A deficiência da desidrogenase de acilas-CoA de cadeia média (MCAD) é um defeito da oxidação de ácidos graxos (DOAG) bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de acilcarnitinas de cadeia média (MCAC) em tecidos e líquidos biológicos de indivíduos afetados. Clinicamente os pacientes apresentam sintomas neurológicos como letargia e coma, geralmente desencadeados por episódios de descompensação metabólica. Outros distúrbios importantes entre os DOAG são as deficiências da proteína trifuncional mitocondrial (MTPD) e da desidrogenase de 3-hidroxiacilas-CoA de cadeia longa (LCHADD) que são caracterizadas pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia longa e seus derivados 3- hidroxilados (LCHFA). Geralmente, os pacientes afetados apresentam disfunção cardíaca e hepática podendo também apresentar sinais de comprometimento neurológico. Até o momento, a hipoglicemia e a toxicidade dos ácidos graxos acumulados têm sido relacionados com a fisiopatologia dessas doenças, embora os mecanismos responsáveis pelo dano tecidual não são bem conhecidos. Assim, foram investigados os efeitos dos MCAC e LCHFA sobre importantes parâmetros da função redox e homeostase energética mitocondrial em cérebro e coração de ratos, bem como a produção de superóxido e morte celular em culturas de fibroblastos da pele de pacientes afetados por essas doenças. Primeiramente, observamos que as MCAC induzem dano oxidativo lipídico e proteico, além de reduzir as defesas antioxidantes não enzimáticas em cérebro de ratos, provavelmente através da indução de radicais hidroxil e peroxil. Além disso, evidenciamos aumento dos níveis de superóxido e de morte celular em fibroblastos de pacientes afetados pela MTPD em condições padrão de cultivo indicando uma exposição crônica a níveis mais elevados de superóxido e uma vulnerabilidade à morte celular. Fibroblastos de pacientes afetados pelas MTPD e MCADD também apresentaram aumento dos níveis de superóxido quando cultivadas em condições de estresse metabólico, contudo não houve aumento de morte celular. Finalmente, a morte celular foi mais pronunciada em fibroblastos afetados pela MTPD em comparação com pacientes afetados pela MCADD, além de apresentar uma forte correlação com a produção de superóxido, sugerindo que esses eventos são provavelmente associados. Por outro lado, observamos que LCHFA prejudicam a homeostase energética em mitocôndrias de coração devido a um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa evidenciado pelo aumento do estado 4 da respiração e diminuição da razão de controle respiratório, pela redução do potencial de membrana, do conteúdo de NAD(P)H e da produção de H2O2. O ácido 3- hidroxitetradecanóico (3 HTA) também induziu inchaço mitocondrial provavelmente como consequência da abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) uma vez que a ciclosporina A (CsA), um inibidor clássico da abertura do poro, impediu esse efeito em mitocôndrias cardíacas carregadas com Ca2+. LCHFA também dissipadaram o potencial de membrana, diminuíram o coneúdo de NAD(P)H e de ATP na presença ou ausência de Ca2+ em mitocondriais de córtex cerebral. Além disso, na presença de Ca2+, 3 HTA induziu inchamento mitocondrial e liberação de citocromo c, que ativa rotas apoptóticas. 3 HTA também afetou a homeostase de Ca2+ evidenciado por uma reduzida capacidade de retenção de Ca2+ pela mitocôndria e induziu a produção de H2O2 na presença de Ca2+. Essas alterações foram prevenidas pelo vermelho de rutênio (RR), um bloqueador da captação mitocondrial de Ca2+, e por CsA mais ADP, inibidores da abertura do mPTP, o que implica o seu envolvimento nesses efeitos. Em contraste, LCHFA não causaram dano oxidativo nem alteraram as defesas antioxidantes em coração de ratos jovens. Em conjunto, nós demonstramos que MCAC e LCHFA que se acumulam em pacientes afetados pelas deficiências da MCAD e MTP/LCHAD, respectivamente, são potencialmente tóxicos para as funções mitocondriais essenciais em cérebro e coração de ratos. Além disso, demonstramos que fibroblastos de pacientes com MTPD cultivados em condições padrão estão sob estresse oxidativo, que é acentuado quando os fibroblastos são submetidos a condições de estresse metabólico. Presume-se que esses mecanismos fisiopatológicos podem ser responsáveis, pelo menos em parte, pelo dano tecidual característico desses pacientes. / The medium chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) deficiency is a fatty acid oxidation disorder (FAOD) biochemically characterized by accumulation of medium-chain acylcarnitines (MCAC) in tissues and biological fluids of affected individuals. The clinical presentation includes neurological symptoms as lethargy and coma, generally followed by episodes of metabolic decompensation. Other important FAOD are the mitochondrial trifunctional protein (MTPD) and the long-chain 3- hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHADD) deficiencies that are characterized by accumulation of long-chain fatty acids and their 3-hydroxylated (LCHFA) derivatives. Usually, affected patients present cardiac and hepatic dysfunction and may present signs of neurological impairment. So far, hypoglycemia and the toxicity of accumulating fatty acids have been related with the pathophysiology in these disorders, although the mechanisms responsible for tissue damage are poorly known. Thus, we investigated the effects of MCAC and LCHFA on important parameters of mitochondrial redox and energetic homeostasis in brain and heart of rats, as well as superoxide production and cell death in skin fibroblasts from patients affected by these diseases. First, we observed that MCAC induced lipid and protein oxidative damage, and reduced the antioxidant non-enzymatic defenses in rat brain, probably through induction of hydroxyl and peroxyl radicals. Furthermore, we evidenced increased superoxide levels and cell death in skin fibroblasts from MTP deficient patients under standard growing conditions indicating a chronic exposure to higher superoxide levels and a vulnerability to cell death. In addition, cells from MCADD and MTPD patients cultured under metabolic stress conditions presented increased levels of superoxide, although cell death was not increased. Finally, cell death was more pronounced in fibroblasts from MTP compared to MCAD deficient patients, and presented a strong correlation with superoxide production, suggesting that these events are probably associated. On the other hand, we observed that LCHFA provoked an impairment of heart mitochondrial energetic homeostasis, by behaving as uncouplers of oxidative phosphorylation, evidenced by increase of state 4 respiration and decrease of the respiratory control ratio, by reducing the membrane potential, the NAD(P)H content and H2O2 production. 3-Hydroxytetradecanoic acid (3 HTA) also induced mitochondrial swelling probably as a consequence of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening once cyclosporin A (CsA), a classical inhibitor, prevented this effect in heart mitochondria loaded with Ca2+. LCHFA also dissipated membrane potential, diminished NAD(P)H content and decreased ATP content in the presence or absence of Ca2+ in cerebral cortex mitochondrial preparations. Moreover, 3 HTA induced mitochondrial swelling and cytochrome c release in the presence of Ca2+, which activates apoptotic cascades. 3 HTA also affected Ca2+ homeostasis evidenced by a diminished mitochondrial Ca2+ retention capacity and induced hydrogen peroxide production in the presence of Ca2+. These alterations where prevented by ruthenium red (RR), a blocker of mitochondrial Ca2+ uptake, and by CsA plus ADP, inhibitors of the mPTP, implying its involvement in these effects. In contrast, LCHFA did not cause oxidative damage nor altered the antioxidant defenses in heart of young rats. Taken together, we demonstrated that MCAC and LCHFA found accumulated in patients affected by MCAD and MTP/LCHAD deficiencies, respectively, are potentially toxic to essential mitochondrial functions in rat brain and heart. We also found that fibroblasts from MTP deficient patients cultured under basal growing conditions are under oxidative stress that is accentuated when cultured metabolic stress conditions are used. It is presumed that these pathomechanisms may be responsible, at least in part, for the tissue damage characteristic of these patients.

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A deficiência da desidrogenase de acilas-CoA de cadeia média (MCAD) é um defeito da oxidação de ácidos graxos (DOAG) bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de acilcarnitinas de cadeia média (MCAC) em tecidos e líquidos biológicos de indivíduos afetados. Clinicamente os pacientes apresentam sintomas neurológicos como letargia e coma, geralmente desencadeados por episódios de descompensação metabólica. Outros distúrbios importantes entre os DOAG são as deficiências da proteína trifuncional mitocondrial (MTPD) e da desidrogenase de 3-hidroxiacilas-CoA de cadeia longa (LCHADD) que são caracterizadas pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia longa e seus derivados 3- hidroxilados (LCHFA). Geralmente, os pacientes afetados apresentam disfunção cardíaca e hepática podendo também apresentar sinais de comprometimento neurológico. Até o momento, a hipoglicemia e a toxicidade dos ácidos graxos acumulados têm sido relacionados com a fisiopatologia dessas doenças, embora os mecanismos responsáveis pelo dano tecidual não são bem conhecidos. Assim, foram investigados os efeitos dos MCAC e LCHFA sobre importantes parâmetros da função redox e homeostase energética mitocondrial em cérebro e coração de ratos, bem como a produção de superóxido e morte celular em culturas de fibroblastos da pele de pacientes afetados por essas doenças. Primeiramente, observamos que as MCAC induzem dano oxidativo lipídico e proteico, além de reduzir as defesas antioxidantes não enzimáticas em cérebro de ratos, provavelmente através da indução de radicais hidroxil e peroxil. Além disso, evidenciamos aumento dos níveis de superóxido e de morte celular em fibroblastos de pacientes afetados pela MTPD em condições padrão de cultivo indicando uma exposição crônica a níveis mais elevados de superóxido e uma vulnerabilidade à morte celular. Fibroblastos de pacientes afetados pelas MTPD e MCADD também apresentaram aumento dos níveis de superóxido quando cultivadas em condições de estresse metabólico, contudo não houve aumento de morte celular. Finalmente, a morte celular foi mais pronunciada em fibroblastos afetados pela MTPD em comparação com pacientes afetados pela MCADD, além de apresentar uma forte correlação com a produção de superóxido, sugerindo que esses eventos são provavelmente associados. Por outro lado, observamos que LCHFA prejudicam a homeostase energética em mitocôndrias de coração devido a um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa evidenciado pelo aumento do estado 4 da respiração e diminuição da razão de controle respiratório, pela redução do potencial de membrana, do conteúdo de NAD(P)H e da produção de H2O2. O ácido 3- hidroxitetradecanóico (3 HTA) também induziu inchaço mitocondrial provavelmente como consequência da abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) uma vez que a ciclosporina A (CsA), um inibidor clássico da abertura do poro, impediu esse efeito em mitocôndrias cardíacas carregadas com Ca2+. LCHFA também dissipadaram o potencial de membrana, diminuíram o coneúdo de NAD(P)H e de ATP na presença ou ausência de Ca2+ em mitocondriais de córtex cerebral. Além disso, na presença de Ca2+, 3 HTA induziu inchamento mitocondrial e liberação de citocromo c, que ativa rotas apoptóticas. 3 HTA também afetou a homeostase de Ca2+ evidenciado por uma reduzida capacidade de retenção de Ca2+ pela mitocôndria e induziu a produção de H2O2 na presença de Ca2+. Essas alterações foram prevenidas pelo vermelho de rutênio (RR), um bloqueador da captação mitocondrial de Ca2+, e por CsA mais ADP, inibidores da abertura do mPTP, o que implica o seu envolvimento nesses efeitos. Em contraste, LCHFA não causaram dano oxidativo nem alteraram as defesas antioxidantes em coração de ratos jovens. Em conjunto, nós demonstramos que MCAC e LCHFA que se acumulam em pacientes afetados pelas deficiências da MCAD e MTP/LCHAD, respectivamente, são potencialmente tóxicos para as funções mitocondriais essenciais em cérebro e coração de ratos. Além disso, demonstramos que fibroblastos de pacientes com MTPD cultivados em condições padrão estão sob estresse oxidativo, que é acentuado quando os fibroblastos são submetidos a condições de estresse metabólico. Presume-se que esses mecanismos fisiopatológicos podem ser responsáveis, pelo menos em parte, pelo dano tecidual característico desses pacientes. / The medium chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) deficiency is a fatty acid oxidation disorder (FAOD) biochemically characterized by accumulation of medium-chain acylcarnitines (MCAC) in tissues and biological fluids of affected individuals. The clinical presentation includes neurological symptoms as lethargy and coma, generally followed by episodes of metabolic decompensation. Other important FAOD are the mitochondrial trifunctional protein (MTPD) and the long-chain 3- hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHADD) deficiencies that are characterized by accumulation of long-chain fatty acids and their 3-hydroxylated (LCHFA) derivatives. Usually, affected patients present cardiac and hepatic dysfunction and may present signs of neurological impairment. So far, hypoglycemia and the toxicity of accumulating fatty acids have been related with the pathophysiology in these disorders, although the mechanisms responsible for tissue damage are poorly known. Thus, we investigated the effects of MCAC and LCHFA on important parameters of mitochondrial redox and energetic homeostasis in brain and heart of rats, as well as superoxide production and cell death in skin fibroblasts from patients affected by these diseases. First, we observed that MCAC induced lipid and protein oxidative damage, and reduced the antioxidant non-enzymatic defenses in rat brain, probably through induction of hydroxyl and peroxyl radicals. Furthermore, we evidenced increased superoxide levels and cell death in skin fibroblasts from MTP deficient patients under standard growing conditions indicating a chronic exposure to higher superoxide levels and a vulnerability to cell death. In addition, cells from MCADD and MTPD patients cultured under metabolic stress conditions presented increased levels of superoxide, although cell death was not increased. Finally, cell death was more pronounced in fibroblasts from MTP compared to MCAD deficient patients, and presented a strong correlation with superoxide production, suggesting that these events are probably associated. On the other hand, we observed that LCHFA provoked an impairment of heart mitochondrial energetic homeostasis, by behaving as uncouplers of oxidative phosphorylation, evidenced by increase of state 4 respiration and decrease of the respiratory control ratio, by reducing the membrane potential, the NAD(P)H content and H2O2 production. 3-Hydroxytetradecanoic acid (3 HTA) also induced mitochondrial swelling probably as a consequence of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening once cyclosporin A (CsA), a classical inhibitor, prevented this effect in heart mitochondria loaded with Ca2+. LCHFA also dissipated membrane potential, diminished NAD(P)H content and decreased ATP content in the presence or absence of Ca2+ in cerebral cortex mitochondrial preparations. Moreover, 3 HTA induced mitochondrial swelling and cytochrome c release in the presence of Ca2+, which activates apoptotic cascades. 3 HTA also affected Ca2+ homeostasis evidenced by a diminished mitochondrial Ca2+ retention capacity and induced hydrogen peroxide production in the presence of Ca2+. These alterations where prevented by ruthenium red (RR), a blocker of mitochondrial Ca2+ uptake, and by CsA plus ADP, inhibitors of the mPTP, implying its involvement in these effects. In contrast, LCHFA did not cause oxidative damage nor altered the antioxidant defenses in heart of young rats. Taken together, we demonstrated that MCAC and LCHFA found accumulated in patients affected by MCAD and MTP/LCHAD deficiencies, respectively, are potentially toxic to essential mitochondrial functions in rat brain and heart. We also found that fibroblasts from MTP deficient patients cultured under basal growing conditions are under oxidative stress that is accentuated when cultured metabolic stress conditions are used. It is presumed that these pathomechanisms may be responsible, at least in part, for the tissue damage characteristic of these patients.

A deficiência da desidrogenase de acilas-CoA de cadeia média (MCAD) é um defeito da oxidação de ácidos graxos (DOAG) bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de acilcarnitinas de cadeia média (MCAC) em tecidos e líquidos biológicos de indivíduos afetados. Clinicamente os pacientes apresentam sintomas neurológicos como letargia e coma, geralmente desencadeados por episódios de descompensação metabólica. Outros distúrbios importantes entre os DOAG são as deficiências da proteína trifuncional mitocondrial (MTPD) e da desidrogenase de 3-hidroxiacilas-CoA de cadeia longa (LCHADD) que são caracterizadas pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia longa e seus derivados 3- hidroxilados (LCHFA). Geralmente, os pacientes afetados apresentam disfunção cardíaca e hepática podendo também apresentar sinais de comprometimento neurológico. Até o momento, a hipoglicemia e a toxicidade dos ácidos graxos acumulados têm sido relacionados com a fisiopatologia dessas doenças, embora os mecanismos responsáveis pelo dano tecidual não são bem conhecidos. Assim, foram investigados os efeitos dos MCAC e LCHFA sobre importantes parâmetros da função redox e homeostase energética mitocondrial em cérebro e coração de ratos, bem como a produção de superóxido e morte celular em culturas de fibroblastos da pele de pacientes afetados por essas doenças. Primeiramente, observamos que as MCAC induzem dano oxidativo lipídico e proteico, além de reduzir as defesas antioxidantes não enzimáticas em cérebro de ratos, provavelmente através da indução de radicais hidroxil e peroxil. Além disso, evidenciamos aumento dos níveis de superóxido e de morte celular em fibroblastos de pacientes afetados pela MTPD em condições padrão de cultivo indicando uma exposição crônica a níveis mais elevados de superóxido e uma vulnerabilidade à morte celular. Fibroblastos de pacientes afetados pelas MTPD e MCADD também apresentaram aumento dos níveis de superóxido quando cultivadas em condições de estresse metabólico, contudo não houve aumento de morte celular. Finalmente, a morte celular foi mais pronunciada em fibroblastos afetados pela MTPD em comparação com pacientes afetados pela MCADD, além de apresentar uma forte correlação com a produção de superóxido, sugerindo que esses eventos são provavelmente associados. Por outro lado, observamos que LCHFA prejudicam a homeostase energética em mitocôndrias de coração devido a um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa evidenciado pelo aumento do estado 4 da respiração e diminuição da razão de controle respiratório, pela redução do potencial de membrana, do conteúdo de NAD(P)H e da produção de H2O2. O ácido 3- hidroxitetradecanóico (3 HTA) também induziu inchaço mitocondrial provavelmente como consequência da abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) uma vez que a ciclosporina A (CsA), um inibidor clássico da abertura do poro, impediu esse efeito em mitocôndrias cardíacas carregadas com Ca2+. LCHFA também dissipadaram o potencial de membrana, diminuíram o coneúdo de NAD(P)H e de ATP na presença ou ausência de Ca2+ em mitocondriais de córtex cerebral. Além disso, na presença de Ca2+, 3 HTA induziu inchamento mitocondrial e liberação de citocromo c, que ativa rotas apoptóticas. 3 HTA também afetou a homeostase de Ca2+ evidenciado por uma reduzida capacidade de retenção de Ca2+ pela mitocôndria e induziu a produção de H2O2 na presença de Ca2+. Essas alterações foram prevenidas pelo vermelho de rutênio (RR), um bloqueador da captação mitocondrial de Ca2+, e por CsA mais ADP, inibidores da abertura do mPTP, o que implica o seu envolvimento nesses efeitos. Em contraste, LCHFA não causaram dano oxidativo nem alteraram as defesas antioxidantes em coração de ratos jovens. Em conjunto, nós demonstramos que MCAC e LCHFA que se acumulam em pacientes afetados pelas deficiências da MCAD e MTP/LCHAD, respectivamente, são potencialmente tóxicos para as funções mitocondriais essenciais em cérebro e coração de ratos. Além disso, demonstramos que fibroblastos de pacientes com MTPD cultivados em condições padrão estão sob estresse oxidativo, que é acentuado quando os fibroblastos são submetidos a condições de estresse metabólico. Presume-se que esses mecanismos fisiopatológicos podem ser responsáveis, pelo menos em parte, pelo dano tecidual característico desses pacientes. / The medium chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) deficiency is a fatty acid oxidation disorder (FAOD) biochemically characterized by accumulation of medium-chain acylcarnitines (MCAC) in tissues and biological fluids of affected individuals. The clinical presentation includes neurological symptoms as lethargy and coma, generally followed by episodes of metabolic decompensation. Other important FAOD are the mitochondrial trifunctional protein (MTPD) and the long-chain 3- hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHADD) deficiencies that are characterized by accumulation of long-chain fatty acids and their 3-hydroxylated (LCHFA) derivatives. Usually, affected patients present cardiac and hepatic dysfunction and may present signs of neurological impairment. So far, hypoglycemia and the toxicity of accumulating fatty acids have been related with the pathophysiology in these disorders, although the mechanisms responsible for tissue damage are poorly known. Thus, we investigated the effects of MCAC and LCHFA on important parameters of mitochondrial redox and energetic homeostasis in brain and heart of rats, as well as superoxide production and cell death in skin fibroblasts from patients affected by these diseases. First, we observed that MCAC induced lipid and protein oxidative damage, and reduced the antioxidant non-enzymatic defenses in rat brain, probably through induction of hydroxyl and peroxyl radicals. Furthermore, we evidenced increased superoxide levels and cell death in skin fibroblasts from MTP deficient patients under standard growing conditions indicating a chronic exposure to higher superoxide levels and a vulnerability to cell death. In addition, cells from MCADD and MTPD patients cultured under metabolic stress conditions presented increased levels of superoxide, although cell death was not increased. Finally, cell death was more pronounced in fibroblasts from MTP compared to MCAD deficient patients, and presented a strong correlation with superoxide production, suggesting that these events are probably associated. On the other hand, we observed that LCHFA provoked an impairment of heart mitochondrial energetic homeostasis, by behaving as uncouplers of oxidative phosphorylation, evidenced by increase of state 4 respiration and decrease of the respiratory control ratio, by reducing the membrane potential, the NAD(P)H content and H2O2 production. 3-Hydroxytetradecanoic acid (3 HTA) also induced mitochondrial swelling probably as a consequence of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening once cyclosporin A (CsA), a classical inhibitor, prevented this effect in heart mitochondria loaded with Ca2+. LCHFA also dissipated membrane potential, diminished NAD(P)H content and decreased ATP content in the presence or absence of Ca2+ in cerebral cortex mitochondrial preparations. Moreover, 3 HTA induced mitochondrial swelling and cytochrome c release in the presence of Ca2+, which activates apoptotic cascades. 3 HTA also affected Ca2+ homeostasis evidenced by a diminished mitochondrial Ca2+ retention capacity and induced hydrogen peroxide production in the presence of Ca2+. These alterations where prevented by ruthenium red (RR), a blocker of mitochondrial Ca2+ uptake, and by CsA plus ADP, inhibitors of the mPTP, implying its involvement in these effects. In contrast, LCHFA did not cause oxidative damage nor altered the antioxidant defenses in heart of young rats. Taken together, we demonstrated that MCAC and LCHFA found accumulated in patients affected by MCAD and MTP/LCHAD deficiencies, respectively, are potentially toxic to essential mitochondrial functions in rat brain and heart. We also found that fibroblasts from MTP deficient patients cultured under basal growing conditions are under oxidative stress that is accentuated when cultured metabolic stress conditions are used. It is presumed that these pathomechanisms may be responsible, at least in part, for the tissue damage characteristic of these patients.

A doença de Chagas, que é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, ocasiona grandes danos à saúde da população latino-americana e vem-se distribuindo para regiões não-endêmicas como os Estados Unidos, Europa e Japão. O tratamento é realizado pela administração de dois medicamentos (Nifurtimox e Benzonidazol) que apresentam sérios efeitos colaterais e baixa eficácia. A busca por novos compostos químicos bioativos com ação farmacológica sobre alvos bioquímicos constitui uma estratégia em desenvolvimento em nosso grupo de pesquisa. Neste trabalho, a principal cisteino protease - a cruzaína, e a enzima central na biossíntese de pirimidinas - a DHODH, ambas de T. cruzi, foram escolhidas como alvos para a identificação de novos inibidores com ação potencial contra o T. cruzi. A síntese de inibidores dessas duas enzimas foi realizada e os ensaios bioquímicos foram usados para identificar novos inibidores em concentrações micro- e nanomolar. Alguns desses inibidores enzimáticos foram ensaiados contra o T. cruzi em sua forma infectiva tripomastigota e foram ativos em concentrações micromolar. A enzima cruzaína (3.4.22.51) possui similaridade baixa na sequência de aminoácidos (18%) com a Catepsina-L (Cat-L, EC 3.4.22.15), mas suficiente para estabelecer a hipótese de que inibidores de Cat-L também poderiam inibir a cruzaína. Assim, com base no conhecimento prévio de vários inibidores da Cat-L, o dipeptídeo-nitrila Neq409 foi inicialmente sintetizado por outro membro do grupo para validar a hipótese de que nitrilas dipeptídicas poderiam inibir a cruzaína. O composto Neq409 inibiu a cruzaína com o valor de pIC50 igual a 5,7 que o qualificou não apenas como inibidor da cruzaína mas também como possível composto matriz para modificação molecular e estudos de relações estrutura-atividade (SAR). Cinco compostos foram então sintetizados através de uma rota de quatro etapas (proteção/desproteção de ácidos carboxílicos e duas formações de amida) e avaliados através de métodos fluorimétricos quanto às suas capacidades de inibir cruzaína. As modificações moleculares resultaram em aumento da potência de até 13 vezes em relação ao composto protótipo Neq409. A substituição do grupo benzoíla, presente em P3 no Neq409, pelo grupo 3-carboxi-5-terc-butil-2-metilpirazol (Neq414) e 5-bromopiridina (Neq419) resultou nos valores de pIC50 de 6,5 e 6,1, respectivamente. A substituição do átomo de hidrogênio por cloro na posição meta da fenila em P2 no composto Neq414 deu origem ao composto Neq415 com pIC50 de 6,8. Outras duas modificações envolveram a inserção do grupo ciclopropila na região P1 do composto Neq0414 gerando o Neq533 (pIC50 = 6,8) e do composto Neq533 resultando no composto Neq543 (pIC50 = 6,2). Os resultados mostraram que o grupo 3-carboxi-5-terc-butil-2-metilpirazol apresenta interações mais eficientes no sub-sítio S3 da cruzaína que o grupo 5-bromopiridina e que um átomo de cloro em P2 e um grupo ciclopropila em P1 possuem contribuições semelhantes para o aumento da potência de inibição da enzima. A busca de inibidores da enzima TcDHODH pelo grupo NEQUIMED levou à identificação de dois novos inibidores nanomolares, o Neq71 (pKi = 6,5) e o Neq130 (pKi = 6,4), ambos derivados de 5-arilpropilidenobarbitúricos. Com base nesses resultados, foi realizada a síntese do Neq71, Neq130 e de um novo inibidor - o Neq0393, biosóstero do composto Neq130, utilizando a condensação de Knoevenagel em meio aquoso sem catalisador, por adaptação de método já descrito anteriormente na literatura. Para avaliar a importância insaturação exocíclica ao anel barbitúrico desses derivados, o Neq71, Neq130 e o Neq393 foram submetidos à redução específica dessa insaturação utilizando-se NaBH4 que resultou nos compostos Neq395, Neq298 e Neq394, respectivamente. Os compostos Neq542, Neq421 e Neq420 derivados 5-metilidenobarbitúricos também foram sintetizados através do mesmo procedimento utilizado para obtenção de Neq71, Neq130 e Neq393, para avaliar a importância do comprimento da cadeia dos derivados 5-arilpropilidenobarbitúricos. A análise das constantes de inibição dos compostos obtidos mostrou que a redução da instauração resulta de até 280 vezes de potência, enquanto o encurtamento da cadeia lateral levou a diminuição de menor escala da potência (25 vezes), indicando a importância da instauração exocíclica para a afinidade dos compostos com a enzima. A característica eletrofílica desta instauração levou identificação de um novo esqueleto para futuros inibidores, o Neq411. / Chagas disease, which is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi, causes severe damage to the health of the population in Latin American countries and comes up distributing to non-endemic regions such as the United States, Europe and Japan. The treatment is accomplished by administering two drugs (Benznidazole and Nifurtimox) that have serious side effects and low efficacy. The search for new bioactive chemical compounds with pharmacological action on biochemical targets is a strategy under development in our research group. In this study, the major cysteine protease - cruzain, and the central enzyme in the biosynthesis of pyrimidines - DHODH, both from T. cruzi, were chosen as targets for the identification of new inhibitors with potential activity against T. cruzi. The synthesis of inhibitors of these two enzymes was performed and biochemical assays were used to identify new inhibitors at micro- and nanomolar concentrations. Some of these enzyme inhibitors were tested against T. cruzi infective trypomastigote form and were active at micromolar concentrations. The cruzain enzyme (EC 3.4.22.51) has low similarity in amino acid sequence (18 %) towards Cathepsin L (Cat-L, EC 3.4.22.15 ), but sufficient to establish the hypothesis that Cat-L inhibitors could also inhibit cruzain. Thus, based on prior knowledge of various Cat-L inhibitors, a dipeptide nitrile - Neq409 was initially synthesized by another group member in order to validate the hypothesis that dipeptide nitriles could really inhibit cruzain. The compound Neq409 inhibited cruzain with a pIC50 value of 5.7, which qualified it not only as an inhibitor of cruzain but also as a possible lead compound for molecular modification and structure-activity relationships (SAR) studies. Five compounds were then designed and synthesized through a route of four steps (protection/deprotection of carboxylic acids and two formations of amides) and evaluated using fluorimetric methods to evaluate their ability to inhibit cruzain. The molecular changes for most potent compound resulted in 13-fold potency increase as compared to the prototype compound Neq0409. The replacement of the P3 benzoyl group present in the Neq409 by 3-carboxy-5-tert- butyl-2-methylpyrazole (Neq0414) and 5- bromopyridine (Neq0419) resulted in the pIC50 values of 6.5 and 6.1, respectively. The replacement of the hydrogen atom by chlorine in the meta position of the phenyl at P2 in the compound neq0414 yielded compound Neq415 with a pIC50 of 6.8. Two other modifications involved the insertion of the cyclopropyl group in the P1 region of Neq0414 generating compound Neq0533 (pIC50 = 6.8) and compounds Neq0533 resulting in compound neq0543 with a pIC50 of 6.2. The results showed that the 3-carboxy-5-tert-butyl-2-methylpyrazole provides more efficient interactions in the cruzain S3 sub-site than 5- bromopyridine group and a chlorine atom at P2 and a cyclopropyl group at P1. The search for inhibitors of the enzyme TcDHODH led to the identification of two new nanomolar inhibitors, the Neq0071 (pKi = 6.5) and Neq0130 (pKi = 6.4), both derived from 5-aril-propiliden-barbituric acid. The Neq393, a bioisostere compound of Neq0130, was synthesized using the Knoevenagel condensation in aqueous media without catalyst, by adaptation of the method previously described in the literature. Based on these results, the synthesis of Neq71, Neq130 and a new inhibitor was performed. To assess the importance of exocyclic barbiturate ring unsaturation, Neq71, Neq130 and Neq393 underwent specific reduction of such unsaturation using NABH4 that resulted in compounds Neq395, Neq298 and Neq0394, respectively. Neq542, Neq421 and Neq420 derived compounds of 5-metilidenobarbiturate were also synthesized by the same procedure used to obtain Neq71 and Neq393 to evaluate the importance of the length of the 5-arilpropilidenobarbiturate derivatives. The inhibition constant of these compounds showed that de lack of the exocyclic double bond decreased the potency 200 times and the shrinkage of the side chain to a decrease of 25 times, showing the importance of the exocyclic bond for the inhibitors affinity for the enzyme. The electrophilicity of this bond lead to an identification of a new scaffold for novel inhibitors, the Neq411.

A doença de Chagas, que é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, ocasiona grandes danos à saúde da população latino-americana e vem-se distribuindo para regiões não-endêmicas como os Estados Unidos, Europa e Japão. O tratamento é realizado pela administração de dois medicamentos (Nifurtimox e Benzonidazol) que apresentam sérios efeitos colaterais e baixa eficácia. A busca por novos compostos químicos bioativos com ação farmacológica sobre alvos bioquímicos constitui uma estratégia em desenvolvimento em nosso grupo de pesquisa. Neste trabalho, a principal cisteino protease - a cruzaína, e a enzima central na biossíntese de pirimidinas - a DHODH, ambas de T. cruzi, foram escolhidas como alvos para a identificação de novos inibidores com ação potencial contra o T. cruzi. A síntese de inibidores dessas duas enzimas foi realizada e os ensaios bioquímicos foram usados para identificar novos inibidores em concentrações micro- e nanomolar. Alguns desses inibidores enzimáticos foram ensaiados contra o T. cruzi em sua forma infectiva tripomastigota e foram ativos em concentrações micromolar. A enzima cruzaína (3.4.22.51) possui similaridade baixa na sequência de aminoácidos (18%) com a Catepsina-L (Cat-L, EC 3.4.22.15), mas suficiente para estabelecer a hipótese de que inibidores de Cat-L também poderiam inibir a cruzaína. Assim, com base no conhecimento prévio de vários inibidores da Cat-L, o dipeptídeo-nitrila Neq409 foi inicialmente sintetizado por outro membro do grupo para validar a hipótese de que nitrilas dipeptídicas poderiam inibir a cruzaína. O composto Neq409 inibiu a cruzaína com o valor de pIC50 igual a 5,7 que o qualificou não apenas como inibidor da cruzaína mas também como possível composto matriz para modificação molecular e estudos de relações estrutura-atividade (SAR). Cinco compostos foram então sintetizados através de uma rota de quatro etapas (proteção/desproteção de ácidos carboxílicos e duas formações de amida) e avaliados através de métodos fluorimétricos quanto às suas capacidades de inibir cruzaína. As modificações moleculares resultaram em aumento da potência de até 13 vezes em relação ao composto protótipo Neq409. A substituição do grupo benzoíla, presente em P3 no Neq409, pelo grupo 3-carboxi-5-terc-butil-2-metilpirazol (Neq414) e 5-bromopiridina (Neq419) resultou nos valores de pIC50 de 6,5 e 6,1, respectivamente. A substituição do átomo de hidrogênio por cloro na posição meta da fenila em P2 no composto Neq414 deu origem ao composto Neq415 com pIC50 de 6,8. Outras duas modificações envolveram a inserção do grupo ciclopropila na região P1 do composto Neq0414 gerando o Neq533 (pIC50 = 6,8) e do composto Neq533 resultando no composto Neq543 (pIC50 = 6,2). Os resultados mostraram que o grupo 3-carboxi-5-terc-butil-2-metilpirazol apresenta interações mais eficientes no sub-sítio S3 da cruzaína que o grupo 5-bromopiridina e que um átomo de cloro em P2 e um grupo ciclopropila em P1 possuem contribuições semelhantes para o aumento da potência de inibição da enzima. A busca de inibidores da enzima TcDHODH pelo grupo NEQUIMED levou à identificação de dois novos inibidores nanomolares, o Neq71 (pKi = 6,5) e o Neq130 (pKi = 6,4), ambos derivados de 5-arilpropilidenobarbitúricos. Com base nesses resultados, foi realizada a síntese do Neq71, Neq130 e de um novo inibidor - o Neq0393, biosóstero do composto Neq130, utilizando a condensação de Knoevenagel em meio aquoso sem catalisador, por adaptação de método já descrito anteriormente na literatura. Para avaliar a importância insaturação exocíclica ao anel barbitúrico desses derivados, o Neq71, Neq130 e o Neq393 foram submetidos à redução específica dessa insaturação utilizando-se NaBH4 que resultou nos compostos Neq395, Neq298 e Neq394, respectivamente. Os compostos Neq542, Neq421 e Neq420 derivados 5-metilidenobarbitúricos também foram sintetizados através do mesmo procedimento utilizado para obtenção de Neq71, Neq130 e Neq393, para avaliar a importância do comprimento da cadeia dos derivados 5-arilpropilidenobarbitúricos. A análise das constantes de inibição dos compostos obtidos mostrou que a redução da instauração resulta de até 280 vezes de potência, enquanto o encurtamento da cadeia lateral levou a diminuição de menor escala da potência (25 vezes), indicando a importância da instauração exocíclica para a afinidade dos compostos com a enzima. A característica eletrofílica desta instauração levou identificação de um novo esqueleto para futuros inibidores, o Neq411. / Chagas disease, which is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi, causes severe damage to the health of the population in Latin American countries and comes up distributing to non-endemic regions such as the United States, Europe and Japan. The treatment is accomplished by administering two drugs (Benznidazole and Nifurtimox) that have serious side effects and low efficacy. The search for new bioactive chemical compounds with pharmacological action on biochemical targets is a strategy under development in our research group. In this study, the major cysteine protease - cruzain, and the central enzyme in the biosynthesis of pyrimidines - DHODH, both from T. cruzi, were chosen as targets for the identification of new inhibitors with potential activity against T. cruzi. The synthesis of inhibitors of these two enzymes was performed and biochemical assays were used to identify new inhibitors at micro- and nanomolar concentrations. Some of these enzyme inhibitors were tested against T. cruzi infective trypomastigote form and were active at micromolar concentrations. The cruzain enzyme (EC 3.4.22.51) has low similarity in amino acid sequence (18 %) towards Cathepsin L (Cat-L, EC 3.4.22.15 ), but sufficient to establish the hypothesis that Cat-L inhibitors could also inhibit cruzain. Thus, based on prior knowledge of various Cat-L inhibitors, a dipeptide nitrile - Neq409 was initially synthesized by another group member in order to validate the hypothesis that dipeptide nitriles could really inhibit cruzain. The compound Neq409 inhibited cruzain with a pIC50 value of 5.7, which qualified it not only as an inhibitor of cruzain but also as a possible lead compound for molecular modification and structure-activity relationships (SAR) studies. Five compounds were then designed and synthesized through a route of four steps (protection/deprotection of carboxylic acids and two formations of amides) and evaluated using fluorimetric methods to evaluate their ability to inhibit cruzain. The molecular changes for most potent compound resulted in 13-fold potency increase as compared to the prototype compound Neq0409. The replacement of the P3 benzoyl group present in the Neq409 by 3-carboxy-5-tert- butyl-2-methylpyrazole (Neq0414) and 5- bromopyridine (Neq0419) resulted in the pIC50 values of 6.5 and 6.1, respectively. The replacement of the hydrogen atom by chlorine in the meta position of the phenyl at P2 in the compound neq0414 yielded compound Neq415 with a pIC50 of 6.8. Two other modifications involved the insertion of the cyclopropyl group in the P1 region of Neq0414 generating compound Neq0533 (pIC50 = 6.8) and compounds Neq0533 resulting in compound neq0543 with a pIC50 of 6.2. The results showed that the 3-carboxy-5-tert-butyl-2-methylpyrazole provides more efficient interactions in the cruzain S3 sub-site than 5- bromopyridine group and a chlorine atom at P2 and a cyclopropyl group at P1. The search for inhibitors of the enzyme TcDHODH led to the identification of two new nanomolar inhibitors, the Neq0071 (pKi = 6.5) and Neq0130 (pKi = 6.4), both derived from 5-aril-propiliden-barbituric acid. The Neq393, a bioisostere compound of Neq0130, was synthesized using the Knoevenagel condensation in aqueous media without catalyst, by adaptation of the method previously described in the literature. Based on these results, the synthesis of Neq71, Neq130 and a new inhibitor was performed. To assess the importance of exocyclic barbiturate ring unsaturation, Neq71, Neq130 and Neq393 underwent specific reduction of such unsaturation using NABH4 that resulted in compounds Neq395, Neq298 and Neq0394, respectively. Neq542, Neq421 and Neq420 derived compounds of 5-metilidenobarbiturate were also synthesized by the same procedure used to obtain Neq71 and Neq393 to evaluate the importance of the length of the 5-arilpropilidenobarbiturate derivatives. The inhibition constant of these compounds showed that de lack of the exocyclic double bond decreased the potency 200 times and the shrinkage of the side chain to a decrease of 25 times, showing the importance of the exocyclic bond for the inhibitors affinity for the enzyme. The electrophilicity of this bond lead to an identification of a new scaffold for novel inhibitors, the Neq411.

Submitted by Dominick Jesus (dominickdejesus@hotmail.com) on 2016-01-06T19:14:56Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Nayara Sousa Castro.pdf: 3041386 bytes, checksum: 04452ee2a4384fb66886d92dc109a417 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-06T19:14:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_Nayara Sousa Castro.pdf: 3041386 bytes, checksum: 04452ee2a4384fb66886d92dc109a417 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-06-29 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM / The L-Lactate Dehydrogenase (LDH) is an enzyme key in the processes of anaerobic glycolytic metabolism and has three encoders genes in fish (LDH-A, LDH-B and LDH-C). The regulation of these genes is independent and has tissue specificity in vertebrates. They were originated by successive events of genome replication and its evolution showed be closely related to the development of adaptive thermal mechanisms and, also different physiological conditions as hypoxia. The main objectives of this study were understand the evolution of these genes in fish, basal group of the vertebrates, and identify specific replacements that may be considered adaptive to Amazon fish species and other parts of the world (temperate, subtropical and polar). Our results showed that the genes A and B originate from a genetic duplication event that occurred near the origin of vertebrates, and that in a second duplication event, the LDH-C gene was originated from the LDH-B. Thus, the LDH of the lamprey was identified as LDH-A, and from this gene had the differentiation in teleost. In addition, our study showed that LDH-A presents sites and lineages that have gone through or are still undergoing of the adaptive evolution (Amazonian and cold weather fish). In the same time their phylogeny combined with the time difference, pointed a later specialization of this gene as a result of the adaptation to the environment. The course of evolution for these genes appears to have resulted in the influence of natural selection with variants adapted to their environment and its functions. / A L-Lactato Desidrogenase (LDH) é uma enzima chave nos processos do metabolismo glicolítico anaeróbico e possui três genes codificadores em peixes (ldh-a, ldh-b e ldh-c). A regulação desses genes é independente, resultando em especificidade tecidual nos vertebrados. Esses genes foram originados por eventos sucessivos de duplicação do genoma e sua evolução mostra-se intimamente relacionada com o desenvolvimento de mecanismos adaptativos térmicos e de condições fisiológicas distintas, as quais compreendem a hipóxia. Entender a evolução desses genes em peixes, grupo base dos vertebrados, e identificar substituições pontuais que possam ser consideradas adaptativas para espécies de peixes da Amazônia e de outras regiões do planeta (Temperada, Polar e Subtropical) estão dentre os principais objetivos deste estudo. Nossos resultados mostraram que os genes A e B se originaram a partir de um evento de duplicação gênica próximo a origem dos vertebrados, e que, por um segundo evento de duplicação, o gene da LDH-C foi originado a partir da LDH-B. Assim, a LDH da lampreia foi identificada como uma LDH-A, a partir da qual o gene se diferenciou nos teleósteos. Além disso, nossos estudos mostram que a LDH-A apresenta sítios e linhagens que sofreram e estão sofrendo evolução adaptativa (peixes amazônicos e de clima frio) e sua filogenia, combinada com o tempo de divergência, apontou uma especialização mais recente desse gene como resultado da adaptação ao ambiente. O curso da evolução para esses genes parece ter resultado na vitória da seleção natural com variantes adaptadas ao seu meio ambiente e às suas funções.

Submitted by Dominick Jesus (dominickdejesus@hotmail.com) on 2016-01-07T15:50:19Z No. of bitstreams: 2 Flávio Augusto Leão da Fonseca.pdf: 279865 bytes, checksum: ae9258fabce24d13ff79b708b8f6aba7 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-07T15:50:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Flávio Augusto Leão da Fonseca.pdf: 279865 bytes, checksum: ae9258fabce24d13ff79b708b8f6aba7 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-06-29 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM / The L-Lactate Dehydrogenase (LDH) is an enzyme key in the processes of anaerobic glycolytic metabolism and has three encoders genes in fish (LDH-A, LDH-B and LDH-C). The regulation of these genes is independent and has tissue specificity in vertebrates. They were originated by successive events of genome replication and its evolution showed be closely related to the development of adaptive thermal mechanisms and, also different physiological conditions as hypoxia. The main objectives of this study were understand the evolution of these genes in fish, basal group of the vertebrates, and identify specific replacements that may be considered adaptive to Amazon fish species and other parts of the world (temperate, subtropical and polar). Our results showed that the genes A and B originate from a genetic duplication event that occurred near the origin of vertebrates, and that in a second duplication event, the LDH-C gene was originated from the LDH-B. Thus, the LDH of the lamprey was identified as LDH-A, and from this gene had the differentiation in teleost. In addition, our study showed that LDH-A presents sites and lineages that have gone through or are still undergoing of the adaptive evolution (Amazonian and cold weather fish). In the same time their phylogeny combined with the time difference, pointed a later specialization of this gene as a result of the adaptation to the environment. The course of evolution for these genes appears to have resulted in the influence of natural selection with variants adapted to their environment and its functions. / A L-Lactato Desidrogenase (LDH) é uma enzima chave nos processos do metabolismo glicolítico anaeróbico e possui três genes codificadores em peixes (ldh-a, ldh-b e ldh-c). A regulação desses genes é independente, resultando em especificidade tecidual nos vertebrados. Esses genes foram originados por eventos sucessivos de duplicação do genoma e sua evolução mostra-se intimamente relacionada com o desenvolvimento de mecanismos adaptativos térmicos e de condições fisiológicas distintas, as quais compreendem a hipóxia. Entender a evolução desses genes em peixes, grupo base dos vertebrados, e identificar substituições pontuais que possam ser consideradas adaptativas para espécies de peixes da Amazônia e de outras regiões do planeta (Temperada, Polar e Subtropical) estão dentre os principais objetivos deste estudo. Nossos resultados mostraram que os genes A e B se originaram a partir de um evento de duplicação gênica próximo a origem dos vertebrados, e que, por um segundo evento de duplicação, o gene da LDH-C foi originado a partir da LDH-B. Assim, a LDH da lampreia foi identificada como uma LDH-A, a partir da qual o gene se diferenciou nos teleósteos. Além disso, nossos estudos mostram que a LDH-A apresenta sítios e linhagens que sofreram e estão sofrendo evolução adaptativa (peixes amazônicos e de clima frio) e sua filogenia, combinada com o tempo de divergência, apontou uma especialização mais recente desse gene como resultado da adaptação ao ambiente. O curso da evolução para esses genes parece ter resultado na vitória da seleção natural com variantes adaptadas ao seu meio ambiente e às suas funções.

A G6PD é expressa em todos os tecidos, onde catalisa a primeira etapa da via das pentoses-fosfato. O NADPH produzido pela ação da G6PD serve como doador de elétrons na biossíntese redutora. Pelo fato de os glóbulos vermelhos não terem mitocôndria, a via das pentoses-fosfato é a única fonte de NADPH e essencial para sua proteção contra o stress oxidativo. A deficiência da G6PD é classificada como anemia hemolítica hereditária ligada ao cromossomo X, associada a manifestações clínicas heterogêneas. O gene da G6PD possui cerca de 140 variantes moleculares já descritas, muitas dessas associadas à enzimopatia. Considerando-se a alta freqüência populacional da deficiência de G6PD, a constituição da população do Rio Grande do Sul e as dificuldades diagnósticas desta deficiência, este trabalho teve como objetivo caracterizar os aspectos laboratoriais do diagnóstico da deficiência de G6PD em nosso meio. Para a quantificação da atividade da G6PD, foi utilizado o método enzimáticocolorimétrico com normalização da hemoglobina (kit intercientífica) e para as análises moleculares foram investigadas as mutações 202, 376 e 563 por PCR/RFLP. O presente estudo revelou uma prevalência combinada de 7,9% das duas formas de deficiência de G6PD (completa e parcial) no Rio Grande do Sul, com alta prevalência de pacientes parcialmente deficientes e sem correlação com origem étnica. Usando técnicas bioquímicas e moleculares, foi caracterizada a deficiência de G6PD em amostras de Porto Alegre como sendo principalmente devida às mutações G202A e A376G, representando a variante G6PD A-, confirmando uma distribuição homogênea do padrão G6PD A- no Brasil. Os resultados apresentados aqui demonstraram que as condições de estocagem (temperatura principalmente) desempenham um papel fundamental na atividade da G6PD, especialmente nas coletas em papel filtro. Na avaliação da acurácia do método enzimático de medida da atividade da G6PD as sensibilidades e especificidades calculadas para os valores de cut-off estabelecido em uma população normal foram: para 2,9 U/gHb ( 11,4% e 100%), para 8 U/g Hb (77,1% e 94,7%) e para 11,5 U/g hb (97,1% e 76,3%). Estima-se que a deficiência de ambas as formas combinadas de G6PD seja de aproximadamente 8% numa amostra do RS. A partir de uma probabilidade pré-teste de 8,0%, após a realização do ensaio enzimático, a probabilidade pós-teste de uma pessoa ser deficiente de G6PD com nível enzimático inferior a 8 U/g Hb passa a ser 55,9%. Ao passo que para níveis superiores a 11,5 U/gHb esta probabilidade de deficiência diminui para 0,37%. Pode-se concluir que o método empregado (kit Intercientífica) foi adequado para avaliar a atividade enzimática de G6PD em amostras de sangue total. É um método capaz de detectar a deficiência de G6PD, demonstrando de forma satisfatória o grau de deficiência em indivíduos que possuem mutações que causam deficiência enzimática menos severa, inclusive mulheres heterozigotas. A análise molecular pode identificar o tipo de variante mas não pode indicar o risco real para as mulheres portadoras, que é diretamente estimado pelo nível de atividade enzimática.

Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2012 / Inclui bibliografias / Background: Colorectal cancer is the third more incident neoplasia orldwide for male and the second one for female with 10% and 9.4%, respectively, of total cases. Recent analysis indicated that the mitochondrial oxidative phosphorylation chain is a signi