Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-11-05T18:03:08Z No. of bitstreams: 1 2014_VanessaToralesPorto.pdf: 950983 bytes, checksum: f7ad5fa50fff60d0a9cb4669e3ce95f4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-11-05T18:32:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_VanessaToralesPorto.pdf: 950983 bytes, checksum: f7ad5fa50fff60d0a9cb4669e3ce95f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-05T18:32:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_VanessaToralesPorto.pdf: 950983 bytes, checksum: f7ad5fa50fff60d0a9cb4669e3ce95f4 (MD5) / Introdução: A dengue é um dos principais problemas de saúde pública no mundo, a forma mais grave da doença é a dengue hemorrágica, fatal se não tratada. No mundo, ocorre em mais de 100 países e territórios – 2,5 bilhões de pessoas estão sob o risco de contraí-la, e anualmente a taxa de incidência atinge 50 milhões de casos (Tauil, 2002). A dengue é uma enfermidade causada por um arbovírus da família Flaviviridae, gênero Flavivírus, que inclui quatro tipos imunológicos: DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Um importante alvo dos anticorpos para DENV é a proteína NS1, uma glicoproteína conservada que parece ser essencial para a replicação do vírus. Recentemente, os testes para a detecção do antígeno NS1 no soro humano foram evoluindo. O antígeno NS1 é encontrado juntamente com endotélio, livre ou solúvel no soro de pacientes, a partir de um dia antes do início dos sintomas e pode ser detectado, pelo menos, até cinco dias após o início dos sintomas, o que permite um diagnóstico precoce da doença. Objetivo: Avaliar a acurácia diagnóstica para a detecção do antígeno NS1 Dengue pelo formato ELISA, quando utilizada por laboratórios de saúde pública. Métodos: estudo analítico retrospectivo dos exames de dengue oriundos das unidades sentinelas de dengue e laboratórios de referência nacional e estaduais no período de 2009 a 2010. Foram calculados os valores de sensibilidade, especificidade, Valor preditivo positivo e valor preditivo negativo. Resultados: A sensibilidade média do kit encontrada nos seis estados envolvidos no estudo foi de 94,5% e a especificidade média foi de 61,20%. O valor preditivo positivo de 81,48% no ano de 2009 e em 2010 o valor caiu para 66,17%, e o valor preditivo negativo no ano de 2009 foi de 89,91% e no ano de 2010 o valor aumentou para 94,43%. Conclusão: Considerando a sensibilidade de 94,50% encontrada podemos considerar que o teste é sensível, e raramente deixará de encontrar pessoas com a doença. Em relação a especificidade de 61,20%,considera-se um valor abaixo do esperado, podendo ocasionar resultados falsos negativos. O kit é sensível, porém pouco específico. __________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: Dengue fever is one of the main public health issues in the world. In its most severe form, dengue hemorrhagic fever, it causes gastrointestinal hemorrhaging which, if untreated, can lead to death. It has been detected in more than 100 countries and territories worldwide -approximately 2.5 billion people are at risk of contracting dengue fever and incidence rate is of 50 million cases per year (Tauil, 2002). Dengue fever is caused by an arbovirus of the family Flaviviridae and genus Flavivirus and includes four serotypes: DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. An important target of antibodies against DENV is the protein NS1, a conserved glycoprotein that appears to be essential for viral replication. Recently, tests for the detection of NS1 antigen in human serum have evolved. This antigen is found in the endothelium, in a free form or soluble in serum of infected patients after one day before symptoms begin, which allows for early diagnosis of the disease. Objective: To evaluate the diagnostic accuracy in the detection of the NS1 antigen in an ELISA format in public health laboratories. Methods: A descriptive retrospective cohort study of dengue laboratory results from sentinel, state and national reference laboratories in 2009 and 2010. Sensitivity, specificity, positive and negative predictive values were determined. Results: The mean sensitivity of the Elisa kit in the six states involved in this study was 94.5% and the mean specificity was 61.2%. Positive predictive value was 81.48% in 2009 and decreased to 66.17% in 2010, whereas the negative predictive value was 89.91% and increased to 94.43% in the years 2009 and 2010, respectively. Conclusion: Considering the mean sensitivity of 94.50%, it can be concluded that the test will rarely fail at detecting contaminated patients. The mean specificity was lower than expected and it can be concluded that mistakes can occur, particularly in assigning false negatives. The kit is sensitive, however non-specific.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-03-29T13:29:04Z No. of bitstreams: 1 monique_rq_lima_ioc_mt_0010_2009.pdf: 1937766 bytes, checksum: d05c52dcbcc952c1a57ff1ff206f06b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-29T13:29:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 monique_rq_lima_ioc_mt_0010_2009.pdf: 1937766 bytes, checksum: d05c52dcbcc952c1a57ff1ff206f06b1 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O diagnóstico laboratorial de dengue é muito importante para apoiar os programas Vigilância Epidemiológica considerando-se a dificuldade da confirmação dos casos em bases clínicas apenas, em especial, durante períodos inter-epidêmicos. Atualmente estão disponíveis kits comerciais para o diagnóstico sorológico do dengue, embora o seu custo ainda represente um alto encargo financeiro para países em desenvolvimento. Um diagnóstico rápido pode direcionar as medidas de controle do vetor. A proteína não-estrutural 1 (NS1) do vírus dengue por ser um marcador utilizado durante a fase aguda da doença e tem sido proposto para o diagnóstico da doença. Desta forma, a sensibilidade e especificidade de três kits comerciais para captura de antígeno NS1 disponíveis no mercado foram avaliadas com um painel de 852 amostras obtidos a partir da coleção do Laboratório de Flavivírus no Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, de epidemias ocorridas durante os anos de 1986 a 2008. O desempenho de cada kit foi avaliado individualmente e, a comparação entre os três kits foi baseada na análise de uma sub-população de 450 amostras. Dentre os três kits analisados, o kit NS1 Ag Strip (BioRad Laboratories) foi o mais sensível em confirmar casos de dengue na amostragem testada (89%, 197/220), seguido pelo Platelia NS1 (BioRad Laboratories) (84%, 184/220) .O menos sensível foi o pan -E Early ELISA (PanBio Diagnostics) com 72% (159/220) de sensibilidade. Porém, neste estudo o kit da PanBio foi o mais especifico (100%), enquanto que ambos os kits da BioRad apresentaram 99% de especificidade. Os resultados obtidos demonstraram uma maior sensibilidade de confirmação de casos de infecção primária pelos três kits, porém não houve diferença significativa em relação aos casos de infecção secundária. Os três kits foram mais sensíveis em confirmar casos positivos por isolamento viral do que em casos positivos por RT-PCR. A sensibilidade dos três kits foi maior no período compreendido entre o primeiro ao quinto dia após o inicio dos sintomas. Reações cruzadas foram raramente observadas em vacinados contra o vírus da febre amarela e casos de rubéola. Os resultados obtidos demonstraram que três kits podem ser utilizados para a detecção precoce da infecção viral por dengue. / Dengue virus diagnosis is an important tool to support Epidemiological Surveillance Programs considering the difficulties found in confirm dengue cases based only on the clinical symptoms, especially during inter-epidemic periods. Currently, there are many commercial serological kits for dengue diagnosis, however its costs poses a financial burden for many developing countries. The dengue virus non- structural protein a (NS1) can be used as a marker during the acute phase of the illness and its use has been proposed for the disease diagnosis. Therefore, here we evaluated the sensitivity and specificity of three newly available NS1 antigen capture commercial kits with a panel of 852 samples from the collection of the Flavivirus Laboratory at the Oswaldo Cruz Institute, FIOCRUZ, from epidemics occurred from 1986 to 2008. Each kit was evaluated individually and the comparison among them was based on the analysis of a sub- population of 450 samples. From the three kits analyzed, the NS1Ag Strip (Biorad Laboratories) showed the highest sensitivity (89%, 197/220) in confirming dengue cases, followed by the PlateliaTM NS1 (Biorad Laboratories). The less sensitive one was the pan-E Early ELISA (PanBio Diagnostics) with a sensitivity of 72% (159/220). However, in this study the PanBio kit was the most specific (100%) while the two kits from BioRad showed both 99% of specificity. Primary dengue cases were more frequently confirmed than secondary ones. A higher sensitivity was observed in cases positive by virus isolation, when compared to cases positive by RT-PCR. The highest NS1 antigen detection was from the first to the fifth day after the onset of the symptoms. Cross reactivity were rarely observed in yellow fever vaccinees and rubella cases. The results showed that the three kits can be used in the early diagnosis of dengue infections.

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:42:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) monique_lima_ipec_dout_2014.pdf: 5463834 bytes, checksum: 3fce9836524ae3941506c5f46b82718e (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A utilidade da proteína NS1 para o diagnóstico precoce e seu papel como uma ferramenta de diagnóstico adicional às abordagens existentes para a identificação das infecções por dengue já foi demonstrada. No ano de 2008, o Ministério da Saúde implantou unidades sentinelas em municípios estratégicos do país, utilizando testes de captura de antígeno (Ag) NS1 como um método de triagem e de diagnóstico precoce de casos suspeitos, contudo sem avaliações prévias. O presente estudo visou atender às demandas de avaliação e confirmação do papel destes testes na investigação de casos de dengue no país. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho e as aplicações alternativas dos testes de captura de NS1 disponíveis comercialmente. O desempenho dos testes Platelia NS1 ELISA (BioRad Laboratories) e pan-E Early ELISA, primeira geração (PanBio Diagnostics) e do teste rápido Ag Strip (BioRad Laboratories) disponíveis no mercado após a introdução destes no país, foi avaliado com um painel de 450 amostras. Dentre os três kits analisados, o teste NS1 Ag Strip foi o mais sensível (89%, 197/220), seguido pelo Platelia NS1 ELISA (84%, 184/220). O menos sensível foi pan-E Early ELISA com 72% (159/220) de sensibilidade. Uma menor sensibilidade foi observada em casos de DENV-3 por todos os três kits analisados A comparação de duas gerações do ELISA para a captura de NS1 do fabricante PanBio Diagnostics (pan-E Dengue Early ELISA e Early ELISA Dengue, segunda geração), após o aperfeiçoamento do teste pelo fabricante, demonstrou um aumento significativo na sensibilidade, de 72,3% (159/220) para 80% (176/220), p=0.05, respectivamente. As sensibilidades dos testes pan-E Dengue Early ELISA, Platelia NS1 ELISA e o NS1 Ag Strip utilizados como uma ferramenta alternativa para o diagnóstico de dengue em fragmentos de tecidos de casos fatais (n=23) foi de 34,7% (08/23), 60,8% (14/23) e 91,3% (21/23), respectivamente. Na análise de 74 fragmentos tecidos provenientes dos casos fatais, o teste NS1 Ag Strip apresentou uma sensibilidade significativamente maior (78,3%, 58/74 [p<0.05]). Este teste foi mais sensível na análise do fígado (91,3%; 21/23), pulmão (71,4%; 10/14), rim (100%, 4/4), cérebro (80%; 8/10), baço (66,6%, 10/15) e timo (100%, 3/3), quando comparado com os testes de ELISA avaliados. A utilidade dos testes de captura de NS1 também foi avaliada nas vigilâncias epidemiológica e entomológica após introdução do DENV-4 no Rio de Janeiro em 2011. Tanto o teste rápido NS1 Ag Strip quanto o Platelia NS1 ELISA confirmaram 4/9 (44,4%) dos casos suspeitos ocorridos na época e confirmaram a infecção em mosquitos Ae. aegypti coletados no campo. Relatos de uma baixa sensibilidade do teste de captura de NS1 no diagnóstico de casos de DENV-4, ocorridos após a introdução deste sorotipo no país, resultou na investigação de metodologias que visassem um aumento das sensibilidades obtidas Para tal, dois métodos de dissociação de imunocomplexos antígeno-anticorpo por calor e por dissociação ácida, foram testados. Foi observado um aumento significativo na sensibilidade do teste de 46,6% (217/466), quando as amostras não sofreram dissociação, para 70,4% (328/466) e 77,5% (361/466), p=0,017, quando sofreram dissociação ácida e térmica, respectivamente. Visando estabelecer a utilização de sangue coletado por punção digital em papel de filtro como espécime alternativo para a utilização em testes de captura de NS1, cinco protocolos, para a eluição do soro do papel de filtro foram avaliados. O protocolo descrito por Matheus et al. (2007), a utilização de 6mm de papel de filtro contendo a amostra e a eluição da amostra utilizando o próprio tampão do kit comercial, foi o protocolo mas sensível para a confirmação dos casos testados. Os resultados obtidos neste trabalho corroboram àqueles que demostram a utilidade da proteína NS1 no diagnóstico precoce das infecções por dengue e demonstram a aplicação alternativa na confirmação de casos fatais, detecção dos vírus em vetores e, potencialmente, sua utilização combinada com métodos menos invasivos de coleta de sangue / The usefulness of the NS1 protein for early diagnosis of dengue infections and its role as an additional tool to existing diagnostic approaches has been demonstrated. In 2008, the Brazilian Ministry of Health established sentinel units in strategic cities of Brazil , using NS1 antigen (Ag) capture tests as a screening method and early diagnosis of suspected cases, however wit hout a previous evaluation. The present study aimed to meet the demands of evaluating and confirming the role of these tests in investigating dengue cases in the country. In this context, the goal of this study was to evaluate the performance and alternati ve applications of NS1 capture tests commercially available. The performance of the Platelia NS1 ELISA (BioRad Laboratories) and pan - E Early ELISA, first generation (PanBio Diagnostics) and rapid test NS1 Ag Strip (BioRad Laboratories) available in the mar ket after the introduction of these in the country, was evaluated with a panel of 450 samples. Among the three kits analyzed, the NS1 Ag Strip test was the most sensitive (89%, 197/220), followed by the Platelia NS1 ELISA (84%, 184/220). The least sensitiv e was the pan - E Early ELISA with 72% (159 /220) of sensitivity. A lower sensitivity was observed in DENV - 3 cases by all three kits analyzed. The comparison of two generations of the NS1 Ag capture ELISA from PanBio Diagnostics (pan - E Dengue Early ELISA an d Early ELISA Dengue, second generation) after a test improvement by the manufacturer, showed a significant increase in the sensitivity, from 72.3% (159 /220) to 80% (176/220), p=0.05, respectively. The sensitivity of the pan - E Dengue Early ELISA, Platelia NS1 ELISA and NS1 Ag Strip tests used as an alternative tool for the diagnosis of dengue in tissues of fatal cases (n=23), were 34.7% (08/23), 60.8% (14/23) and 91.3% (21/23), respectively. In the analysis of 74 tissues from dengue fatal cases, the NS1 Ag Strip test showed a significantly higher sensitivity (78.3%, 58/74 [p <0,05]) . This assay was more sensitive in the analysis of the liver (91.3%, 21/23), lung (71.4%, 10 /14), kidney (100%, 4/4), brain (80 %, 8/10), spleen (66.6%, 10 /15), and thymus (10 0%,3/3), when compared to the ELISA tests evaluated. The usefulness of the NS1 capture tests was also evaluated in the epidemiological and entomological surveillance after DENV - 4 introduction in Rio de Janeiro in 2011. Both the rapid test NS1 Ag Strip and the Platelia NS1 ELISA confirmed 4/9 (44.4%) of the suspected cases occurred at the time and confirmed the infection in Ae. aegypti collected in the field. Reports of a low sensitivity of the NS1 capture tests in diagnosing DENV - 4 cases occurred after the introduction of this serotype in the country and resulted in the investigation of methodologies to increase the sensitivities obtained. In that scenario, two methods for antigen - antibody immune complexes dissociation (heat and acid dissociations) were test ed. The sensitivity observed with the samples non - dissociated (46.6%; 217/466) was significantly improved when the samples were submitted to acid dissociation (70.4% ; 328/466) and heat dissociation (77.5 %; 361/466), p =0.017. To establish the use of fingers tick blood collection on filter paper specimens as an alternative specimen to use on NS1 tests, five protocols for eluting the serum from the filter paper were evaluated. The protocol described by Mat heus et al. (2007), using 6 mm of filter paper containin g the sample and the elution of the sample using the commercial kit buffer was itself, the most effective. The results of this study support those that demonstrate the usefulness of the NS1 protein in the early diagnosis of dengue infections and demonstrat e the alternative applications in confirming fatal cases, in the surveillance of the virus in the vectors and the potentially combined with less invasive methods of blood collection use.

Made available in DSpace on 2015-05-19T13:30:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 414.pdf: 7133398 bytes, checksum: f3c34dbc03132f760978a32309a5b7ce (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A dengue é uma doença causada por um flavivírus, representado por quatro sorotipos distintos (DENV1-4). Entre as proteínas virais, ENV e NS1 contribuem fortemente com o processo de resposta imune desencadeado pelo vírus. Os principais sistemas de diagnóstico utilizam a detecção de anticorpos através da técnica Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay - ELISA, a qual, embora útil, apresenta inúmeras limitações (custo, tempo de processamento, entre outros). Neste trabalho, nós desenvolvemos ensaios multiplex de microarranjos líquidos para ENV e NS1. Sequências de aminoácidos codificantes das proteínas, provenientes de cepas isoladas da América Latina foram selecionadas em bancos de dados públicos, alinhadas para a geração das respectivas sequências consenso e construção dos antígenos recombinantes. As sequências obtidas foram otimizadas para expressão bacteriana, submetidas à síntese comercial e clonadas em vetores de expressão procarióticos. Os antígenos foram expressos e validados através de ensaios de microarranjos líquidos, com obtenção de promissores resultados, especialmente para as proteínas ENV (domínios I/II) sorotipo 1 e 2, com potencial aplicação comercial. Este trabalho desenvolveu ainda metodologia para renaturação de NS1 com excelente rendimento. Os resultados das proteínas produzidas neste trabalho foram de forma geral superiores aos obtidos por antígenos comercialmente disponíveis para a proteína ENV de dengue vírus, utilizando a mesma metodologia. As proteínas NS1 foram ainda utilizadas para imunização de coelhos e produção de anticorpos policlonais, que se mostraram bem sucedidos para aplicações em ensaios de imunofluorescência, western blot, citometria de fluxo e como anticorpo de detecção para ensaios quantitativos para a proteína NS1 por ELISA de captura. Os resultados obtidos neste projeto foram considerados extremamente promissores, com potencial aproveitamento no desenvolvimento de testes diagnósticos comerciais com alta precisão, rápidos e com baixo custo

O diagnóstico rotineiro da dengue é realizado com amostra de sangue dos casos suspeitos. A coleta tradicional de sangue (por punção venosa) é um procedimento que dificulta a realização de exames e pesquisas por ser um procedimento invasivo que nem sempre é prático para crianças e bebês, requer pessoal especializado e necessita de um local para armazenamento da amostra sob refrigeração ou congelamento. O propósito deste estudo foi coletar amostras por punção digital com uma nova tecnologia (FTA Card) e compará-la com amostras coletadas por punção venosa, avaliando-as através de uma técnica molecular de PCR em tempo real. Sendo o PCR em Tempo Real a técnica molecular atualmente disponível de maior rapidez, sensibilidade e especificidade, padronizamos uma metodologia de passo único de PCR em Tempo Real com SYBR green baseando-se na região 3 não codificante do vírus e utilizando primers degenerados, capazes de detectar os quatro sorotipos de uma só vez. A avaliação das técnicas de coleta e amplificação foram feitas com amostras suspeitas de dengue, obtidas em Goiânia durante surto ocorrido no ano de 2008. O limite de detecção da reação padronizada no presente estudo foi de aproximadamente 100 cópias/ml e uma especificidade de 100%. Para tipagem das amostras positivas a técnica empregada foi o PCR multipex. Dentre as 89 amostras coletadas 60 (67%) foram positivas para àquelas coletadas por punção venosa e 14 (16%) para àquelas coletadas por punção digital. Dentre as 89 amostras para o PCR em Tempo Real, apenas 29 (32%), foram tipadas pelo método de PCR multiplex, sendo 3 casos do vírus da dengue 1 (10%), 16 casos do vírus da dengue 2 (55%), e 10 casos do vírus da dengue 3 (35%). Descritores: Dengue/diagnóstico, coleta de amostras sanguíneas, reação em cadeia da polimerase, corantes fluorescentes / The collection by venipuncture is a procedure that is difficult to carry out in diagnosis and research because it is an invasive procedure that is not always practical for children and babies , requires specialized staff, needs a place to store the sample under refrigeration or forzen, This study aimed to collect samples by fingerstick puncture with a new technology named FTA card and compare it with samples collected by venipuncture, using a realtime PCR to evaluate if FTA card collection would have a similar performance to standard blood sampling. Towards that, we obtained viral load values in order to estimate the differences not only qualitatively (e.g. pos or neg) but also in numbers.. We used an one-step SYBR Green I Real-Time PCR based on the region 3 \'noncoding virus using degenerate primers which was able to detected all four serotypes of dengue virus. Among the 89 samples collected 60 (67%) were positive for those collected by venipuncture and 14 (16%) to those collected by fingerstick, Only 29 (32%) were possible to be typed by PCR multiplex. Three cases were dengue virus 1 (10%), 16 cases were dengue virus 2 (55%) and 10 cases were dengue virus 3 (35%). The limit of detection obtained was approximately 100 copies / ml and aspecificity of 100% was observed. Keywords: Dengue / diagnosis, collection of blood samples, polymerase chain reaction, fluorescent dyes

O diagnóstico rotineiro da dengue é realizado com amostra de sangue dos casos suspeitos. A coleta tradicional de sangue (por punção venosa) é um procedimento que dificulta a realização de exames e pesquisas por ser um procedimento invasivo que nem sempre é prático para crianças e bebês, requer pessoal especializado e necessita de um local para armazenamento da amostra sob refrigeração ou congelamento. O propósito deste estudo foi coletar amostras por punção digital com uma nova tecnologia (FTA Card) e compará-la com amostras coletadas por punção venosa, avaliando-as através de uma técnica molecular de PCR em tempo real. Sendo o PCR em Tempo Real a técnica molecular atualmente disponível de maior rapidez, sensibilidade e especificidade, padronizamos uma metodologia de passo único de PCR em Tempo Real com SYBR green baseando-se na região 3 não codificante do vírus e utilizando primers degenerados, capazes de detectar os quatro sorotipos de uma só vez. A avaliação das técnicas de coleta e amplificação foram feitas com amostras suspeitas de dengue, obtidas em Goiânia durante surto ocorrido no ano de 2008. O limite de detecção da reação padronizada no presente estudo foi de aproximadamente 100 cópias/ml e uma especificidade de 100%. Para tipagem das amostras positivas a técnica empregada foi o PCR multipex. Dentre as 89 amostras coletadas 60 (67%) foram positivas para àquelas coletadas por punção venosa e 14 (16%) para àquelas coletadas por punção digital. Dentre as 89 amostras para o PCR em Tempo Real, apenas 29 (32%), foram tipadas pelo método de PCR multiplex, sendo 3 casos do vírus da dengue 1 (10%), 16 casos do vírus da dengue 2 (55%), e 10 casos do vírus da dengue 3 (35%). Descritores: Dengue/diagnóstico, coleta de amostras sanguíneas, reação em cadeia da polimerase, corantes fluorescentes / The collection by venipuncture is a procedure that is difficult to carry out in diagnosis and research because it is an invasive procedure that is not always practical for children and babies , requires specialized staff, needs a place to store the sample under refrigeration or forzen, This study aimed to collect samples by fingerstick puncture with a new technology named FTA card and compare it with samples collected by venipuncture, using a realtime PCR to evaluate if FTA card collection would have a similar performance to standard blood sampling. Towards that, we obtained viral load values in order to estimate the differences not only qualitatively (e.g. pos or neg) but also in numbers.. We used an one-step SYBR Green I Real-Time PCR based on the region 3 \'noncoding virus using degenerate primers which was able to detected all four serotypes of dengue virus. Among the 89 samples collected 60 (67%) were positive for those collected by venipuncture and 14 (16%) to those collected by fingerstick, Only 29 (32%) were possible to be typed by PCR multiplex. Three cases were dengue virus 1 (10%), 16 cases were dengue virus 2 (55%) and 10 cases were dengue virus 3 (35%). The limit of detection obtained was approximately 100 copies / ml and aspecificity of 100% was observed. Keywords: Dengue / diagnosis, collection of blood samples, polymerase chain reaction, fluorescent dyes