Human caretaker genes play a central role in the DNA damage response. Their defects cause a number of rare diseases which show genetic instability and increased propensity to malignant cell growth. The first of these diseases to be described in this thesis is Fanconi anemia (FA), a rare chromosome instability disorder with recessive inheritance characterized by progressive bone marrow failure, variable congenital malformations, and cancer predisposition. There are at least 13 FA complementation groups (FA-A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M and N), each representing mutations in a distinct gene. To date, except FANCI all the corresponding genes have been identified, denoted as FANC-A, B, C, D1/BRCA2, D2, E, F, G, J/BRIP1/BACH1, L/PHF9, M/Hef and N/PALB2.Further information is provided in chapters 1 and 2. FA cells are characterized by high sensitivity to DNA crosslinking agents and to elevated oxygen tension, but it is controversial whether they are also radiosensitive. Systematic testing (chapter 3) of primary skin fibroblast cultures from all currently known FA complementation groups revealed no increased sensitivity towards ionizing radiation (IR) and ultra-violet light (UV) when growing cells at physiological (5% v/v) oxygen levels. Despite considerable interstrain variations FA cells showed no systematic differences to cell cultures derived from healthy controls, whereas positive controls (Ataxia telangiectasia and Cockayne syndrome) proved highly sensitive to IR or UV. Lack of radiosensitivity was also shown for the FANCD2 gene, a central gene in the FA/BRCA pathway whose mutational inactivation was studied in a large patient cohort. FA patients excluded previously from complementation groups FA-A, -C, E, F, G or L were screened for mutations in FANCD2. Even though mutation analysis of FANCD2 is complicated by the presence of pseudogene regions, biallelic FANCD2 mutations were identified in a series of 32 patients (chapter 4). The predominant types of mutations result in aberrant splicing causing exon skipping, exonisation of intronic sequence, activation of cryptic and creation of new 3´ splice sites. Many alleles were recurrent and could be associated with ethnicity. Interestingly, residual FANCD2 protein was observed in all available patient cell lines, and functionality was indicated by the presence of the monoubiquitinated FANCD2 isoform. This suggests that viability of FA-D2 patients depends on the presence of hypomorphic or leaky mutations. In chapter 5 the worldwide second FA patient belonging to complementation group FA-L is reported. Genetic analysis of patient derived fibroblasts revealed heterozygosity for a 5-bp deletion (exon 7) and a missense substitution (exon 11). In contrast to the tested fibroblasts two independent lymphoid cell lines proved resistant to the DNA crosslinking agent mitomycin C and showed proficient FANCD2 monoubiquitination. The functional reversion due to a compensating mutation in the splice acceptor site results in aberrant splicing and the restoration of the open reading frame. However, the revertant mosaicsm was restricted to the lymphatic cell lines such that there was no clinical improvement involving the other hematopoietic cell lineages, and bone marrow transplantation was required to treat the patients bone marrow failure. A direct link of Fanconi anemia to other DNA repair processes was provided by the identification of the BRCA1 interacting protein 1, BRIP1/BACH1, as a genuine FA gene (chapter 6). Genetic mapping of consanguineous Inuit families resulted in the identification of truncating mutations in BRIP1. In contrast to most of the other FA patients FANCD2 monoubiquitination was intact, linking these patients to complementation group FA-J. Biallelic mutations in BRIP1 were found in eight additional patients, one of whom was assigned previously to FA-J by somatic cell fusion. Therefore it could be shown that the postulated FANCJ gene is identical with BRIP1. This finding emphasizes the close connection between the BRCA- and the FA-family of genes, both involved in the DNA damage response. Biallelic mutations in BRCA2/FANCD1 cause a severe form of Fanconi anemia with childhood malignancies. Recently, a BRCA2 interacting protein was identified as a “partner and localizer of BRCA2” (PALB2) which confers cellular MMC resistance. A candidate gene approach revealed biallelic mutations in seven FA patients that developed solid tumors in early childhood (chapter 7). Patient cells show no or little PALB2 protein, lack of MMC induced RAD51 foci formation, and high chromosomal instability. Transduction of PALB2 cDNA complemented the MMC sensitive phenotype. Therefore, biallelic mutations in PALB2 cause a new subtype of FA, denoted as FA-N, which is connected with a high and early cancer risk. With respect to one of the most prominent but least understood caretaker gene syndromes, Fanconi anemia, this thesis has expanded our knowledge as follows: 1. refutation of major cellular radiosensitivity of FA cell lines regardless of complementation group, 2. detection of hypomorphic mutations and residual protein levels as a prerequisite for viability of the FANCD2 gene, 3. description of the worldwide second patient belonging to complementation group FA-L whose lymphocytes exhibit a novel type of somatic reversion, 4. participation in the discovery and functional characterization of two novel FA genes (FANCJ and FANCN). The last chapter of the thesis deals with a DNA repair pathway that is activated following exposure to ionizing radation. One of the central proteins responding to radiation-induced DNA damage is the product of the ATM gene which signals to a myriad of other proteins in response to DNA double strand breaks, including the NMR complex. This complex formed by the NBS1/MRE11/RAD50 proteins is thought to act as a specifi c sensor of DNA double-strand breaks. Mutations of MRE11 and NBS1 are associated with the radiation sensitivity syndromes Ataxia-telangiectasia-like disorder (AT-LD) and Nijmegen breakage syndrome (NBS), respectively. Chapter 8 presents the first ever identified patient with RAD50 deficiency due to biallelic germline mutations in the RAD50 gene. An 18-year-old German girl who has a variant form of NBS without immunodeficiency was found to be compound heterozygous for a nonsense mutation and the loss of the natural termination signal in the RAD50 gene. RAD50 protein expression was reduced to less than one tenth of normal in her fibroblasts and lymphoblastoid cells. At the nuclear level, RAD50 deficiency was associated with a high frequency of spontaneous chromatid exchanges and with the failure to form MRE11 and NBS1 nuclear foci in response to irradiation. ATM autophosphorylation, phosphorylation of p53 at serine 15 and the transcriptional induction of p21/WAF1 mRNA were reduced, and there was no evidence for Ser343 phosphorylation of NBS1 in RAD50 defi cient cells following irradiation. These defects could be complemented by expression of wildtype RAD50 cDNA. Our data shows that RAD50 modulates, like NBS1 and MRE11, the ATM-mediated DNA damage response and the G1/S cell cycle checkpoint. In addition, RAD50 appears to be required for nuclear localization of MRE11, and for NBS1 focus formation, underlining its importance for the proper function of the NMR complex. Owing to the studies performed within the framework of this thesis, RAD50 deficiency can now be added to the growing list of human caretaker gene syndromes with pronounced radiosensitivity that is distinctive at both the cellular and the clinical level from deficiencies involving the other members of the NMR complex. / Die sogenannten “Caretaker”-Gene spielen eine zentrale Rolle in der zellulären Antwort auf DNA Schäden. Mutationen in diesen Genen führen zur Ausprägung von einigen seltenen Erbkrankheiten, die sich durch genetische Instabilität und in vielen Fällen durch erhöhtes Krebsrisiko auszeichnen. Eine dieser Erkrankungen, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde, ist Fanconi Anämie (FA). Dabei handelt es sich um eine sehr seltene chromosomale Instabilitätserkrankung, die einem rezessiven Erbgang folgt. Der klinische Phänotyp von FA ist gekennzeichnet durch ein variables Spektrum von kongenitalen Fehlbildungen, progressivem Knochenmarksversagen und einer Prädisposition für Neoplasien. Durch somatische Zellfusionstudien und in einigen Fällen durch direkte genetische Zuordnung konnten bisher 13 Komplementationsgruppen definiert werden (FAA, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M and N), von denen jede einen Defekt in einem bestimmten Gen widerspiegelt. Inzwischen sind, mit Ausnahme von FANCI, alle korrespondierenden FA Gene identifiziert. Ein Überblick über den aktuellen Stand ist in den Kapiteln 1 und 2 dieser Arbeit zu finden. Zellen von FA-Patienten zeichnen sich durch eine hohe Sensitivität gegenüber DNA quervernetzenden Substanzen und einer hohen Empfindlichkeit gegenüber einer erhöhten Sauerstoffkonzentration aus. Zur Frage der Radiosensitivität von FA-Zellen gab es bisher nur widersprüchliche Daten. Mit Hilfe einer systematischen Analyse von primären Fibroblasten aller (zum Zeitpunkt der Untersuchung) bekannten Komplementationsgruppen konnte gezeigt werden, dass unter physiologischen Sauerstoffkonzentrationen keine erhöhte Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung (IR) und ultraviolettem Licht (UV) besteht (Kapitel 3). Trotz einigen Zellinien-spezifischen Schwankungen waren die Unterschiede zwischen Patientenzellen und gesunden Kontrollen marginal, verglichen mit der eindeutig erhöhten Sensitivität von Zellen positiver Kontrollen (Ataxia telangiactasia (IR Kontrolle) bzw. Cockayne Syndrom (UV-Kontrolle)). Die in Kapitel 3 nachgewiesene fehlende Radiosensitivität von FA-Zellen ist im Kontext des FANCD2-Gens von besonderem Interesse, da diesem Gen eine Schlüsselposition im FA/BRCA Doppelstrangbruch-Reparaturweg zukommt. Das Screening von FA-Patienten, bei denen bereits eine Zuordnung zu den Komplementationsgruppen FA-A, C, E, F, G und L ausgeschlossen war, führte zur Identifikation einer Reihe von FA-D2 Patienten. In einer großen Kohortenstudie wurden 29 FA-D2 Patienten mit klinischen Informationen sowie 3 zusätzliche FA-D2 Patienten hinsichtlich ihrer Mutationen in FANCD2 untersucht (Kapitel 4). Für alle 32 Patienten konnten biallelische Mutationen nachgewiesen werden, auch wenn das Vorhandensein von pseudogenen Regionen die Mutationsanalyse erschwerte. Wie in keinem der anderen FA-Gene führt die Mehrzahl der Mutationen in FANCD2 zu verändertem Spleißenverhalten, wie zum Beispiel zur Exklusion eines Exons, zur Exonisation intronischer Bereiche, der Aktivierung von kryptischen oder der Erzeugung von neuen 3´ Spleißstellen. Viele Allele wurden mehrfach gefunden und konnten einem ethnischen Hintergrund zugeordnet werden. In allen verfügbaren lymphoblastoiden Patienten-Zelllinien wurde residuales FANCD2-Protein detektiert, wobei das Vorhandensein der monoubiquitinylierten Isoform auf ein funktionelles Protein hindeutet. Zusammen mit der Tatsache, dass in keinem der Patienten eindeutige biallelische Nullmutationen nachgewiesen werden konnten, ist somit offenbar das Vorhandensein von hypomorphen Mutationen und entsprechendem Restprotein für die Lebensfähigkeit von FA-D2 Patienten essentiell. In Kapitel 5 wird der weltweit zweite FA Patient vorgestellt, welcher der Komplementationsgruppe FA-L zugeordnet werden konnte. Die genetische Analyse von primären Fibroblasten dieses Patienten führte zum Nachweis einer 5 Basen umfassenden Deletion in Exon 7 sowie zu einer Missense-Mutation in Exon 11. Im Gegensatz zu den untersuchten Fibroblasten zeigten zwei unabhängig etablierte lymphoblastoide Zellinien keine erhöhte Sensitivität gegenüber Mitomycin C, was auf einer somatische Reversion beruhen kann. Diese Vermutung wurde durch den Nachweis einer induzierbaren Monoubiquitinylierung von FANCD2 in Lymphoblasten bestätigt. Die funktionelle Reversion basiert auf einer zur Deletion in cis befindlichen kompensatorischen Mutation im Spleiß-Akzeptor von Exon 7, die zu einem veränderten Spleißprodukt und der Wiederherstellung des Leserahmens führt. Die somatische Reversion beschränkt sich jedoch auf die lymphatischen Zellreihen und hatte daher nur einen partiellen Einfluss auf den Krankheitsverlauf. Ein allgemeines Knochenmarksversagens machte eine Transplantation unumgänglich. Die Konditionierung wurde jedoch auf das vorhandene hämatopoietische Mosaik abgestimmt, um eine Graft vs. Host Reaktion zu vermeiden. Die Identifizierung des BRCA1 interagierenden Proteins 1 (BRIP1/BACH1) als ein bona fide FA-Gen (Kapitel 6) verdeutlicht die direkte Verknüpfung des FA/BRCA DNA Reparaturweges mit anderen DNA Reparaturwegen. Trunkierende Mutationen in BRIP1 wurden in zwei blutsverwandten Eskimofamilien mittels genetischer Positionsanalysen gefunden. Im Gegensatz zu den meisten anderen FA Patienten war die Monoubiquitinylierung von FANCD2 trotz MMC Empfindlichkeit intakt, was für eine Zuordnung zur Komplementationsgruppe FA-J sprach. Biallelische Mutationen in BRIP1 wurden in 8 weiteren Patienten gefunden, von denen einer ursprünglich durch somatische Zellfusion zu FA-J zugeordnet wurde. Dadurch konnte gezeigt werden, dass das postulierte FANCJ Gen mit BRIP1 identisch ist. Als eines der wenigen FA Gene besitzt BRIP1 bekannte funktionelle Domänen (DNA Helikase), die somit biochemisch für die Entschlüsselung des FA/BRCA Weges genutzt werden können. Biallelische Muatationen in FANCD1, welches identisch mit dem bekannten Brustkrebsgen BRCA2 ist, führen zu einer besonders schweren Form von Fanconi Anämie, die bereits im frühen Kindesalter mit einem sehr hohen Krebsrisko verbunden ist. Kurz vor Abschluss dieser Arbeit gelang die Charakterisierung eines mit BRCA2 interagierendes Proteins, welches als „partner und localizer of BRCA2“ (kurz PALB2) bezeichnet wurde und offenbar zelluläre Resistenz gegenüber Mitomycin C (MMC) bedingt. Ein genetischer Screen von bisher nicht-klassifizierten FA-Patienten führte zur Identifizierung von sieben Patienten mit biallelischen Mutationen in PALB2 (Kapitel 7). Alle Patienten entwickelten bereits im frühen Kindesalter bösartige Tumore. Der zelluläre Phänotyp von PALB2- defizienten Zellen weist eine Störung der MMC induzierten RAD51 Foci-Bildung auf. Darüberhinaus zeigen PALB2-defiziente Zellen eine spontane chromosomale Instabilität, die durch eine MMC-Gabe stark erhöht werden kann. Die Transduktion von PALB2 cDNA führt zur Reduktion der MMC induzierten G2 Phasen Arretierung und zur Reversion des MMC-sensitiven Phänotyps. Biallelische Mutationen in PALB2 verursachen somit eine Form von Fanconi Anämie, die mit hohem Krebsrisiko verbunden ist. PALB2 wird nach der gängigen FA-Nomenklatur als FANCN bezeichnet und liegt der neu definierten Komplementationsgruppe FA-N zugrunde. Die vorliegende Arbeit hat in mehreren Punkten zur Verbesserung des derzeitigen Wissenstandes über die komplexe genetisch bedingte Erkrankung Fanconi Anämie beigetragen 1. trotz molekularer Wechselwirkung von FA-Proteinen mit Komponenten aus anderen DNA-Reparatursystemen zeigen Zellen von FA Patienten unabhängig von der Komplentationsgruppe weder Strahlen- noch UV-Sensitivität; 2. die Existenz von hypomorphen Mutationen in FANCD2 und das Auftreten von Restprotein korreliert offenbar mit der Lebensfähigkeit von biallelischen Mutationen im FANCD2 Gen. 3. unter den bisher nicht klassifizierten Patienten wurde der weltweit zweite Patient der Komplementationsgruppe FA-L gefunden, in dessen Blutzellen ein neuartiger Mechanismus von somatischer Reversion nachgewiesen werden konnte 4. die Beteiligung an der Identifizierung und funktionellen Charakterisierung von zwei neuen FA-Genen (FANCJ und FANCN), welche die FA-abhängigen DNA-Reparaturwege direkt mit den Brustkrebsgenen BRCA1 und BRCA2 in Verbindung bringen. Das letzte Kapitel der Arbeit befasst sich mit einem DNA-Reparaturweg, der insbesondere nach Strahlenexposition aktiviert wird. Eines der zentralen Proteine, das an der Erkennung von strahleninduzierten DNA Schäden beteiligt ist, ist die Kinase ATM. Eine Reihe von Proteinen wird von ATM phosphoryliert, womit eine DNA Schadensantwort bei Doppelstrangbrüchen ausgelöst wird. Der NMR-Proteinkomplex, bestehend aus NBS1, MRE11 und RAD50, ist an der Aktivierung der ATM Kinase beteiligt und wird daher als ein Sensor für DNA Doppelstrangbrüche angesehen. Biallelische Mutationen in MRE11 und NBS1 führen zu den Radiosensitivitätssyndromen „Ataxia telangiectasia-like disease“ (AT-LD) bzw. „Nijmegen breakage syndrome“ (NBS). In Kapitel 8 wird der erste Patient mit RAD50 Defizienz vorgestellt. Bei einer 18 jährigen Patientin mit einem NBS- ähnlichem klinischem Phänotyp, jedoch ohne Immundefizienz, wurden eine prämature Stopp- Mutation und der Verlust des natürlichen Translationsterminations-Signals gefunden. Die Expression von RAD50 ist in Fibroblasten und Lymphozyten der Patientin auf weniger als 10% reduziert. Auf zellulärer Ebene ist eine hohe Chromosomenbruchrate, eine dosisabhängige Arretierung in der G2 Phase des Zellzyklus, Defekte in den G1 und S Phase Kontrollpunkten, sowie das Fehlen der IR-induzierten Relokalisation von NBS1 und MRE11 zu beobachten. Korrekte Relokalisation und normale Phosphorylierungsmuster wurden experimentell durch transiente Transfektion von RAD50 cDNA wiederhergestellt, was die Bedeutung von RAD50 für diese Prozesse belegt. Die vorgestellten Daten zeigen, dass RAD50, ebenso wie NBS1 und MRE11, die ATM abhängige DNA Schadensantwort und die G1/S Zellzykluskontrolle moduliert. RAD50 scheint für die nukleäre Lokalisation von MRE11, sowie für die induzierte Relokalisation von MRE11 und NBS1 in nukleäre Foci notwendig zu sein. Als Ergebnis dieser Untersuchungen kann die RAD50-Defizienz zu der wachsenden Liste von Caretaker-Syndromen als eine neue Radiosensitivität-Erkrankung hinzugefügt werden. Das Krankheitsbild unterscheidet sich trotz enger molekularer Interaktion zwischen RAD50, NBS1 und MRE11 im NMR-Komplex von den Defekten in diesen Genen.

In jeder menschlichen Zelle entstehen täglich ca. 10.000 – 150.000 endogene DNA Schäden. Eine Anhäufung dieser Läsionen kann zu genetischer Instabilität führen und dadurch zur Krebsentwicklung beitragen. Daher ist eine schnelle DNA Schadensantwort nötig, um schwerwiegende Folgen für die Zelle zu vermeiden. Da bekannt ist, dass der Multiproteinkomplex LINC (auch humaner dREAM-Komplex genannt) an der transkriptionellen Regulation mitotischer und G2-spezifischer Gene beteiligt ist, sollte in dieser Arbeit seine Beteiligung an der DNA Schadensantwort genauer untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass in normal wachsenden Zellen B-MYB an den LINC-Kernkomplex bindet, welcher sich aus 5 Proteinen zusammensetzt: LIN-9, LIN-54, LIN-52, LIN-37 und RbAp48. Treten DNA Schäden auf, dissoziiert B-MYB vom LINC Kernkomplex wobei gleichzeitig die Bindung von p130 und E2F4 an LINC induziert wird. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass der Signalweg, der die LINC Umlagerung vermittelt, sowohl p53- als auch p21-abhängig ist. p53 negative Zellen können nach Schädigung der DNA weder einen G1 Block induzieren noch einen G2 Block langfristig aufrechterhalten. Eine Erklärung für diese Schwächung des G2 Arrests liefern Daten dieser Arbeit: Da in DNA geschädigten p53 -/- Zellen keine LINC Umlagerung beobachtet werden kann und zusätzlich B-MYB verstärkt an LINC und die Zielpromotoren bindet, kommt es zu einer erhöhten G2/M Genexpression. Dies resultiert häufig in einem verfrühten Wiedereintritt in den Zellzyklus („checkpoint adaptation“). Eine Daten-Analyse primärer Brustkrebstumore zeigte außerdem, dass erhöhte B-MYB Genexpressionslevel mit einer erhöhte Rückfallgefahr und einer schlechten Prognose korrelieren, was möglicherweise auf die Funktion von B-MYB während der „checkpoint adaptation“ zurückzuführen ist. Schlussendlich lassen die Ergebnisse dieser Arbeit vermuten, dass die Hemmung der B-MYB Funktion in solchen Tumoren, die p53 Mutationen tragen, die Wahrscheinlichkeit eines Behandlungserfolges vergrößern und die Wahrscheinlichkeit eines Rückfalls senken könnte. / Around 10.000 – 150.000 endogenous DNA damage-induced lesions occur in a human body per day and cell. Accumulation of unrepaired lesions can lead to aneuploidy and the loss of genomic integrity which in turn contributes to tumor formation. Therefore, an efficient DNA damage response has to be initiated, in the end leading to cell cycle inhibition and induction of repair. Since it is known that a recently characterized human multiprotein complex named LINC (or human dREAM) together with B-MYB is involved in the regulation of G2/M gene expression (Plk1, cyclin B1, cdc2 etc.), its function in the DNA damage response was analyzed in this study. In growing cells B-MYB is associated to the LIN core complex which consists of 5 different proteins named LIN-9, LIN-54, LIN-52, LIN-37 and RbAp48. After induction of DNA damage B-MYB leaves the complex and binding of E2F4 and p130 to LINC is induced. Importantly, the upstream pathway leading to LINC rearrangement is dependent on the activation of p53 and p21. Interestingly, p53 -/- cells solely have the potential to block in the G2 phase of the cell cycle, thereby making them vulnerable for errors during G2 arrest induction or maintenance. Here I demonstrate that LINC rearrangement is absent in p53 -/- cells and that B-MYB/LINC binding to target gene promoters is increased. This in turn leads to an increased G2/M gene expression after DNA damage induction and triggers premature cell cycle re-entry (checkpoint adaptation). Significantly, B-MYB expression is increased in p53 mutated primary breast cancer tumors and correlates with poor prognosis and reoccurrence probably due to its function in checkpoint adaptation. This study gives evidence that inhibition of B-MYB gene expression or B-MYB function in p53 mutant tumors could be a good choice for adjuvant therapy.

Ein sehr wichtiger Tumorsuppressor ist der Transkriptionsfaktor p53, der Zellschicksals-Entscheidungen wie Zellzyklus-Arrest und programmierten Zelltod (Apoptose) kontrolliert. Die Wirkung von p53 und von seinen Familienmitgliedern p63 und p73 beruht überwiegend auf der Fähigkeit, als Transkriptionsfaktoren die Genexpression zu regulieren. Die DNA-Bindung an Promotoren von Zielgenen ist dabei von grundlegender Bedeutung und wird durch die hoch konservierte zentrale DNA-Bindungs-Domäne und den Carboxy-Terminus bestimmt. In dieser Arbeit wurden die DNA-Bindungseigenschaften von p53 und verschiedener Carboxy-terminalen p73 Isoformen untersucht. In „electrophoretic mobility shift assay” (EMSA) Experimenten bildeten p53 und p73gamma nur schwache Sequenz-spezifische DNA-Komplexe, wohingegen p73alpha, beta und delta die DNA deutlich stärker banden. Die schwache DNA-Bindung von p53 und p73gamma kann durch mehrfach positiv geladene Carboxy-Termini erklärt werden, die über eine Sequenz-unabhängige DNA-Bindung ein Gleiten entlang der DNA ermöglichen. Die Deletion der Carboxy-terminalen Domäne (CTD) von p53 („p53delta30“) verstärkte dementsprechend die Sequenz-spezifische DNA-Bindung in vitro und seine Übertragung auf p73alpha („p73alpha+30“) schwächte sie ab. Mittels „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) Experimenten konnte in lebenden Zellen eine Verminderung der intra-nukleären Mobilität von p53 und p73alpha+30 durch die CTD gezeigt werden, die aus der Sequenz-unabhängigen DNA-Bindung resultiert. Zusätzlich reduzierte die CTD die Sequenz-spezifische DNA-Bindung von p53 an den p21 (CDKN1A) Promotor. Das Spektrum der regulierten Zielgene wurde in einer Genom-weiten Genexpressions-Analyse nicht durch die CTD verändert, sondern maßgeblich durch das Protein-Rückgrat von p53 beziehungsweise p73 bestimmt. Allerdings verminderte die CTD das Ausmaß der Transkriptions-Regulation und hemmte die Induktion von Zellzyklus-Arrest und Apoptose. Die mehrfach positiv geladene CTD in p53 besitzt demzufolge eine negativ regulatorische Wirkung, die in den wichtigsten p73 Isoformen alpha, beta und delta fehlt. Die zentrale DNA-Bindungs-Domäne trägt durch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen H1-Helices (Aminosäurereste 177 bis 182) unterschiedlicher p53 Monomere zu kooperativer DNA-Bindung und zu Zellschicksals-Entscheidungen bei. Anhand von Mutanten, die unterschiedlich starke H1-Helix-Interaktionen ermöglichen, konnte gezeigt werden, dass starke Interaktionen die Bindung an Promotoren von pro-apoptotischen Genen verstärkte, wohingegen die Bindung an anti-apoptotische und Zellzyklus-blockierende Gene unabhängig von der Interaktions-Stärke war. Diese Unterschiede in der Promotor-Bindung ließen sich nicht auf eine veränderte zelluläre Lokalisation der Mutanten zurückführen, da alle Mutanten überwiegend nukleär lokalisiert waren. Eine an Serin 183 Phosphorylierungs-defekte Mutante von p53 bildete stabile DNA-Komplexe, entsprechend einer Mutante mit starker H1-Helix-Interaktion, und trans-aktivierte pro-apoptotische Promotoren stärker als Mutanten, die Phosphorylierung von p53 an Serin 183 simulieren. Da zusätzlich bekannt ist, dass Serin 183 mit der H1-Helix wechselwirkt, könnte diese Phosphorylierung einen physiologischen Mechanismus zur Regulation der H1-Helix-Interaktion und damit des Zellschicksals darstellen. Zusammenfassend ließ sich zeigen, dass sowohl die Interaktions-Stärke zweier DNA-Bindungs-Domänen als auch die elektrische Ladung des Carboxy-Terminus die DNA-Bindungseigenschaften von p53 Familienmitgliedern bestimmen und so Zellschicksals-Entscheidungen der p53 Familie beeinflussen. / A very important tumour suppressor is the transcription factor p53 that controls cell fate decisions like cell cycle arrest and programmed cell death (apoptosis). The effects of p53 and its family members p63 and p73 are mainly based on their transcription factor activities to regulate gene expression. The DNA binding to promoters of target genes is of fundamental importance for their functionality and is determined by the highly conserved core DNA binding domain and the carboxy-terminus. In this thesis the DNA binding properties of p53 and different carboxy-terminal p73 isoforms were examined. In electrophoretic mobility shift assays (EMSA) p53 and p73gamma formed only weak sequence-specific protein-DNA-complexes while p73alpha, beta and delta bound considerably stronger to DNA. A highly positively charged carboxy-terminus can explain the weak DNA binding of p53 and p73gamma by enabling sequence-nonspecific DNA binding leading to sliding on DNA. According to this the deletion of the carboxy-terminal domain (CTD) of p53 („p53delta30“) reinforced DNA binding in vitro, and its fusion to p73alpha („p73alpha+30“) attenuated it. In living cells the CTD reduced intranuclear mobility of p53 and p73alpha+30 in fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments by mediating sequence-nonspecific binding to DNA. In addition, the CTD reduced sequence-specific occupancy of the p21 (CDKN1A) promoter by p53 in vivo. In an unbiased genome-wide gene expression analysis the spectrum of target genes was not changed by the presence of the CTD, but mainly determined by the p53 and p73 protein backbone, respectively. However, the CTD diminished the level of target gene activation and inhibited the induction of cell cycle arrest and apoptosis. As a result, the highly positively charged carboxy-terminus of p53 exhibits a negative regulatory effect that is missing in the most important p73 isoforms alpha, beta and delta. The core DNA binding domain adds to cooperative DNA binding and cell fate decisions by electrostatic interactions between H1 helices (residues 177 to 182) of different p53 monomers. Strong H1 helix interactions increased binding to promoters of pro-apoptotic genes, whereas binding to anti-apoptotic and proliferation inhibiting genes was independent of the interaction strength as shown by mutants with different strengths of the H1 helix interactions. These differences in promoter binding were not caused by different cellular localizations of the mutants as they were all predominantly localized to the nucleus. A serine 183 phosphorylation-defective mutant of p53 formed stable protein-DNA-complexes, comparable to a mutant with strong H1 helix interactions, and trans-activated pro-apoptotic promoters stronger than mutants that mimicked p53 phosphorylated on serine 183. Due to the fact that serine 183 interacts with the H1 helix, these data suggest that phosphorylation of serine 183 is a physiological mechanism to regulate H1 helix interactions and thereby cell fate decisions. In summary, it was shown that both the interaction strength of two DNA binding domains and the electrostatic charge of the CTD define the DNA binding properties of p53 family members and thereby influence cell fate decisions of the p53 family.

Several epidemiological studies found that hypertensive patients have an increased risk to develop kidney cancer. Hyperaldosteronism frequently results in arterial hypertension and contributes to the development and progression of kidney injury, with reactive oxygen species (ROS) playing an important role. ROS are thought to be associated with many pathological conditions such as cancer and other disorders, like cardiovascular complications , which often go along with hypertension. The aim of the present work was to investigate whether the effects of elevated aldosterone concentrations might be involved in the increased cancer incidence of hypertensive individuals. First, the potential capacity of aldosterone to induce oxidative stress and DNA damage was investigated in vitro and in vivo. In LLC-PK1 porcine kidney cells and MDCK canine kidney cells the significant formation of ROS, and especially of superoxide (O2˙ˉ) was assessed. With two genotoxicity tests, the comet assay and the micronucleus frequency test, the DNA damaging potential of aldosterone was quantified. In both genotoxicity tests a dose-dependent increase in aldosterone-induced structural DNA damage was observed. Oxidative stress and DNA damage were prevented by antioxidants, suggesting ROS as a major cause of DNA damage. Furthermore, the oxidatively modified DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydro-2´-deoxyguanosine (8-oxodG), was found to be significantly elevated. In kidneys of rats with desoxycorticosterone acetate (DOCA)/salt-induced hypertension, which is a model of severe mineralocorticoid-dependent hypertension, elevated levels of ROS and superoxide were found, compared to kidneys of sham rats. Also DNA strand breaks, measured with the comet assay and double strand breaks, visualized with antibodies against the double strand break-marker gamma-H2AX were significantly elevated in kidneys of DOCA/salt-treated rats. In addition, significantly increased amounts of 8-oxodG were detected. Proliferation of kidney cells was found to be increased, which theoretically enables the DNA damage to manifest itself as mutations, since the cells divide. Second, the effects of aldosterone on the activation of transcription factors and signaling pathways were investigated. A significant activation of the potentially protective transcription factor Nrf2 was observed in LLC-PK1 cells. This activation was triggered by an increase of ROS or reactive nitrogen species (RNS). In response to oxidative stress, glutathione synthesis and detoxifying enzymes, such as the subunits of the glutathione-cysteine-ligase or heme oxygenase 1 were rapidly induced after 4 h. Nevertheless, after 24 h a decrease of glutathione levels was observed. Since ROS levels were still high after 24 h, but Nrf2 activation decreased, this adaptive survival response seems to be transient and quickly saturated and overwhelmed by ROS/RNS. Furthermore, Nrf2 activation was not sufficient to protect cells against oxidative DNA damage, because the amounts of double strand breaks and 8-oxodG lesions steadily rose up to 48 h of aldosterone treatment. The second transcription factor that was time- and dose-dependently activated by aldosterone in LLC-PK1 and MDCK cells was NF-kappaB. Furthermore, a significant cytosolic and nuclear activation of ERK was detected. Aldosterone induced the phosphorylation of the transcription factors CREB, STAT1 and STAT3 through ERK. Third, the underlying mechanisms of oxidant production, DNA damage and activation of transcription factors and signaling pathways were studied. Aldosterone exclusively acted via the MR, which was proven by the MR antagonists eplerenone, spironolactone and BR-4628, whereas the glucocorticoid receptor (GR) antagonist mifepristone did not show any effect. Furthermore, aldosterone needed cytosolic calcium to exert its negative effects. Calcium from intracellular stores and the influx of calcium across the plasma membrane was involved in aldosterone signaling. The calcium signal activated on the one hand, the prooxidant enzyme complex NAD(P)H oxidase through PKC, which subsequently caused the generation of O2˙ˉ. On the other hand, nitric oxide synthase (NOS) was activated, which in turn produced NO. NO and O2˙ˉ can react to the highly reactive species ONOO- that can damage the DNA more severely than the less reactive O2˙ˉ. In the short term, the activation of transcription factors and signaling pathways could be a protective response against aldosterone-induced oxidative stress and DNA damage. However, a long-term NF-B and ERK/CREB/STAT activation by persistently high aldosterone levels could unfold the prosurvival activity of NF-kappaB and ERK/CREB/STAT in aldosterone-exposed cells. DNA damage caused by increased ROS might become persistent and could be inherited to daughter cells, probably initiating carcinogenesis. If these events also occur in patients with hyperaldosteronism, these results suggest that aldosterone could be involved in the increased cancer incidence of hypertensive individuals. / Mehrere epidemiologische Studien haben ein erhöhtes Nierenkrebsrisko bei Patienten mit Bluthochdruck aufgedeckt. Hyperaldosteronismus führt oft zu arteriellem Bluthochdruck und trägt zur Entwicklung und zum Fortschreiten von Nierenschäden bei, wobei reaktive Sauerstoffspezies (ROS) eine wichtige Rolle spielen. Immer häufiger werden ROS mit Krankheitsbildern wie Krebs und kardiovaskulären Erkrankungen, die mit Bluthochdruck einhergehen, in Verbindung gebracht. Das Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob erhöhte Aldosteronkonzentrationen an dem gesteigerten Krebsrisiko von hypertensiven Patienten beteiligt sein könnten. Zunächst wurde die potentielle Kapazität von Aldosteron, oxidativen Stress und DNA-Schaden in vitro und in vivo induzieren zu können, untersucht. In der Schweine-Nierenzelllinie LLC-PK1 und der Hunde-Nierenzelllinie MDCK wurde die Entstehung von ROS und speziell die Bildung von Superoxid (O2˙ˉ) nachgewiesen. Das gentoxische Potential von Aldosteron wurde mit zwei Genotoxizitätstests, dem Comet Assay und dem Mikrokernfrequenztest bestimmt. In beiden Genotoxizitätstests konnte ein dosis-abhängiger Anstieg des strukturellen DNA-Schadens beobachtet werden. Antioxidantien konnten den oxidativen Stress und die DNA-Schäden verringern, was annehmen lässt, dass ROS die Hauptursache für die Entstehung der DNA-Schäden sind. Darüberhinaus wurden signifikant erhöhte Mengen der oxidativ modifizierten DNA Läsion 8-Oxo-7,8-dihydro-2´-deoxyguanosin (8-oxodG) gefunden. In Nieren von Ratten mit Desoxycorticosteron-Acetat (DOCA) und Salz-induziertem Bluthochdruck, ein Modell für massiven Mineralocorticoid-induzierten Bluthochdruck, wurde ebenfalls eine erhöhte Bildung von ROS und O2˙ˉ in Nieren von DOCA/Salz-Ratten im Vergleich zu Sham-Ratten beobachtet. Auch im Comet Assay erfasste DNA-Strangbrüche und Doppelstrangbrüche, die mit Hilfe von Antikörpern gegen den Doppelstrangbruchmarker gamma-H2AX sichtbar gemacht wurden, waren in den Nieren der DOCA/Salz-behandelten Ratten signifikant erhöht. Weiterhin wurden erhöhte 8-oxodG-Spiegel in DOCA/Salz-Ratten beobachtet. Auch eine erhöhte Proliferationsrate in DOCA/Salz-behandelten Ratten konnte festgestellt werden, was theoretisch dazu führen könnte, dass sich die DNA-Schäden als Mutationen manifestieren, da sich die Zellen teilen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss von Aldosteron auf die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren und Signalwegen untersucht. Zunächst konnte die Aktivierung des potentiell schützenden Transkriptionsfaktors Nrf2 in LLC-PK1 Zellen mittels electrophoretic mobility shift assay (EMSA) beobachtet werden. Diese Aktivierung wurde durch den Anstieg an ROS und reaktiven Stickstoffspezies (RNS) ausgelöst. Als Antwort auf den oxidativen Stress, wurde die Glutathion-Synthese und detoxifizierende Enzyme, wie die Untereinheiten der Glutathion-Cystein-Ligase oder Hämoxygenase 1, nach 4 Stunden rasch hochreguliert. Nichtsdestotrotz konnte nach 24 Stunden eine Abnahme des Glutathionspiegels festgestellt werden. Da die Konzentration an ROS nach 24 Stunden immer noch signifikant erhöht war, die Aktivierung von Nrf2 allerdings stark zurückgegangen ist, scheint diese adaptive Überlebensstrategie nur kurzfristig, und somit schnell durch ROS/RNS gesättigt zu sein. Weiterhin war die Aktivierung von Nrf2 nicht ausreichend, um die Zellen vor dem durch Aldosteron-induzierten DNA-Schaden zu schützen, da Doppelstrangbrüche, sowie 8-oxodG-Läsionen bei bis zu 48-stündiger Inkubation mit Aldosteron stetig anstiegen. Der zweite Transkriptionsfaktor, der zeit- und dosisabhängig durch Aldosteron aktiviert wurde, war NF-kappaB. Ausserdem wurde die cytosolische und nukleäre Aktivierung von ERK nachgewiesen. Aldosteron induzierte weiterhin die Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren CREB, STAT1 und STAT3 durch ERK. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden die zugrundeliegenden Mechanismen der Entstehung von ROS/RNS, des DNA-Schadens und der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren untersucht. Aldosteron wirkte ausschließlich über den MR, bewiesen durch Einsatz der MR-Antagonisten Eplerenon, Spironolakton und BR-4628. Der Glucocorticoid-Rezeptor-Antagonist Mifepriston zeigte dagegen keinen Effekt. Weiterhin benötigte Aldosteron cytosolisches Calcium, um seine negativen Effekte auszuüben. Es waren intrazelluäres Calcium, sowie ein Calciuminflux über die Plasmamembran am Aldosteronsignal beteiligt. Einerseits wurde der prooxidative Enzymkomplex NAD(P)H-Oxidase von Calcium durch die Proteinkinase C (PKC) aktiviert, was wiederum zur Bildung von O2˙ˉ führte. Andererseits kam es durch erhöhtes cytosolisches Calcium zur Aktivierung der NO-Synthase (NOS), welche daraufhin Stickoxid (NO) produzierte. NO und O2˙ˉ können zu dem hochreaktiven Peroxynitrit (ONOO-) reagieren, welches die DNA mehr schädigen kann als das etwas weniger reaktive O2˙ˉ. Kurzfristig könnte die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren und Signalwege eine schützende Wirkung gegen den durch Aldosteron-induzierten oxidativen Stress und DNA-Schaden in den Zellen haben. Allerdings kann eine länger anhaltende Aktivierung von NF-kappaB und ERK/CREB/STAT durch permanent hohe Aldosteronspiegel zur Induktion einer Überlebensstrategie durch NF-kappaB und ERK/CREB/STAT in Aldosteron-exponierten Zellen führen. Der DNA-Schaden, der durch erhöhte ROS-Spiegel entsteht, könnte persistent und somit an Tochterzellen weitervererbt werden, was eventuell zur Entstehung von Krebs beitragen könnte. Falls diese Effekte auch in Patienten mit Hyperaldosteronismus gefunden werden können, dann könnte Aldosteron an der erhöhten Krebsinzidenz bei Bluthochdruck beteiligt sein.

Biodiversity may be investigated and explored by the means of genetic sequence information and molecular phylogenetics. Yet, with ribosomal genes, information for phylogenetic studies may not only be retained from the primary sequence, but also from the secondary structure. Software that is able to cope with two dimensional data and designed to answer taxonomic questions has been recently developed and published as a new scientific pipeline. This thesis is concerned with expanding this pipeline by a tool that facialiates the annotation of a ribosomal region, namely the ITS2. We were also able to show that this states a crucial step for secondary structure phylogenetics and for data allocation of the ITS2-database. This resulting freely available tool determines high quality annotations. In a further study, the complete phylogenetic pipeline has been evaluated on a theoretical basis in a comprehensive simulation study. We were able to show that both, the accuracy and the robustness of phylogenetic trees are largely improved by the approach. The second major part of this thesis concentrates on case studies that applied this pipeline to resolve questions in taxonomy and ecology. We were able to determine several independent phylogenies within the green algae that further corroborate the idea that secondary structures improve the obtainable phylogenetic signal, but now from a biological perspective. This approach was applicable in studies on the species and genus level, but due to the conservation of the secondary structure also for investigations on the deeper level of taxonomy. An additional case study with blue butterflies indicates that this approach is not restricted to plants, but may also be used for metazoan phylogenies. The importance of high quality phylogenetic trees is indicated by two ecological studies that have been conducted. By integrating secondary structure phylogenetics, we were able to answer questions about the evolution of ant-plant interactions and of communities of bacteria residing on different plant tissues. Finally, we speculate how phylogenetic methods with RNA may be further enhanced by integration of the third dimension. This has been a speculative idea that was supplemented with a small phylogenetic example, however it shows that the great potential of structural phylogenetics has not been fully exploited yet. Altogether, this thesis comprises aspects of several different biological disciplines, which are evolutionary biology and biodiversity research, community and invasion ecology as well as molecular and structural biology. Further, it is complemented by statistical approaches and development of informatical software. All these different research areas are combined by the means of bioinformatics as the central connective link into one comprehensive thesis. / Biologische Diversität kann mit Hilfe molekularer Sequenzinformation und phylogenetischen Methoden erforscht und erfasst werden. Bei ribosomalen Genen kann man jedoch wertvolle Information nicht nur aus der Primärsequenz beziehen, sondern auch aus der Sekundärstruktur. In den letzen Jahren wurde Software entwickelt, die solche Daten für taxonomische Fragestellung verwerten kann. Diese Arbeit beschäftigt sich mit einer Erweiterung dieser Methodik durch eine Software-Anwendung, die die Annotation des ribosomalen Genes ITS2 deutlich vereinfacht. Mit dieser Studie konnten wir zeigen, dass dies einen entscheidenden Schritt der Sequenz-Struktur-Phylogenie und der Datenerfassung der ITS2-Datenbank darstellt. Die daraus resultierende und frei verfügbare Anwendung ermöglicht Annotationen von hoher Güte. In einer weiteren Studie wurde mittels Simulationen der gesamte Arbeitsfluß der Sequenz-Struktur Phylogenie auf theoretischer Ebene evaluiert. Dabei zeigte sich, dass sich sowohl die Genauigkeit, als auch die Robustheit von phylogenetischen Stammbäumen durch diesen Ansatz deutlich verbessern. Der zweite große Teil der Arbeit befasst sich mit Fallbeispielen, in denen dieser Arbeitsfluß zur Aufklärung von taxomonischen and ökologischen Fragestellungen Anwendung fand. In diesem Rahmen konnten wir mehrere und voneinander unabhängige Phylogenien ermitteln, welche die theoretischen Ergebnisse einer Verbesserung phylogenetischer Bäume auch von biologischer Seite aus bekräftigen. Der Ansatz war anwendbar in sehr feinskaligen Studien auf Art bzw. Gattungsniveau, aber durch die starke Konservierung der Sekundärstruktur auch an sehr weit von einander entfernten taxonomischen Gruppen. Eine weitere Studie, die sich mit der Phylogenie von Bläulingen befasst, zeigt deutlich, dass dieser Ansatz nicht nur für Fragestellungen bei Pflanzen, sondern auch im Tierreich angewandt werden kann. Die Bedeutung von qualitativ hochwertigen Stammbäumen auch für andere Fachbereiche wird an zwei unserer ökologischen Studien deutlich: Mit Hinzunahme von Sekundärstruktur war es uns möglich Fragestellungen über die Evolution von Ameisen-Pflanzen Interaktionen sowie über ökologische Gemeinschaften von Bakterien auf verschiedenen Pflanzenteilen zu beantworten. Zuletzt gehen wir spekulativ auf die Frage ein, wie Strukturphylogenie um die dritte Dimension erweitert werden kann. Dies bleibt zwar spekulativ und wurde nur um ein kleines Fallbeispiel ergänzt, jedoch zeigt sich deutlich, dass das Potential von Strukturphylogenie noch nicht erschöpft ist. Insgesamt befasst sich diese Arbeit mit Aspekten aus verschiedenen biologischen Disziplinen: Evolutionsbiologie und Biodiversitätsforschung, sowie Gemeinschafts- und Invasionsökologie, aber auch Molekular- und Strukturbiologie. Dies wurde ergänzt durch statistische Ansätze und Entwicklung von informatischer Software. Diese verschiedenen Forschungsrichtungen wurden mit Hilfe der Bioinformatik als zentrales Bindeglied vereint.

The increasing importance of the Internet as an integral part of contemporary society has stressed the need to formalize the process of response to security incidents that accompany it inseparably. Security teams of the CERT/CSIRT type are established at different levels for this purpose. These teams respond to reports from their constituency and cooperate with other teams. This thesis introduces the reader to the issues these teams deal with and analyzes their needs in resolving threats and problems related to DNS and its domains. Part of the work is an overview of the basic existing tools to support the work of CERT/CSIRT teams to solve problems with domains, the design of a tool Malicious Domain Manager and description of its implementation. The results of test run of this tool by CZ.NIC-CSIRT team show its contribution to security of DNS.

In the context of this thesis, I investigated the molecular causes and functional consequences of genetic instability using a human inherited disease, Fanconi anemia. FA patients display a highly variable clinical phenotype, including congenital abnormalities, progressive bone marrow failure and a high cancer risk. The FA cellular phenotype is characterized by spontaneous and inducible chromosomal instability, and a typical S/G2 phase arrest after exposure to DNA-damaging agents. So far, 13 genes have been identified, whose biallelic (or, in the case of X-linked FANCB, hemizygous) mutations cause this multisystem disorder. The FA proteins interact in a multiprotein network, instrumental and essential in the cellular response to DNA damage. A more comprehensive summary of Fanconi anemia and its myriad clinical, cellular and molecular manifestations is provided in the introduction section of this thesis. The results of my experimental work are presented as published papers and manuscripts ready to be submitted. In the first publication, I investigated the connection between FA genes and bladder tumors. The question I tried to answer was whether a disruption of the FA/BRCA pathway may be a frequent and possibly causal event in bladder cancer, explaining the hypersensitivity of these cells to DNA-crosslinking agents. On the basis of my experimental data I arrived at the conclusion that disruption of the FA/BRCA pathway might be detrimental rather than advantageous for the majority tumor types by rendering them vulnerable towards DNA damaging agents and oxidative stress. The second publication deals with the gene coding for the core complex protein FANCE and tries to answer the question why FANCE is so rarely affected among FA-patients. The conclusion from these studies is that like FANCF, FANCE functions as a probable adaptor protein with a high tolerance towards amino acid substitutions which would explain the relative rareness of FA-E patients. I have also investigated the FANCL gene whose product functions as the catalytic subunit of the E3 ligase. The third publication addresses this issue by providing the first comprehensive description of genetic alterations and phenotypic manifestations in a series of three FA-L patients. The results of my study show that genetic alterations of FANCL are compatible with survival, these alterations may include large deletions such as so far common only in the FANCA gene, FA-L phenotypes can be mild to severe, and FANCL belongs to the group of FA genes that may undergo somatic reversion. The central protein of the FA/BRCA network, FANCD2, is the subject of the fourth publication presented in this thesis. Most importantly, we were able to show that there are no biallelic null mutations in FANCD2. Correspondingly, residual protein of both FANCD2-isotypes (FANCD2-S and FANCD2-L) was present in all available patient cell lines. This suggests that complete abrogation of the FANCD2 protein cannot be tolerated and causes early embryonic lethality. There are at least three FA proteins that are not required for the posttranslational modification of FANCD2. One of these proteins is the 5’-3’ helicase BRIP1 (BRCA1-interacting protein 1), a protein that interacts directly with the breast cancer susceptibility protein BRCA1. I participated in the identification of BRIP1 as the FA protein FANCJ. This discovery is described in the fifth publication of this thesis. The newly discovered protein BRIP1/FANCJ seems to act as one of the mediators of genomic maintenance downstream of FANCD2. Another protein identified downstream of FANCD2 is PALB2. PALB2 was originally discovered as “partner and localizer of BRCA2”. In a candidate gene approach we tested patients with early childhood cancers but without mutations in BRCA2 for mutations in PALB2 (publication 6). PALB2 was identified as a novel FA gene and designated FANCN. FA-N patients are very severely affected. The last publication included in my thesis describes the identification of the FA gene FANCI as the second monoubiquitinated member of the FA/BRCA pathway (publication 7). We identified biallelic mutations in KIAA1794 in four FA patients, thus proving the genuine FA-nature of this candidate sequence. The general discussion provides a synopsis of the results and conclusions of my work with the state of art of FA research. / Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden molekulare Ursachen und funktionale Konsequenzen genetischer Instabilität am Beispiel der menschlichen Erbkrankheit Fanconi Anämie (FA) untersucht. FA Patienten zeigen einen sehr variablen klinischen Phänotyp, der in der Regel angeborene Fehlbildungen, progressives Knochenmarkversagen und ein hohes Risiko für Tumorerkrankungen beinhaltet. Der zelluläre Phänotyp der FA ist durch eine spontane und induzierbare chromosomale Instabilität und einen typischen S/G2-Phasen-Arrest nach Exposition mit DNA-schädigenden Agentien charakterisiert. Biallelische oder -im Fall des X-chromosomalen FANCB- hemizygote Mutationen, die zu dieser Erkrankung führen, wurden in bislang 13 Genen identifiziert. Die FA Proteine arbeiten in einem gemeinsamen Netzwerk und sind essentiell beteiligt an der zellulären Antwort auf DNA Schädigung. Eine umfassendere Übersicht über Fanconi Anämie und ihre vielfältigen klinischen, zellulären und molekularen Erscheinungsformen ist in der Einleitung dieser Dissertation gegeben. Die Ergebnisse meiner experimentellen Arbeiten sind in Form von publizierten Fachartikeln und fertigen Manuskripten dargestellt. In der ersten Publikation habe ich den Zusammenhang von FA Genen und Harnblasentumoren untersucht. Die Frage, die ich zu beantworten versucht habe, war, ob ein Defekt im FA/BRCA Weg eine mögliche Ursache für die Entstehung von Blasentumoren sein könnte. Aufgrund meiner experimentellen Daten bin ich zu dem Schluss gekommen, dass ein Defekt im FA/BRCA Weg für einen Tumor vermutlich eher schädlich als vorteilhaft ist, da so ein Defekt den Tumor gegenüber DNA-schädigenden Agentien und oxidativem Stress anfällig machen würde. Meine zweite Publikation befasst sich mit dem Kern-Komplex Protein FANCE und versucht die Frage zu beantworten, warum das FANCE Gen in so wenigen FA Patienten betroffen ist. Die Schlussfolgerung dieser Arbeit war, dass FANCE vermutlich genauso wie FANCF im Kern-Komplex die Rolle eines Adaptor-Proteins mit einer hohen Toleranz gegenüber Aminosäure-Austauschen innehat, was die relative Seltenheit von Patienten dieser Untergruppe erklären könnte. Ich habe weiterhin das FANCL Gen untersucht, dessen Produkt als katalytische Untereinheit der E3-Ligase fungiert. Die dritte Publikation in dieser Dissertation befasst sich mit diesem Thema und enthält eine umfassende Beschreibung von genetischen Veränderungen und phänotypischen Auswirkungen in einer Gruppe von 3 FA-L Patienten. Die Ergebnisse meiner Arbeit haben allerdings gezeigt, dass genetische Veränderungen in FANCL mit dem Leben vereinbar sind, dass diese Veränderungen sehr große Deletionen beinhalten können, was bisher nur für FANCA gezeigt werden konnte, dass FA-L Phänotypen von mild bis schwer betroffen reichen können und dass FANCL zu den Genen gehört, in denen somatische Reversionen stattfinden. Das Schlüsselprotein des FA/BRCA Netzwerks, FANCD2, ist das Thema der vierten Publikation in dieser Dissertation. Insbesondere konnten wir zeigen, dass es keine biallelischen Nullmutationen in FANCD2 zu geben scheint. Dementsprechend war Restprotein von beiden FANCD2-Isoformen, FANCD2-L und FANCD2-S, in allen verfügbaren Patienten-Zelllinien nachweisbar. Dies ließ vermuten, dass ein komplettes Fehlen des FANCD2 Proteins nicht tolerierbar ist und frühe embryonale Letalität verursacht. Es mindestens drei Proteine, die nicht für diese posttranslationale Modifikation benötigt werden. Eines dieser Proteine ist die 5’-3’ Helikase BRIP1 (BRCA1-interagierendes Protein 1), ein Protein, das direkt mit dem Brustkrebs-assoziierten Protein BRCA1 interagiert. Ich war an der Identifizierung von BRIP1 als FA Protein (FANCJ) beteiligt. Diese Entdeckung ist in der fünften Publikation meiner Dissertation beschrieben. Das neu entdeckte Protein BRIP1/FANCJ, das direkt mit BRCA1 interagiert, scheint als einer der Mediatoren zur Aufrechterhaltung genomischer Stabilität downstream von FANCD2 zu wirken. Ein weiteres Protein downstream von FANCD2 ist PALB2. PALB2 wurde ursprünglich als „Partner und Lokalisierer von BRCA2“ entdeckt. In einer Kandidatengen-Studie haben wir Patienten mit frühkindlichen Tumoren, aber ohne Mutationen in BRCA2, auf Mutationen in PALB2 untersucht (Publikation 6). Aufgrund unserer Ergebnisse haben wir PALB2 als ein neues FA Gen identifiziert und haben es FANCN genannt. Genauso wie FA-D1 Patienten sind FA-N Patienten sehr schwer betroffen. Die letzte Publikation meiner Dissertation beschreibt die Identifikation des FA Genes FANCI, dessen Produkt das zweite monoubiquitinierte Mitglied des FA/BRCA Weges darstellt (Publikation 7). Wir haben in vier Patienten biallelische Mutationen in KIAA1794 gefunden, und so zeigen können, dass KIAA1794 wirklich ein FA Gen ist. Die generelle Diskussion birgt eine Synopsis der Ergebnisse und Schlussfolgerungen meiner Forschung mit dem aktuellen Wissensstand über FA.

Der probiotische Escherichia coli Stamm Nissle 1917 (EcN) ist eines der wenigen Probiotika, die als aktive Komponente eines Medikaments in mehreren Ländern zugelassen sind. Am besten ist die Wirksamkeit des EcN für die Remissionserhaltung von an Colitis Ulcerosa leidenden Patienten dokumentiert. Diese Fähigkeit ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass EcN in der Lage ist die Produktion des humanen beta-Defensins 2 (HBD2) mittels seiner Flagelle zu Induzieren. In dieser Studie wurden rekombinante EcN Stämme konstruiert, die ein Defensin zu produzieren vermögen. Zu diesem Zweck wurden Kodon-optimierte Defensingene in Expressionsplasmidvektoren kloniert, die entweder die Proform mit der Signalsequenz oder die reife Defensinform des humanen -Defensins 5 (HD5) oder des humanen -Defensins 2 (HBD2) unter der Kontrolle des T7-Promotors kodieren. Die Synthese dieser Defensine wurde mittels Western-Blot nach der Induktion der Expression und der Lyse der rekombinanten EcN Stämme demonstriert. Das rekombinante reife HBD2 mit einem N-terminalen His-Tag konnte mittels Ni-Säulen-Chromatographie aufgereinigt werden. Das so gewonnene HBD2 zeigte antimikrobielle Aktivität gegen E. coli, Salmonella enterica Serovar Typhimurium und Listeria monocytogenes. In einem zweiten Ansatz wurde der Teil des HBD2-Gens mit dem yebF-Gen fusioniert, der das reife HBD2 kodiert. Das resultierende Fusionsprotein YebFMHBD2 wurde von dem entsprechenden EcN Stamm nach Induktion der Expression sekretiert. Die Präsenz von YebFMHBD2 im Medium war nicht das Ergebnis von Zellyse wie Western-Blots spezifisch für die -Galaktosidase und das Maltose-Bindeprotein mit dem Kulturüberstand zeigten. Dieser Kulturüberstand inhibierte das Wachstum von E. coli, Salmonella enterica Serovar Typhimurium und Listeria monocytogenes nach Dialyse und Aufkonzentration sowohl in Agardiffusionsassays als auch in Flüssigcokultur. Damit konnte gezeigt werden, dass EcN ein für die Produktion von bestimmten humanen Defensinen geeignetes Probiotikum darstellt. EcN ist bei der Behandlung von Morbus Crohn Patienten nicht aktiv. Dies ist vermutlich in der genetisch bedingten Unfähigkeit zur ausreichenden Defensinproduktion solcher Individuen begründet. Als ein erster Schritt in der Entwicklung von alternativen Ansätzen zur Behandlung Morbus Crohn Patienten wurden in dieser Arbeit EcN Stämme konstruiert, die in der Lage sind HD5 oder HBD2 zu produzieren. / The probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) is one of the few probiotics licensed as a medication in several countries. Best documented is its effectiveness in keeping patients suffering from ulcerative colitis (UC) in remission. This might be due to its ability to induce the production of human beta defensin 2 (HBD2) in a flagellin-dependent way in intestinal epithelial cells. In contrast to ulcerative colitis, for Crohn´s disease (CD) convincing evidence is lacking that EcN might be clinically effective, most likely due to the genetically based inability of sufficient defensin production in CD patients. As a first step in the development of an alternative approach for the treatment of CD patients, EcN strains were constructed which were able to produce human alpha-defensin 5 (HD5) or beta-defensin 2 (HBD2). For that purpose codon-optimized defensin genes encoding either the proform with the signal sequence or the mature form of human alpha defensin 5 (HD5) or the gene encoding HBD2 with or without the signal sequence were cloned in an expression vector plasmid under the control of the T7 promoter. Synthesis of the encoded defensins was shown by Western blots after induction of expression and lysis of the recombinant EcN strains. Recombinant mature HBD2 with an N-terminal His-tag could be purified by Ni-column chromatography and showed antimicrobial activity against E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Listeria monocytogenes. In a second approach, that part of the HBD2-gene which encodes mature HBD2 was fused with yebF gene. The resulting fusion protein YebFMHBD2 was secreted from the encoding EcN mutant strain after induction of expression. Presence of YebFMHBD2 in the medium was not the result of leakage from the bacterial cells, as demonstrated in the spent culture supernatant by Western blots specific for ß-galactosidase and maltose-binding protein. The dialyzed and concentrated culture supernatant inhibited the growth of E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Listeria monocytogenes in radial diffusion assays as well as in liquid coculture. This demonstrates EcN to be a suitable probiotic E. coli strain for the production of certain defensins.

Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) reguliert den Blutdruck und den Wasser- und Elektrolythaushalt des Körpers. Angiotensin II (Ang II), das aktive Peptid des RAAS, bewirkt eine Vasokonstriktion und in höheren Konzentrationen Bluthochdruck. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass eine Verbindung zwischen Hypertonie und dem gehäuften Auftreten von Krebs besteht. Eine Metaanalyse von 13 Fall-Kontroll-Studien konnte einen Zusammenhang zwischen Hypertonie und einem erhöhten Risiko, an einem Nierenzellkarzinom zu erkranken nachweisen. In vitro-Studien und Studien an der isolierten Niere konnten bereits genotoxische Effekte des blutdruckregulierenden Hormons Ang II zeigen. Zielsetzung dieser Arbeit war es, zunächst in vivo zu prüfen, ob steigende Ang II-Konzentrationen einen Einfluss auf die genomische Stabilität von Nieren- und Herzzellen besitzen. Hierzu wurden im Dosisversuch männliche C57BL/6-Mäuse mit osmotischen Minipumpen ausgestattet, die Ang II in vier verschiedenen Konzentrationen zwischen 60 ng/kg min und 1 µg/kg min über einen Zeitraum von 28 Tagen abgeben sollten. Während des Versuchszeitraums fanden regelmäßige, nicht-invasive Blutdruckmessungen an der Maus statt. Die Behandlung mit Ang II führte zu einem signifikanten Anstieg des Blutdrucks und zu histopathologischen Veränderungen der Glomeruli und des Tubulussystems, was sich in einer verschlechterten Albumin-Ausscheidung wiederspiegelte. Außerdem induzierte die Behandlung mit Ang II die dosisabhängige Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, DNA-Doppelstrangbrüchen und oxidativer DNA-Schäden. Diese Parameter waren bereits in Tieren erhöht, die keinen Bluthochdruck entwickelten und stiegen mit der höchsten Ang II-Konzentration noch an, obwohl hier im Vergleich zur Vorgängergruppe, die eine geringere Ang II-Konzentration erhielt, kein höherer Blutdruck vorlag. Diese Beobachtung deutet auf eine mögliche Unabhängigkeit des entstandenen Schadens vom Bluthochdruck hin und lenkt die Aufmerksamkeit auf Ang II als genomschädigenden Faktor. Der folgende Interventionsversuch sollte Aufschluss über die mögliche blutdruckunabhängige genomschädigende Wirkung von Ang II geben. Dazu wurden C57BL/6-Mäuse neben der Ang II-Behandlung in einer Konzentration von 600 ng/kg min zusätzlich über einen Zeitraum von 28 Tagen mit 5 verschiedenen Substanzen behandelt: Candesartan, Ramipril, Hydralazin, Eplerenon und Tempol. Candesartan ist ein Ang II-Rezeptor-Antagonist, der selektiv den AT1-Rezeptor blockiert. Ramipril wirkt als Hemmer des Angiotensin-Konversions-Enzyms und verhindert die Bildung von endogenem Ang II aus Ang I. Hydralazin, als Vasodilatator, greift nicht in das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System ein. Eplerenon blockiert als selektiver Aldosteronantagonist den Mineralkortikoidrezeptor. Tempol wirkt als Antioxidans. Die Behandlung mit Ang II in einer Konzentration von 600 ng/kg min im Interventionsversuch führte zur Hochregulierung der NADPH-Oxidase 4 und zur Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in der Niere und im kardiovaskulären Gewebe. Der entstandene oxidative Stress führte wiederum zu DNA-Schäden und einer Aktivierung der Transkriptionsfaktoren Nrf2 und NF-B. Nrf2-vermittelt wurde die Induktion antioxidativer Gene ausgelöst, was allerdings nicht ausreichend war, um vor Ang II-induzierten ROS und DNA-Schäden zu schützen. Eine längerfristige NF-B-Aktivierung durch hohe Ang II-Spiegel kann das Überleben und die Proliferation von Zellen, die DNA-Schäden in Form von Doppelstrangbrüchen tragen, fördern, was eine Tumor-initiierende Wirkung haben könnte. Die beschriebenen Effekte erhöhter Ang II-Spiegel konnten durch die Intervention mit dem AT1-Rezeptorblocker Candesartan verhindert werden, was die Beteiligung des Rezeptors nachweist. Eine blutdruckunabhängige, genomschädigende Wirkung von Ang II konnte leider durch die Intervention mit Hydralazin nicht verdeutlicht werden, da die erwünschte langfristige Blutdrucksenkung ausblieb. Allerdings zeigte die Intervention mit Tempol eine Abnahme an oxidativem Stress und DNA-Schäden trotz ausbleibender Blutdrucksenkung. Die Bedeutung von ROS in der Bildung von DNA-Schäden und die Unabhängigkeit dieser Schäden vom Blutdruck konnten somit hervorgehoben werden. Die Tatsache, dass die Intervention mit Ramipril den Blutdruck nicht senken konnte, der oxidative Stress und die DNA-Schäden durch mögliche antioxidative Eigenschaften aber vermindert wurden, unterstützt diese Beobachtung. Die Intervention mit Eplerenon führte zum Teil zu einer Verminderung an ROS und DNA-Schäden, brachte diese Parameter aber nicht auf Kontrollniveau zurück. Somit ist eine Beteiligung von Aldosteron nicht auszuschließen. / The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) regulates blood pressure, water balance and electrolyte metabolism. Angiotensin II (Ang II), the reactive peptide of RAAS, causes vasoconstriction and, in higher concentrations, increased blood pressure. Epidemiological studies found an increased cancer incidence in hypertensive patients. A meta-analysis of 13 longitudinal studies revealed a connection between hypertension and a higher risk to develop kidney cancer. In vitro studies and studies of the isolated mouse kidney already showed genotoxic effects of Ang II. First, the aim of the study was to investigate in vivo the effect of increasing concentrations of Ang II on the genomic stability of kidney and heart cells. Therefore, male C57/BL6 mice were equipped with osmotic mini pumps, delivering Ang II in four different concentrations between 60 ng/kg min and 1 µg/kg min during 28 days. During the 4 weeks blood pressure was measured non-invasively. Treatment with Ang II raised the blood pressure significantly and led to histopathological changes of glomeruli and tubuli, reflecting an impaired albumin-excretion. Furthermore, the formation of reactive oxygen species (ROS), DNA double strand breaks and oxidative DNA damage was induced dose-dependently by Ang II. These parameters were already increased in animals with normal blood pressure and were further increased by the highest Ang II concentration, although blood pressure was not higher than in the precursor group, which received less Ang II. These observations might hint to a possible independency of the Ang II-induced damage from the blood pressure, focusing on Ang II as the genotoxic substance. The following intervention experiment was conducted to investigate the possible blood pressure independent genotoxic effects of Ang II. Besides the treatment with Ang II in a concentration of 600 ng/kg min, C57BL/6 mice were additionally treated with 5 different interventions: candesartan, an AT1 receptor antagonist, ramipril, a angiotensin-converting-enzyme blocker, hydralazine, a vasodilator, eplerenone, a mineralocorticoid receptor blocker and tempol, an antioxidant. In the intervention experiment, Ang II treatment in a concentration of 600 ng/kg min caused an up-regulation of NOX 4 resulting in the production of ROS in the kidney and heart. The oxidative stress led to the formation of DNA damage and to an activation of the transcription factors Nrf2 and NF-B. The induction of Nrf2 was accompanied by up-regulation of antioxidative enzymes, which, however, were not able to defend against ROS-production and DNA damage. A long-term activation of NF-B by high Ang II levels can promote the survival and proliferation of cells with DNA damage in form of DNA double strand breaks, probably initiating carcinogenesis. The AT1 receptor blocker candesartan could prevent the Ang II-induced damage, demonstrating the involvement of the Ang II receptor. The intervention with hydralazine failed to show a genotoxic effect of Ang II independent of the blood pressure, since a long-term decrease of blood pressure was missing. However, despite of the high blood pressure, the intervention with tempol was able to prevent oxidative stress and DNA-damage. The importance of ROS in the formation of DNA damage and an independency of this damage from the increased blood pressure was shown. The fact that, although not lowering blood pressure, ramipril was able to reduce oxidative stress and DNA damage by possible antioxidative properties, supported this observation. Eplerenone led to slight decrease in ROS and DNA damage showing the possible involvement of aldosterone. Ang II contributes to damage detected in the kidney and in the heart during high blood pressure, probably initiating cancer. The involvement of ROS for the formation of DNA damage and the independency of this damage from the increased blood pressure was shown by the effects of the antioxidant tempol. We could demonstrate that the importance of an AT1 receptor antagonist in the treatment of high blood pressure plays a leading role. Compared to other antihypertensive therapies, treatment with a sartan is the best option. Starting at an early stage with this therapy, a long-term damage, induced by Ang II, could be avoided.

Fanconi anemia (FA) is an autosomal recessive or X-chromosomal inherited disorder, which is not only phenotypically but also genotypically very heterogeneous. While its hallmark feature is progressive bone marrow failure, many yet not all patients suffer additionally from typical congenital malformations like radial ray defects and growth retardation. In young adulthood the cumulative risk for developing hematological or other malignancies is compared to the general population several hundred-fold increased. The underlying molecular defect is the deficiency of DNA interstrand crosslink (ICL) repair. ICLs are deleterious lesions, which interfere with crucial cellular processes like transcription and replication and thereby can lead to malignant transformation, premature senescence or cell death. To overcome this threat evolution developed a highly complex network of interacting DNA repair pathways, which is conserved completely only in vertebrates. The so called FA/BRCA DNA damage response pathway is able to recognize ICLs on stalled replication forks and promotes their repair through homologous recombination (HR). Today we know 15 FA genes (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O and -P) whose products are involved in this pathway. Although more than 80% of FA patients carry biallelic mutations in either FANCA, FANCC or FANCG, there are still some who cannot be assigned to any of the known complementation groups. This work aimed to indentify the di¬sease causing mutations in a cohort of those unassigned patients. Initial screens of the candidate genes FAN1, MHF1 and MHF2 did not reveal any pathogenic alterations. Moreover, FAN1 could be excluded as FA candidate gene because patients carrying a homozygous microdeletion including the FAN1 locus did not show a phenotype comparable to FA patients. In the case of MHF1 and MHF2 the reason for the negative screening result is not clear. Mutation carriers might be rare or, regarding the diverse and also FA pathway independent protein functions, phenotypically not comparable to FA patients. Nevertheless, this study contri¬buted to the identification and characterization of the most recent members of the FA pathway - RAD51C (FANCO), SLX4 (FANCP) and XPF (FANCQ). FANCO is one of the RAD51 paralogs and is involved in crucial steps of HR. But since the only reported FA-O patient has so far not developed any hematological anomalies, FANCO is tentatively designated as gene underlying an FA-like disorder. In contrast, patients carrying biallelic mutations in FANCP do not only show hematological anomalies, but as well congenital malformations typical for FA. The distinct role of FANCP in the FA pathway could not be determined, but it is most likely the coordination of structure-specific nucleases during ICL excision. One of these nucleases is the heterodimer XPF/ERCC1. XPF is probably disease causing in the complementation group FA-Q and is the first FA gene, which was identified by Next Generation Sequencing (NGS). Extraordinarily is that mutations in this gene had previously been reported to cause two other disorders, xeroderma pigmentosum and segmental progeria. Despite some overlaps, it was shown that the divergent phenotypes could clearly be distinguished and are caused by distinct functional defects of XPF. Additionally, this work aimed to improve and accelerate the genotyping process of FA patients in general. Therefore, classical approaches should be complemented or fully replaced by approa¬ches using NGS. Massively parallel sequencing of the whole exome proved to be most appro¬priate and the establishment of an FA-specific analysis pipeline facilitated improved molecular diagnostics by combining complementation group assignment and mutation analysis in one step. Consequently two NGS studies revealed the pathogenic defect in several previously unassigned FA patients and thereby added another patient to one of the most recent subtypes, FA-P. In summary, this work contributed not only to further completion of the FA/BRCA DNA repair network by adding three novel genes, it also showed that classical molecular approaches for re¬search as well as for diagnostics could be replaced by NGS. / Die Fanconi Anämie (FA) ist eine autosomal rezessiv oder X-chromosomal vererbte Erkrankung, deren charakteristisches diagnostisches Merkmal das progressive Versagen des Knochenmarks darstellt. Viele, jedoch nicht alle Patienten leiden zusätzlich an kongenitalen Fehlbildungen, wie Radialstrahl-Anomalien oder Minderwuchs. Im Vergleich zur normalen Bevölkerung steigt zu¬dem im jungen Erwachsenenalter das Risiko für hämatologische und auch solide Tumoren um ein Vielfaches. Verantwortlich hierfür ist sehr wahrscheinlich der zugrunde liegende Defekt in der Reparatur von DNA-Interstrang-Quervernetzungen. Diese Art der Läsion blockiert wich¬tige zelluläre Prozesse wie Transkription und Replikation, und kann daher nicht nur zur Ent¬artung oder vorzeitigen Alterung der Zellen, sondern auch zu stark erhöhten Apoptose-Raten führen. Zur Entfernung dieser Quervernetzungen hat die Evolution ein komplexes Netzwerk an verschiedenen Reparaturwegen hervorgebracht, das nur in Vertebraten vollständig konserviert ist. Der sogenannte FA/BRCA-Reparaturweg ist in der Lage Quervernetzungen an stagnierten Replikationsgabeln zu erkennen und zu entfernen. Heute kennen wir 15 Gene (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O und -P), deren Produkte in diesem Weg involviert sind und deren pathogene Veränderung zur Ausprägung des FA-Phänotyps führen. Rund 80% aller Fälle können durch biallelische Mutationen in FANCA, FANCC und FANCG erklärt werden. Pa¬thogene Varianten in anderen Genen werden weitaus seltener gefunden und ein kleiner Anteil der Patienten kann keiner der bekannten Komplementationsgruppen zugeordnet werden. Das Ziel dieser Arbeit war es, den ursächlichen genetischen Defekt in diesen Patienten aufzudecken. Untersuchungen an den Kandidatengenen FAN1, MHF1 und MHF2 konnten keine pathoge¬nen Veränderungen identifizieren. FAN1 konnte darüber hinaus gänzlich als Kandidatengen aus¬geschlossen werden, da Patienten mit einer homozygoten FAN1-Deletion keinen FA-Phänotyp zeigten. Im Fall von MHF1 und MHF2 sind Mutationsträger wahrscheinlich sehr selten oder unterscheiden sich in ihrem Phänotyp von den bisher bekannten FA Patienten. Nichtsdestotrotz trug diese Arbeit maßgeblich zur Aufklärung der genetischen Ursache in den Untergruppen FA-O, FA-P und FA-Q bei. Ursächlich für den Subtyp FA-O sind biallelische Mutationen in RAD51C, einem Paralog der Rekombinase RAD51, mit offenbar entscheidender Funktion in der homolo¬gen Rekombinationsreparatur. Da der einzige bislang beschriebene Patient zum Zeitpunkt der Veröffentlichung zwar charakteristische Fehlbildungen, aber weder hämatologische Auffälligkei¬ten, noch maligne Veränderungen zeigte, wird RAD51C (FANCO) bisher als zugrunde liegendes Gen einer FA-ähnlichen Krankheit bezeichnet. Bei der Identifizierung von SLX4 als ursächliches Gen der Untergruppe FA-P gab es hingegen keine Zweifel; alle Patienten zeigten einen sehr ty¬pischen Phänotyp. SLX4 (FANCP) scheint eine entscheidende Rolle bei der Exzision von DNA-Quervernetzungen zu spielen, indem es die Funktion oder richtige Positionierung von Struktur-spezifischen Nukleasen koordiniert. Eine dieser Nukleasen ist das Heterodimer XPF/ERCC1. XPF liegt wahrscheinlich der Komplementationsgruppe FA-Q zugrunde und ist das erste FA-Gen, das mittels Next Generation Sequencing (NGS) identifiziert wurde. Interessanterweise wurde es zuvor bereits als genetische Ursache von Xeroderma pigmentosum und segmentärer Progerie beschrieben. Diese Studie konnte jedoch belegen, dass die jeweiligen Mutationen die Proteinfunktion derart unterschiedlich beeinflussen, dass es tatsächlich zur Ausprägung von drei divergenten Phänotypen kommen kann. Neben der Kandidatengensuche war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Implementierung neuer Techniken für die FA-Genotypisierung. Klassische Methoden der Molekulargenetik sollten hier¬für durch Anwendungen des NGS ergänzt oder gänzlich ersetzt werden. Die Hochdurchsatz- Sequenzierung des gesamten Exoms erwies sich als geeignet und kann Komplementationsgrup¬pen-Zuordnung und Mutationsanalyse in einem Schritt vereinen. Durch die Etablierung einer FA-spezifischen bioinformatischen Datenanalyse konnte im Rahmen dieser Arbeit der genetische Defekt bereits mehrerer Patienten aufgeklärt werden. Im Besonderen konnte ein weiterer Patient der neuen, noch wenig charakterisierten Untergruppe FA-P zugeordnet werden. Insgesamt trug diese Arbeit also nicht nur zur weiteren Vervollständigung des FA/BRCA-Re-paraturweges bei, indem drei neue FA-Gene hinzugefügt wurden; sie zeigte außerdem, dass klas¬sische Methoden der Molekulargenetik sowohl in Forschung als auch Diagnostik künftig durch das NGS ersetzt werden könnten.