O Glioblastoma Multiforme (GBM) é o tipo de tumor cerebral maligno com maior incidência na população. A perda do gene PTEN (fosfatase e tensina homóloga) é uma alteração comum associada ao GBM (até 60%) e esse gene codifica uma enzima que antagoniza a ação de PI3K, inibindo a fosforilação de AKT e, desse modo, regulando vias de sinalização relativas à sobrevivência celular e proliferação. Mutações em PTEN têm sido associadas à instabilidade genômica e ao aumento no número de quebras de fita dupla, além de serem relacionadas também à redução da expressão de RAD51, a qual é uma proteína-chave da via de reparo por recombinação homóloga (HR). Diante disso, o objetivo deste estudo foi avaliar se o status de PTEN interfere na expressão de RAD51 e proteínas parálogas (RAD51C e RAD51B) e, consequentemente, se PTEN é capaz de influenciar a eficiência de HR. Com o objetivo de induzir a formação de quebras de fita duplas (DSBs) no DNA, as células foram tratadas com a droga antitumoral etoposídeo, que produz quebras no DNA, principalmente duplas (DSBs). Duas linhagens de GBM com status diferentes de PTEN foram utilizadas: T98G (PTEN mutado) e LN18 (PTEN tipo selvagem). As células de GBM foram tratadas com etoposídeo em diferentes experimentos ou ensaios: proliferação celular, quantificação da necrose e apoptose, cinética do ciclo celular, imunofluorescência da proteína ?- H2AX, quantificação dos níveis de expressão de RAD51 e parálogas e o silenciamento de PTEN na linhagem LN18. Os resultados mostraram que a linhagem LN18 foi mais sensível à droga nos tempos iniciais (24 e 72 h) (até 61,2% de redução), em comparação com a T98G (até 12,3% de redução); no tempo mais tardio de análise (120 h), ambas as linhagens sofreram redução acentuadana proliferação. Adicionalmente, a LN18 exibiu maior porcentagem de células apoptóticas e necróticas, em comparação com a linhagem T98G, nos tempos de24, 72 e 120 horas após o tratamento. O ensaio de imunofluorescência revelou maior indução de células positivas para ?-H2AX na linhagem LN18 em relação à T98G (p =<0,001), após tratamento com etoposídeo (50 e 75 ?M). Nessas concentrações, a análise da cinética do ciclo celular mostrou um bloqueio na fase G2 em ambas as linhagens (p<0,01) nos tempos analisados (24, 48 e 72h), mas apenas a linhagem LN18 revelou bloqueio na fase S. A expressão de RAD51, RAD51B e C foi mais elevada em LN18 em comparação com a T98G e U87MG, nas células tratados (75?M) e controles. PTEN foi silenciado (siRNA-PTEN) na linhagem LN18 para verificar se a redução da expressão desse gene reduziria também a expressão de RAD51 e parálogas. Após 72 horas de silenciamento, com 69,9% de inibição de PTEN, a expressão de RAD51 e RAD51C também se mostrou reduzida em relação ao grupo controle. Em conjunto, os resultados obtidos no presente estudo indicam que o status de PTEN é crucial para as vias de sobrevivência, controle do ciclo celular e indução de apoptose nas células de GBM, indicando a relação entre PTEN e RAD51 e parálogas nas células de GBM tratadas com um indutor de quebras no DNA. Adicionalmente, outras ferramentas de estudo são requeridas para investigar as vias moleculares e possíveis interações e complexos proteicos envolvendo a participação de PTEN e RAD51 e suas proteínas parálogas / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common malignant brain tumor. Loss of PTEN (Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10) gene is the most frequent alteration associated with GBM and encodes a phosphatase enzyme that antagonizes the PI3K, by inhibiting AKT phosphorylation thereby regulating signaling pathways related to cell survival and proliferation. PTEN deficiency has been associated with genomic instability and increased endogenous DSBs, as well as reduced expression of RAD51, which is a key gene with crucial role in HR. In this study, we aimed to evaluate whether the PTEN status in GBM cell lines can affect RAD51 expression and HR efficiency under conditions of treatment with the antineoplastic drug etoposide, which targets the DNA topoisomerase II enzyme, thus leading to the production of DNA breaks. T98G (PTEN mutated) and LN18 (PTEN wild-type) cells were treated with etoposide, and several assays were carried out: cell proliferation, detection and quantification of necrosis and apoptosis, cell cycle kinetics, immunofluorescence staining, RAD51 (and paralogs) protein expression, and PTEN silencing in LN18 cell line, by using the siRNA method. LN18 cells showed a greater reduction in cell proliferation, compared to T98G after treatments (25, 50, 75 e 100 µM) at 24, 72 and 120h. Both cell lines showed a significant increase (p=<0.001) in cell death induction, but LN18 presented a greater percentage of apoptotic and necrotic cells than T98G (24, 72 and 120h). The induction of DSB was analyzed by immunostaining (with ?-H2AX antibody), and for the concentrations (50 and 75 µM) tested, LN18 showed higher levels of ?-H2AX positive cells than that observed for T98G (p=<0.001). The analysis of cell cycle kinetics performed for cells treated with etoposide (50 and 75 µM) and collected at 24, 48 and 72h, LN18 presented a greater G2-blockage, as compared to T98G; only LN18 showed a blockage at the S-phase. The expression of RAD51, RAD51B and C was higher in LN18 compared to T98G and U87MG cells treated with etoposide (75 µM) and controls. When we silenced PTEN in LN18 linage, to check if PTEN silencing may reduce the expression of RAD51 and its paralogs, we found a 69.9% reduction in PTEN protein expressions, and the expression of RAD51 and RAD51C was also found reduced, compared to the control group. Taken together, the results obtained in this study indicate that the status of PTEN is critical for survival pathways, cell cycle control and induction of apoptosis in GBM cells, confirming the relationship between PTEN and RAD51 and its paralogs in GBM cells treated with an inducer of DNA breaks. These results contribute with relevant information for further studies on molecular pathways underlying the interaction between PTEN and RAD51 and its paralogs

Over the course of an organism's life, its genome is exposed to endogenous and exogenous chemical, physical and biological agents - genotoxins. These genotoxins alter its basic structural components - sugar residues, phosphodiester bonds, and nitrogenous bases. Organisms have therefore evolved a plethora of different strategies to both repair DNA lesions and maintain genomic stability. These DNA repair pathways are linked with several other cell pathways, including chromatin remodelling, DNA replication, transcription, cell cycle control, apoptosis - programmed cell death (PCD), thereby providing a coordinated cellular response to DNA damage. Biochemical mechanisms of DNA repair are relatively well understood in yeast and mammals, however, far less so in plants. While these repair mechanisms are evolutionary conserved, significant differences still remain. Therefore, further investigation is required. This thesis summarises the introduction of a novel plant model - the moss, Physcomitrella patens (Physcomitrella). As a haploid gametophyte with unique characteristics of high frequency of homologous recombination (HR), and apical growth of filaments, it is an ideal organism to study DNA repair in plants. Previous research on Physcomitrella regarding mechanisms of DNA lesion repair induced by...

L’élimination programmée d’ADN spécifique de la lignée germinale pour former un nouveau noyau somatique a été décrite chez les eucaryotes. Ces réarrangements sont initiés par l’introduction de cassures double brin (CDB) de l’ADN et la préservation de l’intégrité du génome requiert une réparation efficace. Chez Paramecium tetraurelia, le génome est largement réarrangé pendant le développement du nouveau noyau somatique, après l’introduction de milliers de cassures double brin programmées par la transposase domestiquée PiggyMac (Pgm)Ces réarrangements consistent en l’excision précise de dizaines de milliers de séquences uniques et non codantes (IES) qui interrompent 47% des gènes dans la lignée germinale ; et l’élimination hétérogène de séquences répétées qui mène à des délétions internes de taille variable ou à la fragmentation des chromosomes avec addition de télomères aux extrémités.L’implication de la voie du Non Homologous End Joining (NHEJ) dans l’excision précise des IES a été prouvée. Dans des cellules déplétées de Ligase IV ou XRCC4, les cassures aux bornes des IES sont introduites normalement mais il n’y a pas de jonctions d’excision formées et les extrémités cassées s’accumulent sans être dégradées. Mais la voie de réparation impliquée dans les réarrangements imprécis est encore inconnue. L’hypothèse d’une réparation par la voie NHEJ alternative (alt-NHEJ), indépendante de Ku et impliquant la résection des extrémités et l’utilisation de microhomologie, a été émise. C’est pourquoi pendant ma thèse je me suis intéressé à ma thèse au rôle des protéines Ku.Deux gènes KU70 et trois gènes KU80 ont été identifiés dans le génome de la paramécie. KU70a et KU80c sont spécifiquement induits pendant les réarrangements programmés du génome et les protéines localisent dans les noyaux somatiques en développement. Des expériences d’extinction de ces gènes par ARN interférence ont prouvé que ces gènes étaient indispensables. Au niveau moléculaire, l’ADN non réarrangé est amplifié dans les cellules déplétées de Ku. De plus, les cassures double brin programmées ne sont pas introduites aux bornes des IES.Mes résultats suggèrent que Ku fait partie d’un complexe de pré-excision, avec la transposase domestiquée Pgm, et est nécessaire pour l’introduction des cassures double brin programmées pendant les réarrangements programmés du génome. / Programmed elimination of germline specific DNA has been described in several eukaryotic organisms. These rearrangements are initiated through introduction of DNA double strand breaks (DSB). To ensure genome integrity, efficient repair is needed. In Paramecium tetraurelia, the genome is widely rearranged during development of a new somatic nucleus after introduction of tens of thousands of DSBs by the domesticated transposase PiggyMac (Pgm)These rearrangements consist in: the precise excision of thousands of unique and non coding sequences called IESs that interrupt 47% of genes in the germline; and the heterogeneous elimination of repeated sequences. It leads to internal deletions of variable sizes or to chromosome fragmentation with telomere addition at DNA ends.Implication of the Non Homologous End Joining Pathway (NHEJ) in precise IES excision has been proved. In cells depleted for Ligase IV or XRCC4, DSBs at IES boundaries are introduced normally but broken DNA ends accumulate without being repaired nor degraded. The repair pathway implicated in heterogeneous rearrangements is still unknown. An hypothesis would be that heterogeneous rearrangements involve a Ku independent alternative NHEJ (alt-NHEJ) pathway characterized by end resection and use of microhomologies. During my thesis I studied the role of Ku proteins in programmed genome rearrangements.Two KU70 genes and three KU80 genes has been identified in the Paramecium genome. KU70a and KU80c are specifically induced during programmed genome rearrangements. Encoded proteins localize in developing somatic nuclei. Gene extinction by RNA interference experiments proved that these genes are necessary for programmed genome rearrangements. At molecular level, non rearranged DNA is amplified in cells depleted for Ku. And more surprisingly, no programmed DSBs are introduced at IES boundaries in these cells.My results indicate that Ku is a part of a pre excision complex with the domesticated transposase Pgm and necessary for the introduction of programmed DSB during programmed genome rearrangements.

Les défauts dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN (DSBs) peuvent avoir d'importantes conséquences pouvant entrainer une instabilité génomique et conduire à la mort cellulaire ou au développement de cancers. Dans la plupart des cellules mammifères, le mécanisme de Jonction des Extrémités Non Homologues (NHEJ) est le principal mécanisme de réparation des DSBs. L'ADN Ligase IV (LigIV) est une protéine unique dans sa capacité à promouvoir la NHEJ classique. Elle s'associe avec deux autres protéines structuralement similaires, XRCC4 et XLF (ou Cernunnos). LigIV interagit directement avec XRCC4 pour former un complexe stable, tandis que l'interaction entre XLF et ce complexe est médiée par XRCC4. XLF stimule fortement l'activité de ligation du complexe LigIV/XRCC4 par un mécanisme encore indéterminé. Récemment, un rôle structurel non catalytique a été attribué à LigIV (Cottarel et al., 2013). Dans le travail de thèse présenté ici, nous avons reconstitué l'étape de ligation de la NHEJ en utilisant des protéines recombinantes produites dans des bactéries afin d’une part, d'explorer les bases moléculaires du rôle structural de LigIV, d’autre part de comprendre le mécanisme par lequel XLF stimule le complexe de ligation, et enfin de mieux comprendre comment ces trois protéines coopèrent au cours de la NHEJ. Nos analyses biochimiques suggèrent que XLF via son interaction avec XRCC4 lié à LigIV, pourrait induire un changement conformationnel dans la LigIV. Ce réarrangement de la ligase exposerait son interface de liaison à l'ADN ce qui lui permettrait alors de ponter deux molécules indépendantes d'ADN, une capacité indépendante de l'activité catalytique de LigIV. / Failure to repair DNA double-strand breaks (DSBs) may have deleterious consequences inducing genomic instability and even cell death. In most mammalian cells, Non-Homologous End Joining (NHEJ) is a prominent DSB repair pathway. DNA ligase IV (LigIV) is unique in its ability to promote classical NHEJ. It associates with two structurally related proteins called XRCC4 and XLF (aka Cernunnos). LigIV directly interacts with XRCC4 forming a stable complex while the XLF interaction with this complex is mediated by XRCC4. XLF strongly stimulates the ligation activity of the LigIV/XRCC4 complex by an unknown mechanism. Recently, a structural noncatalytic role of LigIV has been uncovered (Cottarel et al., 2013). Here, we have reconstituted the end joining ligation step using recombinant proteins produced in bacteria to explore not only the molecular basis for the structural role of LigIV, but also to understand the mechanism by which XLF stimulates the ligation complex, and how these three proteins work together during NHEJ. Our biochemical analysis suggests that XLF, through interactions with LigIV/XRCC4 complex, could induce a conformational change in LigIV. Rearrangement of the LigIV would expose its DNA binding interface that is able to bridge two independent DNA molecules. This bridging ability is fully independent of LigIV’s catalytic activity. We have mutated this interface in order to attempt to disrupt the newly identified DNA bridging ability. In vitro analysis of this LigIV mutant will be presented as well as a preliminary in vivo analysis.

Hintergrund Die Strahlentherapie ist neben der radikalen Prostatektomie eine Standardtherapie zur Behandlung von Prostatatumoren und führt zu sehr guten Ergebnissen für die lokale Tumorkontrolle und für das Überleben. Allerdings ist, wie bei der Operation auch, dabei das Risiko eines Rezidivs für fortgeschrittene Tumoren im Gegensatz zu Tumoren in früheren Stadien relativ hoch. Daher besteht eine hohe Dringlichkeit zur Verbesserung der Strahlentherapie vor allem bei fortgeschrittenen Tumoren. Ein Ansatz hierfür ist die Kombination der Bestrahlung mit molekularen Therapien. Ziel dabei ist es, bestimmte Zielproteine zu blockieren, um die Strahlensensibilität der Prostatakarzinomzellen zu erhöhen. Ein potentielles Target könnte hierbei die Blockade des VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalwegs (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C; NRP-2 – Neuropilin 2; Akt – Proteinkinase B) sein. Im Prostatakarzinom sind die Konzentrationen von VEGF-C und NRP-2 im Vergleich zu normalen Prostatazellen erhöht. Aus Untersuchungen ist bekannt, dass beide Proteine eine progressive Wirkung auf die Tumorgenese haben. In Vorarbeiten zeigen Muders et al. (2009) zudem eine Aktivierung von Akt über die VEGF-C/NRP-2-Achse und eine darüber vermittelte Resistenz gegenüber oxidativem Stress durch H2O2. Akt wirkt in verschiedenen Tumorentitäten außerdem protektiv gegenüber Bestrahlung. Es besteht die Annahme, dass dies auch für Prostatakarzinomzellen gilt. Zielstellung Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob und über welchen Mechanismus VEGF-C, NRP-2 und Akt die Strahlenresistenz in Prostatakarzinomzelllinien beeinflussen. Methoden Es wurden in vitro- und in vivo-Experimente in den humanen Prostatakarzinomzelllinen PC-3, DU145, LNCaP sowie in PC-3-Xenografts durchgeführt. Der Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz wurde in vitro nach Herunterregulierung der entsprechenden Gene mittels siRNA beziehungsweise nach Supplementierung mit humanem rekombinanten VEGF-C in Koloniebildungsassays untersucht. Zur Ermittlung des Einflusses von VEGF-C und von NRP-2 auf mögliche Zellüberlebensmechanismen wurden der autophagische Flux nach Blockade der Autophagie mit Bafilomycin A1 mittels Western Blot, die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur mittels Quantifizierung der γH2AX Foci sowie die Zellzyklusverteilung mittels Durchflusszytometrie untersucht. Die Signalweiterleitung von VEGF-C über Akt sowie, als weitere Möglichkeit, die Signalweiterleitung über ERK1/2 wurden nach siRNA-Transfektion mit und ohne Bestrahlung mittels Western Blot geprüft. Weitere Versuche zu Akt erfolgten in vitro und in vivo mit dem PI3K/Akt-Inhibitor Nelfinavir in PC-3-Zellen. Der in vitro Effekt von Nelfinavir auf die Strahlenresistenz wurde dabei mithilfe eines Koloniebildungsassays nach Behandlung der Zellen mit 10 µM Nelfinavir getestet. In vivo wurde die Wirkung von Nelfinavir ohne sowie in Kombination mit Bestrahlung in PC-3-Xenografts in Nacktmäusen untersucht. Für die Bestimmung der Tumorwachstumszeit wurden die Mäuse mit 80 mg Nelfinavir/kg Körpergewicht 30 mal innerhalb von 6 Wochen behandelt. In einem weiteren Versuch wurde die lokale Tumorkontrolle bei gleichzeitiger fraktionierter Bestrahlung mit Gesamtdosen von 30 bis 120 Gy und einer Nachbeobachtungszeit von 180 Tagen bestimmt. Ergebnisse Die Untersuchungen zur Strahlenresistenz über den VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalweg haben ergeben, dass in den drei Prostatakarzinomzelllinien PC-3, DU145 und LNCaP VEGF-C signifikant Strahlenresistenz vermittelt. Für NRP-2 hingegen wurde festgestellt, dass es in Abhängigkeit von der Zelllinie entweder zur Strahlenresistenz (DU145) oder zur Strahlensensibilisierung (PC-3) führt. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass durch VEGF-C in PC-3 und DU145 weder über Akt noch über ERK1/2 Strahlenresistenz vermittelt wird. Die Versuche zu Strahlenresistenz vermittelnden Mechanismen ergaben, dass VEGF-C in unbestrahlten PC-3-Zellen die Autophagie fördert, NRP-2 jedoch nicht. Unter Bestrahlung war ein Effekt von VEGF-C und NRP-2 auf die Autophagie nicht reproduzierbar nachweisbar. Ein weiterer Versuch hat gezeigt, dass in PC-3 Autophagie keinen Einfluss auf das klonogene Überleben nach Bestrahlung hat. Außerdem wurde festgestellt, dass VEGF-C in PC-3 die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur nicht beeinflusst. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass eine Verminderung des VEGF-C-Gehalts in PC-3 zum G2/M-Arrest führt. In DU145 konnte jedoch kein Effekt beobachtet werden. In den Untersuchungen zum Einfluss von Akt auf die Strahlenresistenz unabhängig von VEGF-C und NRP-2 wirkte Nelfinavir inhibierend auf die Akt-Phosphorylierung am Ser473 und beeinflusste das klonogene Überleben von PC-3-Zellen minimal. In PC-3-Xenografts führte Nelfinavir zu keiner Tumorwachstumsverzögerung und wirkte in vitro und in vivo nicht strahlensensibilisierend. Schlussfolgerung In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass VEGF-C in Prostatakarzinomzellen Strahlenresistenz vermittelt. Diese Erkenntnis könnte als ein Forschungsansatz zur Entwicklung einer kombinierten Therapie aus VEGF-C-Blockade und Bestrahlung dienen. Ein potentieller Mechanismus, über den VEGF-C die Strahlenresistenz vermittelt, ist, in Abhängigkeit von der Zelllinie, die Aufhebung des G2/M-Arrests. NRP-2 wirkt in der Vermittlung von Strahlenresistenz beziehungsweise sensibilität je nach Zelllinie unterschiedlich. Hierzu sollten weitere Untersuchungen bezüglich möglicher Interaktionen innerhalb anderer Signalwege mit strahlensensibilisierendem Einfluss erfolgen. Innerhalb des untersuchten Signalwegs konnte weiterhin festgestellt werden, dass VEGF-C Strahlenresistenz nicht über Akt vermittelt. Die vorliegende Arbeit enthält die erste Studie sowohl zur Untersuchung des Einflusses von Nelfinavir in Kombination mit Bestrahlung auf das Überleben von Prostatakarzinomzellen in vitro als auch auf die Tumorwachstumszeit und die lokale Tumorkontrolle in vivo. Hierin konnte keine strahlensensibilisierende Wirkung von Nelfinavir nachgewiesen werden. Da Nelfinavir in Zellen anderer Tumorentitäten strahlensensibilisierend wirkt und außerdem bekannt ist, dass es in eine Reihe von Signalwegen eingreift, die das Zellüberleben fördern oder hemmen, sollte weiter geklärt werden, ob Tumorzellen mit einem bestimmten genetischen Profil besser auf die Behandlung mit Nelfinavir ansprechen. / Background In addition to radical prostatectomy, radiotherapy is a standard therapy for the treatment of prostate tumours and leads to good results for local tumour control and survival. However, as with the resection, the risk of recurrence for advanced tumours is relatively high compared to tumours in earlier stages. Therefore, there is a high urgency to improve radiotherapy especially for advanced stages. One approach is the combination of irradiation with molecular therapies. The aim is to block certain target proteins to increase the radiosensitivity of the prostate carcinoma cells. A potential target could be the blockade of the VEGF-C/NRP-2/Akt signalling pathway (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C; NRP-2 – neuropilin 2; Akt – protein kinase B). In prostate cancer the concentrations of VEGF-C and NRP-2 are increased compared to normal prostate cells. Studies have shown that both proteins have a progressive effect on tumourigenesis. In preliminary work Muders et al. (2009) also showed the activation of Akt via the VEGF-C/NRP-2 axis and a resistance to H2O2 induced oxidative stress. Akt also has a protective effect against irradiation in various tumour entities. It is assumed that this also applies to prostate carcinoma cells. Aim of the study Within the framework of this thesis, it was investigated whether and via which mechanism VEGF-C, NRP-2, and Akt affect the radioresistance in prostate carcinoma cell lines. Methods In vitro and in vivo experiments were performed in the human prostate carcinoma cell lines PC-3, DU145, LNCaP, as well as in PC-3 xenografts. The influence of VEGF-C and NRP-2 on the radioresistance was examined in vitro after knock down of the corresponding genes using siRNA or after supplementation with human recombinant VEGF-C in colony formation assays. In order to determine the influence of VEGF-C and NRP-2 on possible cell survival mechanisms, the autophagic flux was examined after the blockade of autophagy with bafilomycin A1 using western blot, the DNA double strand break repair by quantification of the γH2AX foci, and the cell cycle distribution by flow cytometry. The signal transduction of VEGF-C via Akt as well as, as a further possibility, the signal transduction via ERK1/2 were tested after siRNA transfection with and without irradiation using western blot. Further experiments on Akt were performed in vitro and in vivo with the PI3K/Akt inhibitor nelfinavir in PC-3 cells. The in vitro effect of nelfinavir on radioresistance was tested using a colony formation assay after treatment of the cells with 10 μM nelfinavir. In vivo, the effect of nelfinavir without and in combination with irradiation in PC-3 xenografts was investigated in nude mice. For the determination of the tumour growth time, the mice were treated with 80 mg nelfinavir/kg body weight 30 times within 6 weeks. In a further experiment, the local tumour control was determined with simultaneous fractionated irradiation with total doses of 30 to 120 Gy and a follow-up time of 180 days. Results The investigations on radioresistance via the VEGF-C/NRP-2/Akt signalling pathway showed that in the three prostate carcinoma cell lines PC-3, DU145, and LNCaP VEGF-C significantly mediates radioresistance. For NRP-2 however, it was found that, depending on the cell line, it either leads to radioresistance (DU145) or radiosensitization (PC-3). Further, it was shown that in PC-3 and DU145 VEGF-C does not mediate radioresistance via Akt or ERK1/2. The experiments on radioresistance mediating mechanisms revealed that VEGF-C promotes autophagy in untreated PC-3 cells, but NRP-2 does not. Under irradiation, an effect of VEGF-C and NRP-2 on autophagy could not be detected reproducibly. A further experiment has shown that in PC-3 autophagy has no influence on the clonogenic survival after irradiation. In addition, it was found that VEGF-C does not affect the DNA double strand break repair in PC-3. Furthermore, it was shown that a reduction in the VEGF-C content leads to a G2/M arrest in PC-3. However, no effect could be observed in DU145. In studies regarding the influence of Akt on radioresistance independent of VEGF-C and NRP-2, nelfinavir inhibited Akt phosphorylation at Ser473 and minimally affected the clonogenic survival of PC-3 cells. In PC-3 xenografts, nelfinavir did not lead to any tumour growth delay and did not have a radiosensitizing effect in vitro or in vivo. Conclusion In the experiments, it was shown that VEGF-C mediates radioresistance in prostate cancer cells. This finding could serve as a research approach for the development of a combined therapy of a VEGF-C blockade and irradiation. A potential mechanism by which VEGF-C mediates radioresistance is the reverse of the G2/M arrest, depending on the cell line. NRP-2 acts differently in the mediation of radioresistance or radiosensitivity, depending on the cell line. On this, further investigations should be carried out with regard to possible interactions within other signalling pathways with a radiosensitizing influence. Within the investigated signalling pathway, it was further shown that VEGF-C does not mediate radioresistance via Akt. The present work contains the first study examining the effect of nelfinavir in combination with irradiation on prostate cancer cell survival in vitro as well as on growth time and local tumour control in vivo. Herein no radiosensitizing effects of nelfinavir could be detected. Since nelfinavir radiosensitizes cells of other tumour entities and is also known to interfere with a series of signalling pathways that promote or inhibit cell survival, it should be clarified whether tumour cells with a particular genetic profile are more responsive to treatment with nelfinavir.

Recent knowledge suggests that the onset of cancer is modulated by the interplay of internal and external environmental factors along with numerous gene variants. Structural chromsomal aberrations in peripheral blood lymphocytes are considered as biomarkers of effect of genotoxic carcinogens and reflect elevated risk of cancer. Incomplete or deficient repair of double-strand breaks in DNA underlie chromosomal aberrations and the measurement of cytogenetic alterations may reflect interindividual differences in the response towards the mutagen. In this study the expected deficiences in the DNA repair capacity have been determined in incident oncological patients with breast, colorectal and urogenital cancers. The determination of chromosomal aberrations have been supplemented by the measurement of variants in genes involved in double-strand breaks repair (XRCC3, rs861539; RAD54L, rs1048771). Methodologically, we employed conventional cytogenetic analysis, cytogenetic analysis following the induction of chromocomal damage by bleomycin ("Challenge assay"), TaqMan discrimination analysis for the detection of allelic variants and statistical analyses. By using these methods we did not observe statistically signifiant differences either in chromosomal breaks (p=0,354) or in a percentage of cells with...

Hintergrund Die Strahlentherapie ist neben der radikalen Prostatektomie eine Standardtherapie zur Behandlung von Prostatatumoren und führt zu sehr guten Ergebnissen für die lokale Tumorkontrolle und für das Überleben. Allerdings ist, wie bei der Operation auch, dabei das Risiko eines Rezidivs für fortgeschrittene Tumoren im Gegensatz zu Tumoren in früheren Stadien relativ hoch. Daher besteht eine hohe Dringlichkeit zur Verbesserung der Strahlentherapie vor allem bei fortgeschrittenen Tumoren. Ein Ansatz hierfür ist die Kombination der Bestrahlung mit molekularen Therapien. Ziel dabei ist es, bestimmte Zielproteine zu blockieren, um die Strahlensensibilität der Prostatakarzinomzellen zu erhöhen. Ein potentielles Target könnte hierbei die Blockade des VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalwegs (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C; NRP-2 – Neuropilin 2; Akt – Proteinkinase B) sein. Im Prostatakarzinom sind die Konzentrationen von VEGF-C und NRP-2 im Vergleich zu normalen Prostatazellen erhöht. Aus Untersuchungen ist bekannt, dass beide Proteine eine progressive Wirkung auf die Tumorgenese haben. In Vorarbeiten zeigen Muders et al. (2009) zudem eine Aktivierung von Akt über die VEGF-C/NRP-2-Achse und eine darüber vermittelte Resistenz gegenüber oxidativem Stress durch H2O2. Akt wirkt in verschiedenen Tumorentitäten außerdem protektiv gegenüber Bestrahlung. Es besteht die Annahme, dass dies auch für Prostatakarzinomzellen gilt. Zielstellung Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob und über welchen Mechanismus VEGF-C, NRP-2 und Akt die Strahlenresistenz in Prostatakarzinomzelllinien beeinflussen. Methoden Es wurden in vitro- und in vivo-Experimente in den humanen Prostatakarzinomzelllinen PC-3, DU145, LNCaP sowie in PC-3-Xenografts durchgeführt. Der Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz wurde in vitro nach Herunterregulierung der entsprechenden Gene mittels siRNA beziehungsweise nach Supplementierung mit humanem rekombinanten VEGF-C in Koloniebildungsassays untersucht. Zur Ermittlung des Einflusses von VEGF-C und von NRP-2 auf mögliche Zellüberlebensmechanismen wurden der autophagische Flux nach Blockade der Autophagie mit Bafilomycin A1 mittels Western Blot, die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur mittels Quantifizierung der γH2AX Foci sowie die Zellzyklusverteilung mittels Durchflusszytometrie untersucht. Die Signalweiterleitung von VEGF-C über Akt sowie, als weitere Möglichkeit, die Signalweiterleitung über ERK1/2 wurden nach siRNA-Transfektion mit und ohne Bestrahlung mittels Western Blot geprüft. Weitere Versuche zu Akt erfolgten in vitro und in vivo mit dem PI3K/Akt-Inhibitor Nelfinavir in PC-3-Zellen. Der in vitro Effekt von Nelfinavir auf die Strahlenresistenz wurde dabei mithilfe eines Koloniebildungsassays nach Behandlung der Zellen mit 10 µM Nelfinavir getestet. In vivo wurde die Wirkung von Nelfinavir ohne sowie in Kombination mit Bestrahlung in PC-3-Xenografts in Nacktmäusen untersucht. Für die Bestimmung der Tumorwachstumszeit wurden die Mäuse mit 80 mg Nelfinavir/kg Körpergewicht 30 mal innerhalb von 6 Wochen behandelt. In einem weiteren Versuch wurde die lokale Tumorkontrolle bei gleichzeitiger fraktionierter Bestrahlung mit Gesamtdosen von 30 bis 120 Gy und einer Nachbeobachtungszeit von 180 Tagen bestimmt. Ergebnisse Die Untersuchungen zur Strahlenresistenz über den VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalweg haben ergeben, dass in den drei Prostatakarzinomzelllinien PC-3, DU145 und LNCaP VEGF-C signifikant Strahlenresistenz vermittelt. Für NRP-2 hingegen wurde festgestellt, dass es in Abhängigkeit von der Zelllinie entweder zur Strahlenresistenz (DU145) oder zur Strahlensensibilisierung (PC-3) führt. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass durch VEGF-C in PC-3 und DU145 weder über Akt noch über ERK1/2 Strahlenresistenz vermittelt wird. Die Versuche zu Strahlenresistenz vermittelnden Mechanismen ergaben, dass VEGF-C in unbestrahlten PC-3-Zellen die Autophagie fördert, NRP-2 jedoch nicht. Unter Bestrahlung war ein Effekt von VEGF-C und NRP-2 auf die Autophagie nicht reproduzierbar nachweisbar. Ein weiterer Versuch hat gezeigt, dass in PC-3 Autophagie keinen Einfluss auf das klonogene Überleben nach Bestrahlung hat. Außerdem wurde festgestellt, dass VEGF-C in PC-3 die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur nicht beeinflusst. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass eine Verminderung des VEGF-C-Gehalts in PC-3 zum G2/M-Arrest führt. In DU145 konnte jedoch kein Effekt beobachtet werden. In den Untersuchungen zum Einfluss von Akt auf die Strahlenresistenz unabhängig von VEGF-C und NRP-2 wirkte Nelfinavir inhibierend auf die Akt-Phosphorylierung am Ser473 und beeinflusste das klonogene Überleben von PC-3-Zellen minimal. In PC-3-Xenografts führte Nelfinavir zu keiner Tumorwachstumsverzögerung und wirkte in vitro und in vivo nicht strahlensensibilisierend. Schlussfolgerung In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass VEGF-C in Prostatakarzinomzellen Strahlenresistenz vermittelt. Diese Erkenntnis könnte als ein Forschungsansatz zur Entwicklung einer kombinierten Therapie aus VEGF-C-Blockade und Bestrahlung dienen. Ein potentieller Mechanismus, über den VEGF-C die Strahlenresistenz vermittelt, ist, in Abhängigkeit von der Zelllinie, die Aufhebung des G2/M-Arrests. NRP-2 wirkt in der Vermittlung von Strahlenresistenz beziehungsweise sensibilität je nach Zelllinie unterschiedlich. Hierzu sollten weitere Untersuchungen bezüglich möglicher Interaktionen innerhalb anderer Signalwege mit strahlensensibilisierendem Einfluss erfolgen. Innerhalb des untersuchten Signalwegs konnte weiterhin festgestellt werden, dass VEGF-C Strahlenresistenz nicht über Akt vermittelt. Die vorliegende Arbeit enthält die erste Studie sowohl zur Untersuchung des Einflusses von Nelfinavir in Kombination mit Bestrahlung auf das Überleben von Prostatakarzinomzellen in vitro als auch auf die Tumorwachstumszeit und die lokale Tumorkontrolle in vivo. Hierin konnte keine strahlensensibilisierende Wirkung von Nelfinavir nachgewiesen werden. Da Nelfinavir in Zellen anderer Tumorentitäten strahlensensibilisierend wirkt und außerdem bekannt ist, dass es in eine Reihe von Signalwegen eingreift, die das Zellüberleben fördern oder hemmen, sollte weiter geklärt werden, ob Tumorzellen mit einem bestimmten genetischen Profil besser auf die Behandlung mit Nelfinavir ansprechen.:Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung und Zielstellung 1 2 Grundlagen 3 2.1 Zelluläre Auswirkungen der Bestrahlung 3 2.2 Überlebensfördernde Signalwege 6 2.3 Zellüberlebensstrategien 9 2.3.1 Autophagie 10 2.3.2 DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur 12 2.3.3 Zellzyklusarrest 13 2.4 Reaktionen von Tumoren auf Bestrahlung 14 2.5 Nelfinavir als Akt-Inhibitor 15 3 Material und Methoden 17 3.1 Material 17 3.1.1 Zelllinien 17 3.1.2 Reagenzien und Substanzen 17 3.1.3 Kits 19 3.1.4 Primäre Antikörper 19 3.1.5 Sekundäre Antikörper 20 3.1.6 siRNA 20 3.1.7 Primer 20 3.1.8 Materialien und Hilfsmittel 20 3.1.9 Geräte 21 3.1.10 Software 22 3.2 Methoden 22 3.2.1 Zellkultur 22 3.2.2 siRNA-Transfektion 23 3.2.3 Bestrahlung 24 3.2.4 Koloniebildungsassay 24 3.2.5 Autophagischer Flux 26 3.2.6 Semiquantitative Proteinbestimmung 27 3.2.7 mRNA-Quantifizierung 29 3.2.8 γH2AX Foci-Assay 31 3.2.9 Zellzyklusanalyse 33 3.2.10 Tierversuch 34 3.2.11 Statistische Auswertung 37 4 Ergebnisse 39 4.1 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Strahlenresistenz 39 4.1.1 Betrachtung der VEGF C- und NRP 2-Gehalte in den Zelllinien PC 3, DU145 und LNCaP 39 4.1.2 Etablierung der VEGF C- und NRP 2-siRNA-Transfektionen 39 4.1.3 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Klonogenität bestrahlter Zellen 40 4.2 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf überlebensfördernde Signalwege unter Bestrahlung 42 4.2.1 Aktivierung des Akt-Signalwegs 43 4.2.2 Aktivierung des ERK1/2-Signalwegs 45 4.3 Untersuchungen zum Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Strahlenresistenz beeinflussende zelluläre und molekulare Prozesse 46 4.3.1 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Autophagie und deren Bedeutung für die Strahlenresistenz 46 4.3.2 Einfluss von VEGF C auf die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen 48 4.3.3 Der Einfluss von VEGF C auf den Zellzyklus 50 4.4 Inhibierung der Aktivierung von Akt durch Nelfinavir 52 4.4.1 Einfluss von Nelfinavir auf die Klonogenität in vitro 53 4.4.2 Tumorwachstumsverzögerung 54 4.4.3 Lokale Tumorkontrolle 56 5 Diskussion 59 5.1 VEGF C- und NRP 2-Expression und -Herunterregulierung 59 5.2 Der Einfluss von VEGF-C auf die Strahlenresistenz 59 5.3 Die Funktion von NRP-2 als Co-Rezeptor für VEGF-C bei der Vermittlung von Strahlenresistenz 60 5.4 VEGF C-abhängige Akt- und ERK1/2-Regulierung unter Bestrahlung 62 5.5 Der Einfluss der Autophagie auf die Strahlenresistenz 62 5.6 Der Einfluss von VEGF C auf die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur 63 5.7 Der Einfluss von VEGF C auf den Zellzyklus 64 5.8 Der Einfluss von Nelfinavir auf das Wachstum und auf die Strahlenresistenz von PC 3-Zellen in vitro und in vivo 65 5.9 Schlussfolgerung und Ausblick 67 6 Zusammenfassung 69 7 Abstract 72 8 Literaturverzeichnis 75 9 Abbildungsverzeichnis 89 10 Tabellenverzeichnis 90 Danksagung 92 Anhang 93 Anlage 1 94 Anlage 2 96 / Background In addition to radical prostatectomy, radiotherapy is a standard therapy for the treatment of prostate tumours and leads to good results for local tumour control and survival. However, as with the resection, the risk of recurrence for advanced tumours is relatively high compared to tumours in earlier stages. Therefore, there is a high urgency to improve radiotherapy especially for advanced stages. One approach is the combination of irradiation with molecular therapies. The aim is to block certain target proteins to increase the radiosensitivity of the prostate carcinoma cells. A potential target could be the blockade of the VEGF-C/NRP-2/Akt signalling pathway (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C; NRP-2 – neuropilin 2; Akt – protein kinase B). In prostate cancer the concentrations of VEGF-C and NRP-2 are increased compared to normal prostate cells. Studies have shown that both proteins have a progressive effect on tumourigenesis. In preliminary work Muders et al. (2009) also showed the activation of Akt via the VEGF-C/NRP-2 axis and a resistance to H2O2 induced oxidative stress. Akt also has a protective effect against irradiation in various tumour entities. It is assumed that this also applies to prostate carcinoma cells. Aim of the study Within the framework of this thesis, it was investigated whether and via which mechanism VEGF-C, NRP-2, and Akt affect the radioresistance in prostate carcinoma cell lines. Methods In vitro and in vivo experiments were performed in the human prostate carcinoma cell lines PC-3, DU145, LNCaP, as well as in PC-3 xenografts. The influence of VEGF-C and NRP-2 on the radioresistance was examined in vitro after knock down of the corresponding genes using siRNA or after supplementation with human recombinant VEGF-C in colony formation assays. In order to determine the influence of VEGF-C and NRP-2 on possible cell survival mechanisms, the autophagic flux was examined after the blockade of autophagy with bafilomycin A1 using western blot, the DNA double strand break repair by quantification of the γH2AX foci, and the cell cycle distribution by flow cytometry. The signal transduction of VEGF-C via Akt as well as, as a further possibility, the signal transduction via ERK1/2 were tested after siRNA transfection with and without irradiation using western blot. Further experiments on Akt were performed in vitro and in vivo with the PI3K/Akt inhibitor nelfinavir in PC-3 cells. The in vitro effect of nelfinavir on radioresistance was tested using a colony formation assay after treatment of the cells with 10 μM nelfinavir. In vivo, the effect of nelfinavir without and in combination with irradiation in PC-3 xenografts was investigated in nude mice. For the determination of the tumour growth time, the mice were treated with 80 mg nelfinavir/kg body weight 30 times within 6 weeks. In a further experiment, the local tumour control was determined with simultaneous fractionated irradiation with total doses of 30 to 120 Gy and a follow-up time of 180 days. Results The investigations on radioresistance via the VEGF-C/NRP-2/Akt signalling pathway showed that in the three prostate carcinoma cell lines PC-3, DU145, and LNCaP VEGF-C significantly mediates radioresistance. For NRP-2 however, it was found that, depending on the cell line, it either leads to radioresistance (DU145) or radiosensitization (PC-3). Further, it was shown that in PC-3 and DU145 VEGF-C does not mediate radioresistance via Akt or ERK1/2. The experiments on radioresistance mediating mechanisms revealed that VEGF-C promotes autophagy in untreated PC-3 cells, but NRP-2 does not. Under irradiation, an effect of VEGF-C and NRP-2 on autophagy could not be detected reproducibly. A further experiment has shown that in PC-3 autophagy has no influence on the clonogenic survival after irradiation. In addition, it was found that VEGF-C does not affect the DNA double strand break repair in PC-3. Furthermore, it was shown that a reduction in the VEGF-C content leads to a G2/M arrest in PC-3. However, no effect could be observed in DU145. In studies regarding the influence of Akt on radioresistance independent of VEGF-C and NRP-2, nelfinavir inhibited Akt phosphorylation at Ser473 and minimally affected the clonogenic survival of PC-3 cells. In PC-3 xenografts, nelfinavir did not lead to any tumour growth delay and did not have a radiosensitizing effect in vitro or in vivo. Conclusion In the experiments, it was shown that VEGF-C mediates radioresistance in prostate cancer cells. This finding could serve as a research approach for the development of a combined therapy of a VEGF-C blockade and irradiation. A potential mechanism by which VEGF-C mediates radioresistance is the reverse of the G2/M arrest, depending on the cell line. NRP-2 acts differently in the mediation of radioresistance or radiosensitivity, depending on the cell line. On this, further investigations should be carried out with regard to possible interactions within other signalling pathways with a radiosensitizing influence. Within the investigated signalling pathway, it was further shown that VEGF-C does not mediate radioresistance via Akt. The present work contains the first study examining the effect of nelfinavir in combination with irradiation on prostate cancer cell survival in vitro as well as on growth time and local tumour control in vivo. Herein no radiosensitizing effects of nelfinavir could be detected. Since nelfinavir radiosensitizes cells of other tumour entities and is also known to interfere with a series of signalling pathways that promote or inhibit cell survival, it should be clarified whether tumour cells with a particular genetic profile are more responsive to treatment with nelfinavir.:Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung und Zielstellung 1 2 Grundlagen 3 2.1 Zelluläre Auswirkungen der Bestrahlung 3 2.2 Überlebensfördernde Signalwege 6 2.3 Zellüberlebensstrategien 9 2.3.1 Autophagie 10 2.3.2 DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur 12 2.3.3 Zellzyklusarrest 13 2.4 Reaktionen von Tumoren auf Bestrahlung 14 2.5 Nelfinavir als Akt-Inhibitor 15 3 Material und Methoden 17 3.1 Material 17 3.1.1 Zelllinien 17 3.1.2 Reagenzien und Substanzen 17 3.1.3 Kits 19 3.1.4 Primäre Antikörper 19 3.1.5 Sekundäre Antikörper 20 3.1.6 siRNA 20 3.1.7 Primer 20 3.1.8 Materialien und Hilfsmittel 20 3.1.9 Geräte 21 3.1.10 Software 22 3.2 Methoden 22 3.2.1 Zellkultur 22 3.2.2 siRNA-Transfektion 23 3.2.3 Bestrahlung 24 3.2.4 Koloniebildungsassay 24 3.2.5 Autophagischer Flux 26 3.2.6 Semiquantitative Proteinbestimmung 27 3.2.7 mRNA-Quantifizierung 29 3.2.8 γH2AX Foci-Assay 31 3.2.9 Zellzyklusanalyse 33 3.2.10 Tierversuch 34 3.2.11 Statistische Auswertung 37 4 Ergebnisse 39 4.1 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Strahlenresistenz 39 4.1.1 Betrachtung der VEGF C- und NRP 2-Gehalte in den Zelllinien PC 3, DU145 und LNCaP 39 4.1.2 Etablierung der VEGF C- und NRP 2-siRNA-Transfektionen 39 4.1.3 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Klonogenität bestrahlter Zellen 40 4.2 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf überlebensfördernde Signalwege unter Bestrahlung 42 4.2.1 Aktivierung des Akt-Signalwegs 43 4.2.2 Aktivierung des ERK1/2-Signalwegs 45 4.3 Untersuchungen zum Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Strahlenresistenz beeinflussende zelluläre und molekulare Prozesse 46 4.3.1 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Autophagie und deren Bedeutung für die Strahlenresistenz 46 4.3.2 Einfluss von VEGF C auf die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen 48 4.3.3 Der Einfluss von VEGF C auf den Zellzyklus 50 4.4 Inhibierung der Aktivierung von Akt durch Nelfinavir 52 4.4.1 Einfluss von Nelfinavir auf die Klonogenität in vitro 53 4.4.2 Tumorwachstumsverzögerung 54 4.4.3 Lokale Tumorkontrolle 56 5 Diskussion 59 5.1 VEGF C- und NRP 2-Expression und -Herunterregulierung 59 5.2 Der Einfluss von VEGF-C auf die Strahlenresistenz 59 5.3 Die Funktion von NRP-2 als Co-Rezeptor für VEGF-C bei der Vermittlung von Strahlenresistenz 60 5.4 VEGF C-abhängige Akt- und ERK1/2-Regulierung unter Bestrahlung 62 5.5 Der Einfluss der Autophagie auf die Strahlenresistenz 62 5.6 Der Einfluss von VEGF C auf die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur 63 5.7 Der Einfluss von VEGF C auf den Zellzyklus 64 5.8 Der Einfluss von Nelfinavir auf das Wachstum und auf die Strahlenresistenz von PC 3-Zellen in vitro und in vivo 65 5.9 Schlussfolgerung und Ausblick 67 6 Zusammenfassung 69 7 Abstract 72 8 Literaturverzeichnis 75 9 Abbildungsverzeichnis 89 10 Tabellenverzeichnis 90 Danksagung 92 Anhang 93 Anlage 1 94 Anlage 2 96