Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-17T15:22:13Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Luciana Pereira.compressed.pdf: 4618352 bytes, checksum: dfc01e0d1bf57db6a0daaa7da4bafdf1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T15:22:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Luciana Pereira.compressed.pdf: 4618352 bytes, checksum: dfc01e0d1bf57db6a0daaa7da4bafdf1 (MD5) Previous issue date: 2013 / FACEPE / A levedura Dekkera bruxellensis tem sido conhecida por sua adaptação aos processos fermentativos industriais, tendo chegado a situações que suplanta a levedura do processo Saccharomyces cerevisiae possuindo rendimentos equivalentes. Apesar de possuir grande adaptabilidade ao ambiente industrial, ainda são escassos trabalhos que se dediquem ao estudo de suas características fisiológicas e bioquímicas e que expliquem seu sucesso adaptativo. Este trabalho teve por objetivo descrever o metabolismo fermentativo da levedura GDB 248 em situações que simulem os processos fermentativos industriais na produção do álcool combustível bem como, sua tolerância aos diferentes fatores de estresse presentes no ambiente industrial. Foram realizadas fermentações com reciclo celular em meios sintético e caldo de cana. Os resultados mostraram que as células de D. bruxellensis possuem baixa eficiência no consumo da sacarose (consumo máximo 30%), maior tendência de conversão de açúcar em biomassa, mas exibem rendimentos em etanol próximos ao de S. cerevisiae. Os experimentos de tolerância aos fatores de estresse adicionados nas fermentações mostraram que D. bruxellensis possui, quando comparada a S. cerevisiae, tanto tolerância similar ao etanol quanto sensibilidade a ácidos orgânicos (acético e lático). Não foi detectada a produção de acido acético nas culturas de D. bruxellensis, tendo em ácido lático produção similar a S. cerevisiae. Para avaliar a tolerância de D. bruxellensis ao estresse, foram realizadas curvas de sobrevivência celular na presença dos agentes de estresse: H2O2, etanol, KCl, e após um choque térmico, relacionando o envolvimento de três proteínas de choque térmico no padrão transcricional desta resposta. Em conjunto, os resultados mostraram que as células de D. bruxellensis foram mais sensíveis aos fatores de estresse testados, quando comparados a S. cerevisaie, apesar de exibir tolerância similar ao etanol. Os genes HSP22, HSP24 e HSP82 são apenas responsivos ao choque térmico, mas suas proteínas não conferem tolerância às células. Por fim, para avaliar o comportamento desta levedura em outro substrato, frequentemente utilizado em destilarias no Brasil, e assim, compararmos o melhor desempenho desta espécie realizamos fermentações com reciclo em melaço e, desta vez, determinamos o conteúdo intracelular de trealose e glicogênio. No melaço, D. bruxellensis mostrou comportamento similar quanto à assimilação de sacarose, tendo tendência ao desvio do açúcar para biomassa e rendimento final em etanol equivalente ao produzido pelas células de S. cerevisiae. Mas, neste substrato, foi detectado a produção de ácido acético por esta levedura em quantidades superiores ao detectado nas culturas com S. cerevisiae. Quanto ao conteúdo intracelular dos carboidratos de reserva, só foi possível a detecção de glicogênio em quantidades inferiores a S. cerevisiae, pois nenhuma produção de trealose foi detectada em nossos ensaios.

As leveduras Dekkera/Brettanomyces estão envolvidas na deterioração de vinhos após o término das fermentações alcoólicas e maloláticas, tendo se apresentado como agente contaminante de processos contínuos de produção de etanol industrial. São caracterizadas pela morfologia celular típica (células alongadas e ogivais), alta produção de ácido e crescimento lento, porém de difícil identificação. Embora muitos trabalhos já tenham sido publicados acerca do seu papel na fermentação do vinho, pouco se conhece sobre o seu comportamento no processo de fermentação para produção de álcool combustível. Desta forma, este trabalho objetivou selecionar, identificar e caracterizar linhagens de Dekkera e Brettanomyces isoladas de processos fermentativos, através de testes de taxonomia clássica, moleculares (PCR e sequenciamento) e de biotipagem através do sistema killer, visando a avaliação de fermentações mistas de Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxellensis, a última em níveis de contaminação variando de 101 a 103 células/mL, em meio de caldo de cana, em processo de fermentação em batelada com reciclo celular (14 ciclos de 12 horas) para produção de etanol. Os testes morfológicos e fisiológicos/bioquímicos de oito linhagens selecionadas pela alta produtividade de ácido a partir da glicose e morfologia celular característica, apontaram os gêneros Dekkera ou Brettanomyces, sem possibilidade de identificação em nível de espécie devido à ambigüidade dos resultados dos testes fisiológicos. O sequenciamento da região ITS (Internal transcribed spacer) do DNA ribossomal confirmou somente três linhagens como Dekkera bruxellensis, sendo as demais predominantemente pertencentes à espécie Pichia guillermondii. O tamanho da região ITS, incluindo o gene 5,8S, variou de 400 500 pb entre as três linhagens. A utilização do sistema killer como método de biotipagem para leveduras Dekkera mostrou-se inviável devido ao fenótipo predominantemente neutro apresentado pelas linhagens. Somente a levedura killer CCA510 (Kluyveromyces marxianus) apresentou atividade inibitória contra as três linhagens de D. bruxellensis. Os ensaios fermentativos realizados com a linhagem de D. bruxellensis (CCA059) em fermentações puras e mistas com S. cerevisiae (CCA193, PE-02), mostraram que a levedura contaminante foi capaz de crescer em meio de caldo de cana, independentemente do tamanho do seu inóculo inicial (101 a 103 células/mL), impactando negativamente a fermentação etanólica, causando a diminuição da viabilidade de S. cerevisiae, diminuindo o pH do meio, decréscimo na produção de etanol e eficiência fermentativa, possivelmente devido à produção de ácido acético a partir do ART do meio de fermentação. Extrapolando-se os resultados obtidos em escala de laboratório para a escala industrial de uma destilaria de médio porte, a contaminação por Dekkera bruxellensis acarretaria uma perda de 6 milhões a 15 milhões de litros de álcool na safra, que deixariam de ser produzidos, dependendo do nível de contaminação. / Dekkera/Brettanomyces yeasts are found to be either contaminants in wine after completion of alcoholic and malolactic fermentations and in continuous fermentations for fuel alcohol production. They are characterized by typical cell morphology (elongated and ogival cells), high acid production and slow growth, however not easily identified. Although their role in wine fermentations is well-defined, a little is known about their behavior during fermentation for ethanol production. This work aimed the screening, identification and characterization of Dekkera and Brettanomyces strains isolated from fermentative processes, through classical taxonomic tests, molecular analysis (PCR and DNA sequencing) and biotyping by killer system. Following fermentation essays were carried out to evaluate mixed fermentations of Saccharomyces cerevisiae and Dekkera bruxellensis, the last one in contamination levels varying from 101 to 103 cells/mL, in sugar cane medium, using batch fermentation process with cell recycle (fourteen 12-hour cycles) for fuel ethanol production. Morphological and physiological/biochemical tests involving eight strains selected for their high acid production from glucose and typical cell morphology, pointed out to the genera Dekkera or Brettanomyces, without possibility of species identification due to the variability and ambiguity of physiological tests. DNA sequencing of the ITS (Internal transcribed spacer) region belonging to ribosomal DNA confirmed only three strains as Dekkera bruxellensis, the others were predominantly Pichia guilliermondii. The ITS region, including the 5,8S gene, varied from 400 to 500 bp among the three strains. The use of killer system as a biotyping method for Dekkera strains might not be applied because the strains were predominantly neutral to killer toxins. Only the killer strain CCA510 (Kluyveromyces marxianus) showed to have inhibitory activity against the strains of D. bruxellensis. The fermentative essays using a strain of D. bruxellensis (CCA059) in mixed and pure fermentations with S. cerevisiae (CCA193, PE-02), have shown that the contaminant yeast was able to grown in sugar cane juice, regardless of the initial inoculum size ((101 to 103 cells/mL), impairing the bioethanol fermentation, causing diminished S. cerevisiae viability, pH decrease, lower ethanol production and fermentative efficiency, mainly due to the acetic acid production from reducing sugar present in fermentation medium. Extrapolation of the results obtained in laboratory scale to industrial scale in a medium-sized distillery, have revealed that contamination by Dekkera bruxellensis would result in a alcohol loss of 6 millions to 15 millions of liters, which would not be produced, depending on the contamination level.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T14:48:36Z No. of bitstreams: 2 Tese de Doutorado_Will de Barros Pita_CCB_2012.pdf: 2965963 bytes, checksum: babbeaf0d359662414391200c3f5a596 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T14:48:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese de Doutorado_Will de Barros Pita_CCB_2012.pdf: 2965963 bytes, checksum: babbeaf0d359662414391200c3f5a596 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CNPq; CAPES; FACEPE / A levedura Dekkera bruxellensis é consistentemente associada a contaminações de processos de fermentação alcoólica industrial. Na produção de vinhos, esta levedura é responsável pela produção de aromas indesejáveis, enquanto que na produção de etanol combustível, D. bruxellensis compete com Saccharomyces cerevisiae pelo substrato industrial. Apesar de compartilhar alguns fenótipos com S. cerevisiae, D. bruxellensis apresenta características peculiares, como por exemplo, a capacidade de utilizar nitrato como única fonte de nitrogênio. No ambiente industrial, as quantidades de açúcares são elevadas e, nesses casos, o fator limitante do crescimento é geralmente a disponibilidade de nitrogênio, um nutriente essencial para todas as formas de vida. O objetivo do presente trabalho foi investigar o metabolismo de diferentes fontes de nitrogênio e determinar a influência da natureza e da concentração destas fontes na fisiologia e expressão gênica de D. bruxellensis, em busca de potenciais fatores positivos de adaptação para esta levedura. Os resultados mostraram que a assimilação de nitrato pode favorecer D. bruxellensis no ambiente industrial, pois fornece o nitrogênio necessário para manter o crescimento desta levedura mesmo após a depleção da amônia no caldo de cana. Adicionalmente, a escassez de nitrogênio diminui a taxa de crescimento, consumo de açúcares e produção de etanol em D. bruxellensis. No entanto, a limitação de carbono é ainda mais drástica para o metabolismo celular, ocasionando redução significativa dos principais parâmetros fisiológicos. Com relação à assimilação de fontes de nitrogênio, as enzimas glutamato desidrogenase e glutamato sintase podem trocar de papéis como principal via de biossíntese de glutamato e que genes codificantes de permeases de nitrogênio estão sob rígido controle transcricional. Além disso, D. bruxellensis apresenta preferência pela utilização do metabolismo respiratório em detrimento da fermentação em condições limitantes de crescimento. Finalmente, um novo grupo de genes de referência para ensaios de expressão gênica em D. bruxellensis foi estabelecido. A partir dos resultados gerados no presente trabalho, é possível entender as repostas metabólicas de D. bruxellensis em diferentes fontes de nitrogênio, o que pode auxiliar na identificação de novos fatores de adaptação para esta levedura, que permitem o seu estabelecimento e manutenção no ambiente indutrial.

As leveduras Dekkera/Brettanomyces estão envolvidas na deterioração de vinhos após o término das fermentações alcoólicas e maloláticas, tendo se apresentado como agente contaminante de processos contínuos de produção de etanol industrial. São caracterizadas pela morfologia celular típica (células alongadas e ogivais), alta produção de ácido e crescimento lento, porém de difícil identificação. Embora muitos trabalhos já tenham sido publicados acerca do seu papel na fermentação do vinho, pouco se conhece sobre o seu comportamento no processo de fermentação para produção de álcool combustível. Desta forma, este trabalho objetivou selecionar, identificar e caracterizar linhagens de Dekkera e Brettanomyces isoladas de processos fermentativos, através de testes de taxonomia clássica, moleculares (PCR e sequenciamento) e de biotipagem através do sistema killer, visando a avaliação de fermentações mistas de Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxellensis, a última em níveis de contaminação variando de 101 a 103 células/mL, em meio de caldo de cana, em processo de fermentação em batelada com reciclo celular (14 ciclos de 12 horas) para produção de etanol. Os testes morfológicos e fisiológicos/bioquímicos de oito linhagens selecionadas pela alta produtividade de ácido a partir da glicose e morfologia celular característica, apontaram os gêneros Dekkera ou Brettanomyces, sem possibilidade de identificação em nível de espécie devido à ambigüidade dos resultados dos testes fisiológicos. O sequenciamento da região ITS (Internal transcribed spacer) do DNA ribossomal confirmou somente três linhagens como Dekkera bruxellensis, sendo as demais predominantemente pertencentes à espécie Pichia guillermondii. O tamanho da região ITS, incluindo o gene 5,8S, variou de 400 500 pb entre as três linhagens. A utilização do sistema killer como método de biotipagem para leveduras Dekkera mostrou-se inviável devido ao fenótipo predominantemente neutro apresentado pelas linhagens. Somente a levedura killer CCA510 (Kluyveromyces marxianus) apresentou atividade inibitória contra as três linhagens de D. bruxellensis. Os ensaios fermentativos realizados com a linhagem de D. bruxellensis (CCA059) em fermentações puras e mistas com S. cerevisiae (CCA193, PE-02), mostraram que a levedura contaminante foi capaz de crescer em meio de caldo de cana, independentemente do tamanho do seu inóculo inicial (101 a 103 células/mL), impactando negativamente a fermentação etanólica, causando a diminuição da viabilidade de S. cerevisiae, diminuindo o pH do meio, decréscimo na produção de etanol e eficiência fermentativa, possivelmente devido à produção de ácido acético a partir do ART do meio de fermentação. Extrapolando-se os resultados obtidos em escala de laboratório para a escala industrial de uma destilaria de médio porte, a contaminação por Dekkera bruxellensis acarretaria uma perda de 6 milhões a 15 milhões de litros de álcool na safra, que deixariam de ser produzidos, dependendo do nível de contaminação. / Dekkera/Brettanomyces yeasts are found to be either contaminants in wine after completion of alcoholic and malolactic fermentations and in continuous fermentations for fuel alcohol production. They are characterized by typical cell morphology (elongated and ogival cells), high acid production and slow growth, however not easily identified. Although their role in wine fermentations is well-defined, a little is known about their behavior during fermentation for ethanol production. This work aimed the screening, identification and characterization of Dekkera and Brettanomyces strains isolated from fermentative processes, through classical taxonomic tests, molecular analysis (PCR and DNA sequencing) and biotyping by killer system. Following fermentation essays were carried out to evaluate mixed fermentations of Saccharomyces cerevisiae and Dekkera bruxellensis, the last one in contamination levels varying from 101 to 103 cells/mL, in sugar cane medium, using batch fermentation process with cell recycle (fourteen 12-hour cycles) for fuel ethanol production. Morphological and physiological/biochemical tests involving eight strains selected for their high acid production from glucose and typical cell morphology, pointed out to the genera Dekkera or Brettanomyces, without possibility of species identification due to the variability and ambiguity of physiological tests. DNA sequencing of the ITS (Internal transcribed spacer) region belonging to ribosomal DNA confirmed only three strains as Dekkera bruxellensis, the others were predominantly Pichia guilliermondii. The ITS region, including the 5,8S gene, varied from 400 to 500 bp among the three strains. The use of killer system as a biotyping method for Dekkera strains might not be applied because the strains were predominantly neutral to killer toxins. Only the killer strain CCA510 (Kluyveromyces marxianus) showed to have inhibitory activity against the strains of D. bruxellensis. The fermentative essays using a strain of D. bruxellensis (CCA059) in mixed and pure fermentations with S. cerevisiae (CCA193, PE-02), have shown that the contaminant yeast was able to grown in sugar cane juice, regardless of the initial inoculum size ((101 to 103 cells/mL), impairing the bioethanol fermentation, causing diminished S. cerevisiae viability, pH decrease, lower ethanol production and fermentative efficiency, mainly due to the acetic acid production from reducing sugar present in fermentation medium. Extrapolation of the results obtained in laboratory scale to industrial scale in a medium-sized distillery, have revealed that contamination by Dekkera bruxellensis would result in a alcohol loss of 6 millions to 15 millions of liters, which would not be produced, depending on the contamination level.

Thesis (PhD (Genetics. Plant Biotechnology))--Stellenbosch University, 2008. / Wine quality is greatly influenced by the number of microorganisms, which occur throughout the winemaking process. These microorganisms are naturally present on the grapes and in the cellar from where they can be introduced to the winemaking process at any given time and consequently impart specific contributions to the wine quality. However, these microorganisms can be seen either as beneficial or as wine spoilage microorganisms, depending on the conditions under which they can proliferate during the winemaking process. Wine yeasts (Saccharomyces spp.) are typically responsible for the alcoholic fermentation; lactic acid bacteria (LAB) are responsible for malolactic fermentation (MLF), while acetic acid bacteria (AAB) and other wild yeasts (non-Saccharomyces spp.) are typically associated with the formation of off-flavours under poorly controlled winemaking conditions. In recent years, evidence from the wine industry has highlighted a specific group of non-Saccharomyces yeast species as a serious cause for wine spoilage that required more research investigations. Yeast of the genus Brettanomyces or its teleomorph Dekkera has been identified as one of the most controversial spoilage microorganisms during winemaking as they can produce several compounds that are detrimental to the organoleptic quality of wine. This has triggered the research initiative behind this doctoral study on the significance of Brettanomyces and Dekkera yeasts during winemaking. In this dissertation, various aspects of the detection, isolation and identification methods of Brettanomyces yeast from the winemaking environment were investigated. As a first objective, a culture collection of Brettanomyces bruxellensis wine isolates had to be established. This followed after the isolation of Brettanomyces yeasts from various red wine cultivars from South African wineries from different stages of the winemaking process. Different conventional microbiological methods such as plating on selective agar media and microscopy were investigated along with molecular identification techniques such as the polymerase chain reaction (PCR) in this regard. Other focus areas of this study aimed at performing genetic characterisation and differentiation studies of B. bruxellensis wine isolates. For this purpose, different intraspecific identification methods were investigated on several strains, including strains of European origin. The application of molecular techniques allowing strain identification aided in the selection of specific strains that were evaluated for volatile phenol production in synthetic media and wine. The results obtained from this work indicated that a large degree of genetic diversity exists among B. bruxellensis strains and that the volatile phenol production differed between the strains after evaluation in synthetic media and wine. In addition to the molecular intraspecific strain identification techniques that were investigated, a feasibility study was also performed that focused on evaluating Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy combined with chemometrics as an alternative approach for differentiating between B. bruxellensis strains. The two approaches of FTIR spectroscopy that were investigated involved the use of firstly, Fourier transform mid-infrared (FTMIR) spectroscopy to obtain spectral fingerprints of spoiled wines by different B. bruxellensis strains; and secondly, Attenuated total reflectance (FTIR-ATR) to obtain spectral fingerprints from whole cells of B. bruxellensis on microbiological agar media. The results of this study illustrated the potential of FTIR spectroscopy to become a reliable alternative to molecular based methods for differentiating between B. bruxellensis strains and for characterisation studies. The formation of volatile phenols in wine by species of the genera Brettanomyces and Dekkera is one of the primary reasons for their classification as wine spoilage yeasts. The enzymatic activities of this reaction have been identified and involve a phenyl acrylic (phenolic) acid decarboxylase (PAD) and a vinyl phenol reductase (VPR). However, only a limited amount of information is available about these enzymes from Brettanomyces/Dekkera yeasts and no genetic data have been described. It was therefore imperative that this dissertation should include a genetic investigation into the phenylacrylic (hydroxycinnamic) acid decarboxylase from the species B. bruxellensis involved in the formation of volatile phenols. Strategies that were investigated included various molecular DNA techniques and protein purification procedures to obtain either genetic or protein sequence data. The decarboxylase activity of this yeast species towards p-coumaric acid was demonstrated and substantial genetic sequence data was obtained. The results from this dissertation made a substantial contribution to the current available knowledge about Brettanomyces/Dekkera spp. and led to a better understanding of this wine spoilage yeast. This research developed a platform from which further investigations could follow and the knowledge gained will be invaluable for future Brettanomyces research projects at the Institute for Wine Biotechnology at Stellenbosch University.

Made available in DSpace on 2016-06-02T18:55:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5512.pdf: 1675884 bytes, checksum: 47d8b8c6a94d1de848c43c964a5f3257 (MD5) Previous issue date: 2013-08-13 / Financiadora de Estudos e Projetos / Bioethanol is an alternative low cost fuel, which is conventionally obtained in Brazil from the fermentation of sugarcane juice, molasses, or a mixture of these. However, alternatively, ethanol could be obtained from lignocellulosic materials, wastes or agroindustrial byproducts composed of cellulose, hemicellulose and lignin, such as sugarcane bagasse. For each ton of cane processed, 250 kg of bagasse are obtained on average, which is usually burned for power generation industry. The microbial cultivation using these materials depend on the availability of substrates, accordingly, acid hydrolysis has been considered one of the most widely used process for the depolymerization of the hemicellulose fraction of lignocellulosic materials, due to their low cost and high efficiency. However, under conditions of high temperature and pressure, glucose and xylose released are degraded to 5- hydroxymethylfurfural (HMF) and furfural, respectively. These compounds are characterized by inhibiting the yeast used in the fermentation step, which influences the microbial metabolism and the conversion of hexoses and pentoses obtained in ethanol. In this context, the aim of this work was to evaluate the ability of a yeast strain, from the species Dekkera bruxellensis (CCA155) in producing ethanol from sugarcane bagasse hydrolysates, since it has shown to be a yeast tolerant to adverse conditions found in industrial fermentation processes. The results indicated that D. bruxellensis was capable of producing ethanol in a synthetic medium containing xylose or arabinose, and xylose or glucose as sole carbon sources, and when grown in concentrations of 50 or 100% sugarcane bagasse hydrolyzate, maximum specific speeds growth was similar, about 0.009 h-1, with cell productivity of about 0.035 gL-1h-1. In the bioreactor tests, the yeast displayed low specific growth rate during the first five days, 0.003 h-1, caused by a slow consumption of glucose. But in a second phase of growth, with a lower rate 0.001 h-1, there was an increase in xylose consumption, a period in that an increase in ethanol concentration with maximum yield of approximately 3.25 mg/L.h was observed. Therefore even with lower growth when compared to yeast fermentation conventionally used in ethanol industries, these results suggest the feasibility of the cultivation of D. bruxellensis in hydrolysates of sugarcane bagasse. / O bioetanol é um combustível alternativo, de baixo custo o qual convencionalmente é obtido no Brasil a partir da fermentação de caldo de cana-de-açúcar, melaço ou a mistura destes. Entretanto, alternativamente, o etanol poderia ser obtido a partir de materiais lignocelulósicos, resíduos ou subprodutos agroindustriais compostos por celulose, hemicelulose e lignina, tais como o bagaço de cana-de-açúcar. Para cada tonelada de cana processada, são obtidos, em média, 250 kg de bagaço, o qual é geralmente queimado para geração de energia na indústria. Os cultivos microbianos a partir destas matérias-primas dependem da disponibilização dos substratos, nesse sentido, a hidrólise ácida tem sido referida como um dos processos mais utilizados para a despolimerização da fração hemicelulósica dos materiais lignocelulósicos, devido ao seu baixo custo e alta eficiência. No entanto, em condições de alta pressão e temperatura, glicose e xilose liberadas são degradadas a 5-hidroximetilfurfural (HMF) e furfural, respectivamente. Estes compostos são caracterizados por inibirem as leveduras utilizadas na etapa de fermentação, o que influencia o metabolismo microbiano e a conversão das hexoses e pentoses obtidas em etanol. Neste contexto, o trabalho consistiu em avaliar a capacidade de uma linhagem da levedura Dekkera bruxellensis em produzir etanol a partir de pré-hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar, já que a mesma tem mostrado ser uma levedura tolerante a condições adversas encontradas em processos fermentativos industriais. Os resultados indicaram que D. bruxellensis foi capaz de produzir etanol em meio sintético contendo xilose ou arabinose, ou ainda xilose e glicose como únicas fontes de carbono, e quando cultivadas em concentrações de 50 ou 100% de pré-hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar, as velocidades específicas de crescimento máximas foram semelhantes, em torno de 0,009 h-1, com produtividade celular de aproximadamente 0,035 g.L-1 h-1. Os ensaios em biorreator demonstraram baixas velocidades específicas de crescimento nos primeiros cinco dias, 0,003 h-1, ocasionado por um lento consumo de glicose. Porém em uma segunda fase de crescimento, com velocidade específica menor 0,001 h-1, ocorreu um aumento no consumo de xilose, período que também se observou aumento na concentração de etanol com produtividade máxima de aproximadamente 3,25 mg/L.h. Portanto apesar de crescimento inferior quando comparado às leveduras convencionalmente usadas na fermentação etanólica industrial, estes resultados sugerem a viabilidade de cultivo da D. bruxellensis CCA155 em pré-hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar.

Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-13T19:43:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Leite(2012)_Tese Doutorado.pdf: 1676156 bytes, checksum: a0b7f1a26ca74955f4df21cc6a466fe0 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T19:43:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Leite(2012)_Tese Doutorado.pdf: 1676156 bytes, checksum: a0b7f1a26ca74955f4df21cc6a466fe0 (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / FACEPE / A levedura Dekkera bruxellensis tem sido identificada como principal contaminante do processo industrial de produção de álcool combustível e em vinícolas, mas estudos recentes mostraram que linhagens desta espécie podem apresentar rendimentos em etanol comparáveis aos mostrados por Saccharomyces cerevisiae, o principal microrganismo fermentador. Apesar de ter se mostrado um microrganismo bastante atrativo para aplicações industriais, poucos trabalhos têm sido dedicados ao estudo de sua fisiologia. Este trabalho teve por objetivo descrever a fisiologia da linhagem industrial da levedura D. bruxellensis GDB 248 quanto ao seu metabolismo de açúcares e o efeito repressor que a glicose exerce sobre o metabolismo do carbono. Foram realizados cultivos em frascos em diferentes fontes de carbono e em quimiostatos limitados em glicose ou sacarose. Nos experimentos em frascos com hexoses ou dissacarídeos, valores para taxas de crescimento e rendimentos em etanol e acetato foram calculados e nenhuma formação de piruvato, succinato ou glicerol foi observada. A análise elementar da biomassa de D. bruxellensis resultou na composição elementar CH1.754O0.583N0.149e o grau de redução (Nox) para esta biomassa se mostrou muito próximo ao descrito para a biomassa de S. cerevisiae. Nos experimentos em regime de quimiostato, o metabolismo desta levedura foi completamente respiratório e todo o açúcar consumido (glicose ou sacarose) foi convertido em apenas biomassa atingindo rendimento cerca de 25% maior que o observado para S. cerevisiae. Além disso, pulsos de glicose foram aplicados aos quimiostatos limitados em glicose ou sacarose e os resultados mostraram que as células de D. bruxellensis apresentam o efeito Crabtree observado pela rápida produção de etanol, mesmo em presença de oxigênio. No pulso de glicose aplicado ao quimiostato limitado em sacarose, foi observado o acúmulo de sacarose no reator, indicando a presença de mecanismo de repressão catabólica por glicose nestas células. Para avaliar o efeito repressor da glicose, a expressão relativa do gene DbFBP1 foi analisada por PCR em tempo real e foi observado que este gene está sujeito a uma forte regulação repressora exercida pela proteína quinase A em resposta a disponibilidade de glicose. Os dados deste trabalho possibilitaram uma melhor compreensão acerca da capacidade de conversão de diferentes açúcares a etanol, apesar da tendência ao metabolismo respiratório apresentado pelas células de D. bruxellensis e ainda foram gerados os primeiros dados a cerca do efeito repressor da glicose sobre o metabolismo destas fontes de carbono. Por fim, diante da escassez de dados genômicos para esta espécie, foi realizado um estudo para validar genes de referência para normalização de dados de ensaios de expressão gênica por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que os genes DbEFA1, DbEFB1 e DbYNA1 são suficientemente estáveis para esta aplicação e que o método geNorm é, de fato, o mais adequado para esta análise.