As células da polpa dental têm o potencial de responder a estímulos externos e reparar o tecido dentário lesionado. Nos dentes, as lesões cariosas profundas e as lesões traumáticas são frequentes e resultam em alterações pulpares. Com o desenvolvimento da ciência e a busca de formas inovadoras de tratamento utilizando biomateriais de tamanho cada vez menor, verificar a biocompatibilidade desses materiais antes da aplicação clínica se mostra necessário e promissor. Assim, a finalidade deste estudo foi avaliar a biocompatibilidade de uma nova nanopartícula de hidroxiapatita utilizando células pulpares humanas em cultura. As Nanopartículas de Hidroxiapatita (HAp) utilizadas em nosso estudo são um material novo e ainda não disponível para a prática clínica. Como parâmetro comparativo, foi utilizado o material já consagrado na Odontologia para tratamentos endodônticos, o Agregado Trióxido Mineral (MTA). Para tanto, foram realizados testes de biocompatibilidade (MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-y)5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil-2H-tetrazolio)). Foi preparada uma solução de material na concentração de 0,1g/ml diluído em meio de cultura, proporção preconizada pela norma ISO 10.993-12 (ISO, 1996). Esta solução foi diluída em 3 diferentes concentrações (1/10, 1/100 e 1/1000). Também foram realizados testes de migração celular e testes de capacidade de diferenciação, na concentração de 1/100. Como resultados pudemos verificar que as células da polpa foram viáveis quando expostas a diferentes concentrações de HAp, proliferaram mais quando tratadas com HAp na concentração de 1/100, migraram em direção aos materiais estudados e diferenciaram-se em tecido mineralizado quando em contato direto com ambos materiais estudados. Concluímos que o novo material testado é biocompatível e capaz de induzir mineralização em células de polpa dental sugerindo que as HAp podem ter aplicações clínicas futuras em tecidos mineralizados como osso e dente. / The dental pulp cells have the potential to respond to external stimuli and repair the dental tissue injury. On teeth, deep carious lesions and traumatic injuries are common and result in pulp changes. With the development of science and the search for innovative treatment forms using reduced size biomaterials, to verify the biocompatibility of these materials before clinical application has become necessary and promising. Thus, the purpose of this study was to evaluate the biocompatibility of a new hydroxyapatite nanoparticle using human pulp cells in culture. The nanoparticles of hydroxyapatite (HAp) used in our study are new material and not yet available for clinical practice. As a comparator, we used the material already used in dentistry to root canal treatment, the Mineral Trioxide Aggregate (MTA). To do so, biocompatibility (MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-y)5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil-2H-tetrazolio)). A solution of the material in a concentration of 0.1 g / ml diluted in culture medium recommended by ISO 10993-12 (ISO 1996) standard was prepared. This solution was diluted in three different concentrations (1/10, 1/100 and 1/1000). Were also performed cell migration and differentiation capacity assays at a concentration of 1/100. As results, we found that the pulp cells were viable when exposed to different concentrations of HAp, they proliferated more when treated with 1/100 HAp concentration, migrated toward the studied materials and differed into mineralized tissue when there was direct contact with both materials studied. We conclude that the new material tested is biocompatible and able to induce mineralization of dental pulp cells suggesting that the HAp may have future clinical applications in mineralized tissues such as bone and tooth.

RESUMO Comparou-se os períodos de latência e duração da lidocaína 2% associada à adrenalina 1:100.000 (Lidocaína 100 ® da DFL), e da articaína 4% associada à adrenalina 1:200.000 (Septanest 1:200.000 ® da Septodont) e 1:100.000 (Septanest 1:100.000 ® da Septodont), na polpa dentária e gengiva vestibular, em anestesias locais infiltrativas maxilares. Vinte pacientes voluntários, saudáveis, de ambos os sexos, entre 18 e 50 anos de idade receberam tratamento restaurador de baixa complexidade ou selamento de cicatrículas e fissuras nas superfícies oclusais de três dentes superiores posteriores de uma mesma hemiarcada. Cada paciente recebeu, aleatoriamente, um tubete (1,8 ml) de cada solução anestésica local em três consultas. Os períodos de latência e duração da anestesia local na polpa dentária foram monitorados com um aparelho estimulador pulpar elétrico (Vitality Scanner Model 2005 ® da Analytic Endodontics) e na gengiva vestibular por meio do estímulo com a ponta de um explorador. Através do Teste de Kruskal-Wallis foram detectadas diferenças estatisticamente significantes ao nível de 5% entre lidocaína 2% associada à adrenalina 1:100.000, quando comparada tanto com a articaína 4% associada à adrenalina 1:200.000 quanto com a articaína 4% associada à adrenalina 1:100.000, para as variáveis: período de latência e duração na polpa dentária e período de duração na gengiva, sendo que a lidocaína 2% associada à adrenalina 1:100.000 apresentou a maior média para o período de latência pulpar e as menores médias para os períodos de duração na polpa dentária e na gengiva (respectivamente, 2,8, 39,2 e 42,2 minutos),quando comparada à articaína 4% associada à adrenalina 1:200.000 (respectivamente, 1,6, 56,7 e 55,3 minutos) e 1:100.000 (respectivamente, 1,4, 66,3 e 64,7 minutos). Houve diferença estatisticamente significante entre as duas soluções de articaína apenas para o período de duração na gengiva, cuja maior média foi a da articaína 4% associada à adrenalina 1:100.000. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos para o período de latência gengival. Conclui-se que as soluções de articaína apresentam latência mais curta e duração mais longa do que a solução de lidocaína quando da anestesia pulpar. Para a latência gengival não há diferença entre as três soluções testadas, porém, para a duração gengival, a solução de articaína 4% associada à adrenalina 1:100.000 apresenta a maior duração. / SUMMARY Local anesthesias by maxillar infiltration with 2% lidocaine associated with 1:100.000 adrenalin (Lidocaina 100 ® by DFL), 4% articaine associated with 1:200.000 (Septanest 1:200.000 ® by Septodont) and 1:100.000 adrenalin (Septanest 1:100.000 ® by Septodont) were compared concerning to their onset and duration on dental pulp and gingiva. Twenty healthy volunteer patients, of both gender, between 18 and 50 years of age, received filling treatment of low complexity or fissure sealing on the occlusal surface of three superior posterior teeth of the same side. Each patient randomly received an ampoule (1,8ml) of each local anesthetic solution on three appointments. The onset and duration periods of local anesthesia on dental pulp were monitored with an electric pulptester (Vitality Scanner Model 2005 ® by Analytic Endodontics) and on buccal gingiva by the stimulus performed with the point of a probe. Kruskall-Wallis test identified statistic significant difference by the level of 5% between 2% lidocaine associated with 1:100.000 adrenalin when compared with both 4% articaine associated with 1:200.000 or 1:100.000 adrenalin for the following variants: onset and duration periods on dental pulp and duration period on gingiva. 2% lidocaine associated with 1:100.000 adrenalin presented the longest average for onset period on dental pulp and the minorest averages for duration periods on dental pulp and gingiva (respectively, 2,8, 39,2 and 42,2 minutes), when compared with 4% articaine associated with 1:200.000 (respectively, 1,6, 56,7 and 55,3 minutes) and 1:100.000 adrenalin (respectively, 1,4, 66,3 and 64,7 minutes). There was statistic significant difference between the two articaine solutions just for duration period on gingiva, whose longest average was that of 4% articaine associated with 1:100.000 adrenalin. There was no statistic significant difference between the groups for onset period on gingiva. It can be concluded that both articaine solutions present faster onset and longer duration than the lidocaine solution on pulpal anesthesia. For gingival onset there is no difference between the three tested solutions, however, for gingival duration, 4% articaine associated with 1:100.000 adrenalin presents the longest duration.

A regeneração óssea é um processo complexo que exige a atuação coordenada de vários sinalizadores bioquímicos para promover as diversas fases da angiogênese e osteogênese. Diversas pesquisas têm focado no entendimento da biologia molecular com o objetivo de promover e acelerar a regeneração do tecido ósseo. Este estudo avaliou o potencial osteogênico e angiogênico da polpa dentária (PD) fresca e o efeito das proteínas derivadas da matriz do esmalte (EMD) neste tecido, obtido imediatamente após a exodontia, sem isolamento e cultura destas células. Trinta e seis amostras foram utilizadas, cada uma constistuída de um pool de tecidos da polpa removidos de 2 dentes de um mesmo paciente. No grupo controle, as amostras foram inseridas em criotubo e mantidas por 20 minutos em temperatura ambiente. No grupo teste, foi realizada aplicação de EMD (Emdogain®) na proporção de 1:1 e também mantidas por 20 minutos em temperatura ambiente. Análise de expressão gênica de Runx2, Osterix, ALP, BSP, OPN, VEGF-A, FGF-2 foi realizada através da Reação da Transcriptase Reversa em Cadeia da Polimerase (qRT-PCR). As análises imunológicas foram realizadas pelo imunoensaio Multiplex Cytokine Profiling (Luminex) para níveis de OCN, OPN, EGF, Angiopoietina-2, BMP-9, FGF-1, FGF-2, VEGF-A, VEGFC, VEGF-D. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente. Os genes BSP e OPN apresentaram níveis significativamente maiores (p < 0,05) no Grupo Controle. Em relação à Osterix e FGF-2, houve maior expressão (p < 0.05) no Grupo Teste. Nos genes Runx-2, ALP e VEGF-A, não foi possível observar diferenças significativas entre os grupos. Na análise imunológica, OCN e OPN apresentaram níveis significativamente maiores (p < 0,05) no Grupo Controle. Já os níveis de Angiopoietin-2, BMP-9, FGF-1, VEGF-C, VEGF-D, VEGFA e FGF-2 tiveram maior expressão (p < 0,05) no Grupo Teste. Para os níveis de EGF, não foi observada diferença estatística (p < 0,05) entre os grupos. De acordo com os achados deste estudo, a aplicação de EMD no tecido pulpar em modelo ex vivo, aumentou a expressão gênica e proteica relacionada ao processo angiogênico, podendo, portanto, favorecer a regeneração óssea. No entanto, ensaios clínicos são necessários para confirmar os achados deste estudo e para que esta proposta terapêutica seja validada. / Bone regeneration is a complex process that requires coordinated biochemical signaling to promote the various stages of angiogenesis and osteogenesis. In order to promote and accelerate bone regeneration, many studies have focused on molecular biology knowledge of this process. This in vitro study investigated the angiogenic and osteogenic potential of fresh dental pulp tissue with or without enamel matrix derivative (EMD) stimulation through gene and protein expression. Thirty-six samples were obtained, each one composed by a pool of pulp tissue removed from 2 teeth of the same patient. In the control group, immediately after tooth extraction, dental pulp tissue was collected and inserted in cryotube and left 20 minutes at room temperature. In the test group, EMD was applied and left 20 minutes at room temperature. Gene expression of Runx2, Osterix, ALP, BSP, OPN, VEGF-A, FGF-2 was assessed by qRT-PCR. Immunological analysis of OCN, OPN, EGF, Angiopoietin-2, BMP-9, FGF-1, FGF-2, VEGF-A, VEGF-C and VEGF-D levels was performed by Multiplex Cytokine Profiling (Luminex). Test Group presented significantly lower mean levels of BSP and OPN than Control Group (p<0,05). Osterix and FGF-2 mean levels were higher (p<0,05) in Test Group than Control Group. Immunological analyisis showed that OCN and OPN mean levels were significant lower in Test Group (p<0,05). However, Test Group presented significantly higher mean levels of ANGIOPOIETINA-2 BMP-9, FGF-1, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-A (p<0,05). EMD application in dental pulp tissue in ex vivo model increased gene and protein expression related to angiogenesis and can actuate in bone regeneration process. However, randomized clinical trials are required to confirm our findings and to validate this therapy approach.

A retina é composta por células neuronais especializadas, que quando danificadas são incapazes de se regenerar. CTIPD são uma promissória fonte para substituir o tecido lesado pois são capazes de se diferenciar em quase todos os tipos celulares. O objetivo do estudo é avaliar o potencial de diferenciação das CTIPD em neurônios retinais. As CTIPD foram submetidas a formação de neuroesfera, a qual foi avaliada pela expressão de nestin, <font face=\"Symbol\">b-III-tubulin e Pax-6. A partir da neuroesfera foi realizada a indução da diferenciação em neurônios retinais, a qual foi avaliada pela expressão dos marcadores específicos da diferenciação retinal. Observou-se a reação positiva com nestin, <font face=\"Symbol\">b-III-tubulin e Pax-6 na esfera, sugerindo um comprometimento com a linhagem neural/retinal. Nas células diferenciadas observamos uma maior expressão de Chx-10 e Crx e menor de Nrl, Calbindin, Recoverin e Rhodopsin. Este estudo sugere que CTIPD apresentam potencial de desenvolvimento em neurônios retinais. Entretanto, estudos adicionais são necessários para elucidar a formação da retina neural. / Retina is composed of specialized neuronal cells, which in case of damage are unable to regenerate. CTIPD is a promissory source to replace the injured tissue because they can differentiate into almost all cell types. The aim of the study was to evaluate the differentiation potential of CTIPD in retinal neurons. CTIPD were submitted to neurosphere formation and evaluated by the expression of nestin, <font face=\"Symbol\">b-III-tubulin and Pax-6. From the neurosphere was performed the induction of differentiation into retinal neurons, which was assessed by the expression of specific markers of retinal differentiation. We observed a positive reaction with nestin, <font face=\"Symbol\">b-III-tubulin and Pax-6 in the sphere, suggesting a commitment to the neural/retinal lineage. In differentiated cells we found a higher expression of Chx-10 and Crx and a lower expression of Nrl, Calbindin, Recoverin and Rhodopsin. This study suggests that CTIPD show potential development into retinal neurons. However, additional studies are needed to elucidate the formation of the neural retina.

A polpa do dente contém uma população de células-tronco multipotentes, que possuem a capacidade de se diferenciar em várias linhagens celulares distintas, in vitro e in vivo. Estas células possuem origem mesenquimal e, acredita-se que sejam derivadas da crista neural. Elas podem ser induzidas a se diferenciar em células de osso, cartilagem, músculo liso e esquelético. Há trabalhos também que descrevem a diferenciação neural destas células, com base principalmente em caracterizações morfológica e protéica. Contudo, um número crescente de dados sugere que a diferenciação neural de células de origem mesenquimal, pode, na verdade, ser um artefato de cultura. Neste contexto, se torna de grande importância introduzir nos estudos medidas de eletrofisiologia que possam confirmar a identidade neural destas células. Nosso objetivo foi isolar e caracterizar células-tronco de polpa de dente decíduo humano (IDPSC), verificando se as mesmas poderiam configurar um bom modelo para estudo da diferenciação neural in vitro. No presente trabalho, nós descrevemos uma população de IDPSCs indiferenciadas capazes de se diferenciar em adipócitos e osteócitos in vitro. Quando tratadas com ácido retinóico as IDPSC exibiram morfologia semelhante à de células neurais, além de apresentar expressão de proteínas neurais e disparar potencial de ação. Porém, curiosamente, as células sem tratamento também expressam esses marcadores e apresentam resposta eletrofisiológica, limitando a interpretação acerca do valor que o tratamento teria na promoção da diferenciação neural e, conseqüentemente, restringindo a utilização das mesmas como modelo de estudo da diferenciação neural in vitro. Apesar de a questão acerca da capacidade das IDPSCs em se diferenciar para neurônios permanecer não respondida, as IDPSCs foram capazes de direcionar a diferenciação neural de células-tronco embrionárias em ensaios de co-cultura. Estes resultados reforçam trabalhos prévios que mostram que as células-tronco de polpa de dente podem ser boas candidatas para terapia celular. / Post-natal stem cells have been isolated from a multiple source of tissues, as bone marrow, brain, skin, hair follicle and muscle. Many works have shown that these cells exhibit plasticity higher than the first believed and are able to transdifferentiate into cells from other germ layer origin. From dental pulp tissue is possible to isolate a population of multipotent stem cell which have mesenchymal origin and are supposed to be derived from neural crest. They can be induced to differentiate into mesodermal cell types, like chondrocyte, osteocyte and adipocyte. It has been also reported that they are able to transdifferentiate into neural cells. However, increasing data suggests that neural transdifferentiation of cells from mesenchymal origin, actually, may be an artifact of culture, due to cellular stress, for example. In front of this, it becomes of great importance to show that the expected differentiated cells exhibit functional responses, by the investigation of electrophysiological properties. Here we describe a population of undifferentiated human dental pulp stem cell that can be induced to differentiate into adipocytes and osteocytes in vitro. When treated with retinoic acid they showed neural cell like morphology, expressed neural markers and were able to fire action potentials. However, curiously, undifferentiated cells also exhibited the same responses, limiting the interpretation of neural treatment effect and, therefore, restricting the use of IDPSCs as a model for neural differentiation in vitro. Although the question of whether or not DPSC are able to become a neuron remains unsolved, these cells were able to direct neural differentiation of embryonic stem cells in co-culture assays. These findings in conjunction with previous works which shows DPSCs can exercise neuroprotective and neurotrophic effects indicate they may be a feasible candidate for cellular therapy.

Os tecidos dentais apresentam-se como fontes abundantes e de fácil obtenção de células-tronco de diferentes tipos, como é o caso das células-tronco derivadas do epitélio dental, papila dental, ligamento periodontal e folículo dental que possuem origem ectomesenquimal oriundas da crista neural, com a exceção do epitélio dental que é oriundo do ectoderma. As células-tronco de polpa dentária humana (CTPD) expressam estavelmente marcadores de células-tronco adultas (CTA), CD105 e CD73 durante as passagens contínuas, e um grupo de antígenos estágios-específicos de superfície celular, SSEA-3, SSEA-4 e fatores de transcrição de células-tronco embrionárias (CTE) TRA1-60, TRA1-81, Oct-4 e Nanog. Além disso, estas células são capazes de se diferenciar in vitro em vários tipos de células e tecidos: cartilagem, osso, tecido neural, músculo liso e esquelético. Em suínos, modelo animal amplamente utilizado para o estudo de várias doenças encontradas em humanos, os dentes caninos possuem crescimento contínuo que pode ser uma característica bastante interessante quando pensamos em células-tronco. Dessa forma, o estudo das células de polpa dentária desse animal merece destaque. Neste trabalho visamos estabelecer o cultivo e a caracterização de células-tronco derivadas da polpa dentária dos dentes caninos dos suínos com crescimento contínuo (PDS) e dos dentes molares visando um estudo comparativo. O cultivo das células-tronco de polpa dentária de canino e molar foi estabelecido e de acordo com os nossos resultados podemos dizer que as células-tronco de polpa dentária de suíno são de fácil obtenção, já que o dente é descartado após o abate do animal e não tem nenhum valor comercial. Até o momento não observamos diferenças relacionados ao crescimento contínuo dos dentes caninos e as células-troncos isoladas possuem características mesenquimais como era esperado. E ainda, os resultados obtidos neste trabalho poderão contribuir para aquisição de uma nova fonte de células-tronco, cuja obtenção em abatedouros poderá ser contínua, aumento assim a quantidade podendo ser utilizada na Terapia Celular. / The dental tissue presents itself as an easy and abundant source to obtain stem cells of different types, such as stem cells derived from dental epithelium, dental papilla, periodontal ligament and dental follicle origin that have originated from ectomesenquimal neural crest, with the exception of dental epithelium that arises from the ectoderm. Stem cells from human dental pulp (TCDC) stably express markers of adult stem cells (CTA), CD105 and CD73 during continuous passages, and a group of stage-specific antigens of cell surface SSEA-3, SSEA-4 and transcription factors of embryonic stem cells (ESC) TRA1-60, TRA1-81, Oct-4 and Nanog. Furthermore, these cells are able to differentiate in vitro into cartilage, bone, neural tissue, skeletal and smooth muscle. In pigs, an animal model widely used for the study of several human diseases, the canine teeth continues to grow and can be a very interesting feature regarding stem cells. Thus, the study of dental pulp cells in this species is worthy consideration. The aim of this work was to establish the cultivation and characterization of stem cells derived from dental pulp from pigs canine teeth with continuous growth (PDS) and the molar teeth, seeking a comparative study. The cultivation of stem cells from canine dental pulp and molar teeth have been established and, according to our results, we can say that stem cells from porcine dental pulp are easy to obtain, since the tooth is discarded when the animal is slaughtered and has no commercial value. So far no differences related to the continued growth of the canine teeth were observed and the isolated stem cells presented mesenchymal characteristics as expected. The results obtained in this study may contribute to the acquisition of a new source of stem cells, which can be obtained continuously in slaughterhouses, thus increasing the amount of samples to be used in cell therapy.

Em busca de novas estratégias para o reparo de tecidos pulpares com células-tronco faz-se necessário compreender melhor o nicho em que elas se encontram. Uma forma é observar o mecanismo de ativação sobre estas células durante o reparo de tecidos pulpares após sofrer uma injúria. Assim, foi proposto estudar a localização e composição do nicho das célulastronco da polpa dental através da exposição pulpar induzida in vitro em dentes humanos e in vivo em dentes de ratos, através da incorporação de Bromodeoxiuridina (BrdU) e Iododeoxiuridina (IdU) e co-expressão com proteínas de células-tronco. Para o ensaio in vitro, 33 terceiros molares humanos com rizogênese incompleta foram divididos em 3 grupos: dentes com exposição pulpar induzida e mantidos em cultivo (GCE, grupo cultura exposição) (n=15); dentes sem injúria e mantidos em cultivo (GCC, grupo cultura controle) (n=15); dentes hígidos apenas (GH, grupo hígido) (n=3). Os grupos GCE e GCC, foram cultivados com BrdU (10 l/ml) por 24h e posteriormente analisados após 2, 5 e 14 dias. Para o ensaio in vivo, 12 ratos Wistar receberam IdU (1mg/ml) diluído na água por 30 dias. Após 45 dias foram divididos em 2 grupos: grupo in vivo com exposição pulpar (GIVE) (n=17 dentes) e grupo in vivo controle (GIVC) (n=16 dentes). No GIVE foi realizada a exposição pulpar no primeiro molar e em seguida restaurado com Coltosol. Após 2, 4 e 8 dias pós-operatórios as amostras foram coletadas e processadas para análise histológica e imuno-histoquímica. As proteínas CD90, CD146, PDGFr e BrdU foram analisadas em duas áreas: lesão e centro em molares humanos enquanto, as proteínas CD90, NG2 e IdU foram analisadas em uma área única, em molares de rato. As análises estatísticas foram efetuadas pelos testes de Mann- Whitney e Kruskal-Wallis, p 5%. Em dentes humanos, na área de lesão do grupo GCE, células BrdU positivas foram encontradas nos três períodos, sendo presentes em maior número células PDGFr positivas nos dias 2 e 5 e células CD90 positivas no 14º dia; no centro pulpar, no 2º dia pós injúria houve um número semelhante de células CD90, CD146 e PDGFr positivas, sendo encontradas em maior porcentagem no 5º dia células PDGFr e CD90 positivas e 14º dia células CD90 positivas. No grupo GCC na área equivalente à lesão, células CD90 (2 e 5 dias) e PDGFr (14 dias) positivas foram encontradas em maior percentual; no centro pulpar, o número de células positivas para CD90, CD146 e PDGFr foi semelhante em todos os períodos, sendo encontradas células BrdU positivas no 2º dia. Em molares de ratos, no GIVE houveram mais células NG2 positivas no 2º dia, IdU no 4º dia e CD90 no 8º dia. No GIVC, o CD90 foi altamente expresso em todos os períodos analisados, a proteína NG2 também foi expressa em odontoblastos e CD90 na camada subodontoblástica em molares de rato. Todas as proteínas mencionadas coexistem no tecido pulpar humano e animal formando populações celulares heterogêneas perivasculares e perineurais encontradas em maior concentração em regiões próximas à área de injúria, sugerindo que nichos perivasculares e perineurais participam em conjunto na homeostase pulpar em resposta à injúria. / In pursuit of new strategies for pulp tissue repair with stem cells, it is necessary to better understand the niche in which they are found. One way is to observe the mechanism of these cells activation during the repair of pulp tissues after suffering an injury. Thus, it was proposed to study the location and composition of the dental pulp stem cell niche through induced dental pulp exposure in vitro in human teeth and in vivo in rat teeth by incorporating Bromodeoxyuridine (BrdU) and Iododeoxyuridine (IdU) and co-expression with stem cell proteins. For the in vitro assay, 33 human third molars with incomplete rhizogenesis were divided into 3 groups: teeth with induced pulp exposure and maintained in culture (GCE, group cultured with pulp exposure) (n = 15); healthy teeth maintained in culture (GCC, control cultured group) (n = 15); healthy teeth only (GH, healthy group) (n = 3). GCE and GCC groups were cultured with BrdU (10 l / ml) for 24 h and subsequently analyzed after 2, 5 and 14 days. For the in vivo assay, 12 Wistar rats received IdU (1mg / ml) diluted in water for 30 days. After 45 days were divided into 2 groups: in vivo group with pulp exposure (GIVE) (n = 17 teeth) and in vivo control group (GIVC) (n = 16 teeth). In GIVE, the pulp exposure was performed on the first molar and then restored with Coltosol. After 2, 4 and 8 postoperative days the samples were collected and processed for histological and immunohistochemical analysis. CD90, CD146, PDGFr and BrdU proteins were analyzed in two areas: injury and center in human molars whereas, CD90, NG2 and IdU were analysed in a single area in rat molars. Statistical analyzes were performed by the Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests, p 5%. In human teeth, in the lesion area of the GCE group, BrdU positive cells were found in the three periods, while a greater number of PDGFr positive cells on days 2 and 5 and CD90 positive cells on the 14th day was found; in the pulp center, on the second day after injury there were a similar number of CD90, CD146 and PDGFr positive cells, and found in greater percentage in the 5th day PDGFr and CD90 positive cells and in 14th day CD90 positive cells. In the GCC group, in the area equivalent to injury site, CD90 (2 and 5 days) and PDGFr (14 days) positive cells were found in a higher percentage; in the pulp center, the number of cells positive for CD90, CD146 and PDGFr was similar in all periods, and BrdU positive cells were found on day 2. In rat molars, GIVE presented more positive cells for NG2 on day 2, for IdU on day 4 and CD90 on day 8. In the GIVC, CD90 was highly expressed in all periods analysed, the NG2 protein was also expressed in odontoblasts and CD90 in the subodontoblastic layer in rat molars. All mentioned proteins coexist in the human and animal pulp tissue forming heterogeneous perivascular and perineural cellular populations found in greater concentration in regions near the area of injury, suggesting that perivascular and perineural niches participate together in pulpal homeostasis in response to injury.

A BiodentineTM, novo material composto principalmente de silicato tricálcio (Ca3SiO5), apresenta vantagens com relação ao MTA, como menor tempo de presa e uso como material restaurador temporário para esmalte e permanente para dentina. As diferenças no mecanismo de ação entre os dois materiais ainda não estão esclarecidas, assim, o objetivo deste estudo foi avaliar in vitro a viabilidade de células extraídas da polpa dental de humanos, bem como a expressão de diferentes marcadores da mineralização após o estímulo com BiodentineTM e MTA. Além disso, foi avaliada in vivo a expressão dos marcadores previamente observados após a realização de pulpotomia em dentes de cães. Nos experimentos in vitro foram utilizadas células da polpa dentária obtidas a partir de dentes extraídos por razões ortodônticas (n=6). As células foram plaqueadas na concentração de 1x105 células/poço e expostas aos materiais em diferentes concentrações (1:1, 1:10 e 1:100), por 24 e 48 horas. Ao fim dos períodos, foi realizado o Ensaio Colorimétrico MTT para verificação da viabilidade celular e o qRT-PCR para detecção de RNA mensageiro para osteopontina (SPP1), sialoproteína óssea (BSP), sialofosfoproteína dentinária (DSPP), fosfatase alcalina (ALP), proteína da matriz dentinária 1 (DMP1) e fator de transcrição relacionado ao Runt 2 (RUNX2). Os dados foram comparados por meio da análise de variância (ANOVA) de uma via seguido pelo pós-teste de Tukey ou Bonferroni (&alpha; = 0,05). Nos experimentos in vivo, foram utilizadas lâminas obtidas do banco de lâminas do Departamento de Clínica Infantil da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, nas quais foi realizada pulpotomia com MTA (n=35) e BiodentineTM (n=52) em dentes de cães. Foram realizados ensaios de imunoistoquímica para osteopontina (OPN) e fosfatase alcalina (ALP) sendo a intensidade da marcação descrita como suave, moderada e intensa. Além disso, foi realizada imunofluorescência indireta para o fator de transcrição Runx-2, na qual a porcentagem de células positivamente marcadas foi calculada pelo software Image J. Ambas as análises foram realizadas nas regiões de ponte de tecido mineralizado e tecido pulpar. Os grupos foram comparados por meio do teste exato de Fisher ou qui-quadrado ou por análise de variância (ANOVA) de uma via, seguido pelo pós-teste de Tukey (&alpha; = 0,05). No estudo in vitro, após 24 e 48 horas, a diluição 1:100 de ambos os materiais não afetou a viabilidade celular (p > 0,05) em relação ao controle. Após 48 horas, MTA e BiodentineTM induziram a expressão gênica de SPP1, ALP e RUNX2 em relação ao controle (p < 0,05). Já no estudo in vivo, na marcação da ponte de tecido mineralizado para OPN, o MTA apresentou marcações suaves em 29% dos casos e a BiodentineTM marcações suaves em 26%, moderadas em 43% e intensas em 22% (p < 0,0001). A ALP na ponte de tecido mineralizado mostrou marcações suaves para o MTA em 14% dos casos e para a BiodentineTM em 48% (p < 0,0001). A OPN no tecido pulpar radicular para o MTA apresentou 29% de marcação no terço cervical e 29% no médio, sem marcação no apical e para a BiodentineTM apresentou 52% de marcação no cervical, 26% no médio e 26% no apical (p < 0,0001). A marcação para ALP no tecido pulpar não apresentou diferença entre os materiais (p = 0,2). Não houve diferença no número de células positivamente marcadas pela imunofluorescência para Runx-2, entre os materiais estudados e o controle (p > 0,05). A BiodentineTM foi capaz de estimular marcadores da mineralização de forma semelhante ao MTA, porém mais intensamente, com maior formação de pontes de tecido mineralizado, o que poderia ser vantajoso a longo prazo nos casos de tratamentos endodônticos conservadores. / BiodentineTM, a new material composed mainly of tricalcium silicate (Ca3SiO5), shows advantages compared to the MTA, as such less setting time and use as temporary restoring material to enamel and permanent to dentine. Differences in action mechanisms between the two materials are not clarified yet, therefore, the aim of this study was to compare the cellular viability of dental pulp cells when in contact with BiodentineTM and MTA in addition to the mineralization markers expression induced by both, in vitro and in vivo. For the in vitro experiments, dental pulp cells obtained from teeth extracted for orthodontic reasons (n=6) were used. The cells were plated in a density of 1x105 cells/well and exposed to both materials in different concentrations (1:1, 1:10 and 1:100), obtained from serial dilution of an initial extract (1:1), for 24 and 48 hours. At the end of the periods, the Colorimetric MTT Assay was used for cellular viability verification and the qRT-PCR for messenger RNA detection of osteopontin (SPP1), bone sialoprotein (BSP), dentin sialophosphoprotein (DSPP), alkaline phosphatase (ALP), dentin matrix protein 1 (DMP1) and Runt-related transcription factor 2 (RUNX2) was performed. Data were compared through analysis of variance (one-way ANOVA) followed by the Tukeys or Bonferroni post-test (&alpha; = 0.05). For in vivo experiments, histological slides derived from teeth of dogs, on which it was performed pulpotomy with MTA (n=35) and BiodentineTM (n=52), were obtained from a slides bank of Departamento de Clínica Infantil da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto. Immunohistochemistry for osteopontin (OPN) and alkaline phosphatase (ALP) were performed and the percentage of positively marked cells for the transcription factor Runx-2 by indirect immunofluorescence was calculated with the assistance of the software Image J. The groups were compared through the exact Fishers test or chi-square or analysis of variance (one-way ANOVA), followed by Tukeys post-test (&alpha; = 0.05). After 24 and 48 hours, the dilutions 1:100 of both materials did not affect the viability (p > 0.05) in comparison to control group. After 48 hours, MTA and BiodentineTM induced higher gene expression of SPP1, ALP and RUNX2 in comparison to control group (p < 0.05). In mineralized tissue bridge immunostaining for OPN, MTA showed mild staining in 29% of the cases and BiodentineTM mild staining in 26%, moderate staining in 43% and intense in 22% of the cases (p < 0.0001). Mineralized tissue bridge immunostaining for ALP showed mild staining for MTA in 14% of the cases and for BiodentineTM in 48% (p < 0.0001). The OPN immunostaining on radicular pulp tissue for MTA showed 29% of staining on cervical third, 29% on the middle third and no staining on the apical third, while BiodentineTM showed 52% stained on cervical third, 26% on the middle third, and 26% on the apical third (p < 0.0001). Immunostaining for ALP on the pulp tissue did not show difference between the two materials (p = 0.2). There was no difference in the number of positively marked cells by the immunofluorescence for RUNX-2, between the studied materials and the control group (p > 0.05). BiodentineTM was able to stimulate mineralization markers in a similar to MTA manner, but more intense, with greater formation of mineralized tissue bridges. These results indicate that BiodentineTM could be useful in long term in cases of conservative endodontic treatments.

A regeneração óssea é um processo complexo que exige a atuação coordenada de vários sinalizadores bioquímicos para promover as diversas fases da angiogênese e osteogênese. Diversas pesquisas têm focado no entendimento da biologia molecular com o objetivo de promover e acelerar a regeneração do tecido ósseo. Este estudo avaliou o potencial osteogênico e angiogênico da polpa dentária (PD) fresca e o efeito das proteínas derivadas da matriz do esmalte (EMD) neste tecido, obtido imediatamente após a exodontia, sem isolamento e cultura destas células. Trinta e seis amostras foram utilizadas, cada uma constistuída de um pool de tecidos da polpa removidos de 2 dentes de um mesmo paciente. No grupo controle, as amostras foram inseridas em criotubo e mantidas por 20 minutos em temperatura ambiente. No grupo teste, foi realizada aplicação de EMD (Emdogain®) na proporção de 1:1 e também mantidas por 20 minutos em temperatura ambiente. Análise de expressão gênica de Runx2, Osterix, ALP, BSP, OPN, VEGF-A, FGF-2 foi realizada através da Reação da Transcriptase Reversa em Cadeia da Polimerase (qRT-PCR). As análises imunológicas foram realizadas pelo imunoensaio Multiplex Cytokine Profiling (Luminex) para níveis de OCN, OPN, EGF, Angiopoietina-2, BMP-9, FGF-1, FGF-2, VEGF-A, VEGFC, VEGF-D. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente. Os genes BSP e OPN apresentaram níveis significativamente maiores (p < 0,05) no Grupo Controle. Em relação à Osterix e FGF-2, houve maior expressão (p < 0.05) no Grupo Teste. Nos genes Runx-2, ALP e VEGF-A, não foi possível observar diferenças significativas entre os grupos. Na análise imunológica, OCN e OPN apresentaram níveis significativamente maiores (p < 0,05) no Grupo Controle. Já os níveis de Angiopoietin-2, BMP-9, FGF-1, VEGF-C, VEGF-D, VEGFA e FGF-2 tiveram maior expressão (p < 0,05) no Grupo Teste. Para os níveis de EGF, não foi observada diferença estatística (p < 0,05) entre os grupos. De acordo com os achados deste estudo, a aplicação de EMD no tecido pulpar em modelo ex vivo, aumentou a expressão gênica e proteica relacionada ao processo angiogênico, podendo, portanto, favorecer a regeneração óssea. No entanto, ensaios clínicos são necessários para confirmar os achados deste estudo e para que esta proposta terapêutica seja validada. / Bone regeneration is a complex process that requires coordinated biochemical signaling to promote the various stages of angiogenesis and osteogenesis. In order to promote and accelerate bone regeneration, many studies have focused on molecular biology knowledge of this process. This in vitro study investigated the angiogenic and osteogenic potential of fresh dental pulp tissue with or without enamel matrix derivative (EMD) stimulation through gene and protein expression. Thirty-six samples were obtained, each one composed by a pool of pulp tissue removed from 2 teeth of the same patient. In the control group, immediately after tooth extraction, dental pulp tissue was collected and inserted in cryotube and left 20 minutes at room temperature. In the test group, EMD was applied and left 20 minutes at room temperature. Gene expression of Runx2, Osterix, ALP, BSP, OPN, VEGF-A, FGF-2 was assessed by qRT-PCR. Immunological analysis of OCN, OPN, EGF, Angiopoietin-2, BMP-9, FGF-1, FGF-2, VEGF-A, VEGF-C and VEGF-D levels was performed by Multiplex Cytokine Profiling (Luminex). Test Group presented significantly lower mean levels of BSP and OPN than Control Group (p<0,05). Osterix and FGF-2 mean levels were higher (p<0,05) in Test Group than Control Group. Immunological analyisis showed that OCN and OPN mean levels were significant lower in Test Group (p<0,05). However, Test Group presented significantly higher mean levels of ANGIOPOIETINA-2 BMP-9, FGF-1, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-A (p<0,05). EMD application in dental pulp tissue in ex vivo model increased gene and protein expression related to angiogenesis and can actuate in bone regeneration process. However, randomized clinical trials are required to confirm our findings and to validate this therapy approach.

A busca por um material de enxertia que se adapte às necessidades do cirurgião bucomaxilofacial e também que proporcione ao paciente retorno de sua função com menores danos possíveis, tem sido incessante. O enxerto autógeno é ainda hoje considerado padrão ouro devido suas propriedades, porém, ele apresenta algumas desvantagens, sendo que as maiorias de suas complicações estão associadas ao leito doador. Atualmente, a engenharia de biomateriais trabalha com o desenvolvimento de novos materiais e recursos principalmente na área de regeneração tecidual. Neste contexto, scaffolds de origem natural ou sintética com o propósito de promover a regeneração de tecidos tem sido amplamente estudados. O objetivo desse estudo foi avaliar in vitro o comportamento biológico quanto à viabilidade, proliferação celular, adesão e potencial de diferenciação de células tronco de polpa dentária humana cultivadas sobre amostras de scaffold composto por uma nova blenda de poli ?-caprolactona/poli (rotaxano). Células tronco de polpa dentária de molares humanos (hDPSCs) foram cultivadas a partir de amostras congeladas e re-caracterizadas. As células foram semeadas sobre amostras dos scaffolds e sob lamínulas de vidro e cultivadas em diferentes meios: clonogênico, mineralizante e condicionado pelo extrato do biomaterial por 1,3,7,14 e 21 dias. Foram avaliadas as curvas de crescimento e viabilidade celulares, a atividade de fosfatase alcalina, a formação de nódulos de mineralização. A adesão celular foi observada por microscopia eletrônica de varredura até o cultivo de 7 dias. Os scaffolds eram lisos, flexíveis e mostraram-se anfifílicos com características físicas de fibras dispostas aleatoriamente e poros interconectados com diâmetro médio de 13,5?m e abertura com área média de 87,14µm2. As hDPSCs expressaram níveis típicos de marcadores de superfície de células-tronco mesenquimais. Não houve inibição de crescimento celular na interface com o biomaterial. As curvas de crescimento e viabilidade mostraram-se mais significativas (p<0.01), especialmente em 7 dias, para as culturas sobre os scaffolds em meio clonogênico. Resultados semelhantes foram observados com o meio mineralizante (p<0.05). Houve maior formação de nódulos de mineralização nas culturas com a presença dos scaffolds, ou seja, o biomaterial estimulou a diferenciação celular. Em microscopia eletrônica de varredura as células mostraram-se aderidas até o período de 7 dias com formação de lençóis sobre os scaffolds. A blenda de poli £-caprolactona/poli (rotaxano) apresentou biocompatibilidade in vitro, revelando aspectos promissores de serem funcionalizadas por células tronco derivadas de polpa dentária humana com potencial de uso como biomaterial bioativo para bioengenharia de tecido ósseo. / The search for a graft material that provides patient with rehabilitation with little damage and also suits maxillofacial surgeon needs has been incessant. Autogenous bone is still considered the gold standard for grafting because of its properties, although it has some disadvantages and the majority of its complications are associated with the donor site. Currently, bioengineering develops new materials and resources primarily for tissue regeneration area. In this context, scaffolds of natural or synthetic origin with the purpose of promoting tissue regeneration have been widely studied. The aim of this study was to evaluate in vitro biological behavior as viability, cell proliferation, adhesion and potential of stem cell differentiation of human dental pulp grown on scaffold samples composed of a new blend of poly £-caprolactone/poly(rotaxano). Dental pulp stem cells obtained from human molars (hDPSCs) were grown from frozen samples and re-characterized. Cells were seeded onto scaffolds samples or glass coverslips and cultured in different media: clonogenic, mineralizing and conditioned by the biomaterial extract per 1,3,7,14 and 21 days. Cells growth curves and viability, alkaline phosphatase activity, formation of mineralized nodules were assessed. Cell adhesion was observed by scanning electron microscopy up to 7 days cultures. Scaffolds were flat, flexible and proved to be amphiphilic with physical characteristics of randomly arranged fibers and pores interconnected with an average diameter of 13,5?m and aperture average area of 87,14µm2. The hDPSCs expressed typical levels of mesenchymal stem cell surface markers. There was no inhibition of cell growth at the biomaterial interface. The growth rates and viability were more significant (p <0.01), especially in 7 days, to cultures over scaffolds in clonogenic medium. Similar results were observed with the mineralizing medium (p <0.05). There formation of mineralized nodules was increased in the cultures in the presence of scaffolds, in other words, the biomaterial stimulated cell differentiation. In scanning electron microscopy the cells were shown to be attached until 7-day period with formation of sheets over the scaffolds. The blend of poly ?-caprolactone/poly(rotaxano) shows biocompatibility in vitro, revealing promising aspects to be functionalized by stem cells derived from human dental pulp with potential to be used as bioactive biomaterials for bone tissue bioengineering.