Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The exposure of human populations to a variety of heavy metals has been a public health concern. Cadmium is a non-essential elements due to its immense usage in various industrial applications, is an environmental contaminant with food and tobacco smoking. This toxic metal is more efficiently absorbed through the lungs than through the gastrointestinal tract. Therefore, the use of lung as a target tissue of cadmium exposure is of great importance because this heavy metal can be absorbed on suspended particles, entering the lung through the respiration. Thus, a possible therapy for metal intoxication is to remove the toxic metals from the bound functional bioligands. The present study was designed to evaluate the effect of cadmium on d-minolevulinate dehydratase (d-ALA-D) activity from rat lung in vitro. d-ALA-D activity, a toxicological parameter, has been reported as a target of cadmium in different tissues. The protective effect of monotherapies with dithiol chelating (meso-2,3-dimercaptosuccinic acid (DMSA) and 2,3-dimercaptopropane-1- sulfonic acid (DMPS)) or antioxidant agent (ascorbic acid, diphenyl diselenide, (PhSe)2, and Nacetylcysteine (NAC)) were also evaluated; as well as, the effect of a combined therapy (dithiol chelating x antioxidant agent) was studied. Moreover, to investigate the possible mechanism involved, we determined the effect of zinc chloride (ZnCl2) and dithiothreitol (DTT). The rat lung d-ALA-D activity was inhibited by low concentrations of cadmium, this inhibition occurred due the oxidation of SH groups of enzyme, and not by displacing zinc from the enzyme structure. The chelating agents were not effective in restoring enzyme activity inhibited by cadmium, and it presented an inhibitory effect per se. The possible mechanism involved in this inhibition was demonstrated. DTT restored the inhibition caused by both chelating agents, but ZnCl2 restored only the inhibitory effect of DMSA. This indicated that DMPS did not remove the zinc ions of the enzyme structure. This study also demonstrated that these chelating agents potentialized the d-ALA-D inhibition caused by cadmium. In this way, the study of possible mechanism verified that DTT restore the enzyme inhibition caused by cadmium/DMSA complex, but not by cadmium/DMPS complex. In contrast to DTT, ZnCl2 did not restore the enzyme activity inhibited by both complexes. In relation to antioxidants compounds, we can verify that none antioxidant utilized in this work was efficient in restoring the enzyme activity inhibited by cadmium. Some authors had demonstrated that the association of chelating and antioxidant agents is a good alternative in treatment of metal intoxication. In this way, we observed a combined effect of cadmium x DMPS x (PhSe)2 and cadmium x DMPS x NAC. However, this combined effect of cadmium x antioxidant x chelating did not observe when we utilized DMSA as chelating agent. In general, the results of this study indicate that cadmium inhibited the pulmonary d-ALA-D activity; and, the use oh chelating and antioxidant agents, alone or combined, 6 did not restore the enzyme activity, in some cases, potentialized the inhibition induced by cadmium. The principal mechanism involved in enzyme inhibition was the oxidation of SH groups. / A exposição das populações humanas a uma variedade de metais pesados é um problema de saúde pública. O cádmio é um elemento não essencial e devido ao seu imenso uso em diversas aplicações industriais, é um contaminante ambiental através da comida e da fumaça do cigarro. Este metal tóxico é mais eficientemente absorvido através dos pulmões do que do trato gastrointestinal. Portanto, o uso dos pulmões como um tecido alvo do cádmio é de grande importância porque este metal pesado pode ser absorvido, entrando nos pulmões através da respiração. Uma terapia possível para a intoxicação por metais é remover os metais tóxicos ligados a bioligantes funcionais. O presente estudo foi delineado para avaliar o efeito in vitro do cádmio na atividade da d-aminolevulinato desidratase (d-ALA-D) em pulmão de rato. A atividade da d-ALA-D, um parâmetro toxicológico, tem sido reportada como alvo do cádmio em diferentes tecidos. Foram avaliados também o possível efeito protetor dos agentes quelantes ditiólicos (ácido 2,3-dimercapto-1-propanosulfônico (DMPS) e o ácido meso 2,3- dimercaptosuccínico (DMSA)) ou agentes antioxidantes (ácido ascórbico, N-acetilcisteína (NAC) e o disseleneto de difenila (PhSe)2) isolados ou em combinação (agentes quelantes x antioxidantes). Além disso, para investigar o possível mecanismo envolvido, nós determinamos o efeito restaurador do cloreto de zinco (ZnCl2) e do ditiotreitol (DTT) na d-ALA-D. A atividade da d-ALA-D de pulmão de rato foi inibida por baixas concentrações de cádmio, e esta inibição ocorreu devido a oxidação dos grupos -SH da enzima, e não por remover os íons zinco da estrutura enzimática. Os agentes quelantes não foram efetivos em proteger a atividade da enzima inibida por cádmio, e apresentaram um efeito inibitório per se. O possível mecanismo envolvido nesta inibição foi demonstrado. O DTT restaurou a inibição causada por ambos agentes quelantes, mas o ZnCl2 restaurou somente o efeito inibitório do DMSA. Isto indica que o DMPS não remove os íons zinco da estrutura da enzima. Este estudo demonstrou também que estes agentes quelantes potencializam a inibição da d-ALA-D causada por cádmio. Neste sentido, o estudo do possível mecanismo verificou que o DTT restaura a inibição da enzima causada pelo complexo cádmio/DMSA, mas não pelo complexo cádmio/DMPS. Ao contrário do DTT, o ZnCl2 não restaura a atividade da enzima inibida por ambos complexos. Em relação aos compostos antioxidantes, nós podemos verificar que nenhum antioxidante utilizado neste trabalho foi eficiente em restaurar a atividade da enzima inibida por cádmio. Alguns autores têm demonstrado que a associação de agentes quelantes e antioxidantes é uma boa alternativa no tratamento das intoxicações por metais. Neste sentido, observou-se um efeito combinado de cádmio x DMPS x (PhSe)2 e cádmio x DMPS x NAC. Porém esse efeito combinado de cádmio x antioxidantes x quelantes não foi observado quando se utilizou o DMSA como 4 agente quelante. De uma maneira geral, os resultados deste estudo indicam que o cádmio inibiu a atividade da d-ALA-D do tecido pulmonar; e ainda, o uso de agentes quelantes e antioxidantes, sozinhos ou combinados, não restauraram a atividade da enzima, sendo que em alguns casos, potencializaram a inibição induzida por cádmio. O mecanismo principal envolvido na inibição da enzima foi à oxidação dos grupos sulfidrílicos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Lead is a common occupational and environmental hazard, and it is known that can be toxic to several species of animals, and experimental studies support the theory of oxidative damage in lead toxicity. Literature data have shown that high- sucrose diet can increase oxidative stress. Oxidative stress is related with several pathologies, such as enzyme inhibitions to behavioral disorders. Organoselenium compounds, Ebselen and diphenyl diselenide have described antioxidant properties, such as thiol- peroxidase activity. In a sub-chronic protocol of intoxication (ARTICLE 1), was determined whether these selenocompounds were effective to restore the leadtoxicity in mice. Lead acetate injection with subsequent injection of Ebselen only reduce the hepatic levels of non- protein thiol groups (NPSH). The treatment with Ebselen also reduced TBARS levels in kidney. Whereas lead inhibited δ-ALA-D activity in all tissues, Ebselen performed a recovery brain enzyme inhibition. It was also observed that metal or selenocompounds did not change glutamate uptake, whereas lead plus Ebselen showed an increase on this parameter. The results of this study indicate that δ-ALA-D inhibition antecedes the overproduction of reactive oxygen species in a short- term protocol of mice intoxication. In other study (MANUSCRIPT 2), where treated female rats for 12 months with lead acetate and/or sucrose- diet, to evaluate whether simultaneous exposure to these agents could enhance the appearance of orofacial dyskinesia, or could disturb the locomotor behavior. The aged rats demonstrated an increased orofacial dyskinesia, whereas sucrose ingestion was not associated with this parameter. The association between lead and sucrose caused a reduction on orofacial dyskinesia, and can be related to an adaptation after long-term exposure to pro-oxidant agents. In MANUSCRIP 3, a study carried out for 24 months of sucrose diet and lead exposure, where observed that the effects were tissue- specific. Another result obtained in this study was an increased spleen ALA-D activity, it is a vi contraditory result, because this enzyme is a classical marker of lead toxicity. These results may indicate that ALA-D is an indicator of acute or sub-chronic lead exposure and that some adaptations to lead and/or sucrose toxicity occur after long-term exposure to these substances. / O chumbo apresenta um risco ocupacional e ambiental, e sabe-se que pode ser tóxico para diversas espécies de animais. Diversos estudos experimentais confirmam a teoria de dano oxidativo na toxicidade promovida pelo chumbo. Dados da literatura tem mostrado que dietas ricas em sacarose podem incrementar o estresse oxidativo. Estresse oxidativo está relacionado com diversas patologias, desde inibições enzimáticas até distúrbios comportamentais. Compostos orgânicos de selênio, ebselen e disseleneto de difenila tem uma descrita atividade antioxidante, semelhante à atividade tiolperoxidase. Em um protocolo de intoxicação sub- crônica (ARTIGO 1), determinou-se se estes compostos seriam efetivos para reverter a toxicidade promovida pelo chumbo em camundongos. Injeções de acetato de chumbo, com subseqüentes injeções de ebselen reduziram apenas os níveis hepáticos de grupos tiólicos não protéicos (NPSH). O tratamento com ebselen também reduziu os níveis de TBARS no rim. Enquanto o chumbo inibiu a atividade da δ-ALA-D em todos os tecidos, o ebselen reverteu a inibição enzimática no cérebro. Também foi observado que o metal ou os organocompostos de selênio não modificaram a captação de glutamato, enquanto o ebselen promoveu um aumento neste parâmetro. Os resultados deste estudo indicam que a inibição da atividade da δ-ALA-D antecede a produção de espécies reativas de oxigênio em um protocolo sub- crônico de intoxicação em camundongos. Em outro estudo (MANUSCRITO 2), ratas foram tratadas por 12 meses com acetato de chumbo e/ou dieta rica em sacarose, para avaliar se a exposição simultânea a estes agentes poderia produzir o aparecimento de discinesia orofacia, ou modificar o comportamento locomotor. Os ratos demonstraram um incremento na discinesia orofacial, enquanto a ingestão de sacarose não esteve associada à este parâmetro. A associação entre chumbo e iv sacarose causou uma diminuição na discinesia orofacial, o que pode estar relcionado a uma adaptação após uma prolongada exposição a agentes próoxidantes. No MANUSCRITO 3, foi conduzido um estudo por 24 meses com uma dieta rica em sacarose e exposição ao chumbo, onde foram observados uma especificidade dos efeitos nos tecidos. Outro resultado obtido neste estudo foi um aumento na atividade da δ-ALA-D de baço, o que é um resultado contraditório, uma vez que esta enzima é um clássico marcador de toxicidade por chumbo. Estes resultados podem indicar que a enzima δ-ALAD é um indicador de toxicidade aguda ou sub- crônica, e que pode ocorrer alguma adaptação à toxicidade promovida pela sacarose e/ou pelo chumbo após exposição prolongada a estas substâncias.

Several metals are known to disturb cellular functions by binding to thiol groups of biomolecules. Therefore, a possible therapy for metal intoxication is to remove the toxic metals from the bound functional bioligands by administering strong thiol-containing chelators. However, these compounds could remove endogenous metals, which are essential components of many enzyme systems. Thus, the present study was designed to evaluate the effects of chelating agents, meso-2,3-dimercaptosuccinic acid (DMSA), 2,3-dimercaptopropane 1-sulfonate (DMPS) and 2,3-dimercaptopropanol (BAL) per se on toxicological parameters and models of cadmium intoxication. δ-Aminolevulinate dehydratase (δ-ALA-D) activity from human erythrocytes was inhibited by dithiol chelating agents in a concentration-dependent manner. Dithiotreitol and zinc chloride were able to protect the δ-ALA-D inhibition caused by BAL, DMPS and DMSA in a concentration-dependent manner. Acute treatment with chelating agents caused changes in a number of toxicological parameters in mice. BAL caused a decrease on renal δ-ALA-D activity and an increase on brain and liver enzyme activity. DMPS caused an inhibition in renal δ-ALA-D activity, while animals that received a single dose of DMSA did not present δ-ALA-D activity of tissues modified. All three agents produced an increase in both liver and renal lipid peroxidation. Mice that received DMPS presented an increase in renal zinc concentration and a depletion of hepatic zinc occurred in mice administrated with BAL. Of all the toxic metals found in the environment and used in industry, cadmium occupies a special place because of the generally intractable nature of cadmium intoxication. Several lines of evidence indicate that reactive oxygen species are involved in cadmium-mediated tissue damage. Thus, it is believed that antioxidant should be one of the important components of an effective treatment of cadmium poisoning, as well, combined therapy with antioxidants and chelators can yield better therapeutic outcomes than isolated chelation therapy. Acute cadmium-intoxication caused inhibition of δ-ALA-D and superoxide dismutase (SOD) activities, reduction in ascorbic acid levels and increase of lipid peroxidation in mice testes. Also, an increase on plasmatic lactate dehydrogenase (LDH), aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) activities was observed. DMSA, DMPS and diphenyl diselenide ((PhSe)2) protected against the inhibitory effect of cadmium on δ-ALA-D activity and restored the increase of TBARS levels. However, these compounds alone or in combination, were unable to protect SOD activity and to improve ascorbic acid levels near to the normal value. The use of combined therapy (DMSA plus (PhSe)2) not proved be better than the monotherapy, in improving the toxicological parameters evaluated in this model of testicular damage induced by cadmium. On the other hand, the use of combined therapy (DMPS plus (PhSe)2) proved to be better than the monotherapy in decreasing cadmium levels in testes and in ameliorating plasmatic AST level. Sub-chronic effects of cadmium-intoxication in mice caused inhibition of δ-ALA-D activity in liver, kidney and spleen and (PhSe)2 therapy was effective in restoring enzyme activity in all tissues. Also, a reduction in ascorbic acid content by cadmium was observed in kidney and spleen, whereas (PhSe)2 was only effective in improving this reduction in kidney. The therapy with this compound was effective in restoring an increase of TBARS levels caused by cadmium in liver and brain tissues. In general, the results of this study indicate that it is necessary to investigate the potential toxicity of the chelating agents, since chelators may be as harmful as the metals they chelate. In addition, (PhSe)2 therapy in cadmium poisoning may be considered, as alone (antioxidant) as combined with DMPS and DMSA / Diversos metais alteram as funções celulares por serem capazes de se ligar a grupos tióis de biomoléculas. Portanto, uma terapia eficaz na intoxicação por metal seria a remoção dos metais tóxicos dos bioligantes funcionais através da administração de quelantes contendo grupos tióis. Entretanto, estes compostos poderiam remover metais endógenos, os quais são componentes essenciais de muitos sistemas enzimáticos. Dessa forma, o presente estudo foi delineado para avaliar os efeitos dos agentes quelantes, ácido meso-2,3-dimercaptosuccínico (DMSA), ácido 2,3-dimercaptopropano 1-sulfônico (DMPS) and 2,3-dimercaptopropanol (BAL) per se sobre alguns parâmetros toxicológicos e em modelos de intoxicação por cádmio. A atividade da δ-aminolevulinato desidratase (δ- ALA-D) de sangue humano foi inibida pelos agentes quelantes ditiólicos de maneira dependente da concentração. O ditiotreitol e o cloreto de zinco foram efetivos em proteger da inibição da δ-ALA-D causada pelo BAL, DMPS e DMSA de maneira dependente da concentração. O tratamento agudo com os agentes quelantes causou alterações em vários parâmetros toxicológicos em camundongos. O BAL causou uma diminuição significante na atividade da δ-ALA-D renal e um aumento na atividade da enzima cerebral e hepática. O DMPS causou uma inibição na atividade da δ-ALA-D de rim, enquanto os animais que receberam uma única dose de DMSA não apresentaram modificação na atividade da enzima nos tecidos. Todos os quelantes produziram um aumento na peroxidação lipídica no fígado e no rim. Os camundongos que receberam o DMPS apresentaram um aumento na concentração de zinco renal e uma depleção do zinco hepático ocorreu nos camundongos administrados com BAL. De todos os metais tóxicos encontrados no ambiente e utilizados industrialmente, o cádmio ocupa um lugar especial devido à natureza geralmente intratável da intoxicação por este metal. Muitas evidências indicam que as espécies reativas de oxigênio estão envolvidas no dano tecidual induzido pelo cádmio. Então, acredita-se que um antioxidante seja um componente importante de um tratamento efetivo da intoxicação por cádmio, bem como a terapia combinada com antioxidantes e quelantes poderia ser melhor do que a terapia que utiliza apenas os quelantes. A intoxicação aguda por cádmio causou inibição das atividades da δ-ALA-D e da superóxido dismutase (SOD), redução na concentração de ácido ascórbico e aumento da peroxidação lipídica nos testículos dos camundongos. Observou-se também uma elevação da LDH, AST e ALT plasmática. O DMSA, o DMPS e o disseleneto de difenila ((PhSe)2) protegeram do efeito inibitório induzido pelo cádmio na δ-ALA-D e restauraram o aumento dos níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Entretanto, estes compostos sozinhos ou em combinação foram incapazes de proteger a atividade da SOD e em recuperar os níveis de ácido ascórbico. A terapia combinada (DMSA e (PhSe)2) não foi melhor que a monoterapia em restaurar os parâmetros toxicológicos avaliados neste modelo de dano testicular induzido por cádmio. Por outro lado, o uso da terapia combinada (DMPS e (PhSe)2) foi melhor que a monoterapia em reduzir os níveis de cádmio nos testículos e em restaurar o nível da AST plasmática. A intoxicação sub-crônica por cádmio em camundongos causou inibição da atividade da δ-ALA-D do fígado, rim e baço e a terapia com (PhSe)2 foi efetiva em restaurar a atividade da enzima em todos os tecidos. Uma redução no conteúdo de ácido ascórbico no rim e no baço foi também observado, enquanto o (PhSe)2 foi efetivo em restaurar esta redução somente no rim. Além disso, a terapia com este composto foi efetiva em restaurar o aumento dos níveis de TBARS causado pelo cádmio nos tecidos hepático e cerebral. De maneira geral, os resultados deste estudo indicam que é necessário investigar a toxicidade potencial dos agentes quelantes, uma vez que eles podem ser tão prejudiciais quanto os metais que eles quelam. Além disso, a terapia com (PhSe)2 na intoxicação por cádmio pode ser útil, tanto quando utilizada sozinha (antioxidante) quanto combinado com DMPS ou DMSA

Crianças são mais sensíveis aos efeitos adversos causados por contaminantes ambientais, tais como os metais, do que os adultos. Dentre esses efeitos adversos, estão os danos ao sistema nervoso central e inibição da enzima δ-aminolevulinato desidratase (ALA-D). Neste trabalho, as concentrações de alguns metais (Al, Pb, Cd, As, Hg, Cr, Mn e Fe) foram quantificadas em amostras de sangue total, soro e cabelo de crianças provenientes de uma área rural e de uma área urbana. Esses elementos também foram quantificados em amostras de água das residências das crianças. A função cognitiva foi avaliada através da aplicação do Teste Matrizes Progressivas Coloridas de Raven. A atividade da enzima ALA-D e o índice de reativação da enzima (ALA-RE) com DTT e com ZnCl2 foram avaliados. As crianças da área rural demonstraram menor desempenho cognitivo no Teste de Raven do que as crianças da área urbana (p<0,001). Níveis sanguíneos de Cr e Hg foram negativamente associados aos escores de QI (p<0,005). Além disso, os escores de QI foram negativamente associados com os níveis de Mn e Fe no cabelo (p<0,01). Adicionalmente, correlações de Spearman foram observadas entre: Mn no cabelo vs. Mn na água (p<0,001); Fe no cabelo vs. Fe na água (p<0,05) e Fe no sangue total vs. Fe na água (p<0,001). A atividade da enzima ALA-D foi significativamente diminuída nas crianças da área rural em relação às crianças da área urbana (p<0,05), bem como a ALA-RE com DTT e ZnCl2 foi significativamente aumentada nas crianças da área rural em comparação com as crianças da área urbana (p<0,005). Adicionalmente, a inibição da ALA-D foi correlacionada com os níveis sanguíneos de Cr (p<0,05) e a ALA-RE com DTT foi associada com os níveis sanguíneos de Cr (p<0,001) e Hg (p<0,001). De forma semelhante, a ALA-RE com ZnCl2 foi também correlacionada com níveis sanguíneos de Cr e Hg (p<0,05). Neste estudo foi possível observar déficit na função cognitiva e inibição da ALA-D associados à exposição a alguns metais em crianças da área rural. Além disso, os resultados indicaram a água como uma provável fonte de contaminação a metais. / Children are more sensitive to the adverse effects caused by environmental contaminants, such as metals, than adults. Among these adverse effects, there are the damage to nervous system central and inhibition of the enzyme δ-aminolevulinate dehydratase (ALA-D). In this study, the concentrations of some metals (Al, Pb, Cd, As, Hg, Cr, Mn and Fe) were quantified in whole blood, serum and hair of children from rural and urban areas. These elements were measured on samples of drinking water from household’s children. The cognitive function was evaluated by the Raven’s Colored Progressive Matrices Test. The activity of the ALA-D and the rate of reactivation of the enzyme (ALA-RE) with DTT and ZnCl2 were evaluated. Children from rural area had lower performance on the Raven’s Test than children from urban area (p<0.001). The Cr and Hg blood levels were negatively associated with percentile IQ scores (p<0.05). Moreover, the IQ scores were negatively associated with Mn and Fe in hair (p<0.01). Additionally, Spearman’s correlations were found between: Mn in hair vs. Mn in drinking water (p<0.001); Fe in hair vs. Fe in drinking water (p<0.05) and Fe in whole blood vs. Fe in drinking water (p<0.001). The activity of ALA-D was significantly decreased in children from rural area when compared with children from urban area (p<0.05) and the ALA-RE with DTT and ZnCl2 was significantly increased in children from rural area compared with children from urban area (p<0.005). Additionally, the ALA-D inhibition was correlated with Cr in blood (p<0.05) and ALA-RE with DTT was associated with blood levels of Cr and Hg (p<0.001). Similarly, ALA-RE with ZnCl2 was also correlated with blood levels of Cr and Hg (p<0.05). In this study it was revealed cognitive deficit and ALA-D inhibition associated with exposure to some metals in children from a rural area. Moreover, the results indicated the drinking water as a possible source of contamination to metals.

Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-03-08T23:02:15Z No. of bitstreams: 1 126110004.pdf: 1813851 bytes, checksum: 1a28f794fef01acd23da69d00092235e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-08T23:02:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 126110004.pdf: 1813851 bytes, checksum: 1a28f794fef01acd23da69d00092235e (MD5) Previous issue date: 2014-02-22 / A δ-aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D) é uma metaloenzima que requer íons zinco para sua atividade catalítica máxima. Devido a sua natureza sulfidrílica, a δ-ALA-D é extremamente sensível à presença de agentes oxidantes, sendo inibida por metais pesados que possuam elevada afinidade por grupamentos sulfidrílicos, como o Cádmio (Cd). O Cd é um metal pesado e um elemento não essencial utilizado industrialmente. É um dos poluentes mais tóxicos distribuídos no meio ambiente, uma vez que atividades antropogênicas fizeram com que sua concentração aumentasse na atmosfera e se tornasse um contaminante de alimentos e água. Uma importante fonte de Cd nos seres humanos é através da inalação da fumaça de cigarro, pois já que possui uma alta biodisponibilidade, é facilmente depositado em vários tecidos, especialmente o trato reprodutivo. Embora este metal possa causar graves danos aos embriões e aos órgãos reprodutivos, os mecanismos precisos referentes à sua toxicidade permanecem incertos. O objetivo deste tabalho foi avaliar o efeito do cádmio e do seleno-furanosídeo sobre a atividade da enzima δ-ALA-D de ovário, in vitro e ex vivo. Observou-se que baixas concentrações de Cd inibiram a atividade da enzima δ-ALA-D em ovário de vaca in vitro, e o valor da IC 50 obtido foi de 19,17 μM. O Seleno- furanosídeo (10, 50, 100, 200, 400 e 1000 μM) não foi capaz de reverter a toxicidade do Cd no tecido ovariano bovino in vitro. Foi demonstrado também o possível mecanismo pelo qual o Cd inibe a atividade da enzima δ-ALA-D, utilizando o ditiotreitol (DTT) e o Cloreto de Zinco (ZnCl 2 ), onde foi demonstrado que o DTT (3mM) protegeu a inibição da atividade da enzima causada pelo Cd, enquanto o ZnCl 2 (100μM) não protegeu o efeito inibitório do metal, sugerindo que a inibição da atividade da enzima estaria relacionado a oxidação dos grupos tiólicos. No estudo ex vivo utilizando camundongos Swiss (fêmeas adultas), a exposição aguda ao Cd (2,5 e 5 mg/kg intraperitoneal) provocou uma inibição significativa da atividade da δ-ALA-D de ovário (cerca de 27% e 34%, respectivamente). A terapia com o seleno- furanosídeo ex vivo (100 μmol/kg) foi capaz de restaurar a atividade enzimática. Assim, foi demonstrado pela primeira vez que a atividade da enzima δ-ALA-D ovariana é inibida pelo Cd tanto in vitro como ex vivo. Além disso, a terapia com o seleno-furanosídeo foi eficaz em restaurar a atividade da enzima inibida pela exposição ao Cd em ovário de camundongas, mas não foi eficaz em reverter o efeito do metal in vitro. Neste estudo, foi encontrado um novo marcador de toxicidade de Cd no tecido ovariano, bem como o efeito benéfico de um novo composto para tratar o efeito do metal após a exposição aguda do Cd. / δ- aminolevulinate dehydratase (δ-ALA-D) is a metalloenzyme that requires zinc ions for maximum catalytic activity. Due to its sulphidrilic nature, δ-ALA-D is very sensitive to the presence of oxidizing agents being inhibited by heavy metals that have a high affinity for sulfhydryl groups such as cadmium (Cd). Cd is a heavy metal and a non-essential element used industrially. It is one of the most toxic pollutants distributed in the environment, since anthropogenic activities have increased its concentration in the atmosphere and become a contaminant of food and water. An important source of Cd in humans is through inhalation of cigarette smoke, because since it has a high bioavailability, is easily deposited in various tissues, especially the reproductive tract. Although this metal can cause serious damage to embryos and reproductive organs, the precise mechanisms relating to its toxicity remain uncertain . The objective of this work was to evaluate the effect of cadmium and seleno - furanoside on the activity of the enzyme δ-ALA-D ovary , in vitro and ex vivo. We observed that low concentrations of Cd inhibited cow ovary δ-ALA-D activity in vitro and the IC 50 value obtained was 19.17 μM. The Seleno-furanoside (10, 50, 100, 200, 400 and 1000 μM) did not reverse the Cd toxicity in bovine ovarian tissue in vitro. It was also shown possible mechanism by which Cd inhibits the enzyme activity of δ-ALA-D using dithiothreitol (DTT) and Zinc Chloride (ZnCl 2 ), where it was shown that DTT (3 mM) protected against enzyme activity inhibited by Cd while the ZnCl 2 (100μM) did not protect the inhibitory effect of the metal, suggesting that the inhibition of enzyme activity is related to the oxidation of thiol groups. In the ex vivo sturdy using Swiss (adult females), acute exposure to Cd (2.5 and 5 mg / kg intraperitoneally) caused a significant inhibition of δ-ALA-D ovarian (about 27% and 34% activity, respectively). Therapy with seleno-furanosídeo ex vivo (100 μmol /kg) was able to restore enzyme activity. Thus, it was demonstred for the first time that the activity of δ-ALA-D ovarian enzyme is inhibited by Cd both in vitro and ex vivo. In addition, therapy with seleno-furanoside was effective in restoring the enzyme activity inhibited by Cd exposure in mice ovary but was not effective in reversing the effect of metal in vitro. This study found a new marker of toxicity of Cd in ovarian tissue, as well as the beneficial effect of a new compound for treating metal effect after acute exposure of Cd. / Effect of Cadmium and Seleno-furanoside on the Δ-Aminolevulinate Dehydratase Activity In Vitro and Ex Vivo.

Crianças são mais sensíveis aos efeitos adversos causados por contaminantes ambientais, tais como os metais, do que os adultos. Dentre esses efeitos adversos, estão os danos ao sistema nervoso central e inibição da enzima δ-aminolevulinato desidratase (ALA-D). Neste trabalho, as concentrações de alguns metais (Al, Pb, Cd, As, Hg, Cr, Mn e Fe) foram quantificadas em amostras de sangue total, soro e cabelo de crianças provenientes de uma área rural e de uma área urbana. Esses elementos também foram quantificados em amostras de água das residências das crianças. A função cognitiva foi avaliada através da aplicação do Teste Matrizes Progressivas Coloridas de Raven. A atividade da enzima ALA-D e o índice de reativação da enzima (ALA-RE) com DTT e com ZnCl2 foram avaliados. As crianças da área rural demonstraram menor desempenho cognitivo no Teste de Raven do que as crianças da área urbana (p<0,001). Níveis sanguíneos de Cr e Hg foram negativamente associados aos escores de QI (p<0,005). Além disso, os escores de QI foram negativamente associados com os níveis de Mn e Fe no cabelo (p<0,01). Adicionalmente, correlações de Spearman foram observadas entre: Mn no cabelo vs. Mn na água (p<0,001); Fe no cabelo vs. Fe na água (p<0,05) e Fe no sangue total vs. Fe na água (p<0,001). A atividade da enzima ALA-D foi significativamente diminuída nas crianças da área rural em relação às crianças da área urbana (p<0,05), bem como a ALA-RE com DTT e ZnCl2 foi significativamente aumentada nas crianças da área rural em comparação com as crianças da área urbana (p<0,005). Adicionalmente, a inibição da ALA-D foi correlacionada com os níveis sanguíneos de Cr (p<0,05) e a ALA-RE com DTT foi associada com os níveis sanguíneos de Cr (p<0,001) e Hg (p<0,001). De forma semelhante, a ALA-RE com ZnCl2 foi também correlacionada com níveis sanguíneos de Cr e Hg (p<0,05). Neste estudo foi possível observar déficit na função cognitiva e inibição da ALA-D associados à exposição a alguns metais em crianças da área rural. Além disso, os resultados indicaram a água como uma provável fonte de contaminação a metais. / Children are more sensitive to the adverse effects caused by environmental contaminants, such as metals, than adults. Among these adverse effects, there are the damage to nervous system central and inhibition of the enzyme δ-aminolevulinate dehydratase (ALA-D). In this study, the concentrations of some metals (Al, Pb, Cd, As, Hg, Cr, Mn and Fe) were quantified in whole blood, serum and hair of children from rural and urban areas. These elements were measured on samples of drinking water from household’s children. The cognitive function was evaluated by the Raven’s Colored Progressive Matrices Test. The activity of the ALA-D and the rate of reactivation of the enzyme (ALA-RE) with DTT and ZnCl2 were evaluated. Children from rural area had lower performance on the Raven’s Test than children from urban area (p<0.001). The Cr and Hg blood levels were negatively associated with percentile IQ scores (p<0.05). Moreover, the IQ scores were negatively associated with Mn and Fe in hair (p<0.01). Additionally, Spearman’s correlations were found between: Mn in hair vs. Mn in drinking water (p<0.001); Fe in hair vs. Fe in drinking water (p<0.05) and Fe in whole blood vs. Fe in drinking water (p<0.001). The activity of ALA-D was significantly decreased in children from rural area when compared with children from urban area (p<0.05) and the ALA-RE with DTT and ZnCl2 was significantly increased in children from rural area compared with children from urban area (p<0.005). Additionally, the ALA-D inhibition was correlated with Cr in blood (p<0.05) and ALA-RE with DTT was associated with blood levels of Cr and Hg (p<0.001). Similarly, ALA-RE with ZnCl2 was also correlated with blood levels of Cr and Hg (p<0.05). In this study it was revealed cognitive deficit and ALA-D inhibition associated with exposure to some metals in children from a rural area. Moreover, the results indicated the drinking water as a possible source of contamination to metals.

Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-03-08T23:12:00Z No. of bitstreams: 1 126110006.pdf: 1402473 bytes, checksum: aed1fe94c57f7ab83538a36308f58174 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-08T23:12:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 126110006.pdf: 1402473 bytes, checksum: aed1fe94c57f7ab83538a36308f58174 (MD5) Previous issue date: 2014-02-22 / A δ-Aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D) é uma enzima tiólica que catalisa uma das reações iniciais da biossíntese do heme. Essa enzima é considerada um marcador proteico de intoxicação com metais. O cádmio é um dos poluentes tóxicos, amplamente distribuído no meio ambiente, sendo que a exposição humana resulta principalmente da fumaça do cigarro, da poluição do ar e do consumo de alimentos e água contaminados pelo metal. O cádmio apresenta uma baixa taxa de excreção no organismo e um elevado tempo de meia- vida biológico e por esta razão, se acumula no sangue, rins e fígado, bem como nos órgãos reprodutivos, incluindo o ovário. A patogênese do dano ovariano e a redução da viabilidade folicular após exposição ao cádmio tem sido associada a danos oxidativos. Assim, compostos antioxidantes poderiam ser uma terapia alternativa frente a toxicidade do cádmio. O presente estudo avalia o efeito protetor da Camellia sinensis (chás verde, branco e vermelho) sobre a inibição da atividade da δ-ALA-D ovariana induzida pelo cádmio in vitro (ovário bovino) e ex vivo (ovário de camundonga). O efeito do cloreto de cádmio (IC 50 , 20μM), das infusões de chás (0,07 – 10 mg/mL) e das catequinas isoladamente –epicatequina (EC), epigalocatequina (EGC), epicatequina galato (ECG), epigalocatequina galato (EGCG) - foram avaliadas sobre a atividade da δ-ALA-D de ovário bovino (in vitro). Além disso, a composição das infusões de chá foi avaliada por HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) em um ensaio quantitativo de catequinas, alcalóides purina e ácido gálico, bem como o conteúdo de polifenóis totais. Os chás verde e branco nas maiores concentrações estudadas restauraram a atividade da δ-ALA-D inibida pelo cádmio enquanto o chá vermelho não apresentou efeito in vitro. O chá verde apresenta maior quantidadede conteúdo fenólico (757,24 μg EAG/mL) bem como de catequinas (EGCG = 205,64 μg/mL, EC = 84,59 μg/mL, EGC = 75,53 μg/mL, ECG = 64,73 μg/mL) comparado com o chá branco (499,37 μg EAG/mL) (EGCG = 105,57 μg/mL, EC = 54,73 μg/mL, EGC = 81,96 μg/mL, ECG = 34,25 μg/mL) e com o chá vermelho (272,39 μg EAG/mL) (só foi detectado ECG= 1,36 μg/mL). Nenhuma das catequinas testadas isoladamente foi eficaz em restaurar a atividade da enzima inibida pelo cádmio. Para os experimentos ex vivo, camundongas receberam uma única administração nas doses de 2,5 mg/kg e 5 mg/kg de CdCl 2 por via intraperitoneal e chá verde (250 mg/kg) administrado via oral. Verificou-se que a exposição aguda ao cádmio nas doses de 2,5 e 5 mg/Kg inibiu (cerca de 26% e 33%, respectivamente) a atividade da enzima δ-ALA-D de ovário de camundongas e o chá verde foi capaz de restaurar essa inibição. O maior efeito do chá verde observado in vitro, bem como o papel protetor apresentado no estudo ex vivo, poderia ser atribuído ao maior teor de fenóis, mas não de catequinas. Na verdade, as catequinas não foram capazes de restaurar a atividade da enzima inibida por cádmio, demonstrando que estes compostos não são os principais componentes responsáveis pelo efeito benéfico do chá verde observada neste estudo. Esse estudo demonstrou a eficácia do chá verde em restaurar a atividade da δ-ALA-D inibida pelo cádmio em tecido ovariano. / δ-aminolevulinate dehydratase (δ-ALA-D) is a thiol enzyme that catalyzes one of the initial reactions of heme biosynthesis. This enzyme is considered a marker protein for metal poisoning. Cadmium is a toxic pollutant, widely distributed in the environment, and human exposure results mainly from cigarette smoke, air pollution and consumption of food and water contaminated by the metal. Cadmium has a low excretion rate of the organism and high biological ha lf- life and for this reason it accumulates in the blood, kidney and liver as well as on reproductive organs including the ovaries. The pathogenesis of ovarian follicular damage and reduction of viability after exposure to cadmium has been associated with o xidative damage. Thus, antioxidant compounds may be an alternative therapy against cadmium toxicity. The present study evaluates the protective effect of Camellia sinensis (green, white and red teas) on the inhibition of ovarian δ-ALA-D activity induced by cadmium in vitro and ex vivo. The effect of cadmium chloride (IC 50 20μM), tea infusions (0.07 to 10 mg/ml) and individual catechins – epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC), epicatechin gallate (ECG), epigallocatechin gallate (EGCG) - were evaluated on bovine ovaries δ-ALA-D activity (in vitro). Furthermore, the composition of tea infusions was measured on a HPLC quantitative assay of catechins, gallic acid and purine alkaloids, and the content of total polyphenols was measured by Folin–Ciocalteu method. The green and white teas, at the highest concentrations studied, restored the δ-ALA-D activity inhibited by cadmium while red tea had no effect in vitro. Green tea has higher amount of phenolic content ( 757.24 mg GAE/mL ) and catechins (EGCG = 205.64 μg/mL; EC = 84.59 μg/mL; EGC = 75.53 μg/mL; ECG = 64.73 μg/mL) compared with white tea ( 499.37 mg GAE/mL ) (EGCG = 105.57 μg/mL; EC = 54.73 μg/mL; EGC = 81.96 μg/mL; ECG = 34.25 μg/mL) and red tea (272.39 mg GAE/mL) ( only detected ECG = 1.36 μg/mL). None of the tested catechins alone was effective in restoring the enzyme activity inhibited by cadmium. For the ex vivo experiments, mice received a single administration of CdCl 2 , at doses of 2.5 mg/kg and 5 mg/kg intraperitoneally, and green tea (250 mg/kg) administered orally. We found that acute exposure to cadmium at doses of 2.5 and 5 mg/kg inhibited (about 26% and 33%, respectively) δ-ALA-D activity of mice ovaries, and green tea was able to restore this inhibition. The greater effect observed in vitro by green tea as well as the protective role presented at the ex vivo study, could be attributed to the higher phenols content, but not catechins. In fact, the catechins were not able to restore the enzyme activity inhibited by cadmium, demonstrating that these compounds are not the key components responsible for the beneficial effect of green tea observed in this study. This study demonstrated the effectiveness of green tea in restoring the δ-ALA-D activity inhibited by cadmium in ovarian tissue.

Crianças são mais sensíveis aos efeitos adversos causados por contaminantes ambientais, tais como os metais, do que os adultos. Dentre esses efeitos adversos, estão os danos ao sistema nervoso central e inibição da enzima δ-aminolevulinato desidratase (ALA-D). Neste trabalho, as concentrações de alguns metais (Al, Pb, Cd, As, Hg, Cr, Mn e Fe) foram quantificadas em amostras de sangue total, soro e cabelo de crianças provenientes de uma área rural e de uma área urbana. Esses elementos também foram quantificados em amostras de água das residências das crianças. A função cognitiva foi avaliada através da aplicação do Teste Matrizes Progressivas Coloridas de Raven. A atividade da enzima ALA-D e o índice de reativação da enzima (ALA-RE) com DTT e com ZnCl2 foram avaliados. As crianças da área rural demonstraram menor desempenho cognitivo no Teste de Raven do que as crianças da área urbana (p<0,001). Níveis sanguíneos de Cr e Hg foram negativamente associados aos escores de QI (p<0,005). Além disso, os escores de QI foram negativamente associados com os níveis de Mn e Fe no cabelo (p<0,01). Adicionalmente, correlações de Spearman foram observadas entre: Mn no cabelo vs. Mn na água (p<0,001); Fe no cabelo vs. Fe na água (p<0,05) e Fe no sangue total vs. Fe na água (p<0,001). A atividade da enzima ALA-D foi significativamente diminuída nas crianças da área rural em relação às crianças da área urbana (p<0,05), bem como a ALA-RE com DTT e ZnCl2 foi significativamente aumentada nas crianças da área rural em comparação com as crianças da área urbana (p<0,005). Adicionalmente, a inibição da ALA-D foi correlacionada com os níveis sanguíneos de Cr (p<0,05) e a ALA-RE com DTT foi associada com os níveis sanguíneos de Cr (p<0,001) e Hg (p<0,001). De forma semelhante, a ALA-RE com ZnCl2 foi também correlacionada com níveis sanguíneos de Cr e Hg (p<0,05). Neste estudo foi possível observar déficit na função cognitiva e inibição da ALA-D associados à exposição a alguns metais em crianças da área rural. Além disso, os resultados indicaram a água como uma provável fonte de contaminação a metais. / Children are more sensitive to the adverse effects caused by environmental contaminants, such as metals, than adults. Among these adverse effects, there are the damage to nervous system central and inhibition of the enzyme δ-aminolevulinate dehydratase (ALA-D). In this study, the concentrations of some metals (Al, Pb, Cd, As, Hg, Cr, Mn and Fe) were quantified in whole blood, serum and hair of children from rural and urban areas. These elements were measured on samples of drinking water from household’s children. The cognitive function was evaluated by the Raven’s Colored Progressive Matrices Test. The activity of the ALA-D and the rate of reactivation of the enzyme (ALA-RE) with DTT and ZnCl2 were evaluated. Children from rural area had lower performance on the Raven’s Test than children from urban area (p<0.001). The Cr and Hg blood levels were negatively associated with percentile IQ scores (p<0.05). Moreover, the IQ scores were negatively associated with Mn and Fe in hair (p<0.01). Additionally, Spearman’s correlations were found between: Mn in hair vs. Mn in drinking water (p<0.001); Fe in hair vs. Fe in drinking water (p<0.05) and Fe in whole blood vs. Fe in drinking water (p<0.001). The activity of ALA-D was significantly decreased in children from rural area when compared with children from urban area (p<0.05) and the ALA-RE with DTT and ZnCl2 was significantly increased in children from rural area compared with children from urban area (p<0.005). Additionally, the ALA-D inhibition was correlated with Cr in blood (p<0.05) and ALA-RE with DTT was associated with blood levels of Cr and Hg (p<0.001). Similarly, ALA-RE with ZnCl2 was also correlated with blood levels of Cr and Hg (p<0.05). In this study it was revealed cognitive deficit and ALA-D inhibition associated with exposure to some metals in children from a rural area. Moreover, the results indicated the drinking water as a possible source of contamination to metals.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Monoamine oxidase (MAO) is a target enzyme in the treatment of several pathologies, being that new molecules which inhibit of a selective, potent and reversible manner their isoforms and without adverse effects are searched. In this way, the first manuscript of this dissertation evaluated the in vitro inhibitory potential of the 4-organochalcogen-isoquinolines on cerebral MAO-A and B activities, elucidating their kinetics profile and the interaction compound x enzyme. The results demonstrated that all compounds were selective inhibitors of MAO-B, being compound 3-phenyl-4-(selenophenyl) isoquinoline the most potent. The kinetics profile revealed a mixed and reversible inhibition of enzyme, consistent to the results of molecular docking. It is known that both organic selenium compounds and isoquinolines are linked to pro-oxidants situations, thus, it was investigated the in vitro effect of 4-organoseleno-isoquinolines on cerebral activities of the enzymes δ- aminolevulinate dehydratase (δ-ALA-D) e Na+, K+-ATPase, which have easily oxidized cysteine residues. Data demonstrated that compounds substituted with chloro, fluoro and trifluoromethyl in the aromatic ring bonded to the selenium atom of compound 3-phenyl-4-(selenophenyl) isoquinoline inhibited both sulfhydryl enzymes, which was not observed in the compound substituted with methyl and in a nonsubstituted compound. Furthermore, since the inhibition of enzymes δ-ALA-D and Na+, K+-ATPase was restored by dithiothreitol it is possible to propose the oxidation of cysteine residues by compounds. The selective and reversible inhibition of MAO-B and the low toxicological potential demonstrated by compound 3-phenyl-4- (selenophenyl) isoquinoline become this compound a candidate for more studies, which aim this enzyme as a therapeutic target. / A monoamina oxidase (MAO) é uma enzima alvo no tratamento de diversas patologias, sendo que novas moléculas que a inibam de maneira seletiva, potente, reversível, e ausente de efeitos adversos suas isoformas são procuradas. Neste sentido, o primeiro manuscrito desta dissertação avaliou o potencial inibitório dos 4- organocalcogeno-isoquinolinas na atividade cerebral da MAO-A e B in vitro, elucidando seus perfis cinéticos e a interação composto e enzima. Os resultados demonstram que todos os compostos apresentam inibição seletiva da MAO-B, sendo o composto 3-fenil-4-(selenofenil) isoquinolina o mais potente. O perfil cinético revelou inibição do tipo mista e reversível da enzima, coerente aos resultados do docking molecular. Sabe-se que tanto compostos orgânicos de selênio quanto isoquinolinas relacionam-se a situações pró-oxidantes, deste modo, investigou-se o efeito in vitro dos 4-organoseleno-isoquinolinas na atividade cerebral das enzimas δ- aminolevulinato dehidratase (δ-ALA-D) e Na+, K+-ATPase, as quais possuem resíduos de cisteína facilmente oxidáveis. Os dados demonstram que os compostos substituídos com cloro, flúor e trifluormetil no anel aromático ligado ao átomo de Se do composto 3-fenil-4-(selenofenil) isoquinolina inibem ambas as enzimas sulfidrílicas, o que não foi observado com o composto substituído com metil e com o composto não substituído. Além disso, visto que a inibição das enzimas δ-ALA-D e Na+, K+-ATPase foi revertida por ditiotreitol é possível propor o envolvimento da oxidação dos resíduos de cisteína pelos compostos. Devido à inibição seletiva e reversível da MAO-B e ao baixo potencial toxicológico demonstrado, o composto 3- fenil-4-(selenofenil) isoquinolina torna-se um candidato a mais estudos que possuam esta enzima como alvo terapêutico.

Bacteriophage MooMoo is a temperate phage that was isolated and propagated on Mycobacterium smegmatis (M. smeg). It typically produces turbid plaques, however spontaneous clear plaque mutants can be readily isolated. Both turbid (MooMoo-T) and clear plaque (MooMoo-C) formers can establish stable lysogens, but the parental turbid plaque forming phage has a higher lysogenic frequency. The phage repressor protein typically plays the central role in regulating the lysis/lysogeny decision. Therefore, we expected that the mutation responsible for the clear plaque phenotype would be located in the repressor gene. Remarkably, whole genome sequencing detected a single base pair mutation in the minor tail protein gene (gp19). The regulatory role of the repressor protein could not be excluded considering it was unclear how the mutation in gp19 was leading to the altered plaque phenotype. To locate the phage repressor, we used bioinformatics to identify several candidate genes with helix-turn-helix and DNA binding motifs (gp42, gp43 and gp44). We also cloned the parental and mutant gp19 genes. Each candidate gene was cloned into a shuttle vector. The clones of gp43, gp44 and both derivatives of gp19 did not prevent MooMoo growth, whereas the clones of gp42 inhibited phage growth. Based on these results, we concluded that gp42 is the phage repressor for MooMoo. To determine if the presence of gp19 alters lysogenic frequency, lysogeny assays of wild-type (WT) and mutant gp19 clones were evaluated. Compared to the MooMoo-C lysate, the cloned copy of the mutant gp19 showed a slight increase in lysogeny efficiency. The lysogeny frequencies on strains that carry cloned copies of gp19 (WT or mutant) were similar to those obtained on strains that lacked the plasmids. From these results, we concluded, the presence of either parental or mutant gp19 clones does not affect the lysogeny frequency. To determine if host cell physiology was affected by lysogeny, carbon, nitrogen, phosphorus and sulfur utilization resources were screened using high-throughput phenotypic microarrays. From these results, we concluded the presence of the WT or mutant prophage had no significant effect on the utilization of the resources tested.