activity and restored the increase of TBARS levels. However, these compounds alone or in combination, were unable to protect SOD activity and to improve ascorbic acid levels near to the normal value. The use of combined therapy (DMSA plus (PhSe)2) not proved be better than the monotherapy, in improving the toxicological parameters evaluated in this model of testicular damage induced by cadmium. On the other hand, the use of combined therapy (DMPS plus (PhSe)2) proved to be better than the monotherapy in decreasing cadmium levels in testes and in ameliorating plasmatic AST level. Sub-chronic effects of cadmium-intoxication in mice caused inhibition of δ-ALA-D activity in liver, kidney and spleen and (PhSe)2 therapy was effective in restoring enzyme activity in all tissues. Also, a reduction in ascorbic acid content by cadmium was observed in kidney and spleen, whereas (PhSe)2 was only effective in improving this reduction in kidney. The therapy with this compound was effective in restoring an increase of TBARS levels caused by cadmium in liver and brain tissues. In general, the results of this study indicate that it is necessary to investigate the potential toxicity of the chelating agents, since chelators may be as harmful as the metals they chelate. In addition, (PhSe)2 therapy in cadmium poisoning may be considered, as alone (antioxidant) as combined with DMPS and DMSA / Diversos metais alteram as funções celulares por serem capazes de se ligar a grupos tióis de biomoléculas. Portanto, uma terapia eficaz na intoxicação por metal seria a remoção dos metais tóxicos dos bioligantes funcionais através da administração de quelantes contendo grupos tióis. Entretanto, estes compostos poderiam remover metais endógenos, os quais são componentes essenciais de muitos sistemas enzimáticos. Dessa forma, o presente estudo foi delineado para avaliar os efeitos dos agentes quelantes, ácido meso-2,3-dimercaptosuccínico (DMSA), ácido 2,3-dimercaptopropano 1-sulfônico (DMPS) and 2,3-dimercaptopropanol (BAL) per se sobre alguns parâmetros toxicológicos e em modelos de intoxicação por cádmio. A atividade da δ-aminolevulinato desidratase (δ- ALA-D) de sangue humano foi inibida pelos agentes quelantes ditiólicos de maneira dependente da concentração. O ditiotreitol e o cloreto de zinco foram efetivos em proteger da inibição da δ-ALA-D causada pelo BAL, DMPS e DMSA de maneira dependente da concentração. O tratamento agudo com os agentes quelantes causou alterações em vários parâmetros toxicológicos em camundongos. O BAL causou uma diminuição significante na atividade da δ-ALA-D renal e um aumento na atividade da enzima cerebral e hepática. O DMPS causou uma inibição na atividade da δ-ALA-D de rim, enquanto os animais que receberam uma única dose de DMSA não apresentaram modificação na atividade da enzima nos tecidos. Todos os quelantes produziram um aumento na peroxidação lipídica no fígado e no rim. Os camundongos que receberam o DMPS apresentaram um aumento na concentração de zinco renal e uma depleção do zinco hepático ocorreu nos camundongos administrados com BAL. De todos os metais tóxicos encontrados no ambiente e utilizados industrialmente, o cádmio ocupa um lugar especial devido à natureza geralmente intratável da intoxicação por este metal. Muitas evidências indicam que as espécies reativas de oxigênio estão envolvidas no dano tecidual induzido pelo cádmio. Então, acredita-se que um antioxidante seja um componente importante de um tratamento efetivo da intoxicação por cádmio, bem como a terapia combinada com antioxidantes e quelantes poderia ser melhor do que a terapia que utiliza apenas os quelantes. A intoxicação aguda por cádmio causou inibição das atividades da δ-ALA-D e da superóxido dismutase (SOD), redução na concentração de ácido ascórbico e aumento da peroxidação lipídica nos testículos dos camundongos. Observou-se também uma elevação da LDH, AST e ALT plasmática. O DMSA, o DMPS e o disseleneto de difenila ((PhSe)2) protegeram do efeito inibitório induzido pelo cádmio na δ-ALA-D e restauraram o aumento dos níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Entretanto, estes compostos sozinhos ou em combinação foram incapazes de proteger a atividade da SOD e em recuperar os níveis de ácido ascórbico. A terapia combinada (DMSA e (PhSe)2) não foi melhor que a monoterapia em restaurar os parâmetros toxicológicos avaliados neste modelo de dano testicular induzido por cádmio. Por outro lado, o uso da terapia combinada (DMPS e (PhSe)2) foi melhor que a monoterapia em reduzir os níveis de cádmio nos testículos e em restaurar o nível da AST plasmática. A intoxicação sub-crônica por cádmio em camundongos causou inibição da atividade da δ-ALA-D do fígado, rim e baço e a terapia com (PhSe)2 foi efetiva em restaurar a atividade da enzima em todos os tecidos. Uma redução no conteúdo de ácido ascórbico no rim e no baço foi também observado, enquanto o (PhSe)2 foi efetivo em restaurar esta redução somente no rim. Além disso, a terapia com este composto foi efetiva em restaurar o aumento dos níveis de TBARS causado pelo cádmio nos tecidos hepático e cerebral. De maneira geral, os resultados deste estudo indicam que é necessário investigar a toxicidade potencial dos agentes quelantes, uma vez que eles podem ser tão prejudiciais quanto os metais que eles quelam. Além disso, a terapia com (PhSe)2 na intoxicação por cádmio pode ser útil, tanto quando utilizada sozinha (antioxidante) quanto combinado com DMPS ou DMSA

An important direction in nanoscale science is to synthesize materials whereby atomic clusters serve as the building blocks. Properties of these clusters can be controlled through size and composition, and such an approach offers a pathway toward designing larger, customized materials. One way to stabilize such materials is through the use of ligated clusters. Ag4Ni2(DMSA)4 is one such cluster, the first with a bimetallic core, and has been stabilized by the experimental group of A. Sen at The Pennsylvania State University. The theoretical studies undertaken in this thesis were directed toward providing information on the atomic structure, nature of electronic states, optical spectra, and any magnetic information of this new species. Theoretical studies have also been carried out on various clusters to provide input into the fragmentation data obtained through MS/MS experiments.

Les nanoparticules d’oxyde de fer de structure spinelle ouvrent de nombreuses voies dans le domaine biomédical. Parmi les applications possibles, les propriétés superparamagnétiques des cristallites d'une dizaine de nanomètres permettent de les utiliser pour le diagnostic médical, notamment en Imagerie par Résonance Magnétique (IRM).Ce travail a consisté à élaborer des suspensions colloïdales de nanoparticules de magnétite ou de maghémite (nommées USPIO pour Ultrasmall SuperParamagnetic Iron Oxide) compatibles avec les conditions physiologiques (pH = 7,4 et [NaCl] = 0,15 M).Par co-précipitation classique, des USPIO, de taille de cristallites de 8 nm, de surface spécifique de 110 m².g-1 et agrégés en assemblages d’environ 20 nm ont été obtenus. Pour stabiliser ces nano-objets, deux voies ont été explorées. Des agents électrostatiques (acide citrique et DMSA) ont modifié la charge nette de surface des oxydes de fer. La stabilisation stérique a également été explorée par greffage de méthoxy-PEG couplés à des fonctions silanes (mPEG-Si). Par combinaison de mPEG2000-Si et de DMSA, des suspensions stables ont également été obtenues. De plus, les fonctions thiols apportées par le DMSA et présentes à la surface des agrégats se trouvent protégées de leur oxydation naturelle par l'encombrement stérique des chaînes de polymère (la formation de ponts disulfures est évitée). La post-fonctionnalisation de ces nanoparticules via ces fonctions thiols est alors possible plusieurs semaines après leur synthèse. Ce concept a été validé par post-greffage d’un fluorophore (0,48 RITC/nm²) pour la détection in vitro en microscopie à fluorescence.En parallèle de cette étude en « batch », des nanoparticules d’oxyde de fer ont été synthétisées en continu à l’aide d’un procédé hydrothermal pouvant s’étendre au domaine eau supercritique. En voie hydrothermale classique, des USPIO stabilisés par des ions citrates ont été obtenus en continu. Grâce aux propriétés physicochimiques de l’eau supercritique, la co-précipitation de magnétite a été possible sans l’utilisation de base.La cytotoxicité et l’internalisation cellulaire de ces USPIO ont été évaluées sur trois modèles cellulaires (macrophages RAW, hépatocytes HepG2 et cardiomyocytes) et les efficacités comme agents de contraste en IRM de ces nanoparticles ont été mesurées sur gel et sur modèle murin et comparées à un agent de contraste commercial à base d’oxyde de fer. Les nanohybrides étudiés n’ont pas présenté de cytotoxicité et ont développé des pouvoirs contrastants comparables à l’agent commercial. La biodistribution hépatique des nanoparticules couplées au mPEG-Si a été retardée de plus de 3 heures ouvrant la voie à des détections spécifiques. / Spinel structured iron oxide nanoparticles open the way of biomedical applications of nanomaterials.Superparamagnetic properties of ten nanometer size crystallites permit to use them in diagnosis such as Magnetic Resonance Imaging (MRI).The aim of this work was to synthesize colloidal suspension of magnetite or maghemite (called USPIO for Ultrasmall SuperParamagnetic Iron Oxide) stable in physiological conditions (pH = 7.4 and [NaCl] = 0.15M).By classical co-precipitation method, UPSIO were synthesized with a mean crystallite size of 8 nm, with a specific surface area of 110 m².g-1 and an aggregate size of 20 nm. To stabilize these nano-objects, two ways were investigated. Electrostatic agents (like citric acid and DMSA) modified iron oxide surface charge. Steric stabilization was also studied by grafting methoxy-PEG coupled with a silane function (mPEG-Si).and the combination mPEG - DMSA also resulted in stable suspensions. Moreover thiols functions coming from DMSA and present on the surface of the nanoparticles were prevented from oxidation thanks to steric protection of polymer chains. Thanks to this method post-functionalization of USPIO was possible several weeks after synthesis. This concept was validated with the post-grafting of a dye (0.48 RITC per nm²) used for in vitro detection in fluorescent microscopy.Nanoparticles were also synthesized in a continuous way with a hydrothermal process which could work from soft chemistry to supercritical water. In classical hydrothermal conditions, USPIO stabilized with citrates were obtained in a continuous way. Thanks to the physico-chemical properties of supercritical water, co-precipitation of magnetite without base adding was possible.Cytotoxicity and cellular internalization assays were done with our USPIO in three cellular models (macrophages RAW, hepatocytes HePG2 and cardiomyocytes). Moreover the efficiency as MRI contrast agents were measured in gels tubes and on mice models and compared to an iron oxide commercial product. Late hepatic biodistribution (more than three hours) was proven with pegylated nanoparticles, which opens the way of specific detections.

Les nanoparticules d'oxyde de fer de structure spinelle ouvrent de nombreuses voies dans le domaine biomédical. Parmi les applications possibles, les propriétés superparamagnétiques des cristallites d'une dizaine de nanomètres permettent de les utiliser pour le diagnostic médical, notamment en Imagerie par Résonance Magnétique (IRM).Ce travail a consisté à élaborer des suspensions colloïdales de nanoparticules de magnétite ou de maghémite (nommées USPIO pour Ultrasmall SuperParamagnetic Iron Oxide) compatibles avec les conditions physiologiques (pH = 7,4 et [NaCl] = 0,15 M).Par co-précipitation classique, des USPIO, de taille de cristallites de 8 nm, de surface spécifique de 110 m².g-1 et agrégés en assemblages d'environ 20 nm ont été obtenus. Pour stabiliser ces nano-objets, deux voies ont été explorées. Des agents électrostatiques (acide citrique et DMSA) ont modifié la charge nette de surface des oxydes de fer. La stabilisation stérique a également été explorée par greffage de méthoxy-PEG couplés à des fonctions silanes (mPEG-Si). Par combinaison de mPEG2000-Si et de DMSA, des suspensions stables ont également été obtenues. De plus, les fonctions thiols apportées par le DMSA et présentes à la surface des agrégats se trouvent protégées de leur oxydation naturelle par l'encombrement stérique des chaînes de polymère (la formation de ponts disulfures est évitée). La post-fonctionnalisation de ces nanoparticules via ces fonctions thiols est alors possible plusieurs semaines après leur synthèse. Ce concept a été validé par post-greffage d'un fluorophore (0,48 RITC/nm²) pour la détection in vitro en microscopie à fluorescence.En parallèle de cette étude en " batch ", des nanoparticules d'oxyde de fer ont été synthétisées en continu à l'aide d'un procédé hydrothermal pouvant s'étendre au domaine eau supercritique. En voie hydrothermale classique, des USPIO stabilisés par des ions citrates ont été obtenus en continu. Grâce aux propriétés physicochimiques de l'eau supercritique, la co-précipitation de magnétite a été possible sans l'utilisation de base.La cytotoxicité et l'internalisation cellulaire de ces USPIO ont été évaluées sur trois modèles cellulaires (macrophages RAW, hépatocytes HepG2 et cardiomyocytes) et les efficacités comme agents de contraste en IRM de ces nanoparticles ont été mesurées sur gel et sur modèle murin et comparées à un agent de contraste commercial à base d'oxyde de fer. Les nanohybrides étudiés n'ont pas présenté de cytotoxicité et ont développé des pouvoirs contrastants comparables à l'agent commercial. La biodistribution hépatique des nanoparticules couplées au mPEG-Si a été retardée de plus de 3 heures ouvrant la voie à des détections spécifiques.