Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-04-28Bitstream added on 2014-06-13T19:01:00Z : No. of bitstreams: 1 bonassi_nm_dr_sjrp.pdf: 1534267 bytes, checksum: 3adccd4ff98686debb8a8310516a0008 (MD5) / Utilizamos as técnicas de espectrofotometria UV-visível (turbidez), a calorimetria diferencial de varredura (DSC), fluorescência de estado estacionário e ressonância paramagnética eletrônica (EPR), a fim de investigar mudanças estruturais em vesículas de anfifílicos sintéticos catiônicas de brometo de didodecildimetilamônio, DDAB, e haletos de dioctadecildimetilamônio, DODAX(X= Cl - ou Br - ), aniônicas de dihexadecil fosfato, DHP, e zwitteriônicas de DL - a dipalmitoil fosfatidilcolina, DPPC, na ausência e na presença de surfactantes não-iônicos etileno glicol n - dodecil mono éter, C12En (n = 5, 7 e 8), e zwitteriônico 1 - (N hexadecil, N N dimetilamônio) propano, 3, sulfonato, HPS, formadores de micelas. Observamos que a transição vesícula-micela causada pela adição de surfactantes monoalquiladas às vesículas depende da natureza do contra-íon de DODAX (X= Cl - ou Br - ), do método de preparação das vesículas e do co-soluto. Para todos os sistemas investigados, determinamos a temperatura de transição da fase gel para líquido-cristalina (Tm) e as razões de concentrações críticas dos surfactantes na mistura, Rsat e Rsol, no processo de transição estrutural. Os resultados desse trabalho são coerentes com os reportados na literatura para sistemas... / Structural change processes in vesicular systems made up of synthetic cationic double chain amphiphiles didodecyldimethylammonium bromide, DDAB, dioctadecyldimethylammonium halide, DODAX (X = Cl- or Br-), anionic dihexadecyl, DHP, and zwitterionic DL - a dipalmitoyl phosphatidylcholine, DPPC, have been investigated by UV-visible (turbidity) spectroscopy, differential scanning calorimetric (DSC), steady-state fluorescence and electron paramagnetic resonance (EPR) in the absence and presence of nonionic ethylene glycol n - dodecyl monoether, C12En (n = 5, 7 and 8), and zwitterionic 1- (N - hexadecyl, N N dimethylammonium) propane, 3, sulphonate , HPS, surfactants. The addition of single chain surfactant to the vesicle dispersion caused vesicle-micelle transition. We observed that DODAX vesicle counterion shows distinguished interaction and define the extent of the surfactant solubilization. The effects of the vesicles preparation protocol, relative concentration of the surfactant species and co-solutes on the vesicle-micelle transition have been investigated. We determined the gel to liquid crystalline phase transition temperature (Tm) and the surfactant critical molar concentration ratios Rsat and Rsol in the vesicle-micelle transition. Results of the present work are consistent with others for similar systems reported elsewhere.

Submitted by Pós Imunologia (ppgimicsufba@gmail.com) on 2017-02-07T17:52:23Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO CANDACE.pdf: 704424 bytes, checksum: f22bcf625694ce2a558b1c47f749c351 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-02-08T16:02:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO CANDACE.pdf: 704424 bytes, checksum: f22bcf625694ce2a558b1c47f749c351 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-08T16:02:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO CANDACE.pdf: 704424 bytes, checksum: f22bcf625694ce2a558b1c47f749c351 (MD5) / CAPES / As leishmanioses se constituem um complexo de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania spp. Esses parasitos infectam preferencialmente os macrófagos, podendo infectar também células dendríticas e neutrófilos. Macrófagos infectados por microrganismos intracelulares produzem vesículas extracelulares (VEs), que podem modular respostas imunes tanto in vitro quanto in vivo. Essas VEs são consideradas uma das principais vias de comunicação intercelulares, em conjunto com fatores de crescimento, citocinas, nucleotídeos, lipídios, óxido nítrico e moléculas de adesão. Foi demonstrado pelo nosso grupo que vesículas extracelulares secretadas por macrófagos infectados por L. amazonensis são capazes de estimular a produção de IL-12, IL-1β e TNF-α por macrófagos naive. Sendo assim, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito dessas vesículas sobre a infecção leishmaniótica tanto in vitro quanto in vivo. Para isso, as vesículas extracelulares foram geradas a partir de macrófagos originados de medula óssea de camundongos BALB/c superinfectados com L. amazonensis, a confirmação da produção dessas vesículas foi obtida pela visualização das mesmas pela técnica de rastreamento de nanopartículas (NTA, do inglês). As vesículas não foram capazes de interferir na infecção por L. amazonensis in vitro, não houve diferença estatisticamente significativa no percentual de macrófagos infectados e nem no número de parasitos por célula. Em modelo murino, a utilização dessas vesículas ocasionou aumento significativo da carga parasitária em relação ao grupo controle salina sem interferir no tamanho de lesão e na produção de anticorpos anti- Leishmania. É possível que essas vesículas exerçam importante papel no processo biológico da doença, sendo responsáveis pelo agravamento da infecção. / Leishmaniases are a complex of diseases caused by parasites of the genus Leishmania spp. These parasites preferentially infect macrophages, which can also infect dendritic cells and neutrophils. Macrophages infected by intracellular microorganisms release extracellular vesicles (EVs), which can modulate immune responses in vitro and in vivo. These EVs have an important part to play in intercellular communication, together with growth factors, cytokines, nucleotides, lipids, nitric oxide and adhesion molecules. Our group showed that extracellular vesicles secreted by macrophages infected with L. amazonensis are able to induces the production of IL-12, IL-1β and TNF-α by macrophages naive. The aim of this study was to evaluate the role of these vesicles on Leishmania amazonensis infection both in vitro and in vivo. For this, the extracellular vesicles were generated from macrophages derived from bone marrow of BALB/c superinfected with L. amazonensis, confirmation of production of vesicles was obtained by nanoparticle tracking analysis. The vesicles were not able to interfere with infection by L. amazonensis in vitro, there was no statistically significant difference in the percentage of infected macrophages and in the number of parasites per cell. In a murine model, the vesicles caused a significant increase in parasite burden compared to the saline control group without interfering with the lesion size and production of anti-Leishmania antibodies. It is possible that these vesicles carry important role in the biological process of the disease, being responsible for the worsening the infection.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2017. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-08T19:25:00Z No. of bitstreams: 1 2017_VítorYamashiroRochaSoares.pdf: 15000041 bytes, checksum: edeff738495916aac284e7f7815f27cf (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-04-04T22:23:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_VítorYamashiroRochaSoares.pdf: 15000041 bytes, checksum: edeff738495916aac284e7f7815f27cf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T22:23:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_VítorYamashiroRochaSoares.pdf: 15000041 bytes, checksum: edeff738495916aac284e7f7815f27cf (MD5) / Introdução: Apesar do schwannoma vestibular (SV) ser um tumor do nervo vestibular, a perda auditiva (PA) é o sintoma mais comum, presente em 95% dos pacientes. Entretanto, a fisiopatologia dessa PA ainda é desconhecida. A compressão do nervo coclear pelo tumor não é capaz de elucidar completamente sua fisiopatologia e levanta a hipótese que a PA provocada pelo SV pode estar relacionada às substâncias secretadas pelo tumor presentes no líquido que banha a cóclea. Objetivo: Este trabalho identifica se as vesículas extracelulares (VE) derivadas do SV são mediadores no dano de células cocleares. Métodos: VEs foram isoladas de cultura de linhagem celular (células HEI-193) e de cultura de células primárias de SV de pacientes com boa audição (BA) e de pacientes com PA. As VEs foram caracterizadas usando o Nanosight e microscopia eletrônica de transmissão. O conteúdo de RNA das VEs foi extraído. O efeito das VEs sobre cultura de neurônios do gânglio espiral e sobre cultura ex-vivo de cócleas de camundongos foi estudado usando um sistema de cultura duplo e pela marcação das VEs com PKH-67. Mudanças provocadas pelas VEs nas células cocleares foram quantificadas utilizando imunohistoquímica e microscopia confocal. Transfecção da linhagem celular de SV com plasmídeo contendo GFP (proteína fluorescente verde) foi confirmada com reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR). Resultados: Células tumorais humanas de pacientes com PA produzem VEs que podem causar danos em neurônios do gânglio espiral. Em contraste, VEs de células tumorais associados com BA não foram capazes de provocar danos as células cocleares. Conclusão: Este é o primeiro relato de VEs derivadas de SV. Essas VEs quando originadas de SV associados a PA eram capazes de causar danos seletivos nas células cocleares, identificando assim um novo e potencial mecanismo de perda auditiva neurossensorial em pacientes com SV. / Introduction: Although vestibular schwannoma (VS) is a tumor of the vestibular nerve, hearing loss (HL) is the most frequent symptom, presenting in 95% of the patients. However, the pathophysiology of HL is not well understood. The compression of coclear nerve by the tumor is not able to explain the cause of hearing loss perfectly and raise the hypothesis that HL may be related to tumor secretome that reach the cochlea. Objective: This research explores the role of VS-secreted extracellular vesicles (EVs) as a major contributing factor in cochlear cells damage. Methods: EVs were isolated from VS cell line HEI-193 and primary cultured human VS cells from patients with good hearing or poor hearing. The EVs were characterized using a Nanosight device and transmission electron microscopy and by extracting their RNA content. The EVs’ effects on cultured murine spiral ganglion cells and organotypic cochlear cultures were studied using a transwell dual-culture system and by direct labeling of EVs with PKH-67 dye. EV-induced changes in cochlear cells were quantified using confocal immunohistochemistry. Transfection of VS cells with a green fluorescent protein–containing plasmid was confirmed with reverse transcription PCR. Results: Human VS cells, from patients with poor hearing, produced EVs that could damage spiral ganglion neurons. In contrast, EVs derived from VS cells from patients with good hearing did not damage the cultured cochlear cells. Conclusion: This is the first report on EVs derived from VSs and on the capacity of EVs from VSs from patients with hearing loss to selectively damage cochlear cells, thereby identifying a potential novel mechanism of VS-associated sensorineural hearing loss.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctora en Bioquímica / El cáncer de mama corresponde a una de las neoplasias malignas que más se asocia a mortalidad en el género femenino a nivel mundial. Aunque su incidencia ha disminuido gracias a la implementación de mamografías de exploración y aplicación de terapias adyuvantes, esta disminución no parece ser suficiente, ya que el desarrollo de metástasis aún sigue siendo responsable de más del 90% de las muertes asociadas a cáncer de mama, entre otros tipos de cáncer. La progresión de células tumorales hacia un estado metastásico implica la adquisición de características, tales como resistencia a apoptosis, migración e invasividad elevada etc. Teniendo en cuenta esto último, se ha descrito que muchas de estas características son potenciadas por la expresión de Caveolina-1 (CAV1), involucrando a esta proteína de la membrana en la progresión del cáncer. Específicamente en cáncer de mama avanzado se ha observado que una elevada expresión de CAV1 se asocia a una menor sobrevida del paciente. Por otro lado, estudios in vitro realizados en nuestro laboratorio en la línea celular de cáncer de mama metastásico humano, MDA-MB-231, han indicado que el silenciamiento de CAV1 conduce a una disminución en la migración, polarización y recambio de adhesiones focales en comparación con células MDA-MB-231 control. La pregunta que surge ahora es de qué manera CAV1 es capaz de promover migración e invasión, favoreciendo metástasis, considerando que este proceso en sí es ineficiente debido a que menos del 0,1% de las células diseminadas están implicadas en iniciar este proceso. Una de las respuestas puede deberse a que se genera el transporte de CAV1 junto a otras moléculas a través de vesículas xiii extracelulares (EVs), las cuales serían capaces de llevar a esta proteína como mensaje a células contiguas dentro del mismo microambiente tumoral o a células pertenecientes a tejidos distantes idóneos para la formación de un nicho pre-metastásico. En este contexto, se tienen registros de que vesículas de células de la línea celular MDA-MB-231 que contiene niveles endógenos elevados de CAV1 son capaces de promover migración en células de cáncer de mama humano carentes de CAV1, como MCF-7 de carácter no metastásico, pero se desconoce el contenido y su rol en este proceso. Estos antecedentes nos llevaron a plantear la hipótesis que: CAV1 en vesículas extracelulares aumenta el potencial migratorio e invasivo in vitro en células de cáncer de mama y metastásis in vivo en un modelo de xenotrasplante de cáncer de mama. Por consiguiente el objetivo principal de esta tesis fue evaluar la capacidad migratoria e invasora de células de cáncer de mama in vitro y el desarrollo de metástasis in vivo en un modelo de xenotrasplante mamario expuesto a EVs que contienen CAV1. Para abordar la hipótesis de trabajo se plantearon los siguientes objetivos específicos: (1) Purificar y caracterizar vesículas extracelulares de las líneas celulares humanas de cáncer de mama metastásico y no metastásico; (2) Estudiar del efecto de EVs con CAV1 en las propiedades de migración e invasión in vitro en líneas celulares de cáncer de mama humano; (3) Evaluar el perfil proteómico de EVs de las sublíneas de cáncer de mama MDA-MB-231 WT, shC y shCAV1 y por último (4) Evaluar la capacidad metastásica en un modelo murino de xenotrasplante inoculado por la vía intraperitoneal con EVs que contienen CAV1. Los resultados mostraron la obtención de EVs enriquecidos en vesículas del tamaño de exosomas de <200 nm de diámetro a partir de medios condicionados de las líneas xiv celulares de cáncer de mama metástasico humano, MDA-MB-231 WT y MDA-MB-231(shC) que expresan niveles endógenos elevados de CAV1 y en células carentes de CAV1 como MDA-MB-231(shCAV1). Esta caracterización se complementó con imágenes obtenidas mediante microscopía electrónica de transmisión de las vesículas aisladas que mostró tamaños de vesículas de alrededor de 100 nm de diámetro en general y con el hallazgo de CAV1 en vesículas provenientes de MDA-MB-231 WT y shC y no así en vesículas de MDA-MB-231(shCAV1). Cabe añadir que se detectaron marcadores de EVs en todas las muestras mediante Western blot. Para evaluar el efecto biológico de vesículas que contienen o no CAV1 en células de cáncer de mama de carácter metastásico o no metastásico, se evaluaron parámetros de migración e invasión de estas células una vez expuestas a EVs. Los resultados indicaron que independiente del tipo celular utilizado como célula recipiente de EVs, aquellas células que son tratadas con EVs que contienen CAV1 aumentan su potencial migratorio e invasivo en comparación con células no tratadas o tratadas con EVs que no contienen CAV1. El análisis por espectrometría de masas reveló la presencia de proteínas específicas relacionadas con la adhesión celular, como Cyr61, tenascina (TNC) y S100A9 sólo en EVs de MDA-MB-231 WT y shC y no en EVs de MDA-MB-231 carentes de CAV1. De manera de evaluar el rol pro-metastásico de CAV1 en EVs en un modelo animal, se inyectaron estas vesículas junto con células de cáncer de mama metastásico o no metastásico por la vía intraperitoneal en un modelo murino denominado Carcinomatosis intraperitoneal. Los resultados indicaron que animales inoculados con células más EVs que contienen CAV1 presentaron un aumento en el número de células tumorales en el líquido ascítico hallado en la cavidad peritoneal junto con un aumento en la masa tumoral en bazo/páncreas y xv mesenterio en comparación con aquellos animales que no fueron tratados o tratados sólo con células o tratados con células más EVs que no contienen CAV1. Cabe recalcar que nuevamente el efecto de las EVs con CAV1 se dio independiente a que se inoculara junto con células de cáncer de mama que contenían o no CAV1 en el modelo murino. Esto nos lleva a sugerir que la importancia del efecto biológico de estas vesículas en la célula recipiente no sólo recae en la presencia de CAV1, sino que en el tipo de cargo molecular que puedan traer consigo CAV1 en estas vesículas / Breast cancer is the leading cause of cancer-related deaths in women. Although the incidence of this disease has decreased thanks to the implementation of screening mammograms and application of adjuvant therapies, this decrease does not seem to be enough, since the development of metastasis is still responsible for more than 90% of deaths associated with breast cancer, among other types of cancer. The progression of tumor cells towards a metastatic state implies the acquisition of characteristics, such as resistance to apoptosis, migration and high invasiveness, etc. Taking into account the latter, it has been described that many of these characteristics are enhanced by the expression of Caveolin-1 (CAV1), thereby implicating this membrane protein in the progression of cancer. Specifically in advanced breast cancer it has been observed that a high expression of CAV1 is associated with a shorter survival of the patient. On the other hand, in vitro studies conducted in our laboratory using the human metastatic breast cancer cell line, MDA-MB-231, have indicated that the silencing of CAV1 leads to a decrease in migration, polarization and focal adhesion turnover in comparison with control MDA-MB-231 cells. The question that arises is how CAV1 may promote migration, invasion and metastasis, considering that this process is very inefficient because less than 0.1% of the disseminated cells successfully establish a metastatic nodule. One possibility may be that CAV1 is present together with other molecules in extracellular vesicles (EVs), which serve as vectors to transport these components to adjacent cells within the same tumor microenvironment and/or to distant sites where they may condition xvii the pre-metastatic niche. Here, it should be noted that EVs from MDA-MB-231 cells reportedly promote migration of non-metastatic MCF-7 human breast cancer cells, but the precise content of these EVs and their role in this process were not defined. This led us to propose the following hypothesis: CAV1 in extracellular vesicles increases the migratory and invasive potential of breast cancer cells in vitro and in a breast cancer xenotransplant model in vivo. Therefore, the main goal of this thesis was to evaluate the migratory and invasive capacity in vitro and metastatic breast cancer cells in vivo in a xenotransplant model exposed to EVs containing CAV1. To address the working hypothesis, the following specific objectives were proposed: (1) To purify and characterize extracellular vesicles from human metastatic and non-metastatic breast cancer cell lines; (2) To study the effect of CAV1-containing EVs on migration and invasion in vitro of human breast cancer cell lines; (3) To evaluate the protein content by mass spectrometry of EVs from the three breast cancer sub lines MDA-MB-231 WT, shC and shCAV1; and finally (4) To evaluate the metastatic potential in vivo in a murine xenotransplant model inoculated intraperitoneally with EVs containing or not CAV1. The results showed that we were able to isolate an EV preparation enriched in vesicles of <200 nm in diameter, which is characteristic of exosomes. The EVs were purified from conditioned media of the human metastatic breast cancer cell lines, MDA-MB-231 and MDA-MB-231(shC), both expressing elevated endogenous levels of CAV1, as well as from cells lacking CAV1, such as MDA-MB-231(shCAV1) cells. This characterization was complemented by transmission electron microscopy of the isolated vesicles, which revealed that vesicles were around 100 nm in diameter. Finally, by western blotting, CAV1 was detected xviii together with exosome markers in vesicles from MDA-MB-231 WT and shC but not in MDA-MB-231(shCAV1) EVs. To evaluate the biological effects of vesicles with or without CAV1 on metastatic or non-metastatic breast cancer cells, migration and invasion parameters of these cells were evaluated following exposure to EVs. Regardless of the cell type that was used as a recipient cell, those cells that were treated with EVs containing CAV1 increased their migratory and invasive potential in comparison with cells that were either not treated or treated with EVs lacking CAV1. Analysis by mass spectrometry revealed the presence of specific proteins related to cell adhesion, such as Cyr61, tenascin (TNC) and S100A9 only in MDA-MB-231 WT and shC EVs but not in EVs from MDA-MB-231 lacking of CAV1. These results were confirmed by western blotting analysis. In order to evaluate the role of CAV1 in EVs in a murine carcinoma model, these vesicles were injected intraperitoneally together with metastatic or non-metastatic breast cancer cells into recipient mice. For animals inoculated with cells plus EVs containing CAV1, the number of tumor cells found in the ascitic fluid generated within the peritoneal cavity was dramatically increased. Also, a substantial increase in the tumor mass in spleen/pancreas and mesentery was observed in these mice compared to those animals that were either not treated, treated only with cells or treated with cells plus EVs that did not contain CAV1. It should be noted that again these effects of CAV1-containing EVs were observed regardless of whether the reciepient breast cancer cell type employed in these experiments expressed CAV1 or not. Thus, the biological effects of these vesicles in the recipient cell xix appear not to be attributable to CAV1 per se, but rather to depend on differences in the molecular cargos that are incorporated into EVs in the presence of CAV1

Submitted by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T17:09:57Z No. of bitstreams: 1 Tese Ligia Kalb.pdf: 5952650 bytes, checksum: a59edd5e470c45308c3131321c0d4992 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T17:22:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese Ligia Kalb.pdf: 5952650 bytes, checksum: a59edd5e470c45308c3131321c0d4992 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T17:22:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Ligia Kalb.pdf: 5952650 bytes, checksum: a59edd5e470c45308c3131321c0d4992 (MD5) Previous issue date: 2015 / CNPq / Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Fiocruz-PR, Curitiba, PR, Brasil / O tráfego vesicular mediado por clatrina, mecanismo pelo qual proteínas e lipídeos são transportados entre organelas envolvidas por membrana, é responsável por uma grande proporção de interiorização de membrana plasmática (endocitose) e de transporte a partir da Rede Trans Golgi para o sistema endossomal. Os eventos mediados por clatrina ainda são pouco conhecidos no protozoário Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas na América Latina. Além disso, estudos de sequências genômicas demonstram um extremo grau de divergência entre tripanosomatídeos, animais e fungos, com cerca de 1/3 das proteínas preditas sem função conhecida. Neste estudo, a expressão do gene e a localização das proteínas cadeias pesada (TcCHC) e leve (TcCLC) de clatrina foram investigadas em diferentes formas evolutivas de T. cruzi (epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas), utilizando anticorpos policlonais e monoclonais produzidos contra as proteínas recombinantes de T. cruzi. A localização celular da proteína epsina (TcEpsina), uma importante proteína associada à clatrina, também foi investigada através de sua fusão com GFP e subsequente imunolocalização. Análise por microscopia confocal revelou um acúmulo de TcEpsina, TcCHC e TcCLC na porção anterior das células, onde a bolsa flagelar e complexo de Golgi estão localizados. A TcCLC parcialmente colocalizou com o marcador de Golgi TcRAB7-GFP e com albumina endocitada, mas não co-localizou com transferrina, uma proteína endocitada principalmente via vesículas não revestidas formadas no complexo citóstoma/citofaringe. As cadeias leve e pesada de clatrina tipicamente localizaram-se na porção anterior ao cinetoplasto, região em que encontram-se a bolsa flagelar e o Complexo de Golgi. Nossos dados indicam que em formas epimastigotas de T. cruzi a endocitose de albumina mediada por clatrina ocorre na bolsa flagelar, enquanto endocitose de transferina independente de clatrina ocorre no complexo citóstoma/citofaringe. Para uma análise proteômica dos complexos proteicos associados à clatrina e epsina, a cadeia leve de clatrina foi fusionada às proteínas A e C e a epsina foi fusionada a GFP e ambas as proteínas foram submetidas à criomoagem seguida da imunoprecipitação dos complexos a elas associados. Esta metodologia permitiu a identificação de suas proteínas associadas por espectrometria de massas, tais como os Complexos Adaptadores AP-1 e AP-4, vSNAREs, Rab4, Rab 11, epsina, tepsina, AP180, Sec1, Auxilina e Scamp. Foi demonstrada também a presença de proteínas hipotéticas nesta análise. Esta metodologia nos permitiu sugerir a forma com a qual ocorre o tráfego de vesículas em T. cruzi e como ocorre a maturação dos reservossomos, os quais acumulam funções de endossomo inicial, endossomo tardio e lisossomo. Análises futuras são necessárias a fim de comprovar estas hipóteses.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-07-27T16:14:54Z No. of bitstreams: 1 2017_NataliaGurgeldoCarmo.pdf: 2103011 bytes, checksum: 717c638c359f77a76fc1856d6eb60f1a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-08-31T19:05:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_NataliaGurgeldoCarmo.pdf: 2103011 bytes, checksum: 717c638c359f77a76fc1856d6eb60f1a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-31T19:05:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_NataliaGurgeldoCarmo.pdf: 2103011 bytes, checksum: 717c638c359f77a76fc1856d6eb60f1a (MD5) Previous issue date: 2017-08-31 / Exossomos e microvesículas fazem parte das vesículas extracelulares. Estas são produzidas e liberadas por uma variedade de tipos celulares, inclusive em sobrenadante do meio celular, e estão presentes em diferentes fluidos biológicos. Elas podem carregar mRNA e miRNA, dentre outras moléculas. No câncer, os miRNA associados às vesículas extracelulares estão relacionados com a comunicação entre as células tumorais e o microambiente tumoral. Este estudo avaliou a presença das proteínas relacionadas com a maquinaria de processamento de miRNA, nas vesículas extracelulares secretadas pelas linhagens celulares MDA-MB231 (câncer de mama humano) e fibroblasto humano no tempo de crescimento celular de 72 horas. Para purificar estas partículas foi utilizado o método de centrifugação diferencial e ultracentrifugação. Após isto, caracterizou-se as vesículas pelo seu tamanho e distribuição de partículas utilizando a resistência de pulso, pelo sistema qNANO. Para a detecção de proteínas, a técnica de western blot foi realizada a fim de se identificar a presença das proteínas de interesse. Como resultado, as vesículas extracelulares provenientes dos sobrenadantes das linhagens celulares foram purificadas e caracterizadas pelo seu tamanho adequadamente. Observou-se também que a quantidade de partículas de vesículas extracelulares da linhagem tumoral obtida pelo sistema qNANO, foi superior quando comparada à amostra não-tumoral. Os resultados da detecção de proteínas por western blot demonstram que as proteínas Dicer, Ago2 e TRBP2 estão presentes na amostra proveniente da linhagem tumoral MDA-MB231. Confirmou-se a presença de proteínas TSG101, Alix, CD63 - marcadoras moleculares de vesículas extracelulares. Confirmou-se também ausência nas amostras, da proteína Calnexina, a qual é controle negativo e é indicativo de contaminação nas vesículas extracelulares. Por fim, foram identificadas em ambas as amostras as proteínas ApoA-IV, AQP2 e IL-6, as quais estão associadas ao microambiente tumoral na sinalização do miRNA. Conclui-se que as proteínas Dicer, Ago2 e TRBP2, pertencentes a maquinaria de processamento de miRNA, bem como proteínas ainda não discutidas pela literatura em vesículas extracelulares na linhagem tumoral estudada, estão presentes no sobrenadante da linhagem tumoral MDA-MB231, sugerindo um papel para essas moléculas na biologia tumoral. / Exossomes and microvesicles are part of the extracellular vesicles. There are produced and released by a variety of cell types, including cell media supernatant, and be present in different biological fluids. They can carry mRNA and miRNA, among other molecules. In cancer, miRNAs associated with extracellular vesicles are related to the communication between tumor cells and the tumor microenvironment. This study evaluated the presence of proteins related to the miRNA processing machinery in the extracellular vesicles secreted by cell lines MDA-MB231 (human breast cancer) and human fibroblast at cell growth time of 72 hours. Purification of the culture medium supernatant was carried out by the differential ultracentrifugation method. After this, the vesicles were characterized by their size and particle distribution using the pulse resistance by qNANO system. For the detection of proteins, the western blot technique was performed to identify the presence of the proteins of interest. As a result, extracellular vesicles from cell line supernatants were purified and characterized by their size appropriately. It was also observed that the number of extracellular vesicles particles of the tumor lineage obtained by qNANO system was superior when compared to the nontumor sample. The results of western blot detection of proteins demonstrate that Dicer, Ago2 and TRBP2 proteins, related to miRNA processing machinery, are present in the sample from the MDA-MB231 tumor line. We confirmed the presence of TSG101, Alix, CD9 – which are extracellular vesicle molecular marker proteins. Also, we confirmed in both samples the absence of Calnexin, which is a negative control, it is indicative of contamination in the extracellular vesicles. Lastly, we identified in both samples ApoAIV, AQP2 and IL-6 proteins which are associated with tumor microenvironment in miRNA signaling. In conclusion, Dicer, Ago2 and TRBP2 proteins belonging to miRNA processing machinery, as well as proteins not yet discussed in the literature in extracellular vesicles from tumor cell, were present in the supernatant of the MDAMB231 tumor cell, suggesting a role for these molecules in tumor biology.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-03T16:06:57Z No. of bitstreams: 1 2016_GetúlioPereiradeOliveiraJúnior.pdf: 6476902 bytes, checksum: a3f2f0389f08e205c0d33fb86fb3bbd4 (MD5) / Approved for entry into archive by Ruthléa Nascimento(ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2017-03-28T15:23:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_GetúlioPereiradeOliveiraJúnior.pdf: 6476902 bytes, checksum: a3f2f0389f08e205c0d33fb86fb3bbd4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T15:23:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_GetúlioPereiradeOliveiraJúnior.pdf: 6476902 bytes, checksum: a3f2f0389f08e205c0d33fb86fb3bbd4 (MD5) / As vesículas extracelulares (VEs) são liberadas pelas células e circulam em fluidos biológicos. Elas carregam e entregam proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos que participam da regulação da expressão gênica na célula receptora. Entre os ácidos nucleicos transportados por VEs estão os microRNAs (miRNA). As VEs participam de diferentes estados de saúde e doença, por exemplo, durante uma prática esportiva e injúria traumática cerebral (ITC). O exercício físico é importante componente no tratamento de doenças metabólicas. Já a ITC é uma grande causa de morte no mundo, devido a quedas, acidentes de carros e na prática de esportes como futebol americano e boxe. Este trabalho tem como objetivo caracterizar os miRNAs associados a VEs presentes no soro de ratos e plasma de cavalos submetidos a exercício físico aeróbio agudo. Além disso, tem como objetivo caracterizar VEs após ITC em camundongos e na morte celular por necroptose, um dos componentes da ITC, em macrófagos. Ratos foram exercitados em esteira em intensidades leve, moderada e intensa e cavalos foram submetidos a prova oficial de enduro equestre e amostras de sangue foram coletadas antes da prova, após 66km, após o final da prova (130km), 2h após o final da prova e 15h após o final da prova. A caracterização de VEs foi feita, os pequenos RNAs foram extraídos de VEs e sequenciados. A caracterização biofísica das partículas mostrou aumento na concentração de VEs tanto no soro de ratos exercitados quanto no plasma de cavalos após a prova de enduro. Entre os miRNAs diferencialmente expressos após o exercício em ratos são rno-miR-128-3p, rno-miR-25-3p, rno-miR-148a-3p, rno-miR-191a-5p, rno-miR-22-3p, rno-miR- 27a-3p e em cavalos eca-miR-30d, eca-miR-25, eca-miR-30e, eca-miR-423-5p, eca-miR-92a e eca-miR-140-3p. Camundongos foram submetidos à ITC em laboratório e as VEs foram purificadas diretamente do cérebro, quantificadas e a presença de IL-1β analisadas nessas VEs. A via de morte por necroptose foi ativada em macrófagos derivados da medula óssea (MDMO) após tratamento com LPS+ZVAD e as VEs foram analisadas. A ITC não aumentou a concentração de VEs no cérebro de camundongos mas mostrou um aumento na concentração de IL-1β em VEs de camundongos lesionados. A morte por necroptose em MDMO induziu um aumento na concentração de VEs, tendo as proteínas RIPK1 e RIPK3 papel na liberação e carregamento proteico de VEs. As VEs purificadas de MDMO necroptoticos podem causar morte celular em linhagem de célula neuronal receptora. Este estudo pode servir como base para outros estudos e também ajudar no entendimento do papel de VEs na atividade física e na ITC. / As vesículas extracelulares (VEs) são liberadas pelas células e circulam em fluidos biológicos. Elas carregam e entregam proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos que participam da regulação da expressão gênica na célula receptora. Entre os ácidos nucleicos transportados por VEs estão os microRNAs (miRNA). As VEs participam de diferentes estados de saúde e doença, por exemplo, durante uma prática esportiva e injúria traumática cerebral (ITC). O exercício físico é importante componente no tratamento de doenças metabólicas. Já a ITC é uma grande causa de morte no mundo, devido a quedas, acidentes de carros e na prática de esportes como futebol americano e boxe. Este trabalho tem como objetivo caracterizar os miRNAs associados a VEs presentes no soro de ratos e plasma de cavalos submetidos a exercício físico aeróbio agudo. Além disso, tem como objetivo caracterizar VEs após ITC em camundongos e na morte celular por necroptose, um dos componentes da ITC, em macrófagos. Ratos foram exercitados em esteira em intensidades leve, moderada e intensa e cavalos foram submetidos a prova oficial de enduro equestre e amostras de sangue foram coletadas antes da prova, após 66km, após o final da prova (130km), 2h após o final da prova e 15h após o final da prova. A caracterização de VEs foi feita, os pequenos RNAs foram extraídos de VEs e sequenciados. A caracterização biofísica das partículas mostrou aumento na concentração de VEs tanto no soro de ratos exercitados quanto no plasma de cavalos após a prova de enduro. Entre os miRNAs diferencialmente expressos após o exercício em ratos são rno-miR-128-3p, rno-miR-25-3p, rno-miR-148a-3p, rno-miR-191a-5p, rno-miR-22-3p, rno-miR- 27a-3p e em cavalos eca-miR-30d, eca-miR-25, eca-miR-30e, eca-miR-423-5p, eca-miR-92a e eca-miR-140-3p. Camundongos foram submetidos à ITC em laboratório e as VEs foram purificadas diretamente do cérebro, quantificadas e a presença de IL-1β analisadas nessas VEs. A via de morte por necroptose foi ativada em macrófagos derivados da medula óssea (MDMO) após tratamento com LPS+ZVAD e as VEs foram analisadas. A ITC não aumentou a concentração de VEs no cérebro de camundongos mas mostrou um aumento na concentração de IL-1β em VEs de camundongos lesionados. A morte por necroptose em MDMO induziu um aumento na concentração de VEs, tendo as proteínas RIPK1 e RIPK3 papel na liberação e carregamento proteico de VEs. As VEs purificadas de MDMO necroptoticos podem causar morte celular em linhagem de célula neuronal receptora. Este estudo pode servir como base para outros estudos e também ajudar no entendimento do papel de VEs na atividade física e na ITC.

Não consta resumo na publicação / Abstract not available

Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Resumo: As vesículas lipídicas unilamelares gigantes (GUVs) são consideradas ótimas ferramentas em sistemas de estudos que mimetizam membranas biológicas, devido à sua composição fosfolipídica e sensibilidade ao estresse oxidativo, além de possuírem capacidade de encapsular macromoléculas. Este foi o primeiro estudo a utilizar vesículas unilamelares gigantes como carreadoras de antioxidante (cisteina) em sistema de produção in vitro de embriões (PIVE). Sua utilização aliada ao sistema de cultivo é interessante, pois acredita-se poder ocorrer liberação do antioxidante de acordo com a demanda do sistema de PIVE. O objetivo desse estudo foi avaliar o comportamento das GUVs co-cultivadas in vitro com embriões bovinos, definir o método de indução ao estresse oxidativo e sua efetividade ao encapsular e carrear antioxidantes sob condições de estresse oxidativo. Foram testados indutores de estresse oxidativo [menadiona (MD) e peróxido de hidrogênio (H2O2)] nas GUVs, sendo o H2O2 em altas concentrações eficaz em induzir o estresse oxidativo através da alteração do diâmetro [Controle (18,96 μm) vs. H2O2 0,1 mM (17,71 μm), H2O2 0,5 mM (17,32 μm) e H2O2 1,0 mM (16,63 μm)]. Houve redução na taxa de desenvolvimento embrionário (P<0,05) dos grupos co-cultivados com GUVs e submetidos ao estresse oxidativo pela MD [Controle (26,70%) GUV (25,18%) vs. GUV+MD 5,0 μM (6,95%) e GUV+MD 7,5 μM (0,95%)]. As maiores concentrações intracelulares de ROS em embriões bovinos (P<0,05), foi no grupo GUV+MD 5,0 μM (... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Giant unilamellar lipid vesicles (GUVs) are considered to be great tools in study systems that mimic biological membranes due to their phospholipid composition and sensitivity to oxidative stress, as well as their ability to encapsulate macromolecules. This was the first study to use giant unilamellar vesicles as antioxidant (cysteine) carriers in an in vitro embryo production system (PIVE). Its use combined with the cultivation system would be interesting because it is believed that antioxidant release could occur according to the demand of the PIVE system. The aim of this study was to evaluate the behavior of GUVs co-cultured in vitro with bovine embryos, to standardize the oxidative stress induction method and its effectiveness to encapsulate and carry antioxidants under oxidative stress conditions. Oxidative stress inducers [meanadione (MD) and hydrogen peroxide (H2O2)] were tested in GUVs, and H2O2 at high concentrations was effective in inducing oxidative stress by changing the diameter [Control (18.96 μm) vs. 0.1 mM H2O2 (17.71 μm), 0.5 mM H2O2 (17.32 μm) and 1.0 mM H2O2 (16.63 μm)]. Embryonic development rate (P <0.05) was reduced in groups co-cultivated with GUVs and submitted to oxidative stress by DM [Control (26.70%) GUV (25.18%) vs. GUV + MD 5.0 μM (6.95%) and GUV + MD 7.5 μM (0.95%)]. The highest intracellular ROS concentrations in bovine embryos (P <0.05) were in the GUV + MD 5.0 μM group (16.28) vs. Control (3.76) and GUV (3.99 ± 0.33). By co-cultivating GUVs ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A presente tese trata do estudo de vesículas lipídicas utilizando-se principalmente as técnicas de microscopia óptica de fluorescência e confocal. Vesículas unilamelares gigantes (GUVs) são modelos de membranas biológicas de suma importância na pesquisa científica por apresentarem tamanhos similares aos de células biológicas, permitindo a direta visualização das delas por meio de microscopia óptica e, assim, contribuindo para estudos de propriedades de membranas e mecanismo de interação com moléculas biológicas de interesse. O primeiro estudo desta tese refere-se ao mecanismo de fusão de GUVs, durante o crescimento pelo método de eletroformação, foi investigado através da técnica de microscopia óptica e confocal. Observações mostraram que as vesículas pequenas crescem em tamanho por meio de fusão com outras vesículas, aumentando de tamanho para formar as GUVs. Os resultados obtidos indicaram que a fusão ocorre entre vesículas que estão no mesmo substrato lipídico, não ocorrendo com vesículas já formadas em solução. Em seguida, verificou-se a resposta de GUVs constituídas por diferentes composições lipídicas em relação ao campo elétrico externo aplicado (AC), por meio de microscopia óptica de fluorescência. Os resultados obtidos sugerem que o campo elétrico (2 V e 60 Hz, por 2h) modifique alguns domínios em GUVs compostas de 25% de DOPC e 75% de SM. Além disso, observações de microscopia indicaram que GUVs constituídas de DOPC, DMPC e DLPC respondem de diferentes formas ao campo elétrico aplicado, bem como à diferença de pressão osmótica externa e interna das vesículas. As GUVs de DLPC apresentaram a maior deformação de membrana quando aplicada uma variação de tensão de 1 a 20 V. Em resposta a um meio externo mais concentrado em glicose formaram-se longos filamentos externos às GUVs que podem ser retraídos com a aplicação de um campo elétrico de 10 V e 20 Hz. Por fim, investigou-se a interação de GUVs compostas por lipídios majoritariamente encontrados nas plaquetas humanas com a urease de Jack bean (JBU), utilizando-se microscopia óptica de fluorescência. Os resultados obtidos sugerem que o efeito da JBU na membrana seja dependente da concentração, sendo capaz de se inserir na membrana das GUVs nas concentrações de 0,01 e 0,1 μM. / Herein, we report the study of lipid vesicles using fluorescence and confocal microscopy. Giant unilamellar vesicles (GUVs) are models of biological membranes, which are important in scientific research due to their similar size with biological cell, allowing direct visualization in optical microscopy. Thus, the use of GUVs contributes to studies of the properties of membranes and mechanism of interaction with biological molecules of interest. Firstly, the mechanism of GUVs fusion during growth by electroformation method was investigated by confocal microscopy. Observations have shown that small vesicles grow in size by fusing with neighboring vesicles, increasing in size to form GUVs. The results indicated that fusion between vesicles that are in the same lipid substrate is by far the predominant mechanism at play during giant vesicle electroformation. Further, we studied the response of GUVs composed of different lipid in relation to the external applied electric field (AC), by optical fluorescence microscopy. The results suggest that the electric field (2 V and 60 Hz, 2h) modify some domains in GUVs composed of 25% DOPC and 75% SM. In addition, microscopic observations indicated that GUVs of DOPC, DMPC, and DLPC respond differently to electric field applied and the difference in osmotic pressure outside and inside of the vesicles. The GUVs of DLPC showed the highest deformation of the membrane when applied to a range of 1 to 20 V. In response to an external environment more concentrated glucose were formed long filaments outside the GUVs that can be retracted by applying an electric field of 10 V and 20 Hz. Finally, we investigated the interaction of GUVs mainly composed of lipids found in human platelets with Jack Bean urease (JBU), using optical fluorescence microscopy. The results suggest that the effect of JBU on the membrane is concentration dependent, being able to insert itself in the membrane of GUVs at concentrations of 0.01 and 0.1 μM.