This dissertation deals with the numerical investigation of the physics of sprays autoigniting at diesel engine conditions using Direct Numerical Simulations (DNS), and with the modelling of droplet related effects within the Conditional Moment Closure (CMC) method for turbulent non-premixed combustion. The dissertation can be split in four different sections, with the content of each being summarized below. The first part of the dissertation introduces the equations that govern the temporal and spatial evolution of a turbulent reacting flow, and provides an extensive review of the CMC method for both single and two-phase flows. The problem of modelling droplet related effects in the CMC transport equations is discussed in detail, and physically-sound models for the unclosed terms that appear in these equations and that are affected by the droplet presence are derived. The second part of the dissertation deals with the application of the CMC method to the numerical simulation of several n-heptane sprays igniting at conditions relevant to diesel engine combustion. Droplet-related terms in the CMC equations were closed with the models developed in the first part of the dissertation. For all conditions investigated, CMC could correctly capture the ignition, propagation and anchoring phases of the spray flame. Inclusion of droplet terms in the CMC equations had little influence on the numerical predictions, in line with the findings of other authors. The third part of the dissertation presents a DNS study on the autoignition of n-heptane sprays at high pressure / low temperature conditions. The analysis revealed that spray ignition occurs first in well-mixed locations with a specific value of the mixture fraction. Changes in the operating conditions (initial turbulence intensity of the background gas, global equivalence ratio in the spray region, initial droplet size distribution) affected spray ignition through changes in the mixture formation process. For each spray, a characteristic ignition delay time and a characteristic droplet evaporation time could be defined. The ratio between these time scales was suggested as a key parameter for controlling the ignition delay of the spray. The last part of the dissertation exploits the DNS simulations to perform an a priori analysis of the applicability of the CMC method to autoigniting sprays. The study revealed that standard models for the mixing quantities used in CMC provide poor approximations in two-phase flows, and are partially responsible for the poor prediction of the ignition delay time. It was also observed that first-order closure of the chemical source terms performs poorly during the onset of ignition, suggesting that second-order closures may be more appropriate for studying spray autoignition problems. The contribution of the work presented in this dissertation is to provides a detailed insight into the physics of spray autoignition at diesel engine conditions, to propose and derive original methods for incorporating droplet evaporation effects within CMC in a physically-sound manner, and to assess the applicability and shortcomings of the CMC method to autoigniting sprays.

Objective of this thesis is to point out to almost everywhere present flaw in realization of second level network security access to WiFi networks with using traffic tunneling over DNS protocol. Realization has been accomplished by existing utilities OzymanDNS, DNS2TCP, NSTX, Iodine, Heyoka. Measurements were done on realistic traffic on the network. The effort was to show outline of these implementations. Transfer speeds in some implementations can be marked as applicable thanks to high speeds, which are on the same level as broadband internet. Functionality was tested on WiFi network, where was also compromised PPTP VPN tunnel, its function was to provide security of the communication on wireless network due to absence of first level security mechanisms such as WPA, WPA 2 and so on, with the help of Asleap, which comes out of Cisco LEAP attack. At the end of the work are suggested possible countermeasures for securing network by the topology change of the network infrastructure or by implementing IDS.

Combustion at extreme conditions, such as a turbulent flame at high Karlovitz and Reynolds numbers, is still a vast and an uncertain field for researchers. Direct numerical simulation of a turbulent flame is a superior tool to unravel detailed information that is not accessible to most sophisticated state-of-the-art experiments. However, the computational cost of such simulations remains a challenge even for modern supercomputers, as the physical size, the level of turbulence intensity, and chemical complexities of the problems continue to increase. As a result, there is a strong demand for computational cost reduction methods as well as in acceleration of existing methods. The main scope of this work was the development of computational and numerical tools for high-fidelity direct numerical simulations of premixed planar flames interacting with turbulence. The first part of this work was KAUST Adaptive Reacting Flow Solver (KARFS) development. KARFS is a high order compressible reacting flow solver using detailed chemical kinetics mechanism; it is capable to run on various types of heterogeneous computational architectures. In this work, it was shown that KARFS is capable of running efficiently on both CPU and GPU. The second part of this work was numerical tools for direct numerical simulations of planar premixed flames: such as linear turbulence forcing and dynamic inlet control. DNS of premixed turbulent flames conducted previously injected velocity fluctuations at an inlet. Turbulence injected at the inlet decayed significantly while reaching the flame, which created a necessity to inject higher than needed fluctuations. A solution for this issue was to maintain turbulence strength on the way to the flame using turbulence forcing. Therefore, a linear turbulence forcing was implemented into KARFS to enhance turbulence intensity. Linear turbulence forcing developed previously by other groups was corrected with net added momentum removal mechanism to prevent mean velocity drift. Also, dynamic inlet control was implemented which retained flame inside of a domain even at very high fuel consumption fluctuations. Last part of this work was to implement pseudospectral method into KARFS. Direct numerical simulations performed previously are targeting real engines and turbines conditions as an ultimate goal. These targeted simulations are prohibitively computationally expensive. This work suggested and implemented into KARFS a pseudospectral method for reacting turbulent flows, as an attempt to decrease computational cost. Approximately four times computational CPU hours savings were achieved.

The integrity of its DNA is fundamental for every living cell. However, DNA is constantly threatened by exogenous and endogenous damaging agents that can cause a variety of different DNA lesions. The severe consequences of an accumulation of DNA lesions are reflected in cancerogenesis and aging. Several DNA repair mechanisms ensure the repair of DNA lesions and thus maintain DNA integrity. One of these DNA repair mechanisms is nucleotide excision repair (NER), which is famous for its ability to address a large variety of structurally unrelated DNA lesions. A key component of eukaryotic NER is the transcription factor II H (TFIIH) complex, which is not only essential for DNA repair but also for transcription. The TFIIH complex is composed of ten subunits. How these subunits work together during NER to unwind the DNA around the lesion is, however, not yet fully understood. High-resolution structural data and biochemical insights into the function of every subunit are thus indispensable to understand the functional networks within TFIIH. The importance of an intact TFIIH complex is reflected in the severe consequences of patient mutations in the TFIIH subunits XPB, XPD or p8 leading to the hallmark diseases xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy. Defects in the NER pathway are further associated with several types of cancer including skin cancer. The herein described work focused on five TFIIH subunits derived from the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum, the p34/p44 pair and the ternary XPB/p52/p8 complex. The interaction between p34 and p44 was characterized based on a high-resolution structure of the p34_vWA/p44_RING minimal complex. Biochemical studies of the p34/p44 interaction led to the disclosure of an additional interaction between the p34 and p44 subunits, which had not been characterized so far. The p34/p44 interaction was shown to be central to TFIIH, which justifies the presence of several redundant interfaces to safeguard the interaction between the two proteins and might explain why so far, no patient mutations in these subunits have been identified. The p52 subunit of TFIIH was known to be crucial to stimulate the ATPase activity of XPB, which is required during NER. This work presents the first entire atomic resolution structural characterization of p52, which was derived of several crystal structures of p52 variants and a p52/p8 variant thereby demonstrating the interaction between p52 and p8. The precise structural model of p52 offered the possibility to investigate interactions with other TFIIH subunits in more detail. The middle domain 2 of p52 and the N-terminal domain of XPB were shown to mediate the main interaction between the two subunits. An analysis of the p52 crystal structures within recently published cryo-electron microscopy structures of TFIIH provides a model of how p52 and p8 stimulate the ATPase activity of XPB, which is essential for NER and transcription. The structural and biochemical findings of this work provide an additional building block towards the uncovering of the architecture and function of this essential transcription factor. / Die Unversehrtheit ihrer DNA ist für jede lebende Zelle elementar. Die DNA ist jedoch fortwährend exogenen und endogenen Toxinen ausgeliefert, die eine Vielfalt unterschiedlicher DNA-Schäden verursachen. Die sehr ernsthaften Konsequenzen einer Anhäufung von DNA-Schäden spiegeln sich in der Entstehung von Tumorerkrankungen und Alterung wider. Verschiedene DNA-Reparaturmechanismen sorgen für die Reparatur von DNA-Schäden und erhalten so die Unversehrtheit der DNA. Einer dieser DNA-Reparaturmechanismen ist die Nukleotid-Exzisions-Reparatur (NER), die bekannt dafür ist, eine Vielfalt an strukturell unterschiedlichen DNA-Schäden zu adressieren. Eine Schlüsselkomponente der eukaryotischen NER ist der Transkriptionsfaktor II H (TFIIH), welcher nicht nur für die DNA-Reparatur, sondern auch für die Transkription essentiell ist. Der TFIIH Komplex besteht aus zehn Untereinheiten. Wie diese Untereinheiten zusammenarbeiten, um die DNA um den Schaden herum zu entwinden, ist jedoch noch nicht hinreichend bekannt. Hochaufgelöste Strukturdaten und biochemische Einblicke in die Funktion jeder Untereinheit sind daher unabkömmlich, um das funktionelle Netzwerk innerhalb dieses Transkriptionsfaktors zu verstehen. Die Bedeutung eines intakten TFIIH Komplexes spiegelt sich in den verheerenden Folgen von Patientenmutationen in den TFIIH Untereinheiten XPB, XPD oder p8 wider, die zu den kennzeichnenden Krankheitsbildern von Xeroderma Pigmentosum, Cockayne Syndrom und Trichothiodystrophie führen. Ein fehlerhafter NER Reparaturweg ist ferner mit einigen Krebsarten wie Hautkrebs assoziiert. Die hier beschriebene Arbeit hat sich auf fünf TFIIH Untereinheiten konzentriert, die aus dem thermophilen Pilz Chaetomium thermophilum stammen, das p34/p44 Heterodimer und der ternäre XPB/p52/p8 Komplex. Die Interaktion zwischen p34 und p44 wurde basierend auf einer hochaufgelösten Kristallstruktur des p34_vWA/p44_RING Minimalkomplexes charakterisiert. Biochemische Studien der p34/p44 Interaktion haben zur Aufdeckung einer weiteren Interaktion zwischen p34 und p44 geführt, die bisher noch nicht charakterisiert wurde. Die p34/p44 Interaktion ist von zentraler Bedeutung für TFIIH, was die Gegenwart mehrerer redundanter Schnittstellen zwischen p34 und p44, um die p34/p44 Interaktion abzusichern, rechtfertigt und erklären könnte, warum bislang keine Patientenmutationen in diesen Untereinheiten identifiziert wurden. Die p52 Untereinheit von TFIIH ist bekannt dafür, die ATPase-Aktivität von XPB zu stimulieren, die während der NER benötigt wird. Diese Arbeit zeigt die erste vollständige atomare strukturelle Charakterisierung von p52, die aus verschiedenen Kristallstrukturen von p52 Varianten und einer p52/p8 Variante, welche die Interaktion zwischen p52 und p8 darstellt, stammt. Das Strukturmodel von p52 bietet die Möglichkeit Interaktionen mit anderen TFIIH Untereinheiten zu analysieren. Es wurde gezeigt, dass die mittlere Domäne 2 von p52 und die N-terminale Domäne von XPB die hauptsächliche Interaktion zwischen den beiden Untereinheiten vermitteln. Eine Analyse der p52 Kristallstrukturen in neuesten publizierten cryo-Elektronenmikroskopie TFIIH-Strukturen ermöglichte die Erstellung eines Models, das zeigt, wie p52 und p8 die ATPase-Aktivität von XPB stimulieren, welche essentiell für die NER und die Transkription ist. Die strukturellen und biochemischen Erkenntnisse dieser Arbeit bieten einen wichtigen Beitrag zur Enthüllung der Architektur und Funktion von TFIIH, einem essentiellen zellulären Komplex.

Fanconi-Anämie (FA) ist, mit Ausnahme von Mutationen in FANCR/RAD51, eine autosomal-rezessive oder X-chromosomal vererbte Krankheit, die sich durch eine ausgesprochene klinische als auch genetische Heterogenität auszeichnet. Neben einem fortschreitenden Knochenmarksversagen zählen zu den typischen Merkmalen eine Vielzahl an angeborenen Fehlbildungen, wie beispielsweise Radialstrahlanomalien, Minderwuchs oder Pigmentierungsstörungen. Zudem besteht für FA-Patienten ein überdurchschnittlich hohes Risiko bereits in jungen Jahren an akuter myeloischer Leukämie oder soliden Tumoren zu erkranken. Bislang konnten in 21 FA-Genen (FANCA, -B, -C, - D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U oder -V) krankheitsverursachende Mutationen identifiziert werden, deren Proteinprodukte maßgeblich an der Aufrechterhaltung der Genomstabilität beteiligt sind und Komponenten des FA/BRCA-DNA-Reparaturweges darstellen. In der klassischen FA-Mutationsanalyse kommen meist Sanger-Sequenzierungen sowie MLPA- und Immunblot-Analysen zum Einsatz. Da im Wesentlichen keine Genotyp-Phänotyp-Korrelation besteht, gestaltet sich, gerade bei seltenen FA-Komplementationsgruppen, der Nachweis von krankheitsverursachenden Mutationen oftmals sehr zeit- und kostenintensiv. Während der letzten Jahre wurden verschiedene Strategien zur Anreicherung und Sequenzierung entwickelt, welche die parallele Sequenzanalyse einzelner ausgewählter Gene, ganzer Exome oder sogar des gesamten Genoms und somit eine kosten- und zeiteffiziente Mutationsanalyse ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Anreicherungsmethoden mit anschließender Hochdurchsatzsequenzierung auf ihre Anwendbarkeit in der molekulargenetischen FA-Diagnostik getestet, um klassische Mutationsanalyse-Methoden zu ergänzen oder möglicherweise sogar ganz ersetzen zu können. Der erste Teil der Arbeit befasste sich mit der Etablierung eines FA-spezifischen Genpanels zur Genotypisierung von FA-Patienten. Nachdem die Methode zunächst anhand von FA-Patienten mit bekannten Mutationen optimiert werden musste, erwies sie sich als effizienter Ansatz zum Nachweis krankheitsverursachender Mutationen bei FA-Patienten unbekannter Komplementationsgruppe. Durch die FA-Panelanalyse konnten 37 von 47 unklassifizierten Patienten einer FA-Komplementationsgruppe zugeordnet werden, indem deren kausalen Mutationen bestimmt wurden. In einem weiteren Ansatz sollte die Anwendbarkeit eines kommerziellen Anreicherungspanels zur FA-Diagnostik untersucht werden. Auch hier konnte ein Großteil der krankheitsverursachenden Mutationen von fünf bekannten wie auch 13 nicht zugeordneten FA-Patienten detektiert und somit eine molekulargenetische Diagnose bei neun weiteren, zuvor unklassifizierten FA-Patienten, gestellt werden. Ferner wurden sechs ausgewählte Patienten, zusätzlich zur Panelanreicherung, per Exomanalyse untersucht. Zum einen konnten Mutationen in bekannten FA-Genen bestätigt oder neu identifiziert werden. Zum anderen wurden auch potentiell pathogene Mutationen in DNA-Reparaturgenen außerhalb des FA/BRCA-Signalweges bei zwei Patienten mit unbestätigter Verdachtsdiagnose FA verifiziert. So wurde bei mehreren Mitgliedern einer Familie mit unterschiedlichen Tumorerkrankungen eine zuvor unbeschriebene homozygote Nonsense-Mutation in der BER-Glykosylase NTHL1 nachgewiesen, für welche bislang erst zwei pathogene Mutationen als Auslöser eines neuen Krebssyndroms bekannt sind. Bei einem weiteren Patienten wurden compound-heterozygote Mutationen in RPA1 detektiert, ein Gen für das bislang noch kein Krankheitsbild bekannt ist. Mit Hilfe der drei verschiedenen Anreicherungsstrategien konnten insgesamt 47 von 60 unklassifizierten FA-Patienten 13 verschiedenen Komplementationsgruppen eindeutig zugeordnet werden. Es zeigte sich dabei ein breites Spektrum an neuen, bislang unbeschriebenen FA-Mutationen. Den größten Anteil an der Gesamtzahl der nachgewiesenen Mutationen hatten Spleißmutationen, die auf eine Auswirkung auf das kanonische Spleißmuster untersucht wurden, um einen pathogenen Effekt nachweisen zu können. Weiterhin schloss die Arbeit die Charakterisierung einzelner FA-Patienten bzw. Komplementationsgruppen mit ein. Dazu zählen die seltenen Untergruppen FA-T und FA-Q, für die jeweils ein neuer Patient identifiziert werden konnte. Durch die funktionelle Charakterisierung der dritten jemals beschriebenen FA-Q-Patientin konnten Einblicke in das Zusammenspiel der Reparatur von DNA-Quervernetzungen und der Nukleotidexzisionsreparatur gewonnen und die phänotypische Variabilität von FA durch die subjektive als auch zelluläre UV-Sensitivität der Patientin ergänzt werden. Darüber hinaus konnte das Mutationsspektrum in FA-I sowie FA-D2 erweitert werden. Eine genauere Untersuchung der Pseudogenregionen von FANCD2 ermöglichte dabei die gezielte Mutationsanalyse des Gens. Insgesamt konnten die Ergebnisse dieser Arbeit dazu beitragen, das Mutationsspektrum in FA zu erweitern und durch die Identifizierung und Charakterisierung einzelner Patienten neue Einblicke in verschiedene Komponenten des FA/BRCA-Signalweges zu erhalten. Es zeigte sich, dass neue DNA-Sequenzierungsstrategien in der FA-Diagnostik eingesetzt werden können, um eine effiziente Mutationsanalyse zu gewährleisten und klassische Methoden in Teilbereichen zu ersetzen. / Fanconi anemia (FA) is, with the exception of mutations in FANCR/RAD51, an autosomal recessive or X-linked inherited disease that is characterized by a remarkable clinical and genetic heterogeneity. In addition to progressive bone marrow failure, typical features include a multitude of developmental malformations, such as radial ray anomalies, growth retardation or cutaneous pigment displacement. Additionally, FA patients have a higher risk for developing acute myelogenous leukemia or solid tumors early in life. To date, pathogenic mutations have been identified in 21 FA genes (FANCA, -B, -C, - D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U or -V) whose protein products are responsible for maintaining genomic integrity and constitute components of the FA/BRCA DNA repair pathway. Typical methods for FA mutation analysis comprise Sanger sequencing as well as MLPA and immunoblot analyses. As no definite genotype-phenotype correlation exists, pathogenic mutation detection in rare subgroups is often quite time-consuming and cost-intensive. Within the last few years, distinct strategies for both enrichment and sequencing of a subset of genes, whole exomes or even the whole genome have been developed that facilitate a cost-effective and time-saving mutation analysis. In the present work different target-enrichment strategies followed by high-throughput sequencing were tested for their applicability in molecular genetic diagnostics of FA in order to complement or even replace classic strategies for mutation analysis. The first part of this work addressed the establishment of an FA-specific gene panel for genotyping FA patients. After optimizing this method by means of FA patients with known mutations, this proved to be an efficient approach for detecting pathogenic mutations in FA patients of unknown complementation groups. Due to FA gene panel analysis, 37 of 47 unclassified FA patients were assigned to a complementation group based on the identification of their causative mutations. In another approach, a commercial enrichment panel was tested for its application in FA diagnostics. Again, most pathogenic mutations of five classified and 13 unclassified FA patients were detected, enabling a molecular diagnosis for nine previously unclassified FA patients. Moreover, six selected patients were studied by exome analysis in addition to panel enrichment. This allowed for mutations in known FA complementation groups to be confirmed or newly identified. Additionally, potentially pathogenic variants in DNA-repair genes outside the FA/BRCA pathway were verified in two patients with an unconfirmed suspected diagnosis of FA. One previously undescribed homozygous nonsense mutation in the BER glycosylase NTHL1 was detected in several members of one family with various tumors. For this gene, only two distinct pathogenic mutations were previously described to cause a novel cancer syndrome. In another patient, compound heterozygous mutations in RPA1 were detected, a gene for which no disease pattern is yet known. By means of the three different enrichment strategies a total of 47 of 60 unclassified FA patients were definitely assigned to 13 diverse complementation groups. In this context, a broad spectrum of previously undescribed mutations was identified. The majority of all verified mutations were splice mutations that were examined for an effect on the canonical splicing pattern in order to verify a pathogenic effect. Additionally, this work also included the characterization of individual FA patients and complementation groups, respectively. These include the rare subgroups FA-T and FA-Q, for each of which one new patient was identified. Functional characterization of the third ever described FA-Q patient allowed new insights into the interplay of DNA interstrand-crosslink and nucleotide excision repair and broadened the spectrum of phenotypic variability of FA by the subjective and cellular UV sensitivity of this patient. Furthermore, the mutation spectrum in both FA-I and FA-D2 was expanded. Here, a closer investigation of the pseudogene regions of FANCD2 facilitated a precise mutation screening of the gene. Overall, the results of this work broadened the mutation spectrum of FA and allowed new insights into diverse components of the FA/BRCA pathway by identifying and characterizing individual patients. It became apparent that novel strategies for DNA sequencing can be applied in FA diagnostics to ensure an efficient mutation analysis, as well as to replace some parts of classical approaches.

Das hohe invasive Potential und die starke Resistenz gegen Radio-/Chemotherapie von Glioblastoma multiforme (GBM) Zellen machen sie zu dem tödlichsten Tumor ihrer Art. Es ist deshalb von großem Interesse die Grundlagen, welche der Migrationsfähigkeit und DNA Reparatur zu Grunde liegen, besser zu verstehen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden zwei Algorithmen zur automatischen Analyse der Migration in der Einzelzellverfolgung und im Wundheilungsassay modifiziert. Die Auswertung der Daten konnte automatisch und somit schnell, effektiv und mit geringerem Arbeitsaufwand durchgeführt werden. Mit Hilfe dieser automatischen Algorithmen wurde die Migrationsfähigkeit von zwei GBM-Zelllinien (DK-MG und SNB19) untersucht. Zusätzlich wurde die konfokale Laserscanning- sowie die hochauflösende dSTORM-Fluoreszenzmikroskopie verwendet um die, der Zellbewegung zu Grunde liegende, Struktur des F Aktin und der fokalen Adhäsionskinase (FAK) aufzulösen und darzustellen. Unter Anwendung dieser genannten Methoden sind die Effekte des dualen PI3K/mTOR Inhibitors PI-103 alleine und in Kombination mit dem Hsp90 Inhibitor NVP AUY922 mit und ohne Bestrahlung auf die Bewegung untersucht worden. Es konnte festgestellt werden, dass sich beide Zelllinien deutlich in ihrem migratorischem Potential in vitro unterscheiden und zudem auch markante Unterschiede in ihrer Morphologie aufweisen. Die weniger invasiven DK MG-Zellen besitzen eine polarisierte Zellstruktur, wohingegen SNB19-Zellen sich durch multipolare ungerichtete Bewegung auszeichneten. Zudem wurde die Migration, durch PI3K/mTOR Inhibition mit PI-103 bei den DK-MG-Zellen (p53 wt, PTEN wt), sehr effektiv unterdrückt. Wohingegen sich die SNB19-Zellen (p53 mut, PTEN mut) resistent gegen diesen Inhibitor zeigten. Hsp90 Inhibition offenbarte in beiden Zelllinien einen starken inhibitorischen Effekt auf die Migration der Zellen sowie die Reorganisierung des F Aktinskelettes. In der zweiten Hälfte dieser Arbeit wurde ein Augenmerk auf die DNA-DSB-Reparatur der GBM Zellen nach ionisierender Strahlung gelegt. Zunächst wurde eine automatische Analysesoftware „FocAn-3D“ entwickelt, mit dessen Hilfe die DNA Doppelstrangbruchreparaturkinetik untersucht werden sollte. Diese Software ermöglicht es die gesamten Zellkerne mit ihren γH2AX-Foci in 3D-cLSM-Aufnahmen zu untersuchen. Es konnte somit eine Verbesserung der Genauigkeit in der Auszählung der γH2AX-Foci erreicht werden, welche 2D beschränkter Software verwehrt bleibt. Mit FocAn-3D konnte der gesamte Verlauf der Induktions- und Abbauphase der γH2AX-Foci in DK MG- und SNB19-Zellen mit einem mathematischen Modell ausgewertet und dargestellt werden. Des Weiteren wurde die Nanometerstruktur von γH2AX- und pDNA-PKcs-Foci mittels hochauflösender dSTORM-Mikroskopie untersucht. Konventionelle Mikroskopiemethoden, begrenzt durch das Beugungslimit und einer Auflösung von ~200 nm, konnten die Nanometerstruktur (<100 nm) der Reparaturfoci bisher nicht darstellen. Mit Hilfe der beugungsunbegrenzten dSTORM-Mikroskopie war es möglich in DK MG- und SNB19-Zellen die Nanometerstruktur genannten Reparaturproteine in den Foci mit einer Auflösung von bis zu ~20 nm darzustellen. γH2AX-Foci zeigten sich als eine Verteilung aus einzelnen Untereinheiten („Nanofoci“) mit einem Durchmesser von ~45 nm. Dies lässt die Vermutung zu, dass es sich hier um die elementare Substruktur der Foci und somit der γH2AX enthaltenen Nukleosome handelt. DNA-PK-Foci wiesen hingegen eine diffusere Verteilung auf. Die in dieser Arbeit ermittelten Unterschiede im Migrationsverhalten der Zellen rechtfertigen eine weitere präklinische Untersuchung der verwendeten Inhibitoren als potentielle Zelltherapeutika für die Behandlung von GBM. Zudem konnte sich dSTORM als machtvolles Hilfsmittel, sowohl zur Analyse der Migration zugrundeliegenden Zytoskelettstruktur und der Effekte der Hsp90 Inhibierung, als auch, der Nanostruktur der DNA-DSB-Reparaturfoci herausstellen. Es ist anzunehmen, dass beugungsunbegrenzte Mikroskopiemethoden sich als bedeutende Werkzeuge in der medizinischen und biologischen Erforschung der DNA-Reparaturmechanismen herausstellen werden. Das in dieser Arbeit entwickelte ImageJ Plugin „FocAn-3D“ bewies sich ebenfalls als ein vielversprechendes Werkzeug für die Analyse der Reparaturkinetik. Mit Hilfe von „FocAn-3D“ sollte es somit möglich sein u.a. den Einfluss gezielter Inhibition auf den zeitlichen Verlauf der Induktion und des Abbaus der DNA-Reparaturmaschinerie genauer zu studieren. / The high invasive Potential and increased resistance to radio- and chemotherapy of glioblastoma multiforme (GBM) tumor cells make it the most lethal of all primary brain tumors. It is therefore of great interest to gain a better understanding of the mechanisms facilitating the migration and DNA repair. In the first part of this study, two algorithms for single cell tracking and wound healing assays were modified to increase effectiveness and speed of the automatic data analysis. The migratory capacity of the two GBM cell lines, DK MG and SNB19, were analyzed using these automatic algorithms. In addition, employing confocal microscopy and high resolution dSTORM imaging, the underlying F actin/FAK structure was resolved and studied. Together, these automatic algorithms enabled me to elucidate the effects of the dual PI3K/mTOR inhibitor PI 103 alone and in combination with the Hsp90 inhibitor NVP-AUY922 and/or irradiation on the migration, focal adhesions and F-actin cytoskeleton of DK-MG and SNB19 cells. Both cell lines differ markedly in their migratory capacity in vitro and display distinctive differences in their morphology. The less invasive DK-MG cells retained their polarized structure, while SNB19 cells demonstrate multipolar morphology with random migration. The PI3K/mTOR Inhibition using PI-103 suppressed migration of the PTEN wt and p53 wt DK-MG cells but not of the PTEN mut and p53 mut SNB19 cells. In contrast, Hsp90 inhibition using NVP-AUY922 exerted a strong inhibitory effect on the migration in both cell lines as well as massive morphological changes and reorganization of the F-actin cytoskeleton. The second part of this study was designed to gain further insights in the DNA double strand break (DSB) repair of both GBM cell lines. The DNA DSB repair kinetics were analyzed using the novel software “FocAn-3D”. The software enables the 3D analysis of foci in entire nuclei using cLSM-imaging. This in turn results in increased accuracy of the foci counts, compared to approaches restricted to 2D. Using the new software approach, I was able to determine the whole γH2AX-foci induction and decay process and apply a well described mathematical model for the γH2AX-foci repair kinetics. Additionally, diffraction unlimited microscopy (dSTORM) was applied to resolve the nanometer scale of the foci forming repair proteins γH2AX and DNA-PK. Although conventional microscopy is able to reveal the repair foci as diffuse spots, the underlying protein distribution is well beyond the diffraction limit of ~200 nm. In this study, using the diffraction unlimited dSTORM microscopy with a lateral resolution of ~20 nm, it was possible to resolve the nanometer scale of both γH2AX and DNA-PK. γH2AX foci appeared not as diffuse spots, but rather as a distribution of distinct subunits (“nanofoci”). In contrast DNA-PK mostly showed a more diffuse distribution. The nanofoci diameter was about ~45 nm and it can be concluded that these clusters represent the elementary structural subunits of repair foci, the γH2AX-containing nucleosomes. Using the newly developed or modified algorithms for the analysis of cell migration, I was able to show a cell line specific response of the PI3K/mTOR inhibition on the cell migration. This warrants further preclinical trials for its potential as an anti-migratory agent in the treatment of GBM. In addition, dSTORM emerged as a powerful tool for the analysis of the cytoskeletal structure, underlying the cells migration capacity and the effects of Hsp90 inhibition. Also, dSTORM was able to unravel the elementary nanostructure of the DSB repair foci. This means diffraction unlimited single-molecule localization nanoscopy methods will likely emerge as powerful tools for the analysis of targeted inhibition on the DSB repair mechanisms. In addition, the newly developed software “FocAn-3D” showed promising results in the analysis of Foci kinetics. Consequently, it should enable the future study of targeted inhibition and its effects on foci induction and decay processes of the DNA repair.

Im ersten Teil dieser Doktorarbeit wurde die kurz nach Elektroporation eintretende hämolytische Zellbewegung von humanen Erythrozyten erstmals quantitativ untersucht, um den zu Grunde liegenden Mechanismus aufzuklären. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Bewegung aus dem Ausstoß von unter Druck stehendem Zytosol resultierte. Durch weitere Experimente wurde die Beteiligung des Nicht-Muskel-Myosins NMIIA am Aufbau des zytosolischen Überdrucks nachgewiesen. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde ein molekular-mechanischer bisher unbekannter NMII-basierter Mechanismus der rapiden Ghostbildung beschrieben. Diese Erkenntnis könnte biomedizinische Relevanz besitzen, da der Abbau von Erythrozyten in der Milz die Transformation zu Hb-armen Ghosts voraussetzt. Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit dem Hirntumor Glioblastoma multiforme (GBM), dessen Rezidiv hauptsächlich auf Strahlenresistenz und Zellinvasion zurückzuführen ist. Deshalb wurde mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie (dSTORM) die Nanostruktur des DSB-Markers Histon γH2AX und des DNA-Reparaturfaktors DNA-PKcs in bestrahlten GBM-Zellen analysiert. Anhand von dSTORM-Rekonstruktionen wurde erstmals gezeigt, dass die beiden Proteine kaum Kolokalisation im Nanometerbereich aufweisen. Zunehmend wird die anomale Expression von Membrantransportern aus der SLC-Familie mit der Migration von Krebszellen in Verbindung gebracht. Der finale Abschnitt befasste sich daher mit der subzellulären Lokalisierung der Transporterproteine SLC5A1 und SLC5A3 in GBM-Zellen, um ihre Beteiligung an der Zellmigration nachzuweisen. Dabei wurde erstmals gezeigt, dass der Leitsaum der untersuchten GBM-Zellen deutliches SLC5A1- und SLC5A3-Signal aufwies. Basierend auf diesen Befunden wurden den Transportern unterschiedliche Aufgaben bei der zellmigrativen lokalen Volumenregulation zugeschrieben. Somit ergänzen SLC5A1 und SLC5A3 das migrationsassoziierte Krebszell-Transportom. / The unique properties of the highly specialized, enucleated mammalian erythrocytes allows them to withstand enormous mechanical stress. However, because their membrane area is limited, they display high osmotic fragility towards hypotonic shocks. In contrast, the much more complex tumor cells are not only capable of tolerating a wide range of osmotic stresses, but they frequently display considerable chemo- and even radioresistance. Because of these intriguing properties, both cell types have been the subject of intensive biophysical and biomedical research for decades. However, despite the long history of erythrocyte research, the apparently self-propelled motion of red blood cells that occurs in the course of hemolysis is a largely unknown phenomenon. In the first part of this doctoral thesis, the electroporation-triggered hemolytic cell motion of human erythrocytes was examined quantitatively for the first time in order to elucidate the underlying mechanism of this phenomenon. Using fluorescence and videomicroscopic analyses, the two main phases of electrohemolysis were identified. The first, prehemolytic phase was characterized by an efflux of low-molecular cytosolic solutes via electropores, accompanied by transient, osmotic cell shrinkage. Once the influx of extracellular solutes predominated, swelling to the critical cell volume started, apparent from the loss of discoid morphology. The second, hemolytic phase was characterized by a sudden cell acceleration to a peak velocity of ~35 µm/s, ~1 second of rapid and linear movement, gradual volume reduction and transformation to a hemoglobin-depleted, transparent ghost. The results of this work suggest that this rapid linear motion results from a cell contraction-driven expulsion of the pressurized hemoglobin (Hb)-rich cytosol through a single hemolytic hole. ...

Adipositas ist eine Erkrankung, die durch ein erhöhtes Krebsrisiko neben zahlreichen anderen Komorbiditäten mit weitreichenden Folgen für die Gesundheit adipöser Patient*innen einhergeht. In der Pathogenese der adipositas-assoziierten Krebsarten sind dabei ein erhöhter oxidativer Stress sowie die damit einhergehende Schädigung der DNS maßgeblich beteiligt. Im Umkehrschluss wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss eines durch bariatrische Chirurgie induzierten Gewichtsverlusts auf den oxidativen Stress und DNS-Schaden in adipösen Patient*innen anhand von Blutproben präoperativ sowie 6 und 12 Monate postoperativ untersucht. In einer Subpopulation der Patient*innen konnte eine tendenzielle Verringerung des DNS-Schadens anhand des Comet-Assays in peripheren Lymphozyten beobachtet werden. Im Hinblick auf den oxidativen Stress wurde im Plasma die Eisenreduktionsfähigkeit als Maß für die antioxidative Kapazität sowie Malondialdehyd als Surrogatmarker für das Ausmaß an Lipidperoxidation bestimmt. Weiterhin wurde in Erythrozyten das Gesamtglutathion und das oxidierte Glutathion bestimmt. Die oxidativen Stressparameter zeigten insgesamt nach einer initialen Zunahme im oxidativen Stress 6 Monate postoperativ eine rückläufige Tendenz im oxidativen Stress am Studienende. Somit geben die Beobachtungen dieser Arbeit Anlass zur Hoffnung, dass adipöse Patient*innen durch einen bariatrisch induzierten Gewichtsverlust von einer Verringerung des Krebsrisikos profitieren könnten. / Obesity is a disease that is linked with a higher risk of cancer among other comorbidities of obese patients. Especially oxidative stress and DNA damage have been shown to play a major role in the pathogenesis of obesity associated cancers. Therefore the aim of this study was to examine the effect of a massive weight loss induced by bariatric surgery on oxidative stress and DNA damage in whole blood samples of obese patients at 6 and 12 month after bariatric surgery. In a subpopulation of the study population a tending decrease in DNA damage in peripheral lymphocytes could be observed. Concerning oxidative stress parameters, determination of ferric-reducing antioxidative power and malondialdehyde levels as a marker for lipidperoxidation were carried out on plasma samples. Furthermore total and oxidised glutathione levels were determined in erythrocytes of patients. In synopsis oxidative stress parameters indicated an initial increase in oxidative stress 6 month after bariatric surgery and a decreasing trend at the end of the study. These findings give hope that obese patients may benefit from a reduced cancer risk through bariatric surgery induced weight loss.

Inspired by the dilute spray regime in spray combustion, this dissertation explores the evaporation and combustion of an isolated droplet. Under a highly convective environment inside a gas combustor, due to imbalance of inertial and surface tension forces, the droplets of larger size in sprays exhibit notable deformations from spherical to non-spherical shapes. Such shape changes are generally observed but not quantified in experimental studies. Therefore, the effect of this deformation on droplet combustion dynamics is unknown yet. To bridge this gap, a comprehensive investigation of an isolated freely deforming droplet can be insightful as it can reveal more about the interaction of droplet shape with its evaporation and combustion. This work attempts to analyze and quantify the impact of such deformations on evaporation and combustion using interface-capturing Direct Numerical Simulation approach. With the focus on small-scale processes involved in evaporation as it is a pre-step for combustion, this dissertation first covers a thorough examination on evaporation of a deformable droplet under both natural and forced convection. A single component jet-fuel surrogate n-decane is chosen. To ensure that the droplet remains stationary throughout its lifetime, a novel numerical method called "gravity update method" is developed and implemented. The results obtained from these two separate studies are validated against experimental results and analytical correlations respectively. The findings from the investigation of droplet evaporation under forced convective flow at moderate Reynolds numbers are noteworthy. The droplet shape under such flow conditions is governed by Weber number (We) which is a ratio of inertial force to surface tension force. The results demonstrated upto 20% en- hancement in total evaporation rate for highly deformed droplets. This improvement is a net results of increased droplet surface area and alteration in the distribution of local evaporation flux ( m'' ). It is found that m'' is proportional to its curvature up to the point of flow separation which agrees with low Re theories on droplet evaporation by Tonini and Cossalli (International Journal of Heat and Mass Transfer 2013), Palmore (Journal of Heat Transfer 2022). Beyond the flow separation point, evaporation flux distribution depends on the boundary layer development and flow evolution downstream of the droplet. For highly deformed droplets, a larger wake region creates favorable fuel vapor gradients and promotes mixing in droplet wake, hence higher evaporation flux. Such positive impact of droplet deformation on total evaporation rate motivated further investigation on droplet combustion under a low Reynolds number convective flow. High pressure and temperature gas flow leads to Damköhler number is higher than 1. This fa- vors the generation of envelope type flame. The results show overall little sensitivity to combustion related parameters despite the droplet shape change and significant (upto 9%) enhancement in total evaporation rate. It is also noted that while burning, droplets do not reach critical deformation conditions and break-up even beyond the critical Weber number, suggesting the suppression of deformation due to faster evaporation rate. The findings presented in these studies provide substantial evidence for the interaction between droplet shape and flow dynamics. Therefore, it demonstrates the potential for enhancing the existing numerical models and analytical correlations by accounting the influence of droplet shape. / Doctor of Philosophy / This work is inspired by the spray combustion in gas turbines where the pressurized liquid fuel jet is injected in the combustion chamber and converted into dilute sprays after undergoing a series of processes. Due to the presence of higher air to fuel ratio for these spray droplets, they become the localized combustion sites with rapid evaporation rates. Understanding the evaporation of these droplets becomes crucial, as it sets the stage for their subsequent combustion. In an attempt to understand this chemically and fluid-dynamically complex phenomenon, abundant experimental studies are available with focus on overall atomization process and velocity field evolution. However, they lack in resolving the small-scale processes which govern the evaporation, therefore combustion. With the intent to investigate in detail about the combustion aspect, this problem is reduced to analyzing behavior of isolated droplets. Despite the sophisticated measurement technologies particle-scale processes such as temperature and species mass fraction evolution are yet unknown. Moreover, the majority of these studies are performed with simplifying assumptions. assumption has been that the droplet remains spherical throughout its lifetime. However, in practical applications, particularly when exposed to convective and turbulent environments, droplets can undergo significant deformation due to the presence of inherent surface tension of liquid. This deformation can influence their evaporation and burning rates. Additionally, the droplet's shape governs the flow field around it, potentially altering droplet-droplet interactions. Direct Numerical Simulation (DNS) approach is one of the numerical methods which can resolve both the phases. It offers a promising approach to reveal these small-scale details, such as droplet shape, vapor and temperature field around a droplet, droplet-droplet interaction, droplet motion etc. With the aim to bridge this gap, this dissertation focuses on the study of evaporation and combustion of an isolated deformable droplet under various conditions.

Einfluss des Gewichtsverlusts auf den oxidativen Stress und den DNS-Schaden in adipösen Patient*innen nach bariatrischer Chirurgie Adipositas ist eine Erkrankung, die durch ein erhöhtes Krebsrisiko neben zahlreichen anderen Komorbiditäten mit weitreichenden Folgen für die Gesundheit adipöser Patient*innen einhergeht. In der Pathogenese der adipositas-assoziierten Krebsarten sind dabei ein erhöhter oxidativer Stress sowie die damit einhergehende Schädigung der DNS maßgeblich beteiligt. Im Umkehrschluss wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss eines durch bariatrische Chirurgie induzierten Gewichtsverlusts auf den oxidativen Stress und DNS-Schaden in adipösen Patient*innen anhand von Blutproben präoperativ sowie 6 und 12 Monate postoperativ untersucht. In einer Subpopulation der Patient*innen konnte eine tendenzielle Verringerung des DNS-Schadens anhand des Comet-Assays in peripheren Lymphozyten beobachtet werden. Im Hinblick auf den oxidativen Stress wurde im Plasma die Eisenreduktionsfähigkeit als Maß für antioxidative Kapazität sowie Malondialdehyd als Surrogatmarker für das Ausmaß an Lipidperoxidation bestimmt. Weiterhin wurde in Erythrozyten das Gesamtglutathion und oxidierte Glutathion bestimmt. Die oxidativen Stressparameter zeigten insgesamt nach einer initialen Zunahme im oxidativen Stress 6 Monate postoperativ eine rückläufige Tendenz im oxidativen Stress am Studienende. Somit geben die Beobachtungen dieser Arbeit Anlass zur Hoffnung, dass adipöse Patient*innen durch einen bariatrisch induzierten Gewichtsverlust von einer Verringerung des Krebsrisikos profitieren könnten. / Obesity is a disease that is linked with a higher risk of cancer among other comorbidities of obese patients. Especially oxidative stress and DNA damage have been shown to play a major role in the pathogenesis of obesity associated cancers. Therefore the aim of this study was to examine the effect of a massive weight loss induced by bariatric surgery on oxidative stress and DNA damage in whole blood samples of obese patients at 6 and 12 month after bariatric surgery. In a subpopulation of the study population a tending decrease in DNA damage in peripheral lymphocytes could be observed. Concerning oxidative stress parameters, determination of ferric-reducing antioxidative power and malondialdehyde levels as a marker for lipidperoxidation were carried out on plasma samples. Furthermore total and oxidised glutathione levels were determined in erythrocytes of patients. In synopsis oxidative stress parameters indicated a initial increase in oxidative stress 6 month after bariatric surgery and a decreasing trend at the end of the study. These findings give hope that obese patients may benefit from a reduced cancer risk through bariatric surgery induced weight loss.