Orientadores: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin, Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T22:51:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marinho_MarcoAntonioTonus_D.pdf: 17816653 bytes, checksum: e915a871c22b7741c1be765f87c95ff5 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A superfamília Oestroidea (Diptera:Brachycera:Calyptratae), com +13.000 espécies descritas, compreende um dos grupos mais numerosos e ecologicamente diversos da ordem Diptera. O grupo possui grande interesse para atividades humanas por englobar espécies de importância médica, veterinária e forense, muitas das quais compõem a família Calliphoridae. Apesar do grande número de estudos disponíveis, as relações evolutivas no grupo, o qual é composto predominantemente por linhagens de rápida diversificação e radiação, ainda são controversas e pouco compreendidas, encorajando a caracterização de novos marcadores moleculares para análises de filogenia molecular. Neste contexto, esta tese foi desenvolvida e organizada em três capítulos descrevendo estudos genéticoevolutivos em espécies da superfamília Oestroidea, com ênfase em Calliphoridae. O primeiro capítulo trata da caracterização e avaliação do segundo espaçador transcrito interno (ITS2) do DNA ribossomal como um marcador molecular para análises filogenéticas em Calliphoridae, incorporando informações tanto da sequência primária quanto da estrutura secundária adquirida pela região. A análise do ITS2 revelou um padrão hierarquicamente organizado das distâncias genéticas nos níveis de espécies, gêneros e subfamílias, enquanto pouca variação intra-específica foi encontrada. As árvores inferidas recuperaram muitas das relações comumente aceitas entre os táxons amostrados, sendo que a inclusão da informação estrutural nas análises resultou na recuperação de topologias mais confiáveis. Sendo assim, o potencial da região ITS2 como um marcador molecular para análises evolutivas na família Calliphoridae foi confirmado e seu uso em análises de maior escala, incluindo marcadores de diferentes naturezas de evolução, encorajado. O segundo capítulo da tese descreve a caracterização in vitro da estrutura secundária adquirida pelo ITS2, através de padrões de digestão enzimática e análise dos fragmentos gerados, em espécies representantes das três superfamílias de Calyptratae: Glossina morsitans, Musca domestica e Cochliomyia hominivorax. A análise do padrão de fragmentos gerados pelas enzimas RNAse I, A, T1 e V1, quando mapeados na estrutura secundária predita in silico, corroborou muitos dos domínios inicialmente preditos pelo método computacional, ressaltando a importância e confiabilidade desses métodos na predição de estruturas secundárias. O terceiro capítulo da tese descreve análises de filogenia molecular na superfamília Oestroidea, com ênfase na amostragem de espécies de Calliphoridae, utilizando quatro marcadores moleculares, dois nucleares (ITS2 e 28S) e dois mitocondriais (COI e 16). As análises, que incluíram uma extensa avaliação dos efeitos de diferentes estratégias de particionamento dos dados em análises de inferência Bayesiana (por conformação estrutural e posição no códon), revelaram a existência de dois clados principais em Oestroidea: Tachinidae + Mesembrinellinae e Oestridae + Rhiniinae + Sarcophagidae + Calliphoridae (definida em senso estrito). O status de família recentemente atribuído à Rhiniinae foi encontrado, enquanto há também evidências para sugerir o mesmo para a subfamília Mesembrinellinae, como proposto anteriormente por outros autores. As diferentes estratégias de particionamento do conjunto de dados amostrados resultaram em diferenças discretas em termos de topologia, comprimentos de ramo e suporte geral das filogenias inferidas. Embora o resultado geral indique uma melhor resolução das análises quando do uso de combinações de partições e modelos mais complexas, as mesmas podem ocasionar também um aumento considerável na incerteza associada às análises / Abstract: The Oestroidea superfamily (Diptera: Brachycera: Calyptratae), with +13,000 described species, comprises one of the most numerous and ecologically diverse groups in the Diptera order. The group is actually of great interest for human activities since it includes species of medical, veterinary and forensic importance, most of them included in the Calliphoridae family. Despite the existence of several studies addressing the issue, evolutionary relationships in Oestroidea, a group mainly composed of rapidly diverged lineages, remains contentious and poorly understood, encouraging the characterization of new molecular markers for phylogenetic inference analyses. In this context, this thesis was developed and organized in three chapters describing genetic and evolutionary studies in species of the Oestroidea superfamily, with emphasis in Calliphoridae. The first chapter deals with the characterization and evaluation of the second internal transcribed spacer region (ITS2) of the ribosomal DNA cluster as a molecular marker for phylogenetic inference in Calliphoridae, including information of both primary sequence and secondary structure. The analyses revealed an hierarchically organized pattern of genetic distances in the specific, generic and subfamilial level, while little intraspecific variation was detected. Inferred trees were able to recover most of the commonly accepted relationships among the sampled taxa, with the consideration of structural information resulting in better supported topologies. Thereby, the potential of the ITS2 region as a molecular marker for phylogenetic inference in the Calliphoridae family was corroborated and its use in larger scale analyses, including other markers with different evolutionary patterns, encouraged. Chapter II describes the in vitro characterization of the secondary structure of the ITS2 region, through patterns of enzymatic digestion and analysis of the generated fragments, in representative species of the three superfamilies of the Calyptratae clade: Glossina morsitans, Musca domestica and Cochliomyia hominivorax. Analyses of the patterns of the fragments generated by enzymatic digestions with the RNAses I, A, T1 and V1, when mapped in the in silico predicted secondary structure, corroborated the folding of most of the domains predicted by computational methods, highlighting the importance and reliability of these methods in secondary structure prediction. Chapter III describes molecular phylogenetic analyses in the Oestroidea superfamily, with emphasis on the Calliphoridae family, using four different molecular markers, two nuclear (ITS2 and 28S) and two mitochondrial (COI and 16S) regions. The analyses, which included a comprehensive evaluation of the effects of different data partitioning strategies in a Bayesian framework (by structural conformation and codon position), revealed the existence of two main clades in Oestroidea: Tachinidae+Mesembrinellinae and Oestridae+Rhiniinae+Sarcophagidae+Calliphoridae (defined in a strict sense). The recently attributed family status to Rhiniinae was confirmed, and there are evidence to also suggest the same for Mesembrinellinae, as previously pointed out by other studies. The different data partitioning strategies used in the sampled dataset resulted in small differences in terms of inferred topologies, estimated branch lengths and average support. Although the overall results indicate a significant increase in phylogeny resolution when more complex and parameter-rich models / partitions combinations are used, they can also lead to an increased uncertainty in the phylogenetic estimation process / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Soutor em Genética e Biologia Molecular

A malária é uma doença grave, cujos vetores são mosquitos do gênero Anopheles. Esse gênero é composto por cerca de 500 espécies e aproximadamente 45 são responsáveis pela transmissão do parasito em todo o mundo. Alguns destes vetores são componentes de complexo de espécies crípticas como Complexo Albitarsis e Complexo Triannulatus. O Complexo Albitarsis é formado por quatro espécies: An. albitarsis s.s, An. albitarsis B, An. marajoara e An. deaneorum. O Complexo Triannulatus é composto por três espécies: An. triannulatus, An. halophylus e An. triannulatus C. Algumas técnicas moleculares são utilizadas para auxiliar na distinção destas espécies crípticas. Dessa forma, DNA de An. albitarsis s.l e An. triannulatus s.l., capturados na Usina de Porto Primavera, foram amplificados para ITS2 e para o gene ND4 do DNAmt. Todas as amostras foram submetidas à técnica de RFLP. Algumas amostras foram seqüenciadas diretamente ou clonadas para posterior seqüenciamento a fim de se confirmar a espécie. Das amostras do Complexo Albitarsis, 62,85% foram identificadas como An. deaneorum para ITS2-RFLP. As restantes foram amplificadas para ND4-RFLP e foram identificadas como An. albitarsis s.s. Observou-se, no entanto, que as amostras do Complexo Albitarsis não exibiram similaridade total com as depositadas no GeneBank sendo que para ITS2-PCR estas foram identificadas como An. albitarsis s.s. e An. deaneorum, enquanto que para o gene ND4 todas foram identificadas como An. albitarsis B. O ITS2-RFLP para o An. triannulatus s.l demonstrou polimorfismos entre as espécies. No seqüenciamento, estas amostras foram similares àquelas depositadas no GeneBank. O emprego de marcadores moleculares podem, em parte, auxiliar na distinção de espécies crípticas, porém outros marcadores devem ser avaliados a fim de se elucidar a identificação do Complexo Albitarsis. / Malaria is a severe disease whose vectors are mosquitoes belonging to the genus Anopheles. This genus contains 500 species of which approximately 45 are responsible for the worldwide transmission of these parasites. Some of these vectors belong to cryptic species such as those of the Albitarsis and Triannulatus Complex. The Albitarsis Complex is composed of four species: An. albitarsis s.s., An. albitarsis B, An. marajoara and An. deaneorum. The Triannulatus Complex contains three species: An. triannulatus, An. halophylus and An. triannulatus C. We used molecular techniques to differentiate these cryptic species. Thus, DNA of An. albitarsis s.l and An. triannulatus s.l, captured at the Porto Primavera Dam had their ITS2 and their mtDNA, ND4 genes amplified. All samples were analyzed by the RFLP technique. Some samples were directly sequenced while others were cloned for subsequent sequencing for species confirmation. Within the Albitarsis Complex, 62.85% were identified as An. deaneorum by RFLP-ITS2. The remaining were amplified by RFLP-ND4 and identified as An. albitarsis s.s. However the results of sequencing of the samples of the Albitarsis Complex did not overlap entirely with those deposited in the GeneBank since those amplified by RFLP-ITS2 were identified as An. albitarsis s.s. and An. deaneorum while those obtained by RFLP-ND4 were identified as An. albitarsis B. Also RFLP-ITS2 of A. triannulatus s.l. contained polymorphic regions among different species. By sequencing, these samples were similar to those deposited in the GeneBank. The use of molecular markers did, in some instances help to distinguish species within cryptic complexes, however other markers need to be evaluated to elucidate further identification of the Albitarsis Complex.

A malária é uma doença grave, cujos vetores são mosquitos do gênero Anopheles. Esse gênero é composto por cerca de 500 espécies e aproximadamente 45 são responsáveis pela transmissão do parasito em todo o mundo. Alguns destes vetores são componentes de complexo de espécies crípticas como Complexo Albitarsis e Complexo Triannulatus. O Complexo Albitarsis é formado por quatro espécies: An. albitarsis s.s, An. albitarsis B, An. marajoara e An. deaneorum. O Complexo Triannulatus é composto por três espécies: An. triannulatus, An. halophylus e An. triannulatus C. Algumas técnicas moleculares são utilizadas para auxiliar na distinção destas espécies crípticas. Dessa forma, DNA de An. albitarsis s.l e An. triannulatus s.l., capturados na Usina de Porto Primavera, foram amplificados para ITS2 e para o gene ND4 do DNAmt. Todas as amostras foram submetidas à técnica de RFLP. Algumas amostras foram seqüenciadas diretamente ou clonadas para posterior seqüenciamento a fim de se confirmar a espécie. Das amostras do Complexo Albitarsis, 62,85% foram identificadas como An. deaneorum para ITS2-RFLP. As restantes foram amplificadas para ND4-RFLP e foram identificadas como An. albitarsis s.s. Observou-se, no entanto, que as amostras do Complexo Albitarsis não exibiram similaridade total com as depositadas no GeneBank sendo que para ITS2-PCR estas foram identificadas como An. albitarsis s.s. e An. deaneorum, enquanto que para o gene ND4 todas foram identificadas como An. albitarsis B. O ITS2-RFLP para o An. triannulatus s.l demonstrou polimorfismos entre as espécies. No seqüenciamento, estas amostras foram similares àquelas depositadas no GeneBank. O emprego de marcadores moleculares podem, em parte, auxiliar na distinção de espécies crípticas, porém outros marcadores devem ser avaliados a fim de se elucidar a identificação do Complexo Albitarsis. / Malaria is a severe disease whose vectors are mosquitoes belonging to the genus Anopheles. This genus contains 500 species of which approximately 45 are responsible for the worldwide transmission of these parasites. Some of these vectors belong to cryptic species such as those of the Albitarsis and Triannulatus Complex. The Albitarsis Complex is composed of four species: An. albitarsis s.s., An. albitarsis B, An. marajoara and An. deaneorum. The Triannulatus Complex contains three species: An. triannulatus, An. halophylus and An. triannulatus C. We used molecular techniques to differentiate these cryptic species. Thus, DNA of An. albitarsis s.l and An. triannulatus s.l, captured at the Porto Primavera Dam had their ITS2 and their mtDNA, ND4 genes amplified. All samples were analyzed by the RFLP technique. Some samples were directly sequenced while others were cloned for subsequent sequencing for species confirmation. Within the Albitarsis Complex, 62.85% were identified as An. deaneorum by RFLP-ITS2. The remaining were amplified by RFLP-ND4 and identified as An. albitarsis s.s. However the results of sequencing of the samples of the Albitarsis Complex did not overlap entirely with those deposited in the GeneBank since those amplified by RFLP-ITS2 were identified as An. albitarsis s.s. and An. deaneorum while those obtained by RFLP-ND4 were identified as An. albitarsis B. Also RFLP-ITS2 of A. triannulatus s.l. contained polymorphic regions among different species. By sequencing, these samples were similar to those deposited in the GeneBank. The use of molecular markers did, in some instances help to distinguish species within cryptic complexes, however other markers need to be evaluated to elucidate further identification of the Albitarsis Complex.