Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. [68]-79. Publié aussi en version électronique.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La ventilation mécanique(VM) est le premier traitement en réanimation du syndrome de détresse respiratoire aigüe permettant de maintenir une oxygénation tissulaire suffisante. Mais elle induit une atteinte de la fonction contractile des muscles respiratoires, principalement le diaphragme, augmentant ainsi la dépendance du patient vis à vis de son ventilateur. Cette pathologie musculaire acquise est appelée Dysfonction Diaphragmatique induite par la ventilation (VIDD). L’objectif de cette thèse est proposer, à partir d’un modèle murin de ventilation mécanique, les mécanismes physiopathologiques précoces impliqués dans cette dysfonction, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans la prévention de cette pathologie musculaire.Nous avons montré en effet la présence, après 6 heures de ventilation mécanique chez la souris, d’un stress oxydant d’origine mitochondrial à la base d’une oxydation du récepteur à la ryanodine (RyR1), principal canal calcique impliqué dans le CEC. Nous avons également montré la présence au bout d’un temps de ventilation mécanique équivalent, d’une phosphorylation de ce même canal, du faite d’une activation de la voie des protéines kinase, secondaire à un stress adrénergique. Nous également avons démontré que ces deux modifications post traductionnelles du RyR1 devaient être nécessairement associées pour induire une atteinte fonctionnelle du canal avec fuite calcique dans le cytosol, du faite de la perte de liaison avec sa protéine stabilisatrice FKBP12. Dans ses travaux de thèse, nous montrons également, que ces anomalies de troubles de l’homéostasie calcique observée après 6 heures de ventilation mécanique, induisaient au bout de 12 heures de ventilation une activation secondaire de la protéolyse dépendante du calcium, associée à une atrophie. Ainsi ces résultats montrent l’intérêt de toutes thérapeutiques permettant de stabiliser la liaison entre le canal RyR1 et sa protéine FKBP12 dans la prévention de la VIDD. En effet, avons observé chez la souris, qu’un traitement anti oxydant spécifique de la mitochondrie (SS-31) ou qu’un traitement bétabloquant spécifique de la voie béta2 adrénergique (ICI-118551) ou qu’un traitement qui stabilise directement la liaison RyR1-FKBP12 (S107) permettaient de prévenir les troubles précoces de l’homéostasie calcique et l’apparition secondaire d’une protéolyse et d’une atrophie induite par la ventilation mécanique. Enfin, dans le dernier travail de ma thèse, je propose que la production de ROS mitochondriale, puisse être associée à un remodelage du réseau mitochondrial avec prépondérance d’un phénomène de fission des mitochondries. Ce remodelage, qui pourrait être considéré comme une adaptation de la mitochondrie du faite d’une rupture brutale de l’équilibre entre production et consommation d’énergie par la fibre musculaire. En effet, nous montrons qu’un inhibiteur de la fission mitochondriale (P110), qui bloque la liaison entre la protéine Drp1 et son récepteur, dans notre modèle animal de ventilation mécanique, pouvait prévenir l’apparition d’une VIDD. Ainsi dans la continuité de ses derniers travaux, afin de faire le lien entre fission mitochondriale et stress oxydant à la base des troubles de l’homéostasie calcique, j’espère montrer que ce traitement, au cours de la ventilation mécanique, limite la production de ROS mitochondriale, l’oxydation du canal RyR1, ainsi que la fuite calcique à travers le RyR1. Ces derniers travaux, mettraient en avant toute thérapeutique permettant de limiter les phénomènes de fission mitochondriale et ses conséquences dans la prévention de la VIDD.Mots clés : RyR, mitochondrie, dysfonction contractile, VIDD, stress oxydant / Mechanical ventilation (MV) is the first treatment in intensive care for acute respiratory distress syndrome to maintain adequate tissue oxygenation. However, it induces an impairment of the contractile function of the respiratory muscles, particularly the diaphragm, thereby increasing the patient's dependence on his ventilator. This acquired muscle disease have been termed ventilator induced diaphragmatic dysfunction (VIDD). The aim of this thesis is to propose, from a mouse model of mechanical ventilation, early pathophysiologic mechanisms involved in this dysfunction, to identify new therapeutic targets in preventing VIDD.We observed after 6 hours of mechanical ventilation, a mitochondrial oxidative stress which induces ryanodine receptor (RyR1) oxidation, the main calcium channel involved in the ECC. We also showed the presence after an equivalent time of mechanical ventilation, phosphorylation of RyR1, due to protein kinase activation, secondary to an adrenergic stress. Then, we have demonstrated that these post-translational modifications of RyR1 should be necessarily associated to trigger a functional impairment of RyR1 with calcium leakage from the sarcoplasmic reticulum to the cytosol, due to the loss of connection between RyR1 and the stabilizing protein KBP12. In his thesis, we also showed that these calcium homeostasis disorders, induced by 12 hours of ventilation, secondary activates the dependent proteolysis calcium and atrophy.Thus, these results show the benefit of all therapy stabilizing the connection between the RyR1 channel and the FKBP12 protein to prevent VIDD. Indeed, were observed in mice, that a specific mitochondrial anti-oxidant treatment (SS-31), or a specific beta-blocker treatment of beta2 adrenergic pathway (ICI-118551 ) or a treatment that stabilizes directly FKBP12- binding RyR1 (S107 ) prevent early disorders of calcium homeostasis and secondary appearance of proteolysis and atrophy induced by mechanical ventilation.Finally, in the last part of my work thesis, I suggest that mitochondrial ROS production may be associated with remodeling of the mitochondrial network with a preponderance of mitochondrial fission phenomenon. This remodeling could be seen as an adaptation of the mitochondria due to a sudden mismatch between energy production and consumption. Indeed, we showed that an inhibitor of the mitochondrial fission (P110), which blocks the connection between the DRP1 protein and its receptor in our animal model of mechanical ventilation, could prevent the appearance of VIDD. Thus the continuity of this last work of my thesis is to make the link between mitochondrial fission and oxidative stress underlying the disorders of calcium homeostasis. Indeed, I hope to show that this treatment during mechanical ventilation, may decrease mitochondrial ROS production, oxidation of RyR1 channel and calcium leak through the RyR1. This last work will emphasis any therapeutic which limit mitochondrial fission and its consequences, to prevent VIDD.Keywords: RyR1, mitochondria, contractile dysfunction, VIDD, oxidative stress

Les bâtiments en acier de faible hauteur (BAFH) constituent une partie importante des constructions non résidentielles au Canada. Ces bâtiments ont la particularité d'avoir une toiture relativement flexible dans son plan comparativement aux bâtiments en béton où la rigidité est très élevée. La majorité des études sur les BAFH ont été publiées depuis 1994 suite au tremblement de terre de Northridge en Californie. Au Canada, la conception des structures doit respecter les exigences du Code National du Bâtiment du Canada (CNBC) dans lequel sont inscrites les exigences sur les charges sismiques, entre autres. Pour déterminer ces charges, il faut connaître la période de vibration du bâtiment. Le CNBC présente donc des formules empiriques pour déterminer cette période. Celles-ci ont cependant été dérivées pour des bâtiments multiétagés et ne s'appliquent pas pour les BAFH. L'objectif principal de ce mémoire est de mieux comprendre le comportement dynamique des BAFH. Pour ce faire, douze essais sous vibrations ambiantes ont été menés sur onze bâtiments afin de créer une base de données expérimentale. À partir de cette base de données, 24 équations permettant de prédire la période de vibrations sont présentées. De ses équations, six sont retenues et une est suggérée pour remplacer celle du CNBC. Le CNBC permet, pour la conception, d'utiliser la période obtenue à l'aide d'un logiciel d'éléments finis. Ce mémoire compare donc celles-ci à celles obtenues par les essais in situ et celles fournies par le CNBC. De plus, différentes hypothèses de modélisation sont vérifiées par une étude paramétrique. Les résultats montrent que la rigidité du modèle étant plus faible que le bâtiment réel, la période est toujours plus faible. Ceci fait en sorte que les efforts calculés sont aussi plus faible et donc du coté non-sécuritaire. C'est pourquoi il est conseillé de ne jamais utiliser la période obtenue par éléments finis pour le dimensionnement des BAFH.

La commande de la ventilation chez l'humain est capable d'adaptation persistante qui repose sur des mécanismes de type LTP. Différentes techniques permettant l'induction de plasticité sont couramment utilisées mais leur application au contrôle ventilatoire n'a fait l'objet que de très peu de travaux.L'objectif de cette thèse est (1) examiner la possibilité d'induire des mécanismes de type LTP par la rTMS et la tsDCS en deux sites de la commande ventilatoire destinée au diaphragme, l'AMS et les métamères C3-C5 ; (2) évaluer les conséquences sur le profil ventilatoire en ventilation de repos et lorsque la ventilation est artificiellement contrainte. Nous avons examiné les effets d'un conditionnement inhibiteur appliqué par rTMS en regard de l'AMS sur l'excitabilité corticophrénique. Nous avons observé la présence d'une diminution persistante de cette excitabilité et en avons tiré la proposition qu'en ventilation de repos l'AMS augmente l'excitabilité de la commande ventilatoire à l'éveil. Nous avons alors considéré les conséquences de la rTMS sur la ventilation expérimentalement contrainte. Les modifications du profil ventilatoire induites par la rTMS sont en faveur d'une participation de l'AMS à la production ou au traitement de la copie d'efférence. Dans une 3ème étude, nous avons examiné les effets de la tsDCS au niveau C3-C5 sur l'excitabilité corticophrénique et sur le profil ventilatoire. L'augmentation de cette excitabilité et du volume courant nous a conduit à suggérer la possibilité d'induire une plasticité respiratoire au niveau spinal.L'ensemble de ces résultats nous permet d'envisager des perspectives thérapeutiques à l'utilisation de la rTMS et de la tsDCS. / A salient feature of the ventilatory control system is its ability to persistently adapt its behaviour. This stems from long-term plasticity mechanisms similar to those described for the neural control in general. Plasticity can be induced by various non-invasive stimulation techniques(e.g. rTMS, TDCS, tsDCS) that are commonly used but have not be systematically applied to ventilatory plasticity. The aim of this thesis is twofold: (1) to examine the possibility of inducing LTP by rTMS and tsDCS at two sites of the ventilatory control system, namely the SMA and the phrenic motoneurons: (2) to evaluate the impact of such plasticity on breathing pattern during spontaneous ventilation and inspiratory threshold loading. We examined the effects of an inhibitory rTMS paradigm applied to the SMA on corticophrenic excitability. We observed a persistent decrease in corticophrenic excitability and therefore proposed that the SMA participates in the increased resting state of the ventilatory motor system during wake. Then we considered the consequences of rTMS on breathing pattern during ITL. The corresponding modifications support a contribution of the SMA to the production or processing of an ventilatory efference copy. In a third study, we examined the effects of a tsDCS delivered to C3-C5 on the corticophrenic excitability and on the respiratory pattern. Increased corticophrenic excitability and tidal volume were observed. This suggests that respiratory plasticity takes place at the spinal level. Taken together, these results open the perspective of harnessing respiratory plasticity as a therapeutic tool in disorders altering the ventilatory command.

La dysfonction diaphragmatique, au même titre que la neuromyopathie de réanimation qui touche les membres périphériques sont des causes fréquemment impliquées dans l'échec du sevrage de la ventilation mécanique. Des données suggèrent que ces deux atteintes sont le reflet d'une même affection ayant un tropisme respiratoire et locomoteur. Cette thèse met en évidence que la dysfonction diaphragmatique et la neuromyopathie de réanimation sont deux atteintes distinctes dont la coexistence est relativement faible. De plus, la dysfonction diaphragmatique a un impact délétère plus important sur le sevrage et le pronostic vital que la neuromyopathie de réanimation. Toutefois, le niveau de fonction diaphragmatique requis pour permettre une séparation du ventilateur est plus faible que le niveau de fonction définissant la dysfonction diaphragmatique. Ce travail montre également que l'exploration de la fonction diaphragmatique peut être simplifiée par l'utilisation de l'échographie et de l'électromyographie du diaphragme. / Diaphragm dysfunction and critical illness associated neuropathy and myopathy are frequently suspected to cause weaning failure from mechanical ventilation. Some data suggest that both may be gathered into a same entity with two localisations, respiratory and peripheral. This thesis highlights that diaphragm dysfunction and critical illness neuromyopathy are two distinct diseases that don’t frequently coexist. In addition, diaphragm dysfunction has a more severe impact on weaning outcome and prognosis than critical illness associated neuromyopathy and myopathy. However, the level of diaphragm function required to ensure safe mechanical ventilation discontinuation is lower than the level of diaphragm function defining diaphragm dysfunction. This work also shows that investigating diaphragm function may be simplified by the use of ultrasound and diaphragm electromyogram activity.

La VC est nécessaire à la survie des patients les plus graves et impose le plus souvent sédation profonde et une mise au repos des muscles respiratoires. Si la VC est un traitement de référence en cas d'insuffisance respiratoire aigüe, elle peut cependant entraîner une altération des propriétés contractiles du diaphragme, principal muscle respiratoire, et promouvoir la survenue d'infections nosocomiales, pulmonaires en particulier. Dans ce travail, nous avons tout d'abord montré les effets délétères d'une VC de courte durée en acidose hypercapnique aigüe puis nous avons montré les effets protecteurs de l'acidose hypercapnique modérée et prolongée et du maintien de cycles ventilatoires spontanés sur la dysfonction diaphragmatique en comparaison à la VC. Deuxièmement, dans le cadre des effets délétères de la ventilation prolongée sur l'incidence des complications infectieuses pulmonaires nosocomiales, nous avons rapporté l'intérêt de la prise en compte des facteurs de risque de bactéries multi-résistantes dans le traitement des Pneumonie Acquise sous Ventilation Mécanique (PAVM) et avons ensuite montré l'apport de la surveillance de la colonisation trachéale dans le diagnostic et le traitement précoce de la PAVM. Finalement, nous présentons les perspectives d'interactions entre dysfonction diaphragmatique et sepsis, en particulier d'origine pulmonaire à travers nos projets de travaux expérimentaux et cliniques. / Mechanical ventilation (MV) is a life saving procedure for critically ill and often needs deep sedation and rest muscles. Although MV is a basic treatment for acute respiratory failure, it can alter diaphragmatic contractile properties (Ventilator Induced Diaphragmatic Dysfunction, VIDD) and can promote nosocomial infections, Ventilator Associated Pneumonia (VAP) in particular. In this thesis, we first showed the deleterious effects of acute hypercapnic acidosis and the protective effects of both moderate and prolonged hypercapnic acidosis and by maintaining spontaneous ventilation activity while initiating MV in a healthy piglet model. Second, we reported the potential impact of considering tracheal colonisation as a guide for an early diagnosis and adequate initial treatment of VAP. Finally, we present the potential interactions and futures animal and clinical studies suggesting the potential interaction between VIDD and VAP.

Le confort acoustique des passagers à l’intérieur d’un véhicule est fonction des équipements embarqués notamment le Système de Ventilation d’Air (SVA). Un SVA est un système complexe et compact, composé de plusieurs éléments. L’interaction de l’écoulement d’air avec ces éléments est un facteur influant sur les phénomènes acoustiques générés. Le projet CEVAS (Conception d’Eléments de Ventilation d’Air Silencieux), piloté par l’équipementier Valeo, a pour ambition de développer un outil numérique d’aide à la conception des SVA. Dans le cadre de projet, un banc d’essai a été développé à l’UTC en coopération avec Valeo afin de caractériser par mesures acoustique et aéraulique les composants d’un SVA dans les mêmes conditions de fonctionnement que sur véhicule. L’instrumentation acoustique de ce banc permet la caractérisation multimodale des propriétés acoustiques passives et actives de l’élément testé. Dans un premier lieu, la composante passive, représentée par la matrice de diffusion, est mesurée par la méthode multi-sources. Par la suite, la composante active, représentative de l’interaction écoulement objet, est déduite des pressions modales rayonnées en amont et en aval. Les démarches de mesure et de post-traitement sont appliquées pour des éléments académiques et des composants industriels : diaphragme, association de deux diaphragmes, volets et associations volet et mur. / Passenger’s thermal comfort inside car cabin is mainly provided by the heating ventilation and air conditioning system (HVAC). The main part of HVAC modules is placed under the dash board. An HVAC module is a compact system composed of various elements which are subject to airflow. The interaction between airflow and these in-duct elements generates noise inside car cabin. Furthermore, the blower used to blow air inside the cabin must overcome the pressure generated by HVAC elements. Noise is created and its level is linked to flow and pressure. HVAC noise is an important issue for car makers and automotive suppliers wishing to reach passenger’s satisfaction. Furthermore, thermal-engine cars are more and more silent. Also hybrid and electric car sells are expanding around the world. HVAC noise became a main issue for automotive actors. Under CEVAS project, Valeo is aiming to develop a prediction tool to design HVAC systems providing sound quality data. Within CEVAS project the UTC is in charge of performing measurements on academic elements and industrial HVAC components : diaphragm, flaps,…

Introduction : La dysfonction diaphragmatique est très fréquente chez des patients adultes aux soins intensifs et elle est associée à des évolutions cliniques défavorables. Il n’y a pour l’instant aucune méthode reconnue pour évaluer la fonction du diaphragme chez l’enfant sous ventilation mécanique (VM), et aucune étude décrivant son évolution dans le temps chez cette population. Méthodes : Dans ce travail, nous avons évalué la fonction contractile du diaphragme chez des enfants sous ventilation invasive aux soins intensifs pédiatriques (SIP) et en salle d’opération (SOP). Pour ce faire, la pression au tube endotrachéal (Paw) et l’activité électrique du diaphragme (EAdi) étaient enregistrées simultanément lors de respirations spontanées pendant une brève manœuvre d’occlusion des voies respiratoires. Afin de prendre en compte la commande respiratoire, un ratio d’efficience neuro-mécanique (NME, Paw/EAdi) a d’abord été calculé puis validé par une analyse de variabilité. La fonction du diaphragme a ensuite été comparée entre les deux populations, et son évolution dans le temps au sein du groupe SIP décrite. Résultats : Le NME médian était la mesure de fonction diaphragmatique la plus fiable, avec un coefficient de variation de 23.7% et 21.1% dans les groups SIP et SOP, respectivement. Le NME dans le groupe SIP après 21 heures de VM (1.80 cmH2O/μV, IQR 1.25–2.39) était significativement inférieur à celui du groupe SOP (3.65 cmH2O/μV, IQR 3.45–4.24, p = 0.015). Dans le groupe SIP, le NME n’a pas diminué de façon significative pendant la VM (coefficient de corrélation -0.011, p = 0.133). Conclusion : La fonction diaphragmatique peut être mesurée au chevet des enfants sous VM par de brèves manœuvres d’occlusion. L’efficience du diaphragme était significativement plus élevée dans un groupe sain que dans une cohorte d’enfants critiquement malades, mais elle était stable dans ce groupe avec une commande respiratoire préservée. Dans le futur, les contributions relatives de la maladie critique et de la ventilation mécanique sur la fonction diaphragmatique devront être mieux caractérisées avant de procéder à l’évaluation de potentielles interventions visant à protéger le diaphragme. / Introduction : Diaphragmatic dysfunction is highly prevalent in adult critical care and is associated with worse outcomes. There is at present no recognized method to assess diaphragmatic function in children under mechanical ventilation (MV) and no study describing its evolution over time in this population. Methods : In this work, we have assessed the contractile function of the diaphragm in children under invasive MV in the pediatric intensive care unit (PICU) and in the operating room (OR). This was done by simultaneously recording airway pressure at the endotracheal tube (Paw) and electrical activity of the diaphragm (EAdi) over consecutive spontaneous breaths during brief airway occlusion maneuvers. In order to account for central respiratory drive, a neuro-mechanical efficiency ratio (NME, Paw/EAdi) was first computed and then validated using variability analysis. Diaphragmatic function was then compared between the two populations and its evolution over time in the PICU group described. Results : Median NME was the most reliable measure of diaphragmatic function with a coefficient of variation of 23.7% and 21.1% in the PICU and OR groups, respectively. NME in the PICU group after 21 hours of MV (1.80 cmH2O/μV, IQR 1.25–2.39) was significantly lower than in the OR group (3.65 cmH2O/μV, IQR 3.45–4.24, p = 0.015). In the PICU group, NME did not decrease significantly over time under MV (correlation coefficient -0.011, p = 0.133). Conclusion : Diaphragmatic function can be measured at the bedside of children under MV using brief airway occlusions. Diaphragm efficiency was significantly higher in healthy controls than in a cohort of critically ill children, but it was stable over time under MV in this group with preserved respiratory drive. In the future, the relative contributions of critical illness and mechanical ventilation on diaphragmatic function should be better characterized before evaluating potential interventions aimed at protecting the diaphragm.

La diminution de la force et l'exacerbation de la fatigue neuromusculaire sont fortement impliquées dans l'altération des capacités fonctionnelles, de la tolérance à l'effort et du pronostic de patients porteurs de pathologies chroniques variées. Ces altérations peuvent trouver leurs origines dans des atteintes primaires de la fonction neuromusculaire et/ou des atteintes secondaires causées par exemple, par une diminution de l'activité spontanée favorisée par une pathologie chronique. Ainsi, la faiblesse et la fatigabilité musculaire sont des symptômes très fréquemment rapportés dans les maladies neuromusculaires (myopathies/neuropathies d'origine génétique ou acquise), les pathologies impliquant le système cardiovasculaire (insuffisance cardiaque) et/ou respiratoire (broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO)). Ces symptômes sont aussi fréquemment associés aux syndromes idiopathiques de douleurs chroniques accompagnées d'anomalies de la nociception (syndrome fibromyalgique). Le développement d'outils d'évaluation bien tolérés et fiables de la force, de l'endurance et de la fatigue neuromusculaire est d'une importance cruciale pour approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques et pour disposer de critères de jugement de qualité dans le cadre d'études observationnelles et interventionnelles. Dans ce contexte, la stimulation artificielle électrique s'est révélée être un outil performant pour évaluer in situ la fonction musculaire chez l'humain au repos et au cours de l'exercice. Plus spécifiquement, la stimulation magnétique des troncs nerveux périphériques a montré des prédispositions intéressantes pour l'évaluation de la fonction des muscles locomoteurs et respiratoires dans le cadre clinique. Au cours de ce travail, nous avons développé des outils d'évaluation de la force, de l'endurance et de la fatigue neuromusculaire en utilisant la neurostimulation magnétique et des protocoles d'exercice potentiellement applicables chez le patient. Nous avons étudié leurs capacités à détecter des différences liées au sexe, l'âge et au statut d'entrainement. Dans un second temps, nous avons appliqué nos évaluations dans le cadre de maladies neuromusculaires et de syndromes douloureux chroniques. Chez le patient BPCO, nous avons étudié les phénomènes de fatigue des muscles respiratoires et locomoteurs, leur impact sur la réponse à l'effort ainsi que leurs relations entre eux et avec les symptômes perçus. Chez ces patients, nous avons recherché les effets d'un entraiment d'une prise en charge combinant un entrainement des muscles locomoteurs et un entrainement des muscles respiratoires sur ces paramètres. / Strength loss and enhanced neuromuscular fatigue are major contributing factors of impaired functional capacities, exercise tolerance and prognosis in patients with various chronic diseases. These alterations can rely on primary deficiencies of neuromuscular function and/or secondary impairments caused by decreased spontaneous physical activity promoted by a chronic disease. Consequently, muscle weakness and enhanced fatigability are frequently reported symptoms in neuromuscular (inherited or noninherited myopathies/neuropathies), cardiovascular (chronic cardiac failure) and respiratory diseases (chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) and idiopathic painful syndromes associated with alteration of nociception (fibromyalgia syndrome). The development of reliable and well-tolerated evaluations of muscle strength, endurance and fatigue is of major interest to better understand the physiopathology of the diseases and to provide relevant outcomes for observational or interventional studies. Artificially muscular electrical stimulation has been recognized as a valuable tool for noninvasive assessments of neuromuscular function at rest and during exercise in human. Recently, magnetic stimulation showed interesting skills to assess both peripheral and respiratory muscles in the clinical field. During this work, we developed tools to assess muscle strength, endurance and fatigue using magnetic neurostimulation and exercise protocols usable in patients. We studied its ability to detect differences related to sex, age and training status. Then we used these procedures in neuromuscular diseases and fibromyalgia syndrome. In COPD patients, we assessed respiratory and locomotor muscle fatigue and studied how these phenomena impact on exercise response and perceived symptoms. In these patients, we also assessed the combined effects of locomotor and respiratory muscle training on these parameters.