O folículo ovariano é composto pelo oócito (gameta feminino) e por várias camadas de células foliculares somáticas, sendo que destas, as mais intimamente associadas com o oócito são as células do cumulus oophorus (CCs), as quais estão em contato direto com o gameta feminino e formam o complexo cumulus-oócito (CCO), e as células murais da granulosa (CGs), que revestem a parede do folículo ovariano. Visto que estas CGs e CCs são facilmente acessadas durante tratamentos de reprodução assistida (RA), que podem ser coletadas sem comprometimento do oócito e que são descartadas após a recuperação do oócito é possível que elas sejam utilizadas em pesquisas que visam elucidar a fisiologia ovariana. No entanto, quando recuperadas, nos ciclos de reprodução assistida, estas células se encontram em um estado luteinizado, devido ao tratamento hormonal que as pacientes realizam. Sabe-se que o uso de CGs luteinizadas em cultura celular para o estudo do processo molecular ovulatório é limitado visto esta prévia exposição celular às gonadotrofinas e ao seu estado luteinizado. Porém, foi demonstrado que CGs luteinizadas podem readquirir sua capacidade de resposta à estimulação por gonadotrofinas, recuperando características semelhantes às daquelas de folículos não luteinizados nos estágios iniciais de diferenciação (early antral não luteinizado). A estimulação destas células com FSH causa aumento na expressão de genes que caracterizam CGs típicas de folículos pré-ovulatórios (pré-ovulatório não luteinizado). Ainda, outra questão importante com relação ao folículo ovariano diz respeito à ação dos androgênios nesta estrutura ovariana, sendo que já se sabe que a ativação do receptor de androgênio, localizado nas células foliculares, é capaz de modular a expressão e a atividade de genes importantes para a manutenção do desenvolvimento do folículo ovariano. Desta forma, sugere-se que o efeito reprodutivo do tratamento com dehidroepiandrosterona (DHEA) e seu sulfato (SDHEA), importantes androgênios, pode ser devido às suas ações justamente no microambiente folicular. Portanto, o objetivo deste trabalho foi analisar a exposição de células foliculares desluteinizadas (estágios early antral e pré-ovulatório) ao SDHEA. Para isto, células da granulosa e do cumulus foram obtidas de pacientes submetidas à fertilização in vitro e foram cultivas separadamente. Inicialmente, fez-se a determinação do melhor tempo de cultivo deste modelo celular proposto, dentre 6, 8 ou 10 dias de cultivo. As análises de viabilidade celular realizadas mostraram que o melhor tempo para o cultivo primário folicular, para as próximas etapas do trabalho, seria de oito dias. Após, também por análises de viabilidade celular, a melhor dose de SDHEA para exposição às células foliculares foi determinada dentre cinco doses testadas em comparação a um controle sem exposição hormonal. As análises mostraram que a dose mais adequada a ser utilizada era a dose de 0,08 μM de SDHEA. Posteriormente, tendo definido o melhor tempo de cultivo e a dose ideal de exposição das células em questão ao SDHEA, os experimentos foram realizados com dois grupos experimentais distintos: células early antral não luteinizadas e células pré-ovulatórias não luteinizadas – expostas ao FSH. Ambos os grupos foram divididos em dois subgrupos: grupo controle (sem exposição hormonal) e grupo SDHEA (com exposição ao SDHEA). Foram feitas dosagens hormonais de SDHEA, de estradiol e de progesterona nos dias 1, 4, 6 e 8 do sobrenadante do cultivo celular. A análise ao longo do tempo mostrou que os valores das dosagens de SDHEA se mantiveram constantes no grupo controle durante todo o período de cultivo celular, não havendo diferença estatística entre as quatro dosagens hormonais feitas neste grupo. Por outro lado, no grupo tratado houve diferença nos valores deste hormônio nos dias 6 e 8, em comparação aos dias 1 e 4, devido justamente ao tratamento com SDHEA realizado neste grupo experimental. Com relação ao estradiol, independente do tipo celular e do estágio de desenvolvimento, foi possível ver que a sua secreção era elevada no primeiro dia de cultivo, diminuindo nos outros dias devido às condições e ao tempo de cultivo do protocolo de desluteinização celular. Além disso, as células tratadas com SDHEA apresentaram uma secreção de estradiol superior àquelas não tratadas. Por fim, as dosagens de progesterona revelaram que o tratamento com SDHEA não alterou a secreção deste hormônio pelas células, em nenhum dos dois estágios de desenvolvimento. Ainda, as células apresentaram uma secreção aumentada de progesterona no sexto dia de cultivo celular em comparação ao primeiro e ao quarto dia; porém, esta secreção começou a diminuir quando do oitavo dia de cultivo. Tendo em vista os resultados obtidos, podemos concluir que o tratamento com SDHEA é capaz de aumentar a secreção de estradiol de células foliculares não luteinizadas, não alterando a secreção de progesterona dessas mesmas células. Mais estudos são necessários para um melhor entendimento dos efeitos do SDHEA nos processos que compõem a foliculogênese. / Ovarian follicle is formed by the oocyte (female gamete) and somatic follicular cells. Those closer to the oocyte are cumulus oophorus cells (CCs), which are in direct contact with the female gamete, and the granulosa mural cells (GCs), which form the wall of the ovarian follicle. As GCs and CCs are easily accessed during assisted reproduction procedures and are discarded after oocyte retrieval, they can be used in research aimed at elucidating ovarian physiology. However, when recovered in assisted reproduction cycles, these cells are in a luteinized state due patient hormonal treatment. It is known that the use of luteinized GCs to study the molecular ovulatory process is limited due to this prior cellular exposure to gonadotrophins and their luteinized state. However, luteinized CGs have been shown to reacquire similar characteristics to those of non-luteinized follicles in early stages of differentiation (non-luteinized early antral). Stimulation of these cells with follicle stimulating hormone (FSH) increases expression of genes that characterize CGs typical of pre ovulatory follicles (non-luteinized pre ovulatory). Another important question regarding the ovarian follicle relates to androgens action in this ovarian structure. As it is known, androgen receptor activation, located in follicular cells, is able to modulate expression and activity of important genes for the maintenance of ovarian follicle development. Thus, authors suggest that the reproductive effect of dehydroepiandrosterone (DHEA) and their sulfate (SDHEA) treatment, important androgens, may be due their actions precisely in the follicular microenvironment. Consequently, the aim of this work was to analyze the exposure to SDHEA of non-luteinized follicular cells (early antral and pre-ovulatory stages). Granulosa and cumulus cells were obtained from patients submitted to in vitro fertilization and were separately cultivated. Initially, the best culture time of this proposed cellular model was determined among 6, 8 or 10 days of culture. Cellular viability analysis showed that primary follicular culture for the next steps of the study would be of 8 days. Thereafter, cellular viability assays were used to determine the best SDHEA dose among 5 doses to follicular cells exposure in comparison to a control without hormonal exposure. The analysis showed that the best dose to use was 0,08 μM of SDHEA. Subsequently, after defined the best culture time and the ideal exposure dose of the cells to SDHEA, experiments were performed with two different experimental groups: non-luteinized early antral cells and non-luteinized pre ovulatory cells – exposed to FSH. Both groups were divided in two subgroups: control group (no hormonal exposure) and SDHEA group (with SDHEA exposure). SDHEA, estradiol and progesterone hormonal dosages of the cell culture supernatant were done on days 1, 4, 6 and 8. Over time analysis revealed that SDHEA values were constant in control group during all the cell culture period, without statistical difference between the four hormonal dosages performed in this group. However, treated group showed a difference in the values of this hormone on days 6 and 8, compared to days 1 and 4, due to treatment with SDHEA of these experimental group . Regarding estradiol, independent of cell type and stage of development, it was possible to see that its secretion was high on the first day of culture, decreasing in others due to conditions and time of culture of the non-luteinized cells protocol. In addition, the SDHEA treated cells presented higher estradiol secretion than those not treated. Finally, progesterone dosages revealed that treatment with SDHEA did not alter this hormone secretion from the cells in either of the two development stages. Besides that, the cells had an increased progesterone secretion on the sixth cell culture day compared to first and fourth day; however, this secretion began to decrease on the eight day of culture. In conclusion, SDHEA treatment is able to increases the non-luteinized follicular cells secretion of estradiol, but it is not able to modify the progesterone secretion of the same cells. More studies are needed to better understand the effects of SDHEA on the process that make part of folliculogenesis.

A desidroepierosterona (DHEA) é um hormônio esteroide produzido pelas glândula adrenal e gônadas em humanos. Diversas evidencias do efeitos anti-obesidade, antiinflamatórios e antioxidativos, além de ser precursor dos esteroides sexuais. No presente trabalho foi avaliando o efeito do DHEA sobre a citotoxicidade induzida 0,5mM de palmitato em miotubos L6, usando 2 concentrações distintas para o esteroide, uma próxima à fisiológica (10nM) e outra supra-fisiológica (100nM) por 12h. Foram avaliados parâmetros: viabilidade celular, apoptose, vias intracelulares envolvidas na apoptose, no estresse de retículo endoplasmatico e estado de estresse oxidativo. Os resultados obtidos foram, para ambas as concentrações de DHEA a redução do estresse de reticulo induzido por palmitato via Perk/eif2α/CHOP. Além disso o DHEA impediu o aumento da expressão de iNOS e de proteína nitradas induzidas por palmitato. A partir dos resultados concluímos que o DHEA, tem efeitos anti-apoptótico e regulador da UPR. Alem do DHEA ter sido eficaz na redução do estresse oxidativo. / Dehydroepierosterone (DHEA) is a steroid hormone produced by the adrenal gland and gonads in humans. Several evidences of the antiobesity, anti-inflammatory and antioxidative effects, besides being precursor of the sexual steroids. In the present study, the effect of DHEA on the 0.5mM induced cytotoxicity of palmitate in L6 myotubes was evaluated, using 2 different concentrations for the steroid, one physiological (10nM) and one supra-physiological (100nM) for 12h. The following parameters were evaluated: cell viability, apoptosis, intracellular pathways involved in apoptosis, endoplasmic reticulum stress and oxidative stress state. The results obtained were, for both concentrations of DHEA, reduction of the stress of reticulo induced by palmitato via Perk / eif2α / CHOP. In addition, DHEA prevented increased expression of iNOS and nitrite protein induced by palmitate. From the results we conclude that DHEA has anti-apoptotic and UPR regulatory effects. In addition to DHEA, it has been effective in reducing oxidative stress.

Dehidroepiandrosterona (DHEA) é um hormônio esteroide secretado pelas glândulas adrenais, gônadas e cérebro, que juntamente com sua forma sulfatada (DHEAS) constituem os esteroides mais abundantes da circulação. É um importante precursor para hormônios sexuais e exerce funções diretas sob diversos sistemas do corpo, dentre eles, o sistema imune. A relação entre sistema endócrino e imune já é bem estabelecida, tendo hormônios a capacidade de modular a resposta imune e vice-versa. Dentre os componentes da resposta imune, estão os neutrófilos, importantes células da imunidade inata que reconhecem e eliminam patógenos através de diversos mecanismos efetores como fagocitose, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), desgranulação, neutrophil extracellular traps (NETs). Já é descrito que o avanço da idade é acompanhado pela redução dos níveis plasmáticos de DHEA, assim como a redução da atividade efetora de neutrófilo, podendo estes dois mecanismos estarem relacionados com estado de senescência e aumento da suscetibilidade de idosos à infecções. Porém, poucos estudos existem mostrando relação entre DHEA e neutrófilos. Desta forma, o objetivo do nosso trabalho, foi avaliar a influência do hormônio DHEA nas diversas funções efetoras de neutrófilos. Para tanto, neutrófilos humanos isolados do sangue periférico foram submetidos a um pré-tratamento com DHEA e infectado com Salmonella enterica serovar Typhimurium ou estimulados com LPS. Observamos que o tratamento prévio dos neutrófilos com 0,01 ?M de DHEA é capaz aumentar a fagocitose da S. Typhimurium, assim como aumento da atividade microbicida destas células. Para investigar o mecanismo pelos quais a capacidade microbicida foi aumentada, avaliamos a produção de EROs e formação de NETs. Curiosamente o hormônio não influenciou em nenhum destes processos. Então, por fim, avaliamos o perfil de produção de citocinas in vitro produzidas pelos neutrófilos tratados com DHEA e infectados com S. Typhimurium ou estimulados com LPS (lipopolissacarídeo). Nosso estudo mostrou que os neutrófilos infectados ou estimulados reduzem a produção de quimiocinas como IL-8, MIP-1? e MIP-1?, quando comparados aos neutrófilos sem tratamento. Em adição, neutrófilos tratados com esteroide e estimulados com LPS tiveram a produção de TNF-? reduzida, a produção da IL-4 foi aumentada nos neutrófilos tratados com DHEA e infectados e a relação entre IFN-?/IL-4 foi reduzida. Nossos dados mostram que o DHEA pode estar contribuindo para o controle da infecção por S. Typhimurium, principalmente através da fagocitose e killing intracelular. Apesar dos dados de citocinas mostrarem que o DHEA está direcionando a resposta de neutrófilos para um caráter menos inflamatório, acreditamos que este possa ser um mecanismo protetor ao organismo, a fim de evitar uma resposta inflamatória exacerbada que poderia causar lesões teciduais. Concluímos então, que o DHEA é um importante esteroide com atividades imunorreguladoras que podem estar contribuindo para o controle da infecção por S. Typhimurium, porém mais estudos são necessários para o entendimento dos mecanismos utilizados por este esteroide para modular a resposta de neutrófilos, células tão importantes ao organismo humano. / Dehydroepiandrosterone (DHEA) is a steroid hormone secreted by the adrenal glands, gonads and brain, which along with its sulfated form (DHEAS) are the most abundant circulating steroid. It is an important precursor to sex hormones and exerts direct roles in several body systems, including the immune system. The relationship between the endocrine and immune system is already well established, with the hormone modulating the immune response and vice versa. Among the components of the immune response, neutrophils are important innate immunity cells that recognize and eliminate pathogens through various effector mechanisms such as phagocytosis, production of reactive oxygen species (ROS), degranulation, neutrophil extracellular traps (NETs). It is reported that advanced age is accompanied by the reduction of plasma levels of DHEA as well as the reduction of the effector activity of neutrophils, these two mechanisms may be related to the state of senescence and increase in susceptibility of the elderly to infections. However, few studies exist showing the relationship between DHEA and neutrophils activity. Thus, the aim of our study was to evaluate the influence of the hormone DHEA in the several effector functions of neutrophils. To that end, human neutrophils isolated from peripheral blood were subjected to a treatment with DHEA and infected with Salmonella enterica serovar Typhimurium or stimulated with LPS (lipopolysaccharide). We observed that the treatment of neutrophils with 0.01 ?M of DHEA can increase phagocytic rates of S. Typhimurium, as well as increase the microbicidal activity of these cells. To investigate the mechanism by which the microbicidal capacity has been increased, we evaluated the production of ROS and formation of NETs. Interestingly the hormone did not influence in any of these processes. Then, we finally evaluated in the cytokine production profile produced by neutrophils treated in vitro with DHEA and infected with S. Typhimurium or stimulated with LPS. Our study showed that pré-treated and infected neutrophils or LPS-stimulated cells reduced the production of chemokines such as IL-8, MIP-1? and MIP-1? compared to untreated neutrophils. In addition, when steroid treated neutrophils were stimulated with LPS, a reduced TNF-? production was observed and the levels of IL-4 was increased in treated neutrophils with DHEA and infected with S. Typhimurium. The ratio of IFN-? / IL-4 was reduced. Our data show that DHEA may be contributing to the control of infection by S. Typhimurium, mainly by phagocytosis and intracellular killing. Although cytokines data show that DHEA is directing the neutrophil response to a less inflammatory response, and we believe that this may be a protective mechanism of the organism in order to avoid an exacerbated inflammatory response that could cause tissue damage to the body. We conclude then, that DHEA is a steroid with important immunoregulatory activities that may be contributing to the control of infection by S. typhimurium, but more studies are needed to understand the mechanisms used by this steroid to modulate neutrophil response, cells so important to the human body.

As Doenças inflamatórias intestinais (DII) são multifatoriais e sua etiologia envolve susceptibilidade genética, fatores ambientais, disbiose e ativação exacerbada do sistema imunológico no intestino. Essas doenças também tem sido relacionadas a baixos níveis de dehidroepiandrosterona (DHEA), um hormônio precursor de diversos esteroides e relacionado à modulação das respostas imunes. Porém, os mecanismos precisos que relacionam as ações deste hormônio com a proteção ou susceptibilidade à doença de Crohn ou colite ulcerativa ainda não são totalmente conhecidos. Sendo assim, este projeto buscou entender o papel imunomodulador do DHEA exógeno in vitro e in vivo durante a inflamação intestinal experimental induzida por dextran sulfato de sódio (DSS) em camundongos C57BL/6. Inicialmente, in vitro, DHEA inibiu a proliferação de células do baço de forma dose dependente nas concentrações de 5?M, 50?M ou 100?M, com diminuição da produção de IFN-?. Este hormônio não foi tóxico para células de linhagem mieloide, embora tenha causado necrose em leucócitos nas doses mais elevada (50 ?M e 100?M), o que pode ter influenciado a diminuição das citocinas in vitro. Nos ensaios in vivo, os camundongos tratados com DHEA (40 mg/Kg) foram avaliados na fase de indução da doença (dia 6) e durante o reparo tecidual, quando os animais expostos ao DSS e ao DHEA por 9 dias foram mantidos na ausência destas drogas até o dia 15. Houve diminuição do escore pós-morte, melhora no peso e nos sinais clínicos da inflamação intestinal, com redução de monócitos no sangue periférico com 6 dias e aumento de neutrófilos circulantes na fase de reparo tecidual (15 dias). Ainda, a suplementação com DHEA levou à redução da celularidade da lâmina própria (LP) e ao restabelecimento do comprimento normal do intestino. O uso deste hormônio também diminuiu a expressão do RNAm de IL-6 e TGF-?, enquanto aumentou a expressão de IL-13 no colón dos animais durante a fase de indução da doença, o que provavelmente ajudou na atenuação da inflamação intestinal. Além disso, houve acúmulo de linfócitos CD4+ e CD8+ no baço e diminuição apenas de linfócitos CD4+ nos linfonodos mesentéricos (LNM), indicando retenção das células CD4+ no baço após uso do DHEA. O tratamento foi também capaz de aumentar a frequência de células CD4 produtoras de IL-4 e diminuir CD4+IFN-?+ no baço, além de reduzir a frequência de CD4+IL-17+ nos LNM, sugerindo efeito do DHEA no balanço das respostas Th1/Th2/Th17 relacionadas à colite. Em adição, as células de baço dos animais tratados com DHEA e expostos ao DSS se tornaram hiporresponsivas, como visto pela diminuição da proliferação após re-estímulos in vitro. Finalmente, DHEA foi capaz de atuar no metabolismo dos camundongos tratados, levando à diminuição de colesterol total e da fração LDL no soro durante a fase de indução da doença, sem gerar quaisquer disfunções hepáticas. Com isso, podemos concluir que o DHEA atua por meio do balanço das respostas imunes exacerbadas, minimizando os danos locais e sistêmicos causados pela inflamação intestinal induzida por DSS. / Inflammatory bowel diseases (IBD) are multifactorial diseases whose etiology involves genetic susceptibility, environmental factors, dysbiosis and exacerbated activation of the immune system in the gut. These diseases have also been associated to lower levels of dehydroepiandrosterone (DHEA), a precursor of various steroid hormones, related to modulation of immune responses. However, the precise mechanisms that link the actions of this hormone with protection or susceptibility to Crohn\'s disease or ulcerative colitis are still not fully understood. Thus, this project aimed to understand the immunomodulatory role of exogenous DHEA in vitro and in vivo in experimental intestinal inflammation induced by dextran sodium sulfate (DSS) in C57BL/6 mice. Initially, in vitro, DHEA inhibited the proliferation of spleen cells in a dose dependent way on the concentrations of 5?M, 50?M and 100?M, with decreased production of IFN-?. This hormone was not toxic to myeloid lineage cells, although it caused necrosis of leukocytes at the highest doses (50?M and 100?M), which may have influenced the decrease of the cytokines in vitro. Mice treated with DHEA (40 mg / kg) were evaluated at the induction phase of the disease (day 6) and during tissue repair, when animals exposed to DSS and DHEA for 9 days were maintained in the absence these drugs until the day 15. There was decrease of postmortem score, improved weight and clinical signs of intestinal inflammation, besides reduced peripheral blood monocytes on day 6, together with an increase in circulating neutrophils in tissue repair phase (15 days). Supplementation with DHEA also led to a reduction in cellularity of the lamina propria (LP) and to the restoration of normal length of the gut. The use of this hormone also decreased the expression of of IL-6 and TGF-? mRNA, while IL-13 was augmented in the colon of mice during the induction phase of the disease, a fact probably related to attenuation of intestinal inflammation. Furthermore, there was accumulation of CD4+ and CD8+ cells in the spleen along with decreased CD4+ leukocytes in mesenteric lymph nodes (MLN), indicating retention of CD4+ cells in the spleen after use of DHEA. The treatment was also able to increase the frequency of CD4+ cells producing IL-4 and decrease CD4+IFN-?+ in spleen, with reduced frequency of CD4+IL-17+ in the MLN, suggesting a role for DHEA on the balance of Th1/Th2/Th17 responses related colitis. In addition, splenocytes of mice treated with DHEA and exposed to DSS became hiporresponsives as seen by decreased proliferation after re-stimulation in vitro. Finally, DHEA was able to act on the metabolism of treated mice, leading to decreased total cholesterol and LDL cholesterol in serum during the induction phase of the disease, without generating any liver dysfunction. Thus, we concluded that DHEA acts by balancing the exacerbated immune responses, minimizing local and systemic damages caused by intestinal inflammation induced by DSS.

Industrial chemicals known as polychlorinated biphenyls (PCBs) were widely used for decades until their production was banned worldwide due to their persistence and toxicities to humans and other animals. Upon oxidative metabolism by cytochrome P450, hydroxylated metabolites of PCBs (OHPCBs) are formed. OHPCBs have been shown to competitively displace thyroxine from transthyretin, block normal hormonal activity, and inhibit phenol or family 1 sulfotransferases (SULTs) which catalyze sulfation of thyroid hormones and estrogens. Recently, three OHPCBs were shown to also interact with hydroxysteroid or family 2 sulfotransferases that play a role in the homeostasis of steroid hormones such as dehydroepiandrosterone (DHEA). The objectives of the studies presented in this thesis were to further examine the effects of selected OHPCBs on the activity of human hydroxysteroid sulfotransferase (hSULT2A1), to develop a three-dimensional quantitative structure activity relationship (3D-QSAR) model for OHPCBs as inhibitors of DHEA-sulfation catalyzed by this enzyme, and to investigate the mechanism of inhibition and binding of OHPCBs to hSULT2A1. All 15 OHPCBs examined inhibited the sulfation of 1 μ M [3H] DHEA, catalyzed by hSULT2A1 with IC50 values ranging from 0.6 to 96 μ M. The OHPCBs with a 3, 5-dichloro-4-hydroxy substitution were the most potent inhibitors of DHEA sulfation, and they were also shown to be substrates for hSULT2A1. Eight OHPCBs were substrates for hSULT2A1, and seven were solely inhibitors (i.e. they inhibited the sulfation of DHEA, yet they were not themselves sulfuryl-acceptors in hSULT2A1-catalyzed reactions). A 3D-QSAR model was developed utilizing comparative molecular field analysis (CoMFA). The model fit the data well and also had good predictability. The kinetics of inhibition showed that these OHPCBs were noncompetitive inhibitors of hSULT2A1. Binding studies utilizing the displacement of a fluorescent probe, 8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid, revealed that several of the OHPCBs interact either at more than one binding site or with more than one enzyme conformation. Further exploration of this binding by molecular modeling showed that OHPCBs bind similarly to different conformations of the enzyme. This work has helped in our understanding of the roles of sulfotransferases in the metabolism and toxicities of OHPCBs, and it opens new avenues for future work.

Thesis (M.D) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2007. / Vita. Bibliography: pp. 35-37.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2007. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 91-106).

O folículo ovariano é composto pelo oócito (gameta feminino) e por várias camadas de células foliculares somáticas, sendo que destas, as mais intimamente associadas com o oócito são as células do cumulus oophorus (CCs), as quais estão em contato direto com o gameta feminino e formam o complexo cumulus-oócito (CCO), e as células murais da granulosa (CGs), que revestem a parede do folículo ovariano. Visto que estas CGs e CCs são facilmente acessadas durante tratamentos de reprodução assistida (RA), que podem ser coletadas sem comprometimento do oócito e que são descartadas após a recuperação do oócito é possível que elas sejam utilizadas em pesquisas que visam elucidar a fisiologia ovariana. No entanto, quando recuperadas, nos ciclos de reprodução assistida, estas células se encontram em um estado luteinizado, devido ao tratamento hormonal que as pacientes realizam. Sabe-se que o uso de CGs luteinizadas em cultura celular para o estudo do processo molecular ovulatório é limitado visto esta prévia exposição celular às gonadotrofinas e ao seu estado luteinizado. Porém, foi demonstrado que CGs luteinizadas podem readquirir sua capacidade de resposta à estimulação por gonadotrofinas, recuperando características semelhantes às daquelas de folículos não luteinizados nos estágios iniciais de diferenciação (early antral não luteinizado). A estimulação destas células com FSH causa aumento na expressão de genes que caracterizam CGs típicas de folículos pré-ovulatórios (pré-ovulatório não luteinizado). Ainda, outra questão importante com relação ao folículo ovariano diz respeito à ação dos androgênios nesta estrutura ovariana, sendo que já se sabe que a ativação do receptor de androgênio, localizado nas células foliculares, é capaz de modular a expressão e a atividade de genes importantes para a manutenção do desenvolvimento do folículo ovariano. Desta forma, sugere-se que o efeito reprodutivo do tratamento com dehidroepiandrosterona (DHEA) e seu sulfato (SDHEA), importantes androgênios, pode ser devido às suas ações justamente no microambiente folicular. Portanto, o objetivo deste trabalho foi analisar a exposição de células foliculares desluteinizadas (estágios early antral e pré-ovulatório) ao SDHEA. Para isto, células da granulosa e do cumulus foram obtidas de pacientes submetidas à fertilização in vitro e foram cultivas separadamente. Inicialmente, fez-se a determinação do melhor tempo de cultivo deste modelo celular proposto, dentre 6, 8 ou 10 dias de cultivo. As análises de viabilidade celular realizadas mostraram que o melhor tempo para o cultivo primário folicular, para as próximas etapas do trabalho, seria de oito dias. Após, também por análises de viabilidade celular, a melhor dose de SDHEA para exposição às células foliculares foi determinada dentre cinco doses testadas em comparação a um controle sem exposição hormonal. As análises mostraram que a dose mais adequada a ser utilizada era a dose de 0,08 μM de SDHEA. Posteriormente, tendo definido o melhor tempo de cultivo e a dose ideal de exposição das células em questão ao SDHEA, os experimentos foram realizados com dois grupos experimentais distintos: células early antral não luteinizadas e células pré-ovulatórias não luteinizadas – expostas ao FSH. Ambos os grupos foram divididos em dois subgrupos: grupo controle (sem exposição hormonal) e grupo SDHEA (com exposição ao SDHEA). Foram feitas dosagens hormonais de SDHEA, de estradiol e de progesterona nos dias 1, 4, 6 e 8 do sobrenadante do cultivo celular. A análise ao longo do tempo mostrou que os valores das dosagens de SDHEA se mantiveram constantes no grupo controle durante todo o período de cultivo celular, não havendo diferença estatística entre as quatro dosagens hormonais feitas neste grupo. Por outro lado, no grupo tratado houve diferença nos valores deste hormônio nos dias 6 e 8, em comparação aos dias 1 e 4, devido justamente ao tratamento com SDHEA realizado neste grupo experimental. Com relação ao estradiol, independente do tipo celular e do estágio de desenvolvimento, foi possível ver que a sua secreção era elevada no primeiro dia de cultivo, diminuindo nos outros dias devido às condições e ao tempo de cultivo do protocolo de desluteinização celular. Além disso, as células tratadas com SDHEA apresentaram uma secreção de estradiol superior àquelas não tratadas. Por fim, as dosagens de progesterona revelaram que o tratamento com SDHEA não alterou a secreção deste hormônio pelas células, em nenhum dos dois estágios de desenvolvimento. Ainda, as células apresentaram uma secreção aumentada de progesterona no sexto dia de cultivo celular em comparação ao primeiro e ao quarto dia; porém, esta secreção começou a diminuir quando do oitavo dia de cultivo. Tendo em vista os resultados obtidos, podemos concluir que o tratamento com SDHEA é capaz de aumentar a secreção de estradiol de células foliculares não luteinizadas, não alterando a secreção de progesterona dessas mesmas células. Mais estudos são necessários para um melhor entendimento dos efeitos do SDHEA nos processos que compõem a foliculogênese. / Ovarian follicle is formed by the oocyte (female gamete) and somatic follicular cells. Those closer to the oocyte are cumulus oophorus cells (CCs), which are in direct contact with the female gamete, and the granulosa mural cells (GCs), which form the wall of the ovarian follicle. As GCs and CCs are easily accessed during assisted reproduction procedures and are discarded after oocyte retrieval, they can be used in research aimed at elucidating ovarian physiology. However, when recovered in assisted reproduction cycles, these cells are in a luteinized state due patient hormonal treatment. It is known that the use of luteinized GCs to study the molecular ovulatory process is limited due to this prior cellular exposure to gonadotrophins and their luteinized state. However, luteinized CGs have been shown to reacquire similar characteristics to those of non-luteinized follicles in early stages of differentiation (non-luteinized early antral). Stimulation of these cells with follicle stimulating hormone (FSH) increases expression of genes that characterize CGs typical of pre ovulatory follicles (non-luteinized pre ovulatory). Another important question regarding the ovarian follicle relates to androgens action in this ovarian structure. As it is known, androgen receptor activation, located in follicular cells, is able to modulate expression and activity of important genes for the maintenance of ovarian follicle development. Thus, authors suggest that the reproductive effect of dehydroepiandrosterone (DHEA) and their sulfate (SDHEA) treatment, important androgens, may be due their actions precisely in the follicular microenvironment. Consequently, the aim of this work was to analyze the exposure to SDHEA of non-luteinized follicular cells (early antral and pre-ovulatory stages). Granulosa and cumulus cells were obtained from patients submitted to in vitro fertilization and were separately cultivated. Initially, the best culture time of this proposed cellular model was determined among 6, 8 or 10 days of culture. Cellular viability analysis showed that primary follicular culture for the next steps of the study would be of 8 days. Thereafter, cellular viability assays were used to determine the best SDHEA dose among 5 doses to follicular cells exposure in comparison to a control without hormonal exposure. The analysis showed that the best dose to use was 0,08 μM of SDHEA. Subsequently, after defined the best culture time and the ideal exposure dose of the cells to SDHEA, experiments were performed with two different experimental groups: non-luteinized early antral cells and non-luteinized pre ovulatory cells – exposed to FSH. Both groups were divided in two subgroups: control group (no hormonal exposure) and SDHEA group (with SDHEA exposure). SDHEA, estradiol and progesterone hormonal dosages of the cell culture supernatant were done on days 1, 4, 6 and 8. Over time analysis revealed that SDHEA values were constant in control group during all the cell culture period, without statistical difference between the four hormonal dosages performed in this group. However, treated group showed a difference in the values of this hormone on days 6 and 8, compared to days 1 and 4, due to treatment with SDHEA of these experimental group . Regarding estradiol, independent of cell type and stage of development, it was possible to see that its secretion was high on the first day of culture, decreasing in others due to conditions and time of culture of the non-luteinized cells protocol. In addition, the SDHEA treated cells presented higher estradiol secretion than those not treated. Finally, progesterone dosages revealed that treatment with SDHEA did not alter this hormone secretion from the cells in either of the two development stages. Besides that, the cells had an increased progesterone secretion on the sixth cell culture day compared to first and fourth day; however, this secretion began to decrease on the eight day of culture. In conclusion, SDHEA treatment is able to increases the non-luteinized follicular cells secretion of estradiol, but it is not able to modify the progesterone secretion of the same cells. More studies are needed to better understand the effects of SDHEA on the process that make part of folliculogenesis.

O folículo ovariano é composto pelo oócito (gameta feminino) e por várias camadas de células foliculares somáticas, sendo que destas, as mais intimamente associadas com o oócito são as células do cumulus oophorus (CCs), as quais estão em contato direto com o gameta feminino e formam o complexo cumulus-oócito (CCO), e as células murais da granulosa (CGs), que revestem a parede do folículo ovariano. Visto que estas CGs e CCs são facilmente acessadas durante tratamentos de reprodução assistida (RA), que podem ser coletadas sem comprometimento do oócito e que são descartadas após a recuperação do oócito é possível que elas sejam utilizadas em pesquisas que visam elucidar a fisiologia ovariana. No entanto, quando recuperadas, nos ciclos de reprodução assistida, estas células se encontram em um estado luteinizado, devido ao tratamento hormonal que as pacientes realizam. Sabe-se que o uso de CGs luteinizadas em cultura celular para o estudo do processo molecular ovulatório é limitado visto esta prévia exposição celular às gonadotrofinas e ao seu estado luteinizado. Porém, foi demonstrado que CGs luteinizadas podem readquirir sua capacidade de resposta à estimulação por gonadotrofinas, recuperando características semelhantes às daquelas de folículos não luteinizados nos estágios iniciais de diferenciação (early antral não luteinizado). A estimulação destas células com FSH causa aumento na expressão de genes que caracterizam CGs típicas de folículos pré-ovulatórios (pré-ovulatório não luteinizado). Ainda, outra questão importante com relação ao folículo ovariano diz respeito à ação dos androgênios nesta estrutura ovariana, sendo que já se sabe que a ativação do receptor de androgênio, localizado nas células foliculares, é capaz de modular a expressão e a atividade de genes importantes para a manutenção do desenvolvimento do folículo ovariano. Desta forma, sugere-se que o efeito reprodutivo do tratamento com dehidroepiandrosterona (DHEA) e seu sulfato (SDHEA), importantes androgênios, pode ser devido às suas ações justamente no microambiente folicular. Portanto, o objetivo deste trabalho foi analisar a exposição de células foliculares desluteinizadas (estágios early antral e pré-ovulatório) ao SDHEA. Para isto, células da granulosa e do cumulus foram obtidas de pacientes submetidas à fertilização in vitro e foram cultivas separadamente. Inicialmente, fez-se a determinação do melhor tempo de cultivo deste modelo celular proposto, dentre 6, 8 ou 10 dias de cultivo. As análises de viabilidade celular realizadas mostraram que o melhor tempo para o cultivo primário folicular, para as próximas etapas do trabalho, seria de oito dias. Após, também por análises de viabilidade celular, a melhor dose de SDHEA para exposição às células foliculares foi determinada dentre cinco doses testadas em comparação a um controle sem exposição hormonal. As análises mostraram que a dose mais adequada a ser utilizada era a dose de 0,08 μM de SDHEA. Posteriormente, tendo definido o melhor tempo de cultivo e a dose ideal de exposição das células em questão ao SDHEA, os experimentos foram realizados com dois grupos experimentais distintos: células early antral não luteinizadas e células pré-ovulatórias não luteinizadas – expostas ao FSH. Ambos os grupos foram divididos em dois subgrupos: grupo controle (sem exposição hormonal) e grupo SDHEA (com exposição ao SDHEA). Foram feitas dosagens hormonais de SDHEA, de estradiol e de progesterona nos dias 1, 4, 6 e 8 do sobrenadante do cultivo celular. A análise ao longo do tempo mostrou que os valores das dosagens de SDHEA se mantiveram constantes no grupo controle durante todo o período de cultivo celular, não havendo diferença estatística entre as quatro dosagens hormonais feitas neste grupo. Por outro lado, no grupo tratado houve diferença nos valores deste hormônio nos dias 6 e 8, em comparação aos dias 1 e 4, devido justamente ao tratamento com SDHEA realizado neste grupo experimental. Com relação ao estradiol, independente do tipo celular e do estágio de desenvolvimento, foi possível ver que a sua secreção era elevada no primeiro dia de cultivo, diminuindo nos outros dias devido às condições e ao tempo de cultivo do protocolo de desluteinização celular. Além disso, as células tratadas com SDHEA apresentaram uma secreção de estradiol superior àquelas não tratadas. Por fim, as dosagens de progesterona revelaram que o tratamento com SDHEA não alterou a secreção deste hormônio pelas células, em nenhum dos dois estágios de desenvolvimento. Ainda, as células apresentaram uma secreção aumentada de progesterona no sexto dia de cultivo celular em comparação ao primeiro e ao quarto dia; porém, esta secreção começou a diminuir quando do oitavo dia de cultivo. Tendo em vista os resultados obtidos, podemos concluir que o tratamento com SDHEA é capaz de aumentar a secreção de estradiol de células foliculares não luteinizadas, não alterando a secreção de progesterona dessas mesmas células. Mais estudos são necessários para um melhor entendimento dos efeitos do SDHEA nos processos que compõem a foliculogênese. / Ovarian follicle is formed by the oocyte (female gamete) and somatic follicular cells. Those closer to the oocyte are cumulus oophorus cells (CCs), which are in direct contact with the female gamete, and the granulosa mural cells (GCs), which form the wall of the ovarian follicle. As GCs and CCs are easily accessed during assisted reproduction procedures and are discarded after oocyte retrieval, they can be used in research aimed at elucidating ovarian physiology. However, when recovered in assisted reproduction cycles, these cells are in a luteinized state due patient hormonal treatment. It is known that the use of luteinized GCs to study the molecular ovulatory process is limited due to this prior cellular exposure to gonadotrophins and their luteinized state. However, luteinized CGs have been shown to reacquire similar characteristics to those of non-luteinized follicles in early stages of differentiation (non-luteinized early antral). Stimulation of these cells with follicle stimulating hormone (FSH) increases expression of genes that characterize CGs typical of pre ovulatory follicles (non-luteinized pre ovulatory). Another important question regarding the ovarian follicle relates to androgens action in this ovarian structure. As it is known, androgen receptor activation, located in follicular cells, is able to modulate expression and activity of important genes for the maintenance of ovarian follicle development. Thus, authors suggest that the reproductive effect of dehydroepiandrosterone (DHEA) and their sulfate (SDHEA) treatment, important androgens, may be due their actions precisely in the follicular microenvironment. Consequently, the aim of this work was to analyze the exposure to SDHEA of non-luteinized follicular cells (early antral and pre-ovulatory stages). Granulosa and cumulus cells were obtained from patients submitted to in vitro fertilization and were separately cultivated. Initially, the best culture time of this proposed cellular model was determined among 6, 8 or 10 days of culture. Cellular viability analysis showed that primary follicular culture for the next steps of the study would be of 8 days. Thereafter, cellular viability assays were used to determine the best SDHEA dose among 5 doses to follicular cells exposure in comparison to a control without hormonal exposure. The analysis showed that the best dose to use was 0,08 μM of SDHEA. Subsequently, after defined the best culture time and the ideal exposure dose of the cells to SDHEA, experiments were performed with two different experimental groups: non-luteinized early antral cells and non-luteinized pre ovulatory cells – exposed to FSH. Both groups were divided in two subgroups: control group (no hormonal exposure) and SDHEA group (with SDHEA exposure). SDHEA, estradiol and progesterone hormonal dosages of the cell culture supernatant were done on days 1, 4, 6 and 8. Over time analysis revealed that SDHEA values were constant in control group during all the cell culture period, without statistical difference between the four hormonal dosages performed in this group. However, treated group showed a difference in the values of this hormone on days 6 and 8, compared to days 1 and 4, due to treatment with SDHEA of these experimental group . Regarding estradiol, independent of cell type and stage of development, it was possible to see that its secretion was high on the first day of culture, decreasing in others due to conditions and time of culture of the non-luteinized cells protocol. In addition, the SDHEA treated cells presented higher estradiol secretion than those not treated. Finally, progesterone dosages revealed that treatment with SDHEA did not alter this hormone secretion from the cells in either of the two development stages. Besides that, the cells had an increased progesterone secretion on the sixth cell culture day compared to first and fourth day; however, this secretion began to decrease on the eight day of culture. In conclusion, SDHEA treatment is able to increases the non-luteinized follicular cells secretion of estradiol, but it is not able to modify the progesterone secretion of the same cells. More studies are needed to better understand the effects of SDHEA on the process that make part of folliculogenesis.

A modulação das respostas imunológicas frente à administração de substâncias farmacologicamente ativas em modelos experimentais infectados por Trypanossoma cruzi tem contribuído de maneira importante nas investigações de novas terapias para a doença de Chagas. O presente estudo teve como objetivo avaliar um possível efeito sinérgico imunoestimulatório subseqüente à administração de sulfato de zinco e DHEA durante o curso da infecção. O DHEA tem sido amplamente estudado e possui ação comprovada no direcionamento da resposta imune Th1, sendo muito efetivo para diferentes patógenos tais como vírus, bactérias e protozoários. O zinco é considerado um oligoelemento de extrema importância para a manutenção das funções imunes. Age como um inibidor da apoptose celular além de coordenar a seleção fisiológica de células intra-tímicas. Durante a fase aguda da infecção, zinco e DHEA apresentaram atividade estimulatória sobre a imunidade do hospedeiro, potencializando a resposta imune gerada contra o parasita. Comprovamos também a ação sinérgica de DHEA e zinco, através dos parâmetros analisados tais como parasitemia sangüínea e tecidual, além de fatores imunológicos como aumento nas concentrações de NO, IFN-?, IL-12, e número de macrófagos. Este efeito imuno-modulador durante a fase aguda da infecção chagásica pode contribuir para a prevenção dos danos teciduais observados na fase crônica da doença. / The modulation of the immune responses as well as the administration of pharmacologically active substances in infected T. cruzi experimental models has contributed to important investigations of new therapies in the treatment of Chagas\' disease. However, the use of antiparasitary drugs in the chronic indeterminate or in the cardiac chronic phases of Chagas disease is still a controversial issue. This study has as objectives to evaluate a possible synergic immunostimulatory effect after the administration of zinc and DHEA during the course of the infection. A bulk of evidences has been presented confirming the effectiveness action of DHEA on the Th1 immune response against a wide range of pathogens such like viruses, bacteria and protozoans. Zinc is considered an oligoelement of essential importance in the maintenance of the immune functions, as well as inhibiting cell apoptosis besides the function of coordinate the physiological selection of thymic T cells. During the acute phase of infection, zinc and DHEA displayed enhanced stimulatory activity on host\'s immune response. A synergistic action of zinc and DHEA was also observed through the evaluations of distinct parameters such as blood and tissue parasitism, number of macrophages and NO levels as well as elevated concentrations of some immunological interleukins such as IFN-? and IL-12. This work also demonstrates that the enhanced immunostimulatory effect observed during the acute phase certainly contributes in the prevention of tissue damage that normally occurs during the late chronic phase.