Thesis (Ph.D. in Biochemistry) -- University of Colorado, 2006. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 118-126). Free to UCDHSC affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

Viral metagenomics of feces collected from 58 Peruvian children with unexplained diarrhea revealed several small circular ssDNA genomes. Two genomes related to sequences previously reported in feces from chimpanzees and other mammals and recently named smacoviruses were characterized and then detected by PCR in 1.7 % (1/58) and 19 % (11/58) of diarrheal samples, respectively. Another three genomes from a distinct small circular ssDNA viral group provisionally called pecoviruses encoded Cap and Rep proteins with <35 % identity to those in related genomes reported in human, seal, porcine and dromedary feces. Pecovirus DNA was detected in 15.5 % (9/58), 5.9 % (3/51) and 3 % (3/100) of fecal samples from unexplained diarrhea in Peru, Nicaragua and Chile, respectively. Feces containing these ssDNA genomes also contained known human enteric viral pathogens. The cellular origins of these circular ssDNA viruses, whether human cells, ingested plants, animals or fungal foods, or residents of the gut microbiome, are currently unknown.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2002. / Härtill 6 uppsatser.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1999. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 131-157).

Infecções pelos Papilomavirus Humanos (HPVs) estão relacionadas com uma série de malignidades nas regiões genitais, anais e recentemente a uma parcela dos tumores na região da cabeça e pescoço. Enquanto muito já fora explorado a respeito dessas infecções em mulheres, os fatores de risco virais e epidemiológicos para persistência da infecção e desenvolvimento de lesão em homens ainda estão sendo estabelecidos. Dessa forma, em meados de 2005, começou o Estudo HIM (HPV in men), um estudo multicêntrico envolvendo 4200 homens que tem como principal objetivo um melhor entendimento da história natural das infecções por esses vírus nessa população. Sabe-se que um importante evento no processo neoplásico em lesões do colo do útero é a integração do DNA viral no genoma da célula hospedeira. Embora o mecanismo de integração ainda não esteja claro, parece haver uma relação da progressão da doença com o aumento da proporção de lesões com genomas na forma integrada. Diante do exposto, o objetivo desse trabalho foi explorar as metodologias baseadas em PCR (convencional e em tempo real) e de sequenciamento de última geração (NGS) para verificar integração do DNA viral nas células de esfregaços genitais, do canal anal e cavidade oral de homens assintomáticos participantes do Estudo HIM. Além disso, teve como objetivo secundário verificar a carga viral nos diferentes sítios anatômicos. Foram inicialmente incluídas 125 amostras das quais 56 puderam ser incluídas nas análises de integração pela metodologia baseada em PCR e 90 amostras foram selecionadas para os ensaios de carga viral. Dentre as amostras testadas pela metodologia de PCR para integração, 11 foram desafiadas pela metodologia baseada em sequenciamento. Entre as 11 amostras sequenciadas, encontramos concordância entre os resultados em apenas 3 e isso pode ser atribuído à sensibilidade diferencial das metodologias diante de baixas cargas virais. Entre as amostras testadas pela metodologia baseada em PCR pudemos verificar que 30,4% das amostras apresentavam-se na forma puramente epissomal, 10,7% na forma puramente integrada e 58,9% das amostras apresentam as duas formas virais (classificadas como mistas). A amostra que se confirmou integrada pela metodologia de sequenciamento apresentou integração em 4 pontos do DNA humano com a ruptura no gene viral E2, conforme amplamente relatado na literatura. Grande variação na carga viral foi encontrada entre as amostras (0,00008 a 4200 cópias/célula), e isso se mostrou diretamente relacionado com as limitações das metodologias para verificar integração. Embora outras relações não puderam ser verificadas em nosso estudo pelo limitado número de amostras analisadas até o momento, estes dados ampliados poderão responder se a carga viral e integração seriam um fator de risco para a persistência da infecção ou o desenvolvimento de lesão em homens. / Human Papillomavirus (HPV) infections are associated with a range of malignancies in the genital and anal regions and recently, with an appreciable number of head and neck tumors. While much has been explored about these infections in women, viral and epidemiological risk factors for persistent infection and lesions development in men are still being established. Thus, in mid-2005, a multicenter study entitled HIM study (HPV in men) - involving 4200 men - which aims at a better understanding of the natural history of infection by these viruses in this population, was started. It is known that a key event in the transformation process in cervical lesions is the integration of viral DNA into the host cell genome. Although the integration mechanism is not yet clear, there seems to be a relationship of the disease progression with an increase of the proportion of lesions with integrated viral genomes. In view of the above, the aim of this study was to explore the methodologies based on PCR (conventional and real-time) and next-generation sequencing (NGS) to verify integration of viral DNA into cells from genital swabs, anal canal and oral cavity of asymptomatic men participating in the HIM study. Furthermore, the secondary objective was to verify the viral load in cells from different anatomical sites. Initially, 125 samples were selected of which 56 could be included in integration tests with the methodology based on PCR and 90 samples were selected for viral load determination. Of the samples tested by PCR method for integration, 11 were subjected DNA sequencing. We found correlation between the results in only 3 of the 11 samples and this can be attributed to the methodologies\' differential sensitivity to low viral loads. Among the samples tested by PCR-based methodology, we observed that 30.4% of the samples harbored purely episomal viral DNA, 10.7% were integrated and 58.9% of the samples showed the two viral forms (classified as mixed). The sample which was confirmed as integrated by sequencing presented integration into 4 human DNA points with the breakpoint within the E2 viral gene, as widely reported in literature. Large variation in viral load was observed among the samples (0.00008 to 4200 copies / cell), and this was shown to be directly related to the limitations of the methods used to verify integration. Evaluation of a larger number of samples may contribute to define the role of HPV DNA integration as a risk factor for the persistence of HPV infection or development of lesions in men.

O câncer no colo do útero é o segundo tipo de neoplasia maligna mais prevalente nas mulheres no mundo todo e o seu rastreamento é realizado através do exame microscópico das células esfoliadas da mucosa cervical, o teste de Papanicolaou. Partindo-se da premissa que a infecção por Papilomavírus Humano oncogênico (HRHPV) é condição necessária para o desenvolvimento desta neoplasia, tem-se avaliado a possibilidade de empregar-se para a mesma finalidade, o rastreio, métodos que detectam o material genético viral. Estudos recentes demonstraram que estes testes moleculares apresentam maior sensibilidade e a substituição do teste citológico pelos moleculares vem ocorrendo em alguns países. O monitoramento da resposta ao tratamento das pacientes com câncer cervical é realizado por meio de testes inespecíficos como exames de imagem. Portanto, é desejável o desenvolvimento de um teste específico, não invasivo capaz de detectar precocemente a recidiva. Este estudo investigou a freqüência e os tipos de HPV presentes em tumores cervicais de pacientes brasileiras, e verificou a ocorrência de resultados HPV-negativos pelos testes moleculares, procurando investigar as causas de possíveis falhas dos testes. Além disso, padronizou e avaliou uma reação de PCR em tempo real capaz detectar o DNA do HPV-16 e 18 no plasma das pacientes. Foram incluídas no estudo 104 pacientes com diagnóstico confirmado de câncer cervical atendidas em três hospitais oncológicos do Estado de São Paulo, ICESP, IBCC e HC-Barretos, no período de novembro de 2009 a julho de 2011. Foram coletados um fragmento do tumor cervical e sangue total. O DNA extraído dos tumores foi submetido a genotipagem do HPV por meio da utilização dos kits Linear Array HPV Genotyping Test (LA) e PapilloCheck®, além de PCRs tipo específicas para HPV-16, 18 e 45. Amostras que apresentaram resultado HPV-negativo no PapilloCheck®, tiveram parte da região E1 seqüenciada para verificar potenciais causas do resultado falso-negativo. A amostra de plasma das pacientes que apresentavam HPV-16 e/ou 18 no tecido tumoral foi submetida à PCR em tempo real para avaliar a presença do DNA do HPV no plasma. Das 104 amostras de tecido tumoral, 103 foram positivas para HPV, sendo que os HPV-16 e 18, como infecção simples, foram os encontrados com maior freqüência (48,5%). Os testes LA e PapilloCheck® apresentaram 65,4% de concordância total. O PapilloCheck® apresentou 12,5% de resultados falso-negativos (N=13). A principal hipótese para explicar esses resultados é a presença de mutações na região de hibridização dos iniciadores e/ou das sondas. A reação de PCR em tempo real específica para HPV-16 e 18 padronizada no estudo apresentou baixa sensibilidade, mas alta especificidade e não deve ser utilizada como teste diagnóstico para o câncer cervical. A relação entre DNA de HPV no plasma e o prognóstico da paciente deve ser explorada no futuro / Invasive cervical cancer is the second most common cancer among women worldwide and screening programs are based on microscopical examination of cells exfoliated from the cervical mucosa, the Papanicolaou test. Since the infection by an oncogenic HPV (HR-HPV) has been shown to be necessary for the development of this neoplasia, molecular assays are being evaluated for the same application, primary screening. Indeed, recent studies showed these methods to be more sensitive and therefore are replacing the cytological test in many countries. Post treatment surveillance of invasive cervical cancer patients are made by unspecific tests as imaging exams. Hence, the development of a specific non invasive test able to detect premature recurrence is desired. This study investigated the HPV frequency and types on invasive cervical tumors among Brazilian patients observing the occurrence of HPV-negative results on molecular tests, trying to addrees the causes for the putative failures. Moreover, we standardized and evaluated a real time PCR method for HPV-16 and 18 DNA detection on patients plasma. One hundred and four women with invasive cervical cancer were recruited in three oncologic hospitals from São Paulo State, ICESP, IBCC and HCBarretos, in between November 2009 and July 2011. Tumor tissue and whole blood were collected. DNA extracted from the tumors were submitted to HPV detection and genotyping tests such as the Linear Array HPV Genotyping Test (LA) and PapilloCheck®, besides type specific PCRs for HPV-16, 18 e 45. Samples that showed an HPV-negative result on the PapilloCheck® were submitted to direct sequencing of E1 region to verify potential mismatches responsible for that. Plasma samples from patients with tumor tissue positive for HPV-16 and/or 18 were submitted to the real time PCR to evaluate the HPV DNA presence on plasma. Out of 104 cervical carcinomas, 103 were HPV positive, HPV-16 and 18, as single infection, were the most frequent types observed (48.5%). LA and PapilloCheck® showed 65.4% of total agreement. PapilloCheck® displaied 12.5% of false-negative results (N=13). The major hypothesis to explain these results is the presence of mismatches to the primers and/or probes annealing regions. Real time PCR specific for HPV-16 and 18 developed in this study showed low sensitivity, but a high specificity and cannot be used as an invasive cervical cancer diagnostic tool. The relationship between the presence of HPV DNA in the plasma and the patient prognostic shall be evaluated in the future

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 6 uppsatser.

O câncer no colo do útero é o segundo tipo de neoplasia maligna mais prevalente nas mulheres no mundo todo e o seu rastreamento é realizado através do exame microscópico das células esfoliadas da mucosa cervical, o teste de Papanicolaou. Partindo-se da premissa que a infecção por Papilomavírus Humano oncogênico (HRHPV) é condição necessária para o desenvolvimento desta neoplasia, tem-se avaliado a possibilidade de empregar-se para a mesma finalidade, o rastreio, métodos que detectam o material genético viral. Estudos recentes demonstraram que estes testes moleculares apresentam maior sensibilidade e a substituição do teste citológico pelos moleculares vem ocorrendo em alguns países. O monitoramento da resposta ao tratamento das pacientes com câncer cervical é realizado por meio de testes inespecíficos como exames de imagem. Portanto, é desejável o desenvolvimento de um teste específico, não invasivo capaz de detectar precocemente a recidiva. Este estudo investigou a freqüência e os tipos de HPV presentes em tumores cervicais de pacientes brasileiras, e verificou a ocorrência de resultados HPV-negativos pelos testes moleculares, procurando investigar as causas de possíveis falhas dos testes. Além disso, padronizou e avaliou uma reação de PCR em tempo real capaz detectar o DNA do HPV-16 e 18 no plasma das pacientes. Foram incluídas no estudo 104 pacientes com diagnóstico confirmado de câncer cervical atendidas em três hospitais oncológicos do Estado de São Paulo, ICESP, IBCC e HC-Barretos, no período de novembro de 2009 a julho de 2011. Foram coletados um fragmento do tumor cervical e sangue total. O DNA extraído dos tumores foi submetido a genotipagem do HPV por meio da utilização dos kits Linear Array HPV Genotyping Test (LA) e PapilloCheck®, além de PCRs tipo específicas para HPV-16, 18 e 45. Amostras que apresentaram resultado HPV-negativo no PapilloCheck®, tiveram parte da região E1 seqüenciada para verificar potenciais causas do resultado falso-negativo. A amostra de plasma das pacientes que apresentavam HPV-16 e/ou 18 no tecido tumoral foi submetida à PCR em tempo real para avaliar a presença do DNA do HPV no plasma. Das 104 amostras de tecido tumoral, 103 foram positivas para HPV, sendo que os HPV-16 e 18, como infecção simples, foram os encontrados com maior freqüência (48,5%). Os testes LA e PapilloCheck® apresentaram 65,4% de concordância total. O PapilloCheck® apresentou 12,5% de resultados falso-negativos (N=13). A principal hipótese para explicar esses resultados é a presença de mutações na região de hibridização dos iniciadores e/ou das sondas. A reação de PCR em tempo real específica para HPV-16 e 18 padronizada no estudo apresentou baixa sensibilidade, mas alta especificidade e não deve ser utilizada como teste diagnóstico para o câncer cervical. A relação entre DNA de HPV no plasma e o prognóstico da paciente deve ser explorada no futuro / Invasive cervical cancer is the second most common cancer among women worldwide and screening programs are based on microscopical examination of cells exfoliated from the cervical mucosa, the Papanicolaou test. Since the infection by an oncogenic HPV (HR-HPV) has been shown to be necessary for the development of this neoplasia, molecular assays are being evaluated for the same application, primary screening. Indeed, recent studies showed these methods to be more sensitive and therefore are replacing the cytological test in many countries. Post treatment surveillance of invasive cervical cancer patients are made by unspecific tests as imaging exams. Hence, the development of a specific non invasive test able to detect premature recurrence is desired. This study investigated the HPV frequency and types on invasive cervical tumors among Brazilian patients observing the occurrence of HPV-negative results on molecular tests, trying to addrees the causes for the putative failures. Moreover, we standardized and evaluated a real time PCR method for HPV-16 and 18 DNA detection on patients plasma. One hundred and four women with invasive cervical cancer were recruited in three oncologic hospitals from São Paulo State, ICESP, IBCC and HCBarretos, in between November 2009 and July 2011. Tumor tissue and whole blood were collected. DNA extracted from the tumors were submitted to HPV detection and genotyping tests such as the Linear Array HPV Genotyping Test (LA) and PapilloCheck®, besides type specific PCRs for HPV-16, 18 e 45. Samples that showed an HPV-negative result on the PapilloCheck® were submitted to direct sequencing of E1 region to verify potential mismatches responsible for that. Plasma samples from patients with tumor tissue positive for HPV-16 and/or 18 were submitted to the real time PCR to evaluate the HPV DNA presence on plasma. Out of 104 cervical carcinomas, 103 were HPV positive, HPV-16 and 18, as single infection, were the most frequent types observed (48.5%). LA and PapilloCheck® showed 65.4% of total agreement. PapilloCheck® displaied 12.5% of false-negative results (N=13). The major hypothesis to explain these results is the presence of mismatches to the primers and/or probes annealing regions. Real time PCR specific for HPV-16 and 18 developed in this study showed low sensitivity, but a high specificity and cannot be used as an invasive cervical cancer diagnostic tool. The relationship between the presence of HPV DNA in the plasma and the patient prognostic shall be evaluated in the future

Infecções pelos Papilomavirus Humanos (HPVs) estão relacionadas com uma série de malignidades nas regiões genitais, anais e recentemente a uma parcela dos tumores na região da cabeça e pescoço. Enquanto muito já fora explorado a respeito dessas infecções em mulheres, os fatores de risco virais e epidemiológicos para persistência da infecção e desenvolvimento de lesão em homens ainda estão sendo estabelecidos. Dessa forma, em meados de 2005, começou o Estudo HIM (HPV in men), um estudo multicêntrico envolvendo 4200 homens que tem como principal objetivo um melhor entendimento da história natural das infecções por esses vírus nessa população. Sabe-se que um importante evento no processo neoplásico em lesões do colo do útero é a integração do DNA viral no genoma da célula hospedeira. Embora o mecanismo de integração ainda não esteja claro, parece haver uma relação da progressão da doença com o aumento da proporção de lesões com genomas na forma integrada. Diante do exposto, o objetivo desse trabalho foi explorar as metodologias baseadas em PCR (convencional e em tempo real) e de sequenciamento de última geração (NGS) para verificar integração do DNA viral nas células de esfregaços genitais, do canal anal e cavidade oral de homens assintomáticos participantes do Estudo HIM. Além disso, teve como objetivo secundário verificar a carga viral nos diferentes sítios anatômicos. Foram inicialmente incluídas 125 amostras das quais 56 puderam ser incluídas nas análises de integração pela metodologia baseada em PCR e 90 amostras foram selecionadas para os ensaios de carga viral. Dentre as amostras testadas pela metodologia de PCR para integração, 11 foram desafiadas pela metodologia baseada em sequenciamento. Entre as 11 amostras sequenciadas, encontramos concordância entre os resultados em apenas 3 e isso pode ser atribuído à sensibilidade diferencial das metodologias diante de baixas cargas virais. Entre as amostras testadas pela metodologia baseada em PCR pudemos verificar que 30,4% das amostras apresentavam-se na forma puramente epissomal, 10,7% na forma puramente integrada e 58,9% das amostras apresentam as duas formas virais (classificadas como mistas). A amostra que se confirmou integrada pela metodologia de sequenciamento apresentou integração em 4 pontos do DNA humano com a ruptura no gene viral E2, conforme amplamente relatado na literatura. Grande variação na carga viral foi encontrada entre as amostras (0,00008 a 4200 cópias/célula), e isso se mostrou diretamente relacionado com as limitações das metodologias para verificar integração. Embora outras relações não puderam ser verificadas em nosso estudo pelo limitado número de amostras analisadas até o momento, estes dados ampliados poderão responder se a carga viral e integração seriam um fator de risco para a persistência da infecção ou o desenvolvimento de lesão em homens. / Human Papillomavirus (HPV) infections are associated with a range of malignancies in the genital and anal regions and recently, with an appreciable number of head and neck tumors. While much has been explored about these infections in women, viral and epidemiological risk factors for persistent infection and lesions development in men are still being established. Thus, in mid-2005, a multicenter study entitled HIM study (HPV in men) - involving 4200 men - which aims at a better understanding of the natural history of infection by these viruses in this population, was started. It is known that a key event in the transformation process in cervical lesions is the integration of viral DNA into the host cell genome. Although the integration mechanism is not yet clear, there seems to be a relationship of the disease progression with an increase of the proportion of lesions with integrated viral genomes. In view of the above, the aim of this study was to explore the methodologies based on PCR (conventional and real-time) and next-generation sequencing (NGS) to verify integration of viral DNA into cells from genital swabs, anal canal and oral cavity of asymptomatic men participating in the HIM study. Furthermore, the secondary objective was to verify the viral load in cells from different anatomical sites. Initially, 125 samples were selected of which 56 could be included in integration tests with the methodology based on PCR and 90 samples were selected for viral load determination. Of the samples tested by PCR method for integration, 11 were subjected DNA sequencing. We found correlation between the results in only 3 of the 11 samples and this can be attributed to the methodologies\' differential sensitivity to low viral loads. Among the samples tested by PCR-based methodology, we observed that 30.4% of the samples harbored purely episomal viral DNA, 10.7% were integrated and 58.9% of the samples showed the two viral forms (classified as mixed). The sample which was confirmed as integrated by sequencing presented integration into 4 human DNA points with the breakpoint within the E2 viral gene, as widely reported in literature. Large variation in viral load was observed among the samples (0.00008 to 4200 copies / cell), and this was shown to be directly related to the limitations of the methods used to verify integration. Evaluation of a larger number of samples may contribute to define the role of HPV DNA integration as a risk factor for the persistence of HPV infection or development of lesions in men.

O HPV tem sido relacionado a diversos tipos de câncer, inclusive o cervical e o retinoblastoma. Este trabalho visa estudar a atividade viral pelo perfil clastogênico e expressão protéica em mulheres e crianças atendidas em Pernambuco. Amostras cervicais, de sangue periférico e retinoblastomas foram analisadas, sendo trinta e quatro mulheres e 7 crianças avaliadas. A detecção viral foi realizada por PCR e o HPV foi detectado em 29 mulheres (85,3%), com o tipo HPV-16 mais frequente. Através da imunoistoquímica e hibridização foi possível detectar o HPV em 6 crianças e as proteínas E1+E4, L1 e E6 foram evidenciadas nos tecidos em diversas regiões do olho, sugerindo atividade viral na amostra. Além disso, danos no material genético de mulheres com HPV foram envidenciados pelo ensaio cometa, sendo encontrada uma diferença estatística significante entre linfócitos em cultura de pacientes HPV-positivas comparadas àquelas HPV-negativas. Os dados trazem questionamentos sobre a presença de HPVs oncogênicos em tumores infantis e sua possível transmissão e mais evidências sobre os danos observados no DNA dos hospedeiros como consequência da presença e atividade virais. / HPV has been linked to several cancers, including cervical and retinoblastoma. This work aims at to verify the viral activity by clastogenic profile and protein expression in women and children served in Pernambuco. Cervical samples, retinoblastomas and peripheral blood were analyzed, being thirty-four women and 7 children evaluated. Viral detection was performed by PCR and HPV was detected in 29 women, being the most frequent HPV-16. Through hybridization and immunohistochemistry analysis was possible to detect HPV in 6 children and E1+E4, L1 and E6 proteins were highlighted in the tissues in various parts of the eye, suggesting viral activity in the sample. In addition, damage to the genetic material of women with HPV have been showed by the Comet assay and found a significant statistical difference between lymphocytes in culture of HPV-positive patients compared to those HPV-negative. The data bring questions about the presence of oncogenic HPV in tumors and its possible transmission and more evidence about the damage observed in the DNA of the host as a result of the presence and viral activity.