Die Aktivität von Biooligomeren wird wesentlich beeinflusst von deren molekularer Struktur bzw. Konformation. Eine Einflussnahme auf die Struktur sollte deswegen auch mit einer Aktivitätsveränderung einhergehen, ein „Schalten“ von Struktur somit ein „Schalten“ von Aktivität nach sich ziehen. Alanyl-PNA ist ein Oligopeptid alternierender Konfiguration mit Nukleobasen in β-Position der Alanyl-Einheiten, das durch Wasserstoffbrückenbildung und π-Stacking mit einem komplementären Strang Paarungsduplexe mit β-faltblattartiger linearer Struktur eingeht. Der Einbau eines Alanyl-PNA-Stranges in ein Peptid oder Protein und Zugabe des korrespondierenden Gegenstranges sollte zu einer lokalen Induktion eines β-Faltblattes führen und strukturelle Veränderungen im Gesamtpeptid hervorrufen. Es kann dann von einem molekularen Schalter gesprochen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine vom cyclischen Peptidantibiotikum Gramicidin S abgeleitete 18mer-Peptid-Alanyl-PNA-Chimäre 20 mit eingebautem Alanyl-PNA-Pentamer dargestellt. Es konnte mittels temperaturabhängiger UV-Spektroskopie gezeigt werden, dass sich bei Zugabe des komplementären Gegenstranges nichtkovalente Duplexe bilden. CD-spektroskopische Untersuchungen dieses Dimers lieferten keine eindeutigen Beweise für das vorliegen eines β-Faltblattes. Es konnte anhand des humanen Interleukins 8 gezeigt werden, dass der Einbau von Alanyl-PNA durch die Technik der native chemical ligation in größere Peptide möglich ist. Hierfür wurde der N-terminale Thioester 31 des humanen Interleukins hIL8(1-55) durch Expression des Fusionsproteines in E.coli und Expressed Protein Ligation dargestellt. Nach Umsetzung des Thioesters 31 mit einem Alanyl-PNA-Peptid-Hybrid 29, das N-terminal mit einem freien Cystein substituiert ist, wurde durch native chemical ligation ein von dem humanen Interleukin 8 abgeleitetes 77 Aminosäuren enthaltendes Peptid 30 mit eingebauter Alanyl-PNA erhalten. Darüber hinaus wurden mit keinem, einem oder zwei Lysinen substituierte Alanyl-PNA-Hexamere dargestellt und Strukturuntersuchungen unterworfen. Es konnte mittels temperaturabhängiger UV-Spektroskopie gezeigt werden, dass der Einbau zweier Lysine sowohl die Löslichkeit als auch die Bildungskinetik verändert, die Stabilität (Tm-Wert) der Duplexe jedoch unverändert lässt. Diese Hexamere wurden Kristallisationsversuchen unterworfen, bisher konnten noch keine Kristalle erhalten werden. Basierend auf den im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnissen sollte es in Zukunft darüber hinaus möglich sein, genaueren Aufschluss über die Struktur von Alanyl-PNA zu erhalten. Die Erhöhung der Löslichkeit von Alanyl-PNA durch Einbau zweier Lysine ermöglicht nicht nur weitere Kristallisationsversuche, sondern man gelangt auch in Konzentrationsbereiche, in denen NMR-Untersuchungen an Alanyl-PNA möglich werden, die bisher aufgrund zu schlechter Löslichkeit zu keinen zufrieden stellenden Ergebnissen geführt haben. Durch weitere Optimierung der native chemical ligation und Bereitstellung größerer Mengen von Interleukin 8 Derivaten mit eingebauter Alanyl-PNA sollte es in Zukunft möglich sein, den Einfluss des komplementären Alanyl-PNA-Stranges auf die Struktur des Gesamtsystems und dessen biologischer Aktivität zu untersuchen. Durch Variation und Optimierung der Sequenz und des örtlichen Einbaus der Alanyl-PNA kann so vielleicht das Fernziel eines molekularen strukturellen Schalters für Peptide bzw. Proteine erreicht werden. Ebenso ist es denkbar, dass durch den Einbau von Alanyl-PNA in zwei verschiedene Peptide bzw. Proteine nichtkovalente Protein-Protein-Komplexe erhalten werden können. / Activity and properties of biooligomers depend mainly on their molecular structure and conformation. Changing structure causes also a change of activity. Therefore, “switching” structure results in “switching” activity. Alanyl-PNA is an oligopeptide consisting of amino acids with alternating configuration with nucleobases attached to the β-position of an alanyl unit. Addition of a complementary peptide strand induces a β-sheet like conformation in the backbone of the duplex by hydrogen bonding and π-stacking . Incorporation of alanyl-PNA into a peptide or protein and addition of a complementary sequence should induce a β-sheet like structure and produce structural changes in the entire system. For this effect the term molecular switch can be used. In this work a peptide-alanyl-PNA chimera 20 consisting of a sequence of 18 amino acids, which was derived from the cyclic antibiotic Gramicidin S, has been synthesized. It contained a terminal alanyl-PNA pentamere. Using temperature dependent UV-spectroscopy it could be proven that addition of the complementary strand led to noncovalent duplexes. Investigations by CD-spectroscopy did not give clear evidence for the existence of a β-sheet. To accomplish the incorporation of alanyl-PNA into larger peptides the techique native chemical ligation has been applied. Alanyl-PNA has been incorporated into the 77 amino acids containing peptide human interleukine 8 (hIL8). The N-terminal thioester hIL8(1-55) 31 was expressed by a fusion-protein in E.coli and worked up by Expressed Protein Ligation. After reaction of the thioester 31 with an alanyl-PNA-peptide hybrid 29, N-terminally substituted with a free cysteine, a new analogue 30 of hIL-8 could be obtained by native chemical ligation. Furthermore, alanyl-PNA hexamers containing up to two lysines have been synthesized and subjected to structural examinations. Using temperature dependent UV-spectroscopy it could be shown that the incorporation of two lysines not only increased the solubility of the oligomers substantially but also had strong influence on the kinetics of the duplex formation, whereas the stability of the pairing complex (defined by the Tm value) did not change. Attempts to crystallize these hexamers have not been successful up to the present. On the basis of these results it should be possible to obtain in the future more detailed information about the structure of alanyl-PNA. Due to the poor solubility, previous NMR examinations did not give satisfying results. The increase in solubility by addition of a second lysine to alanyl-PNA will allow in future further crystallisation experiments and more promising NMR investigations. By optimization of the native chemical ligation and supply of larger amounts of interleukine 8 derivatives with incorporated alanyl-PNA it should be possible to examine the influence of a complementary alanyl-PNA strand on the structure of the entire system and its biological activity. By variation and optimization of the sequence and the local incorporation of alanyl-PNA moieties the objective of a molecular switch for peptides and proteins might be reached. The incorporation of alanyl-PNA into two different peptides or proteins might also result in the formation of noncovalent protein-protein-complexes mediated by hydrogen bonding.

Biodiversity may be investigated and explored by the means of genetic sequence information and molecular phylogenetics. Yet, with ribosomal genes, information for phylogenetic studies may not only be retained from the primary sequence, but also from the secondary structure. Software that is able to cope with two dimensional data and designed to answer taxonomic questions has been recently developed and published as a new scientific pipeline. This thesis is concerned with expanding this pipeline by a tool that facialiates the annotation of a ribosomal region, namely the ITS2. We were also able to show that this states a crucial step for secondary structure phylogenetics and for data allocation of the ITS2-database. This resulting freely available tool determines high quality annotations. In a further study, the complete phylogenetic pipeline has been evaluated on a theoretical basis in a comprehensive simulation study. We were able to show that both, the accuracy and the robustness of phylogenetic trees are largely improved by the approach. The second major part of this thesis concentrates on case studies that applied this pipeline to resolve questions in taxonomy and ecology. We were able to determine several independent phylogenies within the green algae that further corroborate the idea that secondary structures improve the obtainable phylogenetic signal, but now from a biological perspective. This approach was applicable in studies on the species and genus level, but due to the conservation of the secondary structure also for investigations on the deeper level of taxonomy. An additional case study with blue butterflies indicates that this approach is not restricted to plants, but may also be used for metazoan phylogenies. The importance of high quality phylogenetic trees is indicated by two ecological studies that have been conducted. By integrating secondary structure phylogenetics, we were able to answer questions about the evolution of ant-plant interactions and of communities of bacteria residing on different plant tissues. Finally, we speculate how phylogenetic methods with RNA may be further enhanced by integration of the third dimension. This has been a speculative idea that was supplemented with a small phylogenetic example, however it shows that the great potential of structural phylogenetics has not been fully exploited yet. Altogether, this thesis comprises aspects of several different biological disciplines, which are evolutionary biology and biodiversity research, community and invasion ecology as well as molecular and structural biology. Further, it is complemented by statistical approaches and development of informatical software. All these different research areas are combined by the means of bioinformatics as the central connective link into one comprehensive thesis. / Biologische Diversität kann mit Hilfe molekularer Sequenzinformation und phylogenetischen Methoden erforscht und erfasst werden. Bei ribosomalen Genen kann man jedoch wertvolle Information nicht nur aus der Primärsequenz beziehen, sondern auch aus der Sekundärstruktur. In den letzen Jahren wurde Software entwickelt, die solche Daten für taxonomische Fragestellung verwerten kann. Diese Arbeit beschäftigt sich mit einer Erweiterung dieser Methodik durch eine Software-Anwendung, die die Annotation des ribosomalen Genes ITS2 deutlich vereinfacht. Mit dieser Studie konnten wir zeigen, dass dies einen entscheidenden Schritt der Sequenz-Struktur-Phylogenie und der Datenerfassung der ITS2-Datenbank darstellt. Die daraus resultierende und frei verfügbare Anwendung ermöglicht Annotationen von hoher Güte. In einer weiteren Studie wurde mittels Simulationen der gesamte Arbeitsfluß der Sequenz-Struktur Phylogenie auf theoretischer Ebene evaluiert. Dabei zeigte sich, dass sich sowohl die Genauigkeit, als auch die Robustheit von phylogenetischen Stammbäumen durch diesen Ansatz deutlich verbessern. Der zweite große Teil der Arbeit befasst sich mit Fallbeispielen, in denen dieser Arbeitsfluß zur Aufklärung von taxomonischen and ökologischen Fragestellungen Anwendung fand. In diesem Rahmen konnten wir mehrere und voneinander unabhängige Phylogenien ermitteln, welche die theoretischen Ergebnisse einer Verbesserung phylogenetischer Bäume auch von biologischer Seite aus bekräftigen. Der Ansatz war anwendbar in sehr feinskaligen Studien auf Art bzw. Gattungsniveau, aber durch die starke Konservierung der Sekundärstruktur auch an sehr weit von einander entfernten taxonomischen Gruppen. Eine weitere Studie, die sich mit der Phylogenie von Bläulingen befasst, zeigt deutlich, dass dieser Ansatz nicht nur für Fragestellungen bei Pflanzen, sondern auch im Tierreich angewandt werden kann. Die Bedeutung von qualitativ hochwertigen Stammbäumen auch für andere Fachbereiche wird an zwei unserer ökologischen Studien deutlich: Mit Hinzunahme von Sekundärstruktur war es uns möglich Fragestellungen über die Evolution von Ameisen-Pflanzen Interaktionen sowie über ökologische Gemeinschaften von Bakterien auf verschiedenen Pflanzenteilen zu beantworten. Zuletzt gehen wir spekulativ auf die Frage ein, wie Strukturphylogenie um die dritte Dimension erweitert werden kann. Dies bleibt zwar spekulativ und wurde nur um ein kleines Fallbeispiel ergänzt, jedoch zeigt sich deutlich, dass das Potential von Strukturphylogenie noch nicht erschöpft ist. Insgesamt befasst sich diese Arbeit mit Aspekten aus verschiedenen biologischen Disziplinen: Evolutionsbiologie und Biodiversitätsforschung, sowie Gemeinschafts- und Invasionsökologie, aber auch Molekular- und Strukturbiologie. Dies wurde ergänzt durch statistische Ansätze und Entwicklung von informatischer Software. Diese verschiedenen Forschungsrichtungen wurden mit Hilfe der Bioinformatik als zentrales Bindeglied vereint.

Background: RNA secondary structure prediction by energy minimization is the central computational tool for the analysis of structural non-coding RNAs and their interactions. Sparsification has been successfully applied to improve the time efficiency of various structure prediction algorithms while guaranteeing the same result; however, for many such folding problems, space efficiency is of even greater concern, particularly for long RNA sequences. So far, spaceefficient sparsified RNA folding with fold reconstruction was solved only for simple base-pair-based pseudo-energy models. Results: Here, we revisit the problem of space-efficient free energy minimization. Whereas the space-efficient minimization of the free energy has been sketched before, the reconstruction of the optimum structure has not even been discussed. We show that this reconstruction is not possible in trivial extension of the method for simple energy models. Then, we present the time- and space-efficient sparsified free energy minimization algorithm SparseMFEFold that guarantees MFE structure prediction. In particular, this novel algorithm provides efficient fold reconstruction based on dynamically garbage-collected trace arrows. The complexity of our algorithm depends on two parameters, the number of candidates Z and the number of trace arrows T; both are bounded by n2, but are typically much smaller. The time complexity of RNA folding is reduced from O(n3) to O(n2 + nZ); the space complexity, from O(n2) to O(n + T + Z). Our empirical results show more than 80 % space savings over RNAfold [Vienna RNA package] on the long RNAs from the RNA STRAND database (≥2500 bases). Conclusions: The presented technique is intentionally generalizable to complex prediction algorithms; due to their high space demands, algorithms like pseudoknot prediction and RNA–RNA-interaction prediction are expected to profit even stronger than \"standard\" MFE folding. SparseMFEFold is free software, available at http://www.bioinf.unileipzig. de/~will/Software/SparseMFEFold.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Thema Evolutionäre Algorithmen und deren Verwendung für Optimierungsaufgaben. Im ersten Teil der Arbeit werden die theoretischen Grundlagen ausführlich dargelegt, die zum Verständnis der Problemstellung und der vorgeschlagenen Lösungsmöglichkeiten notwendig sind. Dazu gehören die Einführung des Konzeptes von Fitneßlandschaften, deren Eigenschaften sowie die kurze Darstellung bekannter stochastischer Optimierungsverfahren wie z.B. Simulated Annealing. Im Anschluß daran wird auf neue Verfahren - insbesondere gemischte Strategien - eingegangen und diese vergleichend gegenüber den herkömmlichen Verfahren abgegrenzt. Die neu entwickelten Verfahren werden an Modellproblemen getestet, welche im zweiten Teil der Arbeit vorgestellt werden. Verwendet wurden sowohl einfache theoretische Modelle wie Frustrierte Periodische Sequenzen als auch praktisch relevante Probleme wie das der RNA Sekundärstrukturen. Die verschiedenen Modellprobleme werden bezüglich ihrer Eigenschaften und Schwierigkeitsgrade untersucht und miteinander verglichen, um die Effizienz der verwendeten Optimierungsverfahren abschätzen zu können. Der dritte Teil der Arbeit präsentiert wichtige Ergebnisse der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten umfangreichen numerischen Simulationen. Es wird demonstriert, wie sensitiv die Optimierungsergebnisse von den verwendeten Parametern der Algorithmen (wie z.B. Ensemblegröße, Temperatur oder Mutationsrate) abhängen und das ein relativ scharf umrissenes evolutionäres Fenster der Parameter existiert, innerhalb dessen die Optimierungsresultate deutlich besser sind. Eine im Rahmen dieser Arbeit entwickelte adaptive Parametersteuerung wird an den im zweiten Teil vorgestellten Modellproblemen getestet und gezeigt, daß es möglich ist, den Optimierungsprozeß automatisch innerhalb des evolutionären Fensters zu halten. Der letzte Teil gibt Einblick in die im Rahmen dieser Arbeit verwendete Computer-Software und das vom Autor entwickelte Programmpaket. Es wird hervorgehoben, daß die in C++ objektorientiert und modular geschriebene Software leicht an andere Optimierungsaufgaben angepaßt werden kann und dank graphischer Benutzeroberfläche auch einfach zu bedienen ist. / This work explores Evolutionary Algorithms and their application to optimization tasks. The work's first part gives detailed theoretical background information necessary to understand the problem and proposed solutions. This theoretical part includes the introduction of fitness landscapes, the investigation of their properties, and it briefly reiterates well known stochastic optimization strategies like Simulated Annealing. Finally, new strategies, in particular mixed stategies, are introduced and compared to traditional optimization techniques. In the second part of this work, the newly developed strategies are benchmarked using model problems such as 'Frustrated Periodic Sequences', or the analysis of RNA secondary structures. To evaluate the efficiency of different optimization strategies, the introduced model problems are compared with respect to their difficulty level. The third part of this work presents results of extensive numerical simulations demonstrating how sensitive the investigated algorithms depend on their respective control parameters (ensemble size, temperature, mutation rate). It is shown that there is always a distinct parameter window, the so-called evolutionary window, that clearly leads to improved optimization results. Going back to the model problems introduced in part two, a newly developed adaptive parameter control is presented that automatically keeps the optimization algorithm's parameters within the evolutionary window. In the final part of this work not only the software used, but also the software newly developed by this work's author is illuminated. It is emphasized that the new software was designed highly flexible to allow for easy adaptation to different optimization problems. A graphical user interface is provided for convenience.

Background: RNA secondary structure prediction by energy minimization is the central computational tool for the analysis of structural non-coding RNAs and their interactions. Sparsification has been successfully applied to improve the time efficiency of various structure prediction algorithms while guaranteeing the same result; however, for many such folding problems, space efficiency is of even greater concern, particularly for long RNA sequences. So far, spaceefficient sparsified RNA folding with fold reconstruction was solved only for simple base-pair-based pseudo-energy models. Results: Here, we revisit the problem of space-efficient free energy minimization. Whereas the space-efficient minimization of the free energy has been sketched before, the reconstruction of the optimum structure has not even been discussed. We show that this reconstruction is not possible in trivial extension of the method for simple energy models. Then, we present the time- and space-efficient sparsified free energy minimization algorithm SparseMFEFold that guarantees MFE structure prediction. In particular, this novel algorithm provides efficient fold reconstruction based on dynamically garbage-collected trace arrows. The complexity of our algorithm depends on two parameters, the number of candidates Z and the number of trace arrows T; both are bounded by n2, but are typically much smaller. The time complexity of RNA folding is reduced from O(n3) to O(n2 + nZ); the space complexity, from O(n2) to O(n + T + Z). Our empirical results show more than 80 % space savings over RNAfold [Vienna RNA package] on the long RNAs from the RNA STRAND database (≥2500 bases). Conclusions: The presented technique is intentionally generalizable to complex prediction algorithms; due to their high space demands, algorithms like pseudoknot prediction and RNA–RNA-interaction prediction are expected to profit even stronger than \"standard\" MFE folding. SparseMFEFold is free software, available at http://www.bioinf.unileipzig. de/~will/Software/SparseMFEFold.

Innerhalb der Arthropodensystematik sind die phylogenetischen Beziehungen der höheren Crustaceataxa seit langem von besonderen Interesse. Ziel dieser Arbeit ist die Rekonstruktion der phylogenetischen Verwandtschaftsverhältnisse mit Hilfe molekularer Datensätze für die Phyllopoda, die zusammen mit den Anostraca die Branchiopoda bilden und der Astacoidea (Astacida), einer Teilgruppe der Flusskrebse. Folgende molekulare Marker kamen zum Einsatz: 1) Für die Phyllopoda: Die 3. Domäne der mitochondrial codierten 12S rRNA, unter Berücksichtigung von Sekundärtrukturinformationen, das nukleare Gen EF-1 alpha und die Positionen von Introns im Gen EF-1 alpha. 2) Für die Astacoidea: Die 3. Domäne der 12S rRNA und das mitochondrial codierte Gen cox1. Durch die Wahl der molekularen Marker, die mit unterschiedlichen computerkladistischen Methoden ausgewertet wurden, konnten für die meisten Fragen eine eindeutige und im Fall der Astacoidea überraschende phylogenetische Aussage getroffen werden. Die gewonnenen Hypothesen werden ausführlich im Licht morphologischer Hypothesen diskutiert. / The phylogenetic relationships of the higher arthropod taxa are still of special interest. Especially the interrelationships of the different Crustacea taxa have long been debated. The focus of this investigation is to make a contribution to the phylogenies of two Crustacea taxa using molecular markers: The Phyllopoda which belong together with the Anostraca to the branchiopods, and of the Astacoidea, one of the two higher crayfish taxa (Astacida). The following molecular markers were used: 1) Phyllopoda: the 3rd domain of the mitochondrial encoded 12S rRNA taking into account informations of the secondary structure, the nuclear encoded proteingene EF-1 alpha and the positions of introns found in the coding region of EF-1 alpha. 2) Astacoidea: the 3rd domain of the 12S rRNA and the mitochondrial encoded proteingene cox1. The choice of the mentioned markers in combination with different computercladistical methods allowed to give a satisfying, and in the case of the Astacoidea a more surprising answer to most addressed phylogenetic questions. The gained hypotheses are then discussed in detail in the light of morphological features and hypotheses.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der molekularen Struktur der amyloiden Aggregate von Antagonisten des Gonadotropin-Releasing Hormones (GnRH) und Analoga des Growth Hormone-Releasing Hormones (GHRH) sowie deren schrittweiser Bildung und der Inhibierung dieses Prozesses durch verschiedene Polyphenole. Die dabei erhaltenen Erkenntnisse werden genutzt, um pharmazeutisch relevante Depotformulierungen der genannten Peptide zu generieren und deren Freisetzungsverhalten zu untersuchen. Die 3D Strukturen der Peptidmonomere werden basierend auf zweidimensionalen NMR-Experimenten aufgeklärt. Zur Untersuchung der einzelnen Teilschritte der Aggregation dienen zahlreiche strukturanalytische Methoden, u.a. zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie (TCSPC), Untersuchungen mit strukturselektiven Sonden sowie TEM-Messungen. Ein Schwerpunkt liegt auf der Sekundärstrukturanalyse durch Bandenformanalyse von ATR-FTIR-Banden, um die Ausbildung der amyloid-typischen β Faltblattstrukturen detailliert zu beschreiben. Aus den Ergebnissen wird für GnRH-Antagonisten ein fibrilläres Aggregatmodell mit paralleler β Faltblattstruktur abgeleitet, dass zwei voneinander unterscheidbare β Faltblattbereiche enthält. Mithilfe einer eigens entwickelten Kongorot-Titrationsmethode wird der amyloid-aggregierte Anteil der Peptide in Gegenwart verschiedener Partnermoleküle untersucht. Dabei zeigt sich u.a., dass Poly-L-Glutamat nur eine der beiden β Faltblattstrukturen schwächen kann, wohingegen eine Gallotanninmischung aus Rhus chinensis die Amyloidbildung vollständig unterdrückt. Durch umfangreiche Arbeiten zur Trennung und Charakterisierung der polyphenolischen Komponenten der Gallotanninmischung werden Untersuchungen zu Struktur-Eigenschaftsbeziehungen ermöglicht. Unter Nutzung dieser Erkenntnisse werden pharmazeutisch relevante Formulierungen aus den Peptiden und Partnermolekülen hergestellt und mit einer speziell entwickelten Dialyse-Liberationsmethode auf ihr Freisetzungsverhalten untersucht. Da der aggregationsinhibierende Effekte der Polyphenole diffusionsbedingt schnell verloren geht, wird schließlich die Synthese von mit Polyphenolen modifizierten Chitosanen und deren erfolgreicher Einsatz zur Komplexierung der Peptide beschrieben, wodurch erstmals eine Formulierung zur Verfügung steht, welche die Aggregation des Peptidwirkstoffes verhindert und gleichsam eine kontrolliert verzögerte Freisetzung ermöglicht. / The present study addresses the molecular structure of the amyloid type aggregates of GnRH antagonists and GHRH analogs, their stepwise formation and the inhibition of this process by various polyphenols. The findings thus obtained are used to prepare pharmaceutically relevant drug delivery systems of the peptides and to study the corresponding release behavior. The 3D structure of the peptide monomers are elucidated by two-dimensional nmr experiments. Numerous structure analytical approaches are applied to obtain further insight into the partial steps of the aggregation process, e.g. TCSPC, experiments with structure selective probes and TEM. Emphasis is placed on the investigation of the secondary structure by band shape analysis of amide bands obtained by ATR-FTIR spectroscopy in order to analyze the formation of amyloid type β sheet structures. Based on the analytical results, a fibrilar aggregate model is described, which contains two distinguishable β sheet structures. Using a newly developed congored titration method, the amyloid content of the peptides is examined in the presence of various additives. Whereas poly-L-glutamate is only capable of weakening one of the two β sheet structures, a crude tannic acid mixture from Rhus chinensis may suppress the aggregate formation completely. Extensive efforts are made to enable experiments targeting the structure-activity relationships of the polyphenolic components of the tannic acid mixture. With this in mind, pharmaceutically relevant formulations of the peptides and several additives are prepared and their release properties investigated using a newly developed dialysis liberation device. Since the aggregation inhibiting effect is lost quite fast due to the diffusive loss of the polyphenolic compounds, furthermore the synthesis of chitosan, which is covalently modified with the polyphenlic components, and its successful application for the generation of drug delivery systems of the peptides is described.

En sjukdom kan många gånger härledas till en kaskadereaktion mellan proteiner, co-faktorer och substrat. Denna kaskadreaktion blir många gånger målet för att behandla sjukdomen med läkemedel. För att designa nya läkemedelsmoleyler används vanligen datorbaserade verktyg. Denna design av läkemedelsmolekyler drar stor nytta av att målproteinet är känt och då framförallt dess tredimensionella (3D) struktur. Är 3D-strukturen känd kan man utföra så kallad struktur- och datorbaserad molekyldesign, 3D-geometrin (f.f.a. för inbindningsplatsen) blir en vägledning för designen av en ny molekyl. Många faktorer avgör interaktionen mellan en molekyl och bindningsplatsen, till exempel fysikalisk-kemiska egenskaper hos molekylen och bindningsplatsen, flexibiliteten i molekylen och målproteinet, och det omgivande lösningsmedlet. För att strukturbaserad molekyldesign ska fungera väl måste två viktiga steg utföras: i) 3D anpassning av molekyler till bindningsplatsen i ett målprotein (s.k. dockning) och ii) prediktion av molekylers affinitet för bindningsplatsen. Huvudsyftena med arbetet i denna avhandling var som följer: i) skapa modeler för att prediktera affiniteten mellan en molekyl och bindningsplatsen i ett målprotein; ii) förfina molekyl-protein-geometrin som skapas vid 3D-anpassning mellan en molekyl och bindningsplatsen i ett målprotein (s.k. dockning); iii) karaktärisera proteiner och framför allt deras sekundärstruktur; iv) bedöma effekten av olika matematiska beskrivningar av lösningsmedlet för förfining av 3D molekyl-protein-geometrin skapad vid dockning och prediktion av molekylers affinitet för proteiners bindningsfickor. Ett övergripande syfte var att använda kemometriska metoder för modellering och dataanalys på de ovan nämnda punkterna. För att sammanfatta så presenterar denna avhandling metoder och resultat som är användbara för strukturbaserad molekyldesign. De rapporterade resultaten visar att det är möjligt att skapa kemometriska modeler för prediktion av molekylers affinitet för bindningsplatsen i ett protein och att dessa presterade lika bra som andra vanliga metoder. Dessutom kunde kemometriska modeller skapas för att beskriva effekten av hur inställningarna för olika parametrar i dockningsprogram påverkade den 3D molekyl-protein-geometrin som dockingsprogram skapade. Vidare kunde kemometriska modeller andvändas för att öka förståelsen för deskriptorer som beskrev sekundärstrukturen i proteiner. Förfining av molekyl-protein-geometrin skapad genom dockning gav liknande och ickesignifikanta resultat oberoende av vilken matematisk modell för lösningsmedlet som användes, förutom för ett fåtal (sex av 30) fall. Däremot visade det sig att användandet av en förfinad geometri var värdefullt för prediktion av molekylers affinitet för bindningsplatsen i ett protein. Förbättringen av prediktion av affintitet var markant då en Poisson-Boltzmann beskrivning av lösningsmedlet användes; jämfört med prediktionerna gjorda med ett dockningsprogram förbättrades korrelationen mellan beräknad affintiet och uppmätt affinitet med 0,7 (R2). / A disease is often associated with a cascade reaction pathway involving proteins, co-factors and substrates. Hence to treat the disease, elements of this pathway are often targeted using a therapeutic agent, a drug. Designing new drug molecules for use as therapeutic agents involves the application of methods collectively known as computer-aided molecular design, CAMD. When the three dimensional (3D) geometry of a macromolecular target (usually a protein) is known, structure-based CAMD is undertaken and structural information of the target guides the design of new molecules and their interactions with the binding sites in targeted proteins. Many factors influence the interactions between the designed molecules and the binding sites of the target proteins, such as the physico-chemical properties of the molecule and the binding site, the flexibility of the protein and the ligand, and the surrounding solvent. In order for structure-based CAMD to be successful, two important aspects must be considered that take the abovementioned factors into account. These are; i) 3D fitting of molecules to the binding site of the target protein (like fitting pieces of a jigsaw puzzle), and ii) predicting the affinity of molecules to the protein binding site. The main objectives of the work underlying this thesis were: to create models for predicting the affinity between a molecule and a protein binding site; to refine the geometry of the molecule-protein complex derived by or in 3D fitting (also known as docking); to characterize the proteins and their secondary structure; and to evaluate the effects of different generalized-Born (GB) and Poisson-Boltzmann (PB) implicit solvent models on the refinement of the molecule-protein complex geometry created in the docking and the prediction of the molecule-to-protein binding site affinity. A further objective was to apply chemometric methodologies for modeling and data analysis to all of the above. To summarize, this thesis presents methodologies and results applicable to structure-based CAMD. Results show that predictive chemometric models for molecule-to-protein binding site affinity could be created that yield comparable results to similar, commonly used methods. In addition, chemometric models could be created to model the effects of software settings on the molecule-protein complex geometry using software for molecule-to-binding site docking. Furthermore, the use of chemometric models provided a more profound understanding of protein secondary structure descriptors. Refining the geometry of molecule-protein complexes created through molecule-to-binding site docking gave similar results for all investigated implicit solvent models, but the geometry was significantly improved in only a few examined cases (six of 30). However, using the geometry-refined molecule-protein complexes was highly valuable for the prediction of molecule-to-binding site affinity. Indeed, using the PB solvent model it yielded improvements of 0.7 in correlation coefficients (R2) for binding affinity parameters of a set of Factor Xa protein drug molecules, relative to those obtained using the fitting software.

Den här rapporten presenterar ett antibiotikafritt, stabilt och kromosombaserat expressionssystem för läkemedelsproduktion i Escherichia coli på beställning av företaget Affibody AB. E. coli-stammen BL21(DE3) valdes som värdorganism för expressionssystemet. Systemet består av en genkassett som innehåller en T7-promotor, en 5′-UTR från genen ompA och en terminatorsekvens från RNA-operonet rrnB. Fyra kopior av genkassetten ska integreras i pseudogenerna caiB, yjjM, hsdS och yjiV. En datormodell som modellerar det egentliga kopietalet i cellerna har skapats i mjukvaran MATLAB, vilket visar att det uppskattas vara maximalt 32 kopior av genkassetten per cell på grund av replikation av kromosomen. Ett högt pH i fermentorn; att använda fed-batch och blandade kolhydratkällor; och att använda stammen BL21(DE3) minskar acetatproduktionen i cellen. En lägre acetatproduktion kan leda till en högre produkthalt. En proteinutbytesmodell för mjukvaran MATLAB har konstruerats för att uppskatta koncentrationen av Affibody®-molekylen i en E. coli cell.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung und Beschreibung der Eigenschaften der synthetischen Dekapeptide Cetrorelix und Ozarelix durch analytische Methoden und computergestützte Modellierung. Diese Moleküle sind hydrophobe, aggregierende Antagonisten des Gonadotropin-Releasing-Hormons (GnRH). Zusätzlich wurden amyloidbildende Peptidstrukturen als Modelle für die Assoziationsprozesse in hydrophoben Peptiden untersucht und visualisiert. Die intrinsische Fluoreszenz der GnRH-Antagonisten und zusätzlich der Peptide Teverelix und D-Phe6-GnRH sowie von verkürzten Fragmenten des Cetrorelix wurde untersucht. Ein Strukturmodell für die Beschreibung der Aggregation der Dekapeptide wurde erarbeitet. Der Aufbau eines Rechenclusters durch das Einbinden der Computer am Lehrstuhl in ein Linux-System zur Verteilung von Rechenprozessen über das Netzwerk ermöglichte die Bereitstellung der notwendigen Leistung zur Realisierung der Berechnungen. Es wurden Werkzeuge zur Modellierung der solvatisierten Aggregate von Peptiden ohne eindeutige Vorzugsstruktur programmiert und in ein Docking-System für beliebige Moleküle eingebunden. Verwendet wurde das Kraftfeld MMFF94 mit einer Erweiterung durch ein Verfahren zur dynamischen Berechnung von Partialladungen in Molekülstrukturen. Solvatisierte Aggregate der Dekapeptide und von bekannten amyloidbildenden Strukturen wurden modelliert (Docking). Berechnet wurden als aggregierend beschriebene Sequenzen und entsprechende Vergleichsstrukturen des Calcitonins, des Insel-Amyloid-Polypeptides, des beta2-Mikroglobulins, des Amyloid-beta-Proteins, des Lactoferrins und weitere Modellpeptide. Die wesentlichen Wechselwirkungen während der Aggregation konnten schließlich anhand von Dynamik-Simulationen der faltblattartigen Dimere des Cetrorelix und Ozarelix beschrieben werden. So wurden die Prozesse der hydrophoben Assoziation und Stabilisierung durch Wasserstoffbrücken von Peptiden veranschaulicht und auf molekularer Ebene erfolgreich analysiert. Die Visualisierung der erhaltenen Modellierungsergebnisse erfolgt durch die Darstellung der Strukturen und Dynamik-Simulationen als interaktive 3D-Modelle in einem für diese Arbeit aufgebauten Internetauftritt. / This work discusses the analysis of the aggregation properties of the gonadotropin releasing hormone antagonists Cetrorelix, Teverelix, Ozarelix and of small amyloid forming model peptides by analytical fluorescence spectroscopy and molecular modelling. A high performance linux compute cluster was developed for calculation of molecular structures. Solvated aggregate clusters of peptides without defined secondary structure were modelled by molecular mechanics methods (forcefield mmff94) in combination with an advanced charge equilibration and docking technique. Molecular dynamics of solvated peptide dimers were implemented and the role of hydrophic association and hydrogen bond formation in hydrophobic peptide aggregates was explained. Finally, an aggregation model for the directed association of hydrophobic peptides is presented. The modelling results, 3d structures and dynamic simulations are visualized in an interactive web material.