Ingeniera Civil en Biotecnología / En distintos estudios se ha determinado que mutaciones en la proteína transportadora DMT1, encargada de transportar hierro desde el lumen intestinal hacia los enterocitos, son causantes de distintos tipos de anemia, no obstante, poco se conoce sobre su estructura tridimensional y su mecanismo de transporte. Por esta razón, el objetivo del presente trabajo es obtener un modelo estructural de la isoforma 1A/IRE(+) de la proteína DMT1 humana y a partir de éste estudiar el posible comportamiento de la proteína inserta en membrana. La predicción de dominios transmembrana para la proteína de interés estableció la presencia de 12 dominios transmembrana, 6 loops extracelulares, 5 loops intracelulares y los extremos amino y carboxilo terminales al interior del citoplasma de los enterocitos, lo cual concuerda totalmente con lo expuesto en bibliografía. Se obtuvieron 100 modelos de la proteína mediante modelamiento comparativo, utilizando el cristal de la familia de la proteína, ScaDMT, como plantilla principal. El mejor modelo se obtuvo a través de un análisis energético y estructural. Este modelo obtuvo un z-score de -4.3, dentro de la densidad de puntajes obtenidos por estructuras cristalinas, un perfil energético por residuo similar al del cristal de ScaDMT, y un gráfico de Ramachandran con tan solo 2 residuos dentro de zonas no permitidas. Se realizaron cuatro dinámicas moleculares para estudiar el comportamiento del modelo en membrana, las cuales fueron analizadas para estudiar las características de la proteína. A partir del análisis de los modos normales, se observó un movimiento de apertura y cierre, el cual podría representar el movimiento principal de captura y liberación del ion de hierro. Por otro lado, se presentó una variación en el potencial electrostático en las regiones superior e inferior de la proteína, lo que podría estar relacionado al mecanismo de interacción de la proteína con hierro. A partir del análisis del comportamiento de las moléculas de agua en el sistema, se determinó que éstas ingresan a la proteína por la zona orientada hacia el citoplasma, posicionándose entre las hélices TM1 y TM6, donde se ubica el ion de hierro. Finalmente, en cuanto a la interacción de la proteína con hierro, se proponen los residuos Asp115, Asn118, Ala291 y Met294 como principales candidatos a interaccionar con él, y se observa un posible rol del agua en la estabilización de éste. De esta manera, los resultados y discusiones aquí expuestos representan los primeros avances para un mejor conocimiento de la estructura y características de la proteína DMT1 humana. Se requiere profundizar y extender estos análisis para poder establecer bases más sólidas respecto a la relación estructura-función y dilucidar el mecanismo de transporte asociado a la proteína. Esto resultaría de gran utilidad para comprender la causa de las enfermedades asociadas a mutaciones en DMT1 y posteriormente proponer tratamientos más efectivos para estas enfermedades.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniera Civil en Biotecnología / El hierro es un metal traza, fundamental para la existencia de la vida. Los niveles de hierro en el organismo deben ser altamente controlados ya que pequeñas variaciones desencadenan numerosas enfermedades, entre ellas la anemia y hemocromatosis. En seres humanos la presencia de este metal se controla regulando su absorción intestinal, en donde el hierro ingresa al organismo a través de la proteína DMT1, ubicada en la cara apical de los enterocitos. Luego, el hierro es transportado a la cara basolateral y finalmente, es expulsado al torrente sanguíneo mediante la proteína FPN1. \par El objetivo de este trabajo es analizar el transporte de hierro en células Caco-2 mediante métodos experimentales y modelación matemática. Para esto se determinaron experimentalmente los flujos de hierro en el tiempo, a diferentes concentraciones iniciales en el medio apical. Se determinó la velocidad inicial de la absorción en función de la concentración apical. Y además, se midió la cantidad de hierro que ingresa a las células luego de una segunda exposición al metal. Los resultados de estos experimentos concuerdan con las magnitudes reportadas en casos similares, pero muestran un comportamiento no lineal en los flujos de absorción, lo cual no había sido observado anteriormente. \par Para analizar matemáticamente los resultados experimentales obtenidos, se desarrolló un modelo empírico y un modelo fenomenológico. El modelo empírico se construyó utilizando un algoritmo de programación genética modificado para lograr mejores resultados. El modelo representa adecuadamente los datos experimentales utilizados en la etapa de entrenamiento, alcanzado un coeficiente de determinación de $R^2=0.85$ y un error de generalización de $MSE_{jk}=1.32$. Además, el modelo permite representar la velocidad inicial de absorción apical, es decir, datos que no fueron empleados en la etapa de entrenamiento del algoritmo. Por otro lado, el modelo exhibe características básicas del fenómeno, sin que se le entregue información a priori al respecto. \par El modelo fenomenológico consta de un conjunto de ecuaciones diferenciales ordinarias que capturan dos fenómenos relevantes. La actividad de DMT1 y la variación de la cantidad de ésta en la membrana apical. Este modelo permite simular todos los escenarios estudiados experimentalmente, asimismo representa los flujos de absorción apical con un coeficiente de determinación de $R^2=0.867$, mientras que su error de generalización es de $MSE_{jk}=1.39$. \par Del análisis realizado, se concluye que la endocitosis de DMT1 desde la cara apical, es un fenómeno relevante en el proceso de absorción de hierro. Este fenómeno no había sido considerado anteriormente y debe ser estudiado en detalle para poder caracterizar el sistema. \par En el trabajo se planteó una metodología para desarrollar modelos empíricos que puede utilizarse en otros sistemas biológicos complejos. Su principal ventaja es que permite mejorar la capacidad de generalización de los modelos realizados.

Ingeniera Civil en Biotecnología / El hierro es un elemento fundamental para muchos organismos por las reacciones en las que se encuentra involucrado, y su absorción está altamente regulada por mecanismos a diferentes niveles. El transporte de hierro se realiza en el duodeno a través de proteínas transportadoras que se encuentran en la membrana apical de los enterocitos (DMT1, Divalent Metal Transporter 1). Uno de los mecanismos de regulación involucra la traslocación de estas proteínas hacia el interior de las células cuando éstas son expuestas a una cierta concentración de hierro en la cara apical. Mediante este mecanismo se disminuye la absorción del mineral minutos después de dicha exposición. En el presente trabajo se busca proponer un modelo fenomenológico que permita representar cualitativamente los perfiles de distribución espacial de DMT1 en el interior célular. Estos perfiles han sido observados experimentalmente en la línea celular Caco-2, la cual es comúnmente utilizada para estudios de transporte de hierro debido a sus características similares con los enterocitos del intestino delgado. El modelo propuesto consiste en un sistema de ecuaciones diferenciales parciales cuya simulación permite obtener la distribución de DMT1 en el tiempo y espacio. Se realizaron simulaciones para obtener la distribución estacionaria inicial, y la evolución del sistema desde dicho estado hasta alcanzar una nueva distribución estacionaria producto de perturbar el sistema mediante la introducción de un pulso de hierro. Como resultado se observó que el modelo es capaz de reproducir cualitativamente el comportamiento observado experimentalmente. A través de un estudio de variación de parámetros, se verificó que el comportamiento del sistema corresponde a lo esperado biológicamente. A partir de dicho estudio se encontró un set de parámetros que permiten simular el comportamiento en el estado previo a la exposición de hierro y uno que simula el estado posterior a dicha exposición. Se concluye que este modelo propuesto representa una primera aproximación para la simulación del movimiento de DMT1 en células Caco-2. El modelo desarrollado en este trabajo es adecuado también para la representación de otros sistemas que involucren movimiento de vesículas o elementos desde un sitio a otro de la célula, debido a que sus ecuaciones son generales y sus parámetros pueden ser variados para la simulación de diferentes escenarios tales como distintas concentraciones de proteínas motoras o distintas velocidades de transporte. Ejemplos de estos sistemas son el movimiento vesículas de las proteínas transportadoras de glucosa GLUT-4, o la transistosis de diversos elementos en células epiteliales.

Eating Disorder-Diabetes Mellitus Type 1 (ED-DMT1) refers to individuals who have type 1 diabetes and a co-occurring eating disorder. The aim of this study was to identify current treatment practices for individuals with ED-DMT1 in a residential eating disorder treatment setting. Clinical nutrition managers (CNMs) at 18 residential eating disorder treatment facilities were interviewed about treatment practices for patients with type 1 diabetes. Four themes were identified through qualitative case study analysis: 1) nutrition interventions for patients with diabetes, 2) medical diabetes management, 3) interdisciplinary diabetes team, and 4) CNM's assessment of diabetes care. The majority of CNMs interviewed reported utilizing an exchange- based meal plan, which is well suited for patients with type 1 diabetes. Dietitians described the use of diabetes technology (e.g., insulin pumps and continuous glucose monitors) and described a gradual advancement of responsibility and autonomy with portioning food at meals and snacks and managing diabetes care. The dietitian is heavily involved in providing diabetes education along with the medical and/or nursing team. The majority of CNMs interviewed demonstrated knowledge deficits related to diabetes management and expressed the need and desire for increased education for themselves and other staff members in order to provide the highest quality of care.

[Formulae and special characters can only be approximated here. Please see the pdf version of the abstract for an accurate reproduction.] Iron is vital for almost all living organisms by participating in a wide variety of metabolic processes, including oxygen transport, DNA synthesis, and electron transport. However, iron concentrations in body tissues must be tightly regulated because excessive iron leads to tissue damage, as a result of formation of free radicals. In mammals since no controlled means of eliminating unwanted iron has evolved, body iron balance is maintained by alterations in dietary iron intake. This occurs in the duodenum where most dietary iron is absorbed. Absorption involves at least two steps, uptake of iron from the intestinal lumen and then its transport into the body, processes that occur at the apical and basal membranes of enterocytes, respectively. In chapter one of this thesis the background information relevant to iron absorption is described. Despite numerous studies, the role of these proteins in iron absorption remains unclear, partly because many studies have reported them in non-enterocyte cell lines where the expression of the proteins involved in iron absorption is unlikely and therefore the physiological significance of the findings uncertain. Therefore, the study of iron absorption would value from additional cell lines of intestinal origin being used, preferably derived from a species used to comprehensively study this process in vivo, namely the rat. Validation of such a model would enable comparisons to be made from a molecular level to its relevance in the whole organism. In chapter 3 of this thesis, the rat intestinal cell line 6 (IEC-6) was examined as a model of intestinal iron transport. IEC-6 cells expressed many of the proteins involved in iron absorption, but not the ferrireductase Dcytb, sucrase or αvβ3 integrin. In addition, in IEC-6 cells the expression of the apical transporter divalent metal transporter 1 (DMT1), the iron storage protein ferritin, the uptake of Fe(II) and Fe(III) were regulated by cellular iron stores as is seen in vivo. This suggests that IEC-6 cells are of a lower villus enterocyte phenotype. Presented in chapter 4 is the study of the uptake of iron from Fe(II):ascorbate and Fe(III):citrate by IEC-6 cells in the presence of a blocking antibody to the putative basolateral transporter ferroportin1 and of colchicine and vinblastine, different pHs, and over-expression of DMT1. It was shown that optimal Fe(II) uptake required a low extracellular pH and was dependent on DMT1. Uptake of Fe(III) functioned optimally at a neutral pH, did not require surface ferrireduction, and was increased during over-expression of DMT1. These observations suggest that intravesicular ferrireduction takes place before transport of Fe(II) to the cytoplasm by DMT1. This pathway was not blocked by a functional antibody against αvβ3 integrin but was inhibited by competition with unlabeled iron citrate or citrate alone. Surprisingly, a functional antibody against ferroportin1 had no effect on efflux but significantly reduced (p<0.05) uptake of Fe(II) by 40-50% and Fe(III) by 90%, indicating two separate pathways for the uptake of iron from Fe(II)-ascorbate and from Fe(III)-citrate in IEC-6 cells. Presented in chapter 5 is the development and validation of a technique for the removal of freshly isolated enterocytes from the rat duodenum and their use to study iron transport processes that enabled comparisons to be made between these cells, IEC-6 cells and the human enterocyte cell line Caco-2 cells. In chapter 6 a blocking antibody to ferroportin1 was shown to inhibit uptake of Fe(II) but not release of iron in freshly isolated duodenal enterocytes from rats and Caco-2 cells supporting the findings obtained with IEC-6 cells described in chapter 4. Fe(II) uptake was reduced only when the antibody was in contact with the apical membrane indicating its expression at the microvillus membrane. Confirming this, ferroportin1 was shown along the microvillus membrane of Caco-2 cells, in enriched microvillus membrane preparations and in enterocytes of duodenum tissue of rats where it co-localised with lactase. The significant findings to emerge from this thesis are that the IEC-6 cell is a valid model to study iron absorption producing results consistent with those found in freshly isolated enterocytes and in human enterocyte-like cells. In particular, ferroportin1 functions in the uptake of iron at the apical membrane possibly by modulating surface binding of Fe(II) to DMT1 or the activity of DMT1. In addition to this in Fe(II) uptake from Fe(III) ferroportin1 may also affect the number of Fe(III): citrate binding sites. Preliminary studies further characterizing the function of ferroportin1 at the apical membrane and at intracellular sites of IEC-6 cells along with integration of these data are discussed in chapter 7.

Iron is an essential element for human organism, because it cooperates as a cofactor of enzymes in many metabolic pathways. Iron is a component of hemoglobin, and thus it is indispensable for the oxygen transport to tissues. It can exist as a ferrous or ferric form. However, ferrous iron paticipates in reactions in which highly reactive hydroxyl group can be formed. This product is harmful for the organism. Non-heme iron is taken up to the circulation through duodenal enterocyte. Iron excretion is carried out only by desquamation of the enterocytes or by bleeding. Therefore, iron intake must be strictly regulated. Iron overloading is observed in some chronic diseases (hereditary hemochromatosis, alcohol liver disease). In contrary, iron depletion can be a case of iron deficiency anemia. The aim of this master thesis is to determine the expression of iron transport molecules in duodenum in chronic diseases which originate due to disturbances of iron intake regulation. We determine the expression of molecules of iron transport (DMT1, Dcytb, ferroportin, hephaestin) on mRNA level by qPCR and on protein level by western blot. The level of serum hepcidin was determined by ELISA. Our results show an increased expression of mRNA of transporters DMT1 and ferroportin as well as ferrireductase Dcytb and ferroxidase...