No presente trabalho foi investigado o efeito do oligonucleotídeo-modelo 5-AAAAAAAAAA-3(ODN) sobre a estabilidade e estrutura de vesículas catiônicas de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB), extrusadas através filtros de 100 nm, em dispersão aquosa, com as técnicas de espalhamento de luz dinâmico (DLS), medidas de potencial de superfície (potencial zeta), calorimetria diferencial de varredura (DSC), espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS), espectroscopias de absorção óptica e de fluorescência do estado estacionário da sonda Laurdan incorporada a vesículas de DODAB-ODN. Este fluoróforo monitora a polaridade e estrutura da superfície da membrana de DODAB. Variando a concentração de ODN, três diferentes regimes foram observados. Para baixas concentrações de ODN, ([ODN]/[DODAB]) 0.025 mM, a dispersão é estável, límpida, apesar do diâmetro médio das vesículas aumentar, um aumento de turbidez ser observado por medidas de Absorbância, e o SAXS já acusar a presença de algumas poucas multilamelas. As vesículas mistas apresentam potencial de superfície positivo, semelhante ao potencial medido para vesículas de puro DODAB. A calorimetria mostra a coexistência de regiões da bicamada de puro DODAB, e regiões mistas, com DODAB-ODN, sendo estas últimas mais estáveis, apresentando maior temperatura de transição gel-fluido. A forma e posição da banda de fluorescência do Laurdan incorporado às vesículas não são alteradas pela presença do oligonucleotídeo, indicando pouca variação na polaridade e estrutura da superfície da membrana mista monitorada pela sonda. Um segundo regime é observado para ([ODN]/[DODAB]) 0.05 mM, onde não é mais observado por calorimetria a presença significativa de domínios de puro DODAB, e a dispersão mostra-se instável, turva, com agregação/fusão das vesículas. Finalmente, o terceiro regime, para altas concentrações de ODN, ([ODN]/[DODAB]) 0.075 mM, onde é observado um potencial de superfície negativo, portanto, com predominância da carga do oligonucleotídeo, e a dispersão volta a ser estável, apresentando baixa turbidez. Neste regime, a calorimetria indica uma grande estabilidade da fase gel, medidas de SAXS mostram a formação de estruturas multilamelares, porém DLS indica a presença de vesículas pequenas, com dimensões às observadas para DODAB puro. Neste regime, a sonda Laurdan monitora variações na superfície da membrana, possivelmente indicando a diminuição da quantidade de moléculas de água na superfície e/ou um enrijecimento da bicamada. Os estudos aqui apresentados fazem parte de um amplo esforço para entender as características estruturais de agregados lipídio-material genético, com o objetivo de seu uso futuro em terapias gênicas. / In the present work the effect of 5\'-AAAAAAAAAA-3 \'oligonucleotide model (ODN) was investigated on the stability and structure of dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) cationic vesicles, extruded through 100 nm filters in aqueous dispersion, with dynamic scattering techniques (DLS), surface potential measurements (zeta potential), differential scanning calorimetry (DSC), small angle X-ray scattering (SAXS), optical absorption spectrometry and stationary-state fluorescence spectroscopy of Laurdan incorporated into DODAB-ODN vesicles. This fluorophore monitors the polarity and surface structure of the DODAB membrane. Varying the ODN concentration, three different behaviors were observed. For low concentrations of ODN, ([ODN] / [DODAB]) 0.025 mM, the dispersion is stable, clear, although the mean diameter of the vesicles increases, an increase in turbidity is observed by Absorbance measurements, and SAXS already shows the presence of a few multilamellar structure. The mixed vesicles present positive surface potential, similar to the potential measured for pure DODAB vesicles. Calorimetry shows the coexistence of regions of the pure DODAB bilayer, and mixed regions, with DODAB-ODN, the latter being more stable, presenting a higher gel-fluid transition temperature. The shape and position of the Laurdan fluorescence band incorporated into the vesicles are not altered by the presence of the oligonucleotide, indicating minor variation in the polarity and surface structure of the mixed membrane monitored by the probe. A second behavior is observed for ([ODN] / [DODAB]) 0.05 mM, where the presence of pure DODAB domains is no longer detected by calorimetry, and the dispersion is unstable, cloudy, displaying vesicle aggregation/fusion. Finally, the third behavior is detected at high concentrations of ODN, ([ODN] / [DODAB]) 0.075 mM, where a negative surface potential is observed, therefore, with predominance of the charge of the oligonucleotide, and the dispersion is stable, exibiting low turbidity. In this regime, the calorimetry indicates a great stability of the gel phase, SAXS measurements show the formation of multilamellar structures, however DLS indicates the presence of small vesicles, with dimensions to those observed for pure DODAB. In this region, the Laurdan probe monitors variations at the surface of the membrane, possibly indicating the decrease in the amount of water molecules on the surface and/or a stiffening of the bilayer. The studies presented here are part of a broad effort to understand the structural characteristics of \"lipid-genetic material\", aggregates, with the aim of their future use in gene therapies.

No presente trabalho foi investigado o efeito do oligonucleotídeo-modelo 5-AAAAAAAAAA-3(ODN) sobre a estabilidade e estrutura de vesículas catiônicas de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB), extrusadas através filtros de 100 nm, em dispersão aquosa, com as técnicas de espalhamento de luz dinâmico (DLS), medidas de potencial de superfície (potencial zeta), calorimetria diferencial de varredura (DSC), espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS), espectroscopias de absorção óptica e de fluorescência do estado estacionário da sonda Laurdan incorporada a vesículas de DODAB-ODN. Este fluoróforo monitora a polaridade e estrutura da superfície da membrana de DODAB. Variando a concentração de ODN, três diferentes regimes foram observados. Para baixas concentrações de ODN, ([ODN]/[DODAB]) 0.025 mM, a dispersão é estável, límpida, apesar do diâmetro médio das vesículas aumentar, um aumento de turbidez ser observado por medidas de Absorbância, e o SAXS já acusar a presença de algumas poucas multilamelas. As vesículas mistas apresentam potencial de superfície positivo, semelhante ao potencial medido para vesículas de puro DODAB. A calorimetria mostra a coexistência de regiões da bicamada de puro DODAB, e regiões mistas, com DODAB-ODN, sendo estas últimas mais estáveis, apresentando maior temperatura de transição gel-fluido. A forma e posição da banda de fluorescência do Laurdan incorporado às vesículas não são alteradas pela presença do oligonucleotídeo, indicando pouca variação na polaridade e estrutura da superfície da membrana mista monitorada pela sonda. Um segundo regime é observado para ([ODN]/[DODAB]) 0.05 mM, onde não é mais observado por calorimetria a presença significativa de domínios de puro DODAB, e a dispersão mostra-se instável, turva, com agregação/fusão das vesículas. Finalmente, o terceiro regime, para altas concentrações de ODN, ([ODN]/[DODAB]) 0.075 mM, onde é observado um potencial de superfície negativo, portanto, com predominância da carga do oligonucleotídeo, e a dispersão volta a ser estável, apresentando baixa turbidez. Neste regime, a calorimetria indica uma grande estabilidade da fase gel, medidas de SAXS mostram a formação de estruturas multilamelares, porém DLS indica a presença de vesículas pequenas, com dimensões às observadas para DODAB puro. Neste regime, a sonda Laurdan monitora variações na superfície da membrana, possivelmente indicando a diminuição da quantidade de moléculas de água na superfície e/ou um enrijecimento da bicamada. Os estudos aqui apresentados fazem parte de um amplo esforço para entender as características estruturais de agregados lipídio-material genético, com o objetivo de seu uso futuro em terapias gênicas. / In the present work the effect of 5\'-AAAAAAAAAA-3 \'oligonucleotide model (ODN) was investigated on the stability and structure of dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) cationic vesicles, extruded through 100 nm filters in aqueous dispersion, with dynamic scattering techniques (DLS), surface potential measurements (zeta potential), differential scanning calorimetry (DSC), small angle X-ray scattering (SAXS), optical absorption spectrometry and stationary-state fluorescence spectroscopy of Laurdan incorporated into DODAB-ODN vesicles. This fluorophore monitors the polarity and surface structure of the DODAB membrane. Varying the ODN concentration, three different behaviors were observed. For low concentrations of ODN, ([ODN] / [DODAB]) 0.025 mM, the dispersion is stable, clear, although the mean diameter of the vesicles increases, an increase in turbidity is observed by Absorbance measurements, and SAXS already shows the presence of a few multilamellar structure. The mixed vesicles present positive surface potential, similar to the potential measured for pure DODAB vesicles. Calorimetry shows the coexistence of regions of the pure DODAB bilayer, and mixed regions, with DODAB-ODN, the latter being more stable, presenting a higher gel-fluid transition temperature. The shape and position of the Laurdan fluorescence band incorporated into the vesicles are not altered by the presence of the oligonucleotide, indicating minor variation in the polarity and surface structure of the mixed membrane monitored by the probe. A second behavior is observed for ([ODN] / [DODAB]) 0.05 mM, where the presence of pure DODAB domains is no longer detected by calorimetry, and the dispersion is unstable, cloudy, displaying vesicle aggregation/fusion. Finally, the third behavior is detected at high concentrations of ODN, ([ODN] / [DODAB]) 0.075 mM, where a negative surface potential is observed, therefore, with predominance of the charge of the oligonucleotide, and the dispersion is stable, exibiting low turbidity. In this regime, the calorimetry indicates a great stability of the gel phase, SAXS measurements show the formation of multilamellar structures, however DLS indicates the presence of small vesicles, with dimensions to those observed for pure DODAB. In this region, the Laurdan probe monitors variations at the surface of the membrane, possibly indicating the decrease in the amount of water molecules on the surface and/or a stiffening of the bilayer. The studies presented here are part of a broad effort to understand the structural characteristics of \"lipid-genetic material\", aggregates, with the aim of their future use in gene therapies.

Introdução: A tuberculose é uma infecção curável causada pelo Mycobacterium tuberculosis. Requer tratamento prolongado e a combinação de vários fármacos implicando em efeitos colaterais que podem levar pacientes ao abandono do tratamento. Formulações de droga de liberação controlada como nanopartículas, nanoemulsões ou lipossomos têm tido sucesso contra doenças infecciosas. Em especial, brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) disperso em água pode formar lipossomos ou vesículas grandes (LV) ou fragmentos de bicamada (BF) que podem carrear drogas hidrofóbicas ou hidrofílicas e ademais, podem atuar como microbicidas. Objetivos: determinar atividade do DODAB contra Mycobacterium tuberculosis e M. smegmatis tanto isoladamente como em combinação com duas drogas tuberculostáticas, rifampicina (RIF) e isoniazida (ISO); determinar a incorporação de RIF e ISO em dispersões de DODAB. Material e Métodos: Dispersões de DODAB foram obtidas por vortexação (LV) ou sonicação (BF) e sua interação com as drogas foi avaliada por espectros óticos das drogas, espalhamento de luz dinâmico para medida de distribuição de tamanhos e potencial-zeta e diálise para determinação de incorporação dos fármacos em DODAB LV ou BF. Viabilidade de M. smegmatis ou M. tuberculosis foi determinada por contagem de viáveis em função de concentração de DODAB. Combinações DODAB/droga contra micobactérias foram avaliadas por determinação de concentração inibitória minima (CIM), em µg/ml. Resultados: DODAB mata M. smegmatis a partir de 4 µM de concentração e 1 h de interação e M. tuberculosis, em 100 µM e 120 h de interação. ISO resultou permeável através da bicamada de DODAB em contraste com RIF que adsorveu irreversivelmente nas bicamadas, resultando em 75% de incorporação com 0.1 e 2 mM de droga e DODAB, respectivamente. CIM de RIF contra M. smegmatis foi 32 e, em combinação com 2 de DODAB caiu para 2. Para M. tuberculosis CIM de 0,015 caiu para 0,007 em combinação com 4 DODAB. A combinação foi sinérgica contra M. smegmatis e de ação independente contra M. tuberculosis. / Introduction: Tuberculosis is potentially curable but remains a serious public health problem with large numbers of infected people in several countries. The long time that the patient should receive medication, associated with a large number of adverse effects often cause treatment failure. Nanoparticles, liposomes and emulsions have been used successfully in antibacterial therapy. In particular, dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) bilayers in form of bilayer fragments (BF) or vesicles (LV) provided adequate environment for solubilization and stabilization of several drugs with an additional advantage: they acted as antimicrobial agents themselves. Objectives: investigation of DODAB bactericidal activity against mycobacteria, determination of entrapment efficiency for rifampicin (RIF) and isoniazid (ISO) in DODAB dispersions and determination of the DODAB/drug activity against Mycobacterium smegmatis and tuberculosis. Material and Methods: DODAB dispersions were obtained by sonication of dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) synthetic lipid (BF)or by vortexing (LV) the lipid powder in aqueous solution. The physic-chemical characteristics of drugs in DODAB dispersions were determined from optical spectra and dynamic light scattering for evaluating size distribution and zeta-potentials. Drug incorporation in DODAB dispersions was determined from dialysis. Cell viability was determined from plating and colony forming unities (CFU) counting as a function of [DODAB]. Minimal inhibitory concentration (MIC) was obtained for drug or DODAB/drug combinations. Results: DODAB killed M. smegmatis and tuberculosis from 4¨µM (1 h interaction) and 100 µM (120 h interaction), respectively. Rifampicin drug particles above its solubilization limit could be solubilized by BF at 0.5 mM lipid. LV was leaky to ISO whereas RIF could be incorporated in BF or LV bilayer at high percentiles (0.1 mM RIF in 2 mM DODAB BF or LV). MIC for combination DODAB/RIF was 2/2 or 4/0.007 µg/mL whereas synergism index was 0.5 or 1.0 against M. smegmatis or M. tuberculosis, respectively. DODAB and RIF acted synergistically when tested against M. smegmatis.

Introdução: A tuberculose é uma infecção curável causada pelo Mycobacterium tuberculosis. Requer tratamento prolongado e a combinação de vários fármacos implicando em efeitos colaterais que podem levar pacientes ao abandono do tratamento. Formulações de droga de liberação controlada como nanopartículas, nanoemulsões ou lipossomos têm tido sucesso contra doenças infecciosas. Em especial, brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) disperso em água pode formar lipossomos ou vesículas grandes (LV) ou fragmentos de bicamada (BF) que podem carrear drogas hidrofóbicas ou hidrofílicas e ademais, podem atuar como microbicidas. Objetivos: determinar atividade do DODAB contra Mycobacterium tuberculosis e M. smegmatis tanto isoladamente como em combinação com duas drogas tuberculostáticas, rifampicina (RIF) e isoniazida (ISO); determinar a incorporação de RIF e ISO em dispersões de DODAB. Material e Métodos: Dispersões de DODAB foram obtidas por vortexação (LV) ou sonicação (BF) e sua interação com as drogas foi avaliada por espectros óticos das drogas, espalhamento de luz dinâmico para medida de distribuição de tamanhos e potencial-zeta e diálise para determinação de incorporação dos fármacos em DODAB LV ou BF. Viabilidade de M. smegmatis ou M. tuberculosis foi determinada por contagem de viáveis em função de concentração de DODAB. Combinações DODAB/droga contra micobactérias foram avaliadas por determinação de concentração inibitória minima (CIM), em µg/ml. Resultados: DODAB mata M. smegmatis a partir de 4 µM de concentração e 1 h de interação e M. tuberculosis, em 100 µM e 120 h de interação. ISO resultou permeável através da bicamada de DODAB em contraste com RIF que adsorveu irreversivelmente nas bicamadas, resultando em 75% de incorporação com 0.1 e 2 mM de droga e DODAB, respectivamente. CIM de RIF contra M. smegmatis foi 32 e, em combinação com 2 de DODAB caiu para 2. Para M. tuberculosis CIM de 0,015 caiu para 0,007 em combinação com 4 DODAB. A combinação foi sinérgica contra M. smegmatis e de ação independente contra M. tuberculosis. / Introduction: Tuberculosis is potentially curable but remains a serious public health problem with large numbers of infected people in several countries. The long time that the patient should receive medication, associated with a large number of adverse effects often cause treatment failure. Nanoparticles, liposomes and emulsions have been used successfully in antibacterial therapy. In particular, dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) bilayers in form of bilayer fragments (BF) or vesicles (LV) provided adequate environment for solubilization and stabilization of several drugs with an additional advantage: they acted as antimicrobial agents themselves. Objectives: investigation of DODAB bactericidal activity against mycobacteria, determination of entrapment efficiency for rifampicin (RIF) and isoniazid (ISO) in DODAB dispersions and determination of the DODAB/drug activity against Mycobacterium smegmatis and tuberculosis. Material and Methods: DODAB dispersions were obtained by sonication of dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) synthetic lipid (BF)or by vortexing (LV) the lipid powder in aqueous solution. The physic-chemical characteristics of drugs in DODAB dispersions were determined from optical spectra and dynamic light scattering for evaluating size distribution and zeta-potentials. Drug incorporation in DODAB dispersions was determined from dialysis. Cell viability was determined from plating and colony forming unities (CFU) counting as a function of [DODAB]. Minimal inhibitory concentration (MIC) was obtained for drug or DODAB/drug combinations. Results: DODAB killed M. smegmatis and tuberculosis from 4¨µM (1 h interaction) and 100 µM (120 h interaction), respectively. Rifampicin drug particles above its solubilization limit could be solubilized by BF at 0.5 mM lipid. LV was leaky to ISO whereas RIF could be incorporated in BF or LV bilayer at high percentiles (0.1 mM RIF in 2 mM DODAB BF or LV). MIC for combination DODAB/RIF was 2/2 or 4/0.007 µg/mL whereas synergism index was 0.5 or 1.0 against M. smegmatis or M. tuberculosis, respectively. DODAB and RIF acted synergistically when tested against M. smegmatis.

Staphylococcus spp. é uma das principais causas da mastite bovina, onde o uso de antimicrobianos tem sido comprometido por mecanismos de resistência bacteriana e geração de resíduos que alteram a qualidade e segurança alimentar do leite e derivados. Foi avaliada a atividade in vitro da nisina (NS), do brometo de dioctadecildimetilamônio (DDA) e do complexo NS/DDA contra Staphylococcus spp. resistentes isolados de mastite bovina. A CBM50 da nisina e DDA foi 50 e 4μg/mL, respectivamente, enquanto que a CBM50 do complexo NS/DDA foi 3/2μg/mL, com efeito parcialmente sinérgico. O estudo de time-kill revelou redução de 3 log10 UFC/mL após uma hora de interação entre NS/DDA e a bactéria. A microscopia de fluorescência confirmou uma perda da viabilidade após 6 horas de interação. A interação NS/DDA resultou na formação de nanopartículas (148,5 nm) catiônicas (+8,84 mV) cuja interação com a superfície bacteriana negativa (-27,32 mV) resultou em ação bactericida. NS/DDA pode ser uma alternativa promissora contra Staphylococcus spp. resistentes isolados de mastite bovina. / Staphylococcus spp. is a major cause of bovine mastitis, where the use of antimicrobials has been compromised by bacterial resistance mechanisms and waste generation that change the food quality and safety of milk and dairy products. The in vitro activity antibacterial was evaluated of the nisin (NS), of the dioctadecyldimethylammonium bromide (DDA) and of the NS/DDA complex against drug-resistant Staphylococcus spp. isolated from bovine mastitis. The CBM50 of nisin and DDA were 50 and 4μg/ml, respectively, while the CBM50 NS/DDA complex was 3/2mg/mL, with partially synergistic effect. The time-kill study showed reduction of 3log10 CFU/mL after an hour of interaction between NS/DDA and bacteria. Fluorescence microscopy confirmed a loss of viability after 6h of interaction. NS/DDA interaction resulted in formation of nanoparticles (148.5 nm) cationic (+8.84 mV) which interact with negative bacterial surface (-27.32 mV) resulted in bactericidal activity. NS/DDA may be a promising alternative against drug-resistant Staphylococcus spp. isolated from bovine mastitis.

Lipossomos de cloreto de dioctadecildimetilamonio (DODAC) com 0,51µ de diâmetro externo médio e transição de fase ocorrendo em uma faixa estreita de temperaturas (0,5-1,0°C) foram obtidos por vaporização de clorofórmio e comparados com vesículas sonicadas de DODAC (cerca de 250 Å de diâmetro externo). Sacarose foi impermeante através de lipossomos grandes de DODAC ou de vesículas sonicadas de DODAC podendo ser utilizada para determinações de volume interno em ambas as preparações. Volume interno aparente para lipossomos grandes de DODAC foi 9,7 ± 1,3 1/mol e para vesículas sonicadas de DODAC, 0,33 ± 0,20 1/mol (adsorção de sacarose à bicamada de, respectivamente, 0,64 ± 0,30 e 0,20 ± 0,08 1/mol). Lipossomos grandes de DODAC comportaram-se como osmômetros em relação à sacarose e ao KCl (0-50mM KCl). Já as vesículas sonicadas de DODAC foram osmoticamente não-responsivas em relação à sacarose, floculando em presença de KCl. Essa não-responsividade osmótica foi interpretada como decorrente da presença única e exclusiva de água de hidrataçao no compartimento aquoso interno das vesículas sonicadas. Outras propriedades de lipossomos grandes de DODAC foram análogas às apresentadas por lipossomos de fosfolípides. Permeabilidades relativas (KCl como referência incorporado ao compartimento aquoso interno) do NaCl, HCl e sacarose foram similares às descritas para lipossomos de fosfatidilcolina; NaCl e sacarose sendo tão impermeantes quanto o KCl e HCl, sendo ligeiramente mais permeante que o KCl. Nas vizinhanças da temperatura de transição de fase, ocorreu um acentuado aumento da velocidade inicial de encolhimento e a extensão total de encolhimento chegou a um mínimo. A comparaçao de algumas propriedades físicas e funcionais de vesículas sonicadas e de lipossomos grandes de DODAC permitiu concluir que lipossomos grandes de DODAC constituem um modelo mais adequado para estudos de transporte. Adicionalmente, o método de vaporização de clorofórmio foi testado para o dihexadecilfosfato de Na+ (DCP) sendo obtidas dispersões homogêneas desse anfifílico capazes de incorporar um volume de 13 ± 4 1/mol e de responderem como osmômetros a gradientes osmóticos de sacarose, um soluto que praticamente nao é adsorvido à bicamada de DCP e que resultou impermeante através da mesma. / Dioctadecyldimethylammonium chloride (DODAC) liposomes with 0.51µ mean external diameter and sharp phase transitions were obtained by chloroform vaporization and compared with (small) sonicated DODAC vesicles. Sucrose was impermeant through large DODAC liposomes and sonicated vesicles and was used for internal volume determinations. The apparent internal volumes for large DODAC liposomes and sonicated DODAC vesicles were, respectively, 9.7 ± 1.3 and 0.33 ± 0.20 1/mol. (External sucrose adsorption were, respectively, 0.64 ± 0.30 and 0.20 ± 0.08 l/mol). Ideal osmometer behaviour towards KCl over the 0-50mM concentrations range and towards sucrose were observed only for large DODAC liposomes. Sonicated DODAC vesicles were osmotically non responsive towards sucrose and floculate with KCl. Other properties of large DODAC liposomes closely resembled those of phospholipid liposomes. At temperatures near the phase transition temperature, a steep increase in the initial shrinkage rate and a minimum for the total extent of shrinkage occured. Relative permeabilities (KCl as reference entrapped inside) to NaCl, HCl and sucrose were similar to those of phosphatidyl choline liposomes. NaCl and sucrose were as impermeant as KCl, and HCl slighthly more permeant than KCl. Large DODAC liposomes are proposed as an adequate synthetic membrane model, in contrast to sonicated DODAC vesicles. In addition, the chlroform vaporization method was tested for sodium dihexadecylphosphate (DCP). Large DCP liposomes were demonstrated to be impermeant towards sucrose entrapping 13 ± 4 l/mol and behaving as an osmometer towards this solute.

Staphylococcus spp. é uma das principais causas da mastite bovina, onde o uso de antimicrobianos tem sido comprometido por mecanismos de resistência bacteriana e geração de resíduos que alteram a qualidade e segurança alimentar do leite e derivados. Foi avaliada a atividade in vitro da nisina (NS), do brometo de dioctadecildimetilamônio (DDA) e do complexo NS/DDA contra Staphylococcus spp. resistentes isolados de mastite bovina. A CBM50 da nisina e DDA foi 50 e 4μg/mL, respectivamente, enquanto que a CBM50 do complexo NS/DDA foi 3/2μg/mL, com efeito parcialmente sinérgico. O estudo de time-kill revelou redução de 3 log10 UFC/mL após uma hora de interação entre NS/DDA e a bactéria. A microscopia de fluorescência confirmou uma perda da viabilidade após 6 horas de interação. A interação NS/DDA resultou na formação de nanopartículas (148,5 nm) catiônicas (+8,84 mV) cuja interação com a superfície bacteriana negativa (-27,32 mV) resultou em ação bactericida. NS/DDA pode ser uma alternativa promissora contra Staphylococcus spp. resistentes isolados de mastite bovina. / Staphylococcus spp. is a major cause of bovine mastitis, where the use of antimicrobials has been compromised by bacterial resistance mechanisms and waste generation that change the food quality and safety of milk and dairy products. The in vitro activity antibacterial was evaluated of the nisin (NS), of the dioctadecyldimethylammonium bromide (DDA) and of the NS/DDA complex against drug-resistant Staphylococcus spp. isolated from bovine mastitis. The CBM50 of nisin and DDA were 50 and 4μg/ml, respectively, while the CBM50 NS/DDA complex was 3/2mg/mL, with partially synergistic effect. The time-kill study showed reduction of 3log10 CFU/mL after an hour of interaction between NS/DDA and bacteria. Fluorescence microscopy confirmed a loss of viability after 6h of interaction. NS/DDA interaction resulted in formation of nanoparticles (148.5 nm) cationic (+8.84 mV) which interact with negative bacterial surface (-27.32 mV) resulted in bactericidal activity. NS/DDA may be a promising alternative against drug-resistant Staphylococcus spp. isolated from bovine mastitis.

Lipossomos de cloreto de dioctadecildimetilamonio (DODAC) com 0,51µ de diâmetro externo médio e transição de fase ocorrendo em uma faixa estreita de temperaturas (0,5-1,0°C) foram obtidos por vaporização de clorofórmio e comparados com vesículas sonicadas de DODAC (cerca de 250 Å de diâmetro externo). Sacarose foi impermeante através de lipossomos grandes de DODAC ou de vesículas sonicadas de DODAC podendo ser utilizada para determinações de volume interno em ambas as preparações. Volume interno aparente para lipossomos grandes de DODAC foi 9,7 ± 1,3 1/mol e para vesículas sonicadas de DODAC, 0,33 ± 0,20 1/mol (adsorção de sacarose à bicamada de, respectivamente, 0,64 ± 0,30 e 0,20 ± 0,08 1/mol). Lipossomos grandes de DODAC comportaram-se como osmômetros em relação à sacarose e ao KCl (0-50mM KCl). Já as vesículas sonicadas de DODAC foram osmoticamente não-responsivas em relação à sacarose, floculando em presença de KCl. Essa não-responsividade osmótica foi interpretada como decorrente da presença única e exclusiva de água de hidrataçao no compartimento aquoso interno das vesículas sonicadas. Outras propriedades de lipossomos grandes de DODAC foram análogas às apresentadas por lipossomos de fosfolípides. Permeabilidades relativas (KCl como referência incorporado ao compartimento aquoso interno) do NaCl, HCl e sacarose foram similares às descritas para lipossomos de fosfatidilcolina; NaCl e sacarose sendo tão impermeantes quanto o KCl e HCl, sendo ligeiramente mais permeante que o KCl. Nas vizinhanças da temperatura de transição de fase, ocorreu um acentuado aumento da velocidade inicial de encolhimento e a extensão total de encolhimento chegou a um mínimo. A comparaçao de algumas propriedades físicas e funcionais de vesículas sonicadas e de lipossomos grandes de DODAC permitiu concluir que lipossomos grandes de DODAC constituem um modelo mais adequado para estudos de transporte. Adicionalmente, o método de vaporização de clorofórmio foi testado para o dihexadecilfosfato de Na+ (DCP) sendo obtidas dispersões homogêneas desse anfifílico capazes de incorporar um volume de 13 ± 4 1/mol e de responderem como osmômetros a gradientes osmóticos de sacarose, um soluto que praticamente nao é adsorvido à bicamada de DCP e que resultou impermeante através da mesma. / Dioctadecyldimethylammonium chloride (DODAC) liposomes with 0.51µ mean external diameter and sharp phase transitions were obtained by chloroform vaporization and compared with (small) sonicated DODAC vesicles. Sucrose was impermeant through large DODAC liposomes and sonicated vesicles and was used for internal volume determinations. The apparent internal volumes for large DODAC liposomes and sonicated DODAC vesicles were, respectively, 9.7 ± 1.3 and 0.33 ± 0.20 1/mol. (External sucrose adsorption were, respectively, 0.64 ± 0.30 and 0.20 ± 0.08 l/mol). Ideal osmometer behaviour towards KCl over the 0-50mM concentrations range and towards sucrose were observed only for large DODAC liposomes. Sonicated DODAC vesicles were osmotically non responsive towards sucrose and floculate with KCl. Other properties of large DODAC liposomes closely resembled those of phospholipid liposomes. At temperatures near the phase transition temperature, a steep increase in the initial shrinkage rate and a minimum for the total extent of shrinkage occured. Relative permeabilities (KCl as reference entrapped inside) to NaCl, HCl and sucrose were similar to those of phosphatidyl choline liposomes. NaCl and sucrose were as impermeant as KCl, and HCl slighthly more permeant than KCl. Large DODAC liposomes are proposed as an adequate synthetic membrane model, in contrast to sonicated DODAC vesicles. In addition, the chlroform vaporization method was tested for sodium dihexadecylphosphate (DCP). Large DCP liposomes were demonstrated to be impermeant towards sucrose entrapping 13 ± 4 l/mol and behaving as an osmometer towards this solute.

A interação entre fragmentos de bicamada (BF) de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) e um mononucleotídeo-modelo (deoxiadenosina monofosfato, dAMP) ou um oligodeoxinucleotídeo-modelo (5\'- AAAAAAAAAA-3\', poli(dA)) ou um oligodeoxinucleotídeo terapêutico (5\'- TTGACGTTCG -3\', CpG) foi investigada por turbidimetria, espalhamento de luz dinâmico, espectroscopia de dicroísmo circular e de fluorescência e calorimetria diferencial de varredura (DSC). Respostas imunológicas foram caracterizadas com ensaio de hipersensibilidade tardia por inchamento de coxim patelar de camundongo, dosagem de anticorpos IgG1 e IgG2a e de citocinas secretadas por células de linfonodo em cultura. Poli(dA), em contraste com dAMP, induziu fusão máxima de DODAB BF a partir da neutralização de cargas, quando houve obtenção de um tamanho máximo e um potencial-zeta igual a zero para os arranjos. Para [poli(dA)] maiores do que aquela correspondente à neutralização de cargas, houve recuperação da estabilidade coloidal com reversão do potencial-zeta e com obtenção de tamanhos que foram aproximadamente o dobro daqueles determinados inicialmente para DODAB BF. A proporção molar de neutralização poli(dA): DODAB foi 1:10 para DODAB BF e 1:20 para vesículas grandes (LV) de DODAB, de acordo com as estruturas de bicamada aberta e fechada dessas duas dispersões de bicamada de DODAB. A fusão de DODAB BF induzida por poli(dA) foi extensiva aumentando o grau de empacotamento das bicamadas formadas conforme inferido a partir dos termogramas de DSC. Em condições de equivalencia de cargas, nucleotídeo não causou fusão de DODAB BF, mostrando a importância do caráter de polieletrólito do poli(dA) para induzir fusão. O sal divalente Na2HPO4 causou fusão e aumentou o empacotamento da bicamada graças à blindagem eficiente de cargas. Reestabilização coloidal como aquela induzida por poli(dA) não ocorreu em presença de Na2HPO4, NaCl ou nucleotídeo. Para complexos DODAB BF/CpG em presença de ovalbumina (OVA) como antígenomodelo, a neutralização de cargas de DODAB BF/OVA por CpG reduziu a estabilidade coloidal, enquanto que supercompensação de cargas levou à reestabilização por repulsão eletrostática, como observado para a interação DODAB BF/poli(dA). Diferenças no tamanho e nas proporções de neutralização por CpG indicaram que os fragmentos são capazes de carregar mais moléculas de OVA do que de BSA. Na região de supercompensação de cargas com potenciais-zeta negativos, arranjos Al(OH)3/ OVA/ CpG são coloidalmente bem mais instáveis que DODAB BF/ OVA ou DODAB BF / OVA/ CpG. O complexo negativamente carregado DODAB (0,1 mM) / OVA (0,1mg/mL)/ CpG (0,020 mM) potencializou a resposta Th1 obtida com DODAB (0,1 mM)/ OVA (0,1 mg/mL). Houve um aumento de 25 % no inchamento do coxim patelar, de 36 % na produção de IFN-γ, de 60 % de IL-12 e produção sustentada de IgG2a ao longo de 35 dias pós-imunização, todos indícios fortes de potencialização da resposta Th1 por CpG. Arranjos negativamente carregados de oligonucleotídeos em fragmentos de bicamada de DODAB possuem excelente potencial para terapias baseadas em oligonucleotídeos e para produção de vacinas para diferentes antígenos de interesse. / The interaction between bilayer fragments (BF) of dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) and a model nucleotide (deoxyadenosine monophosphate, dAMP) or a model oligodeoxynucleotide (5\'- AAAAAAAAAA-3\', poly(dA)) or a therapeutic oligodeoxynucleotide (5\'- TTGACGTTCG -3\', CpG) was investigated by means of turbidimetry, dynamic light scattering, circular dichroism and fluorescence spectroscopies and differential scanning calorimetry. Immune responses were characterized using footpad swelling delayed type hipersensitivity assay and antibody and cytokine measurements. In contrast to dAMP, poly(dA) induced maximal DODAB BF fusion from charge neutralization, where assemblies presented maximal size and zero zeta-potential. Above charge neutralization colloid stability was recovered with negative zeta-potentials and sizes that were about the double of those initially determined for DODAB BF. The poly(dA):DODAB molar ratio for neutralization was 1:10 for DODAB BF and 1:20 for DODAB LV, in agreement with the open and closed bilayer structures of these two DODAB bilayer dispersions. The poly(dA)-induced DODAB BF fusion was extensive and increased the packing of the formed bilayers, as inferred from DSC thermograms. In conditions of charge equivalence, nucleotide did not cause DODAB BF fusion, highlighting the importance of poly(dA)\'s polyelectrolyte character to induce fusion. Divalent Na2HPO4 salt caused fusion and increased bilayer packing due to efficient BF charge shielding. Colloid restabilization as induced by poly(dA) was not observed in presence of Na2HPO4, NaCl and nucleotide. For DODAB BF/CpG complexes in presence of the ovalbumin (OVA) model antigen, the charge neutralization of DODAB BF/OVA by CpG reduced colloid stability, while charge overcompensation led to restabilization due to electrostatic repulsion, as observed for DODAB BF/poly(dA) interaction. Differences in size and neutralization proportions by CpG indicate that BF are able to load more OVA than BSA molecules. In the charge overcompensation region with negative zeta-potentials, Al(OH)3/OVA/CpG assemblies are colloidally less stable than DODAB BF/OVA or DODAB BF/OVA/CpG. The negatively charged DODAB (0.1mM)/OVA (0.1mg/ml)/CpG (0.020mM) assembly enhanced the Th1 response obtained with DODAB (0.1mM)/OVA (0.1mg/ml). There was a 25% increase in footpad sweeling, a 36% and 60% increase in the production of IFN-γ and IL-12 and sustained IgG2a production for the 35-day period after immunization, all indicative of strong Th1 response enhancement by CpG. Negatively charged assemblies of oligonucleotides in DODAB bilayer fragments have excellent potential in oligonucleotidebased therapies and in vaccine production for different antigens of interest.

A bactéria Neisseria meningitidis é um diplococo Gram-negativo. Dentre os sorogrupos de N. meningitidis, o sorogrupo B é um dos principais causadores da doença meningocócica invasiva (DMI), de ocorrência mundial. Recém-nascidos e crianças são especialmente susceptíveis a este tipo de infecção, uma vez que os seus sistemas imunitários ainda estão em desenvolvimento, assim mais estudos sobre a utilização da imunização materna para a proteção contra esta doença, são necessários. O objetivo desse estudo foi avaliar o potencial imunogênico dos antígenos de membrana externa de N. meningitidis sorogrupo B em camundongos Swiss quanto ao efeito da imunização passiva na prole, além de analisar o efeito de diferentes adjuvantes na produção de anticorpos e transferencia materno-fetal destes. O hidróxido de alumínio (HA) e fragmentos de bicamada de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB-BF) foram utilizados como adjuvantes junto às vesículas de membrana externa (OMVs) para a imunização de camundongos adultos fêmeas, o que resultou em um aumento dos títulos de anticorpos do isótipo IgG quando comparado a imunização apenas com o antígeno, tanto pela via de imunização subcutânea com booster intramuscular (SC/IM), quanto pela via intranasal com booster subcutâneo (IN/SC). Esses anticorpos foram transferidos para a prole, que apresentou títulos de anticorpos significantes até o período no qual os camundongos apresentavam cinco semanas de vida. A imunização com OMVs + DODAB-BF foi capaz de gerar o reconhecimento específico de um maior número de antígenos que OMVs + HA, nos camundongos adultos fêmeas imunizados pela via SC/IM. A imunização com OMVs + DODAB-BF pela via SC/IM também resultou em anticorpos na prole que foram capazes de reconhecer antígenos proteicos da cepa homóloga e de cepas heterólogas, o que não ocorre quando essa imunização é realizada pela via IN/ SC. Apesar da presença de títulos de anticorpos na prole, estes irão apresentar funcionalidade diferente em comparação aos anticorpos da prole de mães imunizadas pela via SC/IM, sugerindo que a via SC/IM é melhor para a imunização materna com OMVs + DODAB-BF. / The Neisseria meningitidis bacterium is a Gram-negative diplococcus. Among the serogroups of N. meningitidis, serogroup B is one of the main causes of invasive meningococcal disease (IMD), worldwide occurrence. Newborns and children are particularly susceptible to this type of infection, since their immune systems are still developing, so further studies about the use of the maternal immunization to protect against this disease, are needed. The aim of this study was to evaluate the potential immunogenic antigens from outer membrane of N. meningitidis serogroup B in Swiss mice as to the effect of passive immunization in the offspring, in addition to analyze the effect of different adjuvants in the production of antibodies and maternal-fetal transfer of these. The aluminium hydroxide (HA) and bilayer fragments from dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB-BF) were used as adjuvants with the outer membrane vesicles (OMVs) for immunization of adult female mice, which resulted in an increase of the antibodies titers of IgG isotype when compared to immunization with only the antigen, either by subcutaneous route of immunization with intramuscular booster (SC/IM), as by the intranasal route with subcutaneous booster (IN/SC). These antibodies were transferred to the offspring, which presented significant antibodies titers to the period in which the mice had five weeks of live. Immunization with OMVs + DODAB-BF was able to generate the specific recognition of a greater number of antigens than OMVs + HA, in adult female mice immunized by SC/IM route. Immunization with OMVs + DODAB-BF SC/IM route also resulted in antibodies in offspring that were able to recognize protein antigens of the homologous strain and heterologous strains, which does not occur when this immunization is carried out by IN/SC route. Despite the presence of antibodies in the offspring, they will present different functionality compared to antibodies of the offspring of mothers immunized by SC/IM route, suggesting that the SC/IM route is better for maternal immunization with OMVs + DODAB-BF.