Assistierte Reproduktionstechniken (ARTs) zur Behandlung von Infertilität werden mit einer erhöhten Häufigkeit von epigenetischen Aberrationen während der Gametogenese und der frühen Embryonalentwicklung in Verbindung gebracht, speziell durch eine Beeinträchtigung von geprägten Genen. Die in vitro-Maturation (IVM) von Eizellen ist eine ART, die bereits routinemäßig zur Reproduktion von ökonomisch wertvollen Zuchttieren wie dem Hausrind (Bos taurus) eingesetzt wird. IVM-Oozyten weisen jedoch eine verringerte Entwicklungs-kompetenz zum Blastozystenstadium dar, welche möglicherweise auf eine beeinträchtigte epigenetische Regulation zurückzuführen ist. Von allen bekannten epigenetischen Mechanismen ist die DNA-Methylierung die meist untersuchte DNA-Modifikation. In dieser Arbeit wurden zur Klärung der Frage nach den Auswirkungen der IVM auf die DNA-Methylierung geprägter als auch nicht geprägter Gene Oozyten des Hausrinds analysiert. Diese Tierart weist eine ähnliche Präimplantations-entwicklung und Tragezeit wie der Mensch auf und wird daher zunehmend als Modell zum Studium der humanen Keimzell- und Embryonalentwicklung herangezogen. Im Gegensatz zu Mensch und Maus gibt es bislang nur wenig Information über bovine geprägte Gene. Das erste Ziel der hier dargestellten Forschungsarbeiten war daher die Identifizierung und Charakterisierung der bovinen differenziell methylierten Regionen (DMRs) der drei geprägten Genorte von IGF2/H19, SNRPN und PEG3, welche mit Imprintingdefekten des Menschen und/oder im Mausmodell assoziiert werden. Die hier erstmalig erfolgte Beschreibung von mehreren intergenischen DMRs mittels Bisulfitsequenzierung und Pyrosequenzierung belegt die Existenz und evolutionäre Konservierung der IGF2/H19-Imprintingkontrollregion (ICR) beim Rind. Der geprägte Zustand der IGF2/H19-ICR sowie der bovinen Gene SNRPN und PEG3 wurde durch den Nachweis differenzieller Methylierung in plazentalen und somatischen Geweben sowie in Spermien und parthenogenetischen Embryonen bestätigt. Die beobachteten Methylierungsprofile waren typisch für genomische Prägung. Die direkte Bisulfitsequenzierung nach vorangegangener Limiting Dilution (LD) erlaubt die Analyse von Methylierungsmustern einzelner Allele (DNA-Moleküle) von einigen wenigen oder auch nur einer einzigen Zelle (El Hajj et al., 2011). In einem ersten LD-Versuch an bovinen Oozyten wurden die drei vorab charakterisierten und geprägten Gene hinsichtlich möglicher epigenetischer Veränderungen untersucht, welche durch verschiedene IVM-Bedingungen und -Medien (TCM und mSOF) hervorgerufen werden könnten. Die Gesamtrate von Methylierungsfehlern einzelner CpG-Stellen sowie die von ganzen Allelen (Imprintingfehlern) unterschied sich nicht wesentlich zwischen den beiden IVM-Gruppen und der in vivo-Gruppe. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die gängigen IVM-Protokolle keinen oder nur einen geringfügigen Einfluss auf diese entscheidenden epigenetischen Markierungen haben. IVM-Oozyten präpuberaler Kälber weisen eine herabgesetzte Entwicklungskompetenz im Vergleich zu IVM-Oozyten aus adulten Tieren auf. Aus diesem Grund wurde in einem zweiten LD-Versuchsansatz die Promotormethylierung von drei entwicklungsrelevanten, nicht geprägten Genen (SLC2A1, PRDX1, ZAR1) nach ovarieller Stimulation mit FSH und/oder IGF1 untersucht. Sowohl ungereifte als auch in vitro-gereifte Oozyten präpuberaler und adulter Kühe zeigten eine deutliche, unbeeinträchtige Hypomethylierung der drei Genpromotoren ohne jegliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Alterstypen der Spendertiere oder deren Behandlung. Weder das Alter, die hormonelle Stimulation noch die IVM scheinen somit einen Einfluss auf den Methylierungsstatus dieser drei Gene zu haben. Zusammenfassend spiegelte sich die reduzierte Entwicklungsfähigkeit von IVM-Eizellen aus adulten und präpuberalen Kühen nicht in abnormalen Methylierungsmustern der untersuchten geprägten und ungeprägten Gene wider. Dies lässt auf eine generelle Stabilität der etablierten DNA-Methylierungsprofile in Oozyten schließen. Aus diesem Grund müssen andere epigenetische Mechanismen als die DNA-Methylierung wie beispielsweise ncRNAs oder Histonmodifikationen zur Reduktion der Entwicklungskompetenz von präpuberalen und IVM-Oozyten beitragen. Diese Veränderungen behindern mutmaßlich die zytoplasmatische Reifung der Eizelle, welche wiederum zu einer späteren Beeinträchtigung der Entwicklung der Zygote und des Embryos führt. / Infertility treatments by assisted reproductive technologies (ARTs) are associated with an increased incidence of epigenetic aberrations during gametogenesis and early embryo-genesis, specifically in imprinted genes. In vitro-maturation (IVM) of oocytes is an ART which is routinely applied for reproduction of agriculturally and economically important species like cattle (Bos taurus). However, IVM oocytes exhibit a reduced developmental competence to the blastocyst stage which may be caused by an impaired epigenetic regulation. Of all known epigenetic mechanisms DNA-methylation is the most studied DNA-modification. In this thesis, bovine oocytes have been analyzed in order to investigate the impact of IVM on the DNA-methylation of imprinted and non-imprinted genes. Because this species exhibits a similar preimplantation development and gestation length as humans, it is increasingly being used as a model for human germ-cell and embryo development. In contrast to humans and mice, only little information on bovine imprinted genes is available. Thus, the first attempt of the research presented here was to identify and characterize the bovine differentially methylated regions (DMRs) of the three imprinted loci, namely IGF2/H19, SNRPN and PEG3 which are each associated with imprinting defects in humans and/or the mouse model. The first description of several intergenic DMRs by bisulfite sequencing and pyrosequencing proved the existence of an intergenic IGF2/H19 imprinting control region (ICR) in the bovine. The imprinted status of the IGF2/H19-ICR as well as the bovine genes SNRPN and PEG3 was confirmed by differential methylation consistent with genomic imprinting in placental and somatic bovine tissues, in sperm and parthenogenetic embryos. Limiting Dilution (LD) Bisulfite Sequencing (El Hajj et al., 2011) followed by direct bisulfite sequencing allows the analysis of methylation profiles of individual alleles (DNA molecules) from only a few or even single cells. In a first approach using LD, the three characterized imprinted regions were analyzed to determine putative epigenetic alterations in bovine oocytes cultured with different types of IVM conditions and media (TCM and mSOF). The total rate of individual CpG and entire allele methylation errors did not differ significantly between the two IVM and the in vivo group, indicating that current IVM protocols have no or only marginal effects on these critical epigenetic marks. The developmental capacity of IVM oocytes from prepubertal calves is reduced compared with their IVM oocyte counterparts from adult animals. Therefore, in a second LD approach, the promoter methylation of three developmentally important, non-imprinted genes (SLC2A1, PRDX1, ZAR1) has been studied in IVM oocytes from prepubertal cattle after ovarial stimulation with FSH and/or IGF1. Both immature and in vitro matured prepubertal and adult oocytes showed unimpaired hypomethylation of the three gene promoters without differences between the different ages of donors and treatments. Thus, neither age nor hormonal treatment or IVM seem to influence the methylation status of these three genes. In conclusion, the reduced developmental capacity of IVM oocytes from adult and prepubertal cattle were not associated with aberrant methylation patterns of the investigated imprinted and non-imprinted genes suggesting a general stability of established DNA-methylation marks in oocytes. Therefore, epigenetic mechanisms other than DNA-methylation such as ncRNAs or histone modifications might confer to the reduced developmental competence of prepubertal and IVM oocytes. These factors are supposed to interfere with cytoplasmic maturation of the oocyte leading to an impaired development of the zygote and embryo rather than to influence nuclear maturation of the oocyte.

Stem cells are defined by their capacity to self-renew and their potential to differentiate into multiple cell lineages. Pluripotent embryonic stem (ES) cells can renew indefinitely while keeping the potential to differentiate into any of the three germ layers (ectoderm, endoderm or mesoderm). For decades, ES cells are in the focus of research because of these unique features. When ES cells differentiate they form spheroid aggregates termed “embryoid bodies” (EBs). These EBs mimic post- implantation embryonic development and therefore facilitate the understanding of developmented mechanisms. During ES cell differentiation, de-repression or repression of genes accompanies the changes in chromatin structure. In ES cells, several mechanisms are involved in the regulation of the chromatin architecture, including post-translational modifications of histones. Post-translational histone methylation marks became one of the best- investigated epigenetic modifications, and they are essential for maintaining pluripotency. Until the first histone demethylase KDM1A was discovered in 2004 histone modifications were considered to be irreversible. Since then, a great number of histone demethylases have been identified. Their activity is linked to gene regulation as well as to stem cell self-renewal and differentiation. KDM6A and KDM6B are H3K27me3/2-specific histone demethylases, which are known to play a central role in the regulation of posterior development by regulating HOX gene expression. So far less is known about the molecular function of KDM6A or KDM6B in undifferentiated and differentiating ES cells. In order to completely abrogate KDM6A and KDM6B demethylase activity in undifferentiated and differentiating ES cells, a specific inhibitor (GSK-J4) was employed. Treatment with GSK-J4 had no effect on the viability or proliferation on ES cells. However, in the presence of GSK-J4 ES cell differentiation was completely abrogated with cells arrested in G1-phase and an increased rate of apoptosis. Global transcriptome analyses in early-differentiating ES cells revealed that only a limited set of genes were differentially regulated in response to GSK-J4 treatment with more genes up- regulated than down-regulated. Many of the up-regulated genes are linked to DNA damage response (DDR). In agreement with this, DNA damage was found in EBs incubated with GSK-J4. A co-localization of H3K27me3 or KDM6B with γH2AX foci, marking DNA breaks, could be excluded. However, differentiating Eed knockout (KO) ES cells, which are devoid of the H3K27me3 mark, showed an attenuated GSK-J4- induced DDR. Finally, hematopoietic differentiation in the presence of GSK-J4 resulted in a reduced colony-forming potential. This leads to the conclusion that differentiation in the presence of GSK-J4 is also restricted to hematopoietic differentiation. In conclusion, my results show that the enzymatic activity of KDM6A and KDM6B is not essential for maintaining the pluripotent state of ES cells. In contrast, the enzymatic activity of both proteins is indispensable for ES cell and hematopoietic differentiation. Additionally KDM6A and KDM6B enzymatic inhibition in differentiating ES cells leads to increased DNA damage with an activated DDR. Therefore, KDM6A and KDM6B are associated with DNA damage and in DDR in differentiating ES cells. / Stammzellen sind definiert durch ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung und dem Potential in multiple Zellinien zu differenzieren. Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen) können sich fortlaufend erneuern und besitzen zudem das Potential, in alle drei Keimblätter (Ektoderm, Endoderm oder Mesoderm) zu differenzieren. Auf Grund dieser einzigartigen Eigenschaften sind ES Zellen seit Jahrzehnten im Focus der Wissenschaft. Wenn ES Zellen differenzieren, sind sie in der Lage, sphäroid-förmige Aggregate zu bilden, welche als embryoide Körperchen (EBs) bezeichnet werden. In EBs finden sich Zellen aller 3 Keimblätter und daher dienen sie als in vitro Modell für frühe embryonale Entwicklung. Während der ES Zell Differenzierung verändert die De-repression oder Repression von Genen die Struktur des Chromatins. ES Zellen besitzen eine Vielzahl von Mechanismen, die mit der Regulation des Chromatins assoziiert sind, einschließlich post-translationale Modifikationen an Histonen. Post-translationale Histon- methylierung gehören zu den am häufigsten untersuchten epigenetischen Modifikationen und spielen z.B. ein wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz. Bis zur Entdeckung der ersten Histon-Demethylase KDM1A im Jahre 2004 glaubte man, dass Modifikationen an Histonen irreversible sind. Bislang wurden jedoch eine Vielzahl an Histon-Demethylasen identifiziert, welche mit der Genregulation, sowie der Selbsterneuerung und Differenzierung von Stammzelle in Verbindung gebracht werden konnten. KDM6A und KDM6B sind H3K27me3/2-spezifische Histon-Demethylasen, welche bei der posterioren Entwicklung durch Regulation der Hox Gene eine wichtige Rolle spielen. Bislang ist über die molekulare Funktion von KDM6A und KDM6B in nicht differenzierten und differenzierenden ES Zellen wenig bekannt. Um die KDM6A und KDM6B Demethylase Aktivität in nicht differenzierten und differenzierenden ES Zellen außer Kraft zu setzten kam ein spezifischer Inhibitor (GSK-J4) zum Einsatz. Die Behandlung mit GSK-J4 zeigte keine Auswirkungen auf die Viabilität oder Proliferation von nicht differenzierten ES Zellen. Jedoch war die Differenzierung von ES Zellen in Gegenwart von GSK-J4 inhibiert und zeigte einen erhöhten G1-Phase Arrest sowie eine erhöhte Rate an apoptotischen Zellen. Eine globale Transkriptionsanalyse in frühen differenzierenden ES Zellen, in Gegenwart von GSK- J4 zeigte, dass lediglich eine relativ geringe Zahl von Genen differenziell reguliert war. Dabei waren mehr Gene hochreguliert als herunterreguliert. Viele der hochregulierten Gene konnten mit der DNA Schadensantwort in Verbindung gebracht werden. In Übereinstimmung damit konnte in Gegenwart von GSK-J4 in differenzierenden ES Zellen DNA Schaden nachgewiesen werden. Eine Kolokalisation von H3K27me3 oder KDM6B mit γH2AX markierten Foci, welche DNA Schaden markieren, konnte nicht nachgewiesen werden. Nichts desto trotz zeigten GSK-J4 behandelte, differenzierende Eed KO ES Zellen, welche keine H3K27me3 Modifikation besitzen, eine abgemilderte DNA Schadensantwort. In Anwesenheit von GSK-J4 konnte während der hämatopoetischen Differenzierung eine reduzierte Kolonie-Bildung beobachtet werden. Daraus lässt sich schließen, dass in Anwesenheit von GSK-J4 ebenfalls auch die hämatopoetische Differenzierung inhibiert wird. Zusammenfassend zeigen meine Ergebnisse, dass die enzymatische Aktivität von KDM6A und KDM6B für die Aufrechterhaltung des pluripotenten Zustands nicht essenziell ist. Im Gegensatz dazu ist die enzymatische Aktivität von beiden Proteinen unabdingbar für die ES Zell sowie die hämatopoetische Differenzierung. Die enzymatische Inhibierung von KDM6A und KDM6B führt während der Differenzierung zu einem erhöhten DNA Schaden, wodurch die DNA Schadensantwort aktiviert wird. Somit sind KDM6A und KDM6B mit DNA Schaden und der DNA Schadensantwort assoziiert.

In der nuklearmedizinischen Therapie werden Radiopharmaka meist systemisch verabreicht. Primär werden dafür, wegen der kurzen Reichweite, beta-Strahler eingesetzt. Als Folge davon verteilt sich das Radiopharmakon im Körper, reichert sich in Organen und Zielstrukturen an und bestrahlt somit den Körper intern, im Gegensatz zur externen Bestrahlung bei der Strahlentherapie. Das Verteilungsmuster der verabreichten Aktivität im Körper wird durch die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Radiopharmakons bestimmt. Außerdem sind die Aktivität und die Art der Anreicherung ausschlaggebend für die durch ionisierende Strahlung deponierte Energie im Körper, der Energiedosis. Gemeinsam haben externe und interne Bestrahlungsverfahren, dass der Patient ionisierender Strahlung ausgesetzt ist, die nicht nur die kranken Zellen zerstört, sondern auch gesunde Zellen schädigen kann. Dies geschieht durch direkte oder indirekte Wechselwirkung der Strahlung mit der DNA, die zur Schädigung der DNA-Struktur führt. Am häufigsten sind dabei Einzelstrangbrüche und Basenschäden. Die Doppelstrangbrüche sind im Vergleich zu Einzelstrangbrüchen und Basenschäden sehr selten aber sehr viel schädlicher für die Zelle, da die Reparatur komplizierter ist. Somit sind diese primär für den Zelltod oder für die Folgen nach fehlerhafter Reparatur verantwortlich. Eine sehr schnelle Antwort auf strahleninduzierte oder durch andere Stoffe, wie z.B. zytotoxische Substanzen, induzierte Doppelstrangbrüche ist die Phosphorylierung der Histon H2 Variante H2AX, die gamma-H2AX genannt wird. Zusätzlich reichert sich das Protein 53BP1 nach dem Erkennen eines Doppelstrangbruches durch Sensorproteine sofort am Chromatin, das den Doppelstrang umgibt, an. Damit ist 53BP1 ein weiterer Biomarker, der strahleninduzierte Doppelstrangbrüche sehr effektiv nachweisen kann und der auf sehr verlässliche Weise mit gamma-H2AX kolokalisiert. Mittels Immunfluoreszenzfärbung lassen sich gamma-H2AX und 53BP1 als umschriebene „Foci“, im Zellkern mikroskopisch darstellen und zählen. Unter der Annahme, dass ein Focus einem Doppelstrangbruch entspricht, kann die Anzahl der Foci im Zellkern als quantitativer Biomarker für DNA Doppelstrangbrüche und damit für die Strahlenexposition und Strahlenwirkung verwendet werden. Zudem zeigen Studien der Induktion von gamma-H2AX nach externer Bestrahlung von unterschiedlichen Gewebearten Linearität zwischen der Energiedosis und der Zahl der Foci im Zellkern. Weitere Studien beschäftigen sich mit den Auswirkungen externer Bestrahlung auf Patienten, aber nur wenige mit offenen radioaktiven Substanzen. Ziele dieser Arbeit waren daher: 1. Die Generierung einer bisher noch nicht beschriebenen in-vitro Kalibrierkurve nach interner Bestrahlung von Vollblut mit den in der Therapie eingesetzten beta-Strahlern. 2. Die gleichzeitige Bestimmung der physikalischen Dosis sowie der strahleninduzierten Anzahl der Foci in Lymphozyten, gewonnen aus Blutproben von Patienten nach Radiopeptidtherapie mit Lu-177 und Radioiodtherapie mit I-131. 3. Eine umfassende Beschreibung der Induktion und der Abnahme der Foci in den Lymphozyten aus den Blutproben der Patienten unter Einbeziehung der in-vitro Kalibrierung, um den dosis- und zeitabhängigen Verlauf der Anzahl der strahleninduzierten Foci zu bestimmen. Für die in-vitro Kalibrierung mit I-131 und Lu-177 wurden bei Probanden Blutproben gewonnen und mit unterschiedlichen Aktivitätskonzentrationen ergänzt. Das Ziel war, eine Energiedosis bis 100mGy zu erhalten. Das Ergebnis war, dass sich die Zahl der strahleninduzierten Foci in Abhängigkeit von der Energiedosis gut durch eine lineare Funktion beschreiben lässt, so wie es auch für die externe Bestrahlung bereits gezeigt wurde. Die Patientenstudien befassten sich mit dem Zusammenhang zwischen der im Blut deponierten Energiedosis und der Anzahl und dem zeitlichen Verlauf der induzierten Doppelstrangbrüche im peripheren Blut von Patienten unter Peptidrezeptor-Radionuklidtherapie mit Lu-177 DOTATATE/-TOC und Patienten unter Radioiodtherapie mit I-131 bei Ablationstherapien nach Operation eines differenzierten Schilddrüsenkarzinoms. Die durchschnittliche Anzahl induzierter DSB-Foci zeigte in den frühen Zeitpunkten einen linearen dosisabhängigen Anstieg. In den ersten Stunden nach Therapie stimmten die in-vitro Kalibrierung und die Zahl der strahleninduzierten Foci sowohl für Lu-177 als auch für I-131 für die Patientendaten gut überein. Die späteren Zeitpunkte werden durch eine Abnahme der Dosisrate und der Foci-Anzahl, bedingt durch Reparatur der DNA-Schäden, charakterisiert. Überstiegen die Blutdosiswerte in der ersten Stunde jedoch 20mGy (nur nach I-131-Gabe beobachtet), dann war die Induktion eines schnellen Reparaturprozesses festzustellen. Diese experimentellen Ergebnissen und Modellierungen beschreiben erstmalig die Dosisabhängigkeit und den zeitlichen Verlauf der in-vitro und in-vivo DNA-Schadensantwort nach Inkorporation von beta-emittierenden Radionukliden. / In radionuclide therapy radiopharmaceuticals are administered mostly systemically. Primarily, beta-emitters are used because of their short range in tissue. As a result the radiopharmaceutical distributes within the human body and accumulates in organs and target structures. Thus, the body is irradiated internally, in contrast to external irradiation in radiotherapy. The pattern of the activity distribution within the human body is determined by the physical and chemical properties of the radiopharmaceutical. Furthermore, the amount of activity and its accumulation in organs or tissues is essential for the calculation of the absorbed dose which defines the energy deposited in the body by ionizing radiation. During internal or external irradiation, patients are exposed to ionizing radiation which does not only destroy the malignant cells but also damages healthy tissue and cells. This is mainly caused by direct and indirect interaction of the radiation with the DNA which damages the DNA structure. Most frequently, there are single strand breaks and base damages. DNA double strand breaks (DSBs) are rare; nevertheless, they are the most critical lesions for cells as repairing the damage is difficult. Unrepaired or misrepaired DNA could cause mutations, chromosomal aberrations or lead to cell death. The formation of a DNA DSB in nuclear chromatin results in the rapid phosphorylation of the histone H2 variant H2AX, then called gamma-H2AX. Furthermore, DSBs also recruit the damage sensor 53BP1 to the chromatin surrounding the DSBs, which leads to 53BP1 and gamma-H2AX co-localization in the chromatin surrounding a DSB. By immunofluorescence staining with gamma-H2AX and 53BP1 antibodies those biomarkers can be addressed by microscopically visible DNA damage protein foci, this is also known as the DNA damage focus assay. With progression of DSB repair, gamma-H2AX and 53BP1 foci disappear. It is assumed that one focus corresponds to one DSB. Therefore, the number of foci per cell can be used as a quantitative biomarker for DNA double strand breaks and hence for radiation exposure and radiation effects. Most studies dealing with the DNA damage focus assay performed in the last years were looking only on the effect of external irradiation after external radiation therapy or after diagnostic radiology procedures, but only few with the effects after administration of radiopharmaceuticals. Therefore, the aims of this thesis were: 1. To develop a method to generate an in-vitro calibration curve for the DSB focus assay after internal irradiation with beta-emitting radionuclides by creating a low dose and low dose-rate blood irradiation situation in-vitro, at dose-rates that are similar to the ones that have been observed in nuclear medicine patients. 2. To determine the absorbed dose and the number of radiation-induced foci in lymphocytes by sampling blood from patients after radiopeptide therapy with Lu-177 and radioiodine therapy with I-131. 3. To describe comprehensively the temporal and dose-dependent behavior of the DNA damage focus assay in radiation treatment-naive patients after their first radionuclide therapy using the results of the in-vitro calibration. For the in-vitro calibration with I-131 and Lu-177 blood samples For the in-vitro calibration with I-131 and Lu-177 blood samples were drawn from volunteers. Different activity concentrations were added to the samples for achieving absorbed doses up to 100mGy. As a result it was shown that the number of radiation-induced foci were linearly dependent of the absorbed dose. This is the same result that has been shown after external irradiation. The patient studies addressed the relationship between the absorbed dose to the blood and the number and temporal behavior of radiation-induced DNA double strand breaks in peripheral blood samples under radiopeptide therapy and under radioiodine therapy. The average number of radiation-induced foci showed a linear dose-response relationship within the first hours after administration of the radiopharmaceutical. The slope of the in-vitro calibration curve was in good agreement with the slopes of the linear functions fitted to the in-vivo data for Lu-177 and I-131. Later time points were characterized by a diminishing number of radiation-induced foci which was in accordance with the progression of DNA repair and the declining dose rates. Most patients treated with I-131 exceeded 20mGy in the first hour and in these patients the onset of a fast repair component was observed. With the experimental results and model calculations presented in this work, for the first time a dose-response relationship and a description of the time course of the in-vitro and in-vivo damage response after internal irradiation of beta-emitters could be established.

Anxiety disorders (AD) are common, disabling mental disorders, which constitute the most prevalent mental health condition conveying a high individual and socioeconomic burden. Social anxiety disorder (SAD), i.e. fear in social situations particularly when subjectively scrutinized by others, is the second most common anxiety disorder with a life time prevalence of 10%. Panic disorder (PD) has a life time prevalence of 2-5% and is characterized by recurrent and abrupt surges of intense fear and anticipatory anxiety, i.e. panic attacks, occurring suddenly and unexpected without an apparent cue. In recent years, psychiatric research increasingly focused on epigenetic mechanisms such as DNA methylation as a possible solution for the problem of the so-called “hidden heritability”, which conceptualizes the fact that the genetic risk variants identified so far only explain a small part of the estimated heritability of mental disorders. In the first part of this thesis, oxytocin receptor (OXTR) gene methylation was investigated regarding its role in the pathogenesis of social anxiety disorder. In summary, OXTR methylation patterns were implicated in different phenotypes of social anxiety disorder on a categorical, neuropsychological, neuroendocrinological as well as on a neural network level. The results point towards a multilevel role of OXTR gene hypomethylation particularly at one CpG site (CpG3, Chr3: 8 809 437) within the protein coding region of the gene in SAD. The second part of the thesis investigated monoamine oxidase A (MAOA) gene methylation regarding its role in the pathogenesis of panic disorder as well as – applying a psychotherapy-epigenetic approach – its dynamic regulation during the course of cognitive behavioural therapy (CBT) in PD patients. First, MAOA hypomethylation was shown to be associated with panic disorder as well as with panic disorder severity. Second, in patients responding to treatment MAOA hypomethylation was shown to be reversible up to the level of methylation in healthy controls after the course of CBT. This increase in MAOA methylation along with successful psychotherapeutic treatment was furthermore shown to be associated with symptom improvement regarding agoraphobic avoidance in an independent replication sample of non-medicated patients with PD. Taken together, in the future the presently identified epigenetic patterns might contribute to establishing targeted preventive interventions and personalized treatment options for social anxiety disorder or panic disorder, respectively. / Angsterkrankungen sind die häufigsten psychischen Erkrankungen, welche in hohem Maße den Alltag der Betroffenen beeinträchtigen und eine große sozioökonomische Belastung darstellen. Eine der häufigsten Formen von Angsterkrankungen bildet die soziale Phobie, d.h. die Angst vor sozialen Situationen, in denen man im Mittelpunkt der Aufmerksamkeit steht, mit einer Lebenszeit-Prävalenz von circa 10%. Die Panikstörung, charakterisiert durch das wiederholte und unerwartete Auftreten von Panikattacken, ist eine weitere Form der Angsterkrankungen mit einer Lebenszeit-Prävalenz von circa 2-5%. Epigenetische Mechanismen, wie zum Beispiel die DNA Methylierung, rücken in den letzten Jahren immer weiter in den Fokus der psychiatrischen Forschung. Hier werden sie als eine mögliche Lösung für das Problem der „hidden heritability“ (versteckte Heritabilität) angesehen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die DNA Methylierung des Oxytozinrezeptorgens (OXTR) hinsichtlich ihrer Rolle in der Pathogenese der sozialen Phobie untersucht. Hierbei konnte eine verringerte Methylierung des Gens, speziell an einem CpG-Dinukleotid (CpG3, Chr3: 8 809 437) innerhalb der protein-kodierenden Genregion, auf verschiedenen Ebenen mit der Erkrankung an sozialer Phobie, dimensionalen Maßen der Erkrankungsschwere sowie der Stressverarbeitung auf neuro-endokrinologischer und neuronaler Ebene in Verbindung gebracht werden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle von DNA Methylierungsmustern des Monoaminooxidase A (MAOA) Gens in der Pathogenese und der Therapie der Panikstörung. Zum einen konnte gezeigt werden, dass eine verringerte MAOA Methylierung mit dem Auftreten von Panikstörung sowie mit einer erhöhten Symptomschwere assoziiert ist. Zum anderen zeigten Patienten, welche auf eine kognitive Verhaltenstherapie (KVT) ansprachen, eine signifikante Erhöhung der MAOA Methylierung nach der Therapie, welche zusätzlich in einer unabhängigen Stichprobe mit einer Verringerung der Symptomschwere assoziiert war. Diese Veränderung zeigte sich jedoch nicht in Patienten, welche nicht auf die KVT ansprachen. Zusammenfassend können beide im Rahmen dieser Arbeit untersuchten epigenetischen Muster und deren Rolle in der Pathogenese der sozialen Phobie sowie der Panikstörung zur Etablierung personalisierter Therapiemöglichkeiten wie auch targetierter präventiver Interventionen beitragen.

Die Sequenzierungstechnologien entwickeln sich stetig weiter, dies ermöglicht eine zuvor nicht erreichte Ausbeute an experimentellen Daten und auch an Neuentwicklungen von zuvor nicht realisierbaren Experimenten. Zugleich werden spezifische Datenbanken, Algorithmen und Softwareprogramme entwickelt, um die neu entstandenen Daten zu analysieren. Während der Untersuchung bioinformatischer Methoden für die Identifizierung und Klassifizierung somatischer Mutationen in hämatologischen Erkrankungen, zeigte sich eine hohe Vielfalt an alternativen Softwaretools die für die jeweiligen Analyseschritte genutzt werden können. Derzeit existiert noch kein Standard zur effizienten Analyse von Mutationen aus Next-Generation-Sequencing (NGS)-Daten. Die unterschiedlichen Methoden und Pipelines generieren Kandidaten, die zum größten Anteil in allen Ansätzen identifiziert werden können, jedoch werden Software spezifische Kandidaten nicht einheitlich detektiert. Um eine einheitliche und effiziente Analyse von NGS-Daten durchzuführen war im Rahmen dieser Arbeit die Entwicklung einer benutzerfreundlichen und einheitlichen Pipeline vorgesehen. Hierfür wurden zunächst die essentiellen Analysen wie die Identifizierung der Basen, die Alignierung und die Identifizierung der Mutationen untersucht. Des Weiteren wurden unter Berücksichtigung von Effizienz und Performance diverse verfügbare Softwaretools getestet, ausgewertet und sowohl mögliche Verbesserungen als auch Erleichterungen der bisherigen Analysen vorgestellt und diskutiert. Durch Mitwirken in Konsortien wie der klinischen Forschergruppe 216 (KFO 216) und International Cancer Genome Consortium (ICGC) oder auch bei Haus-internen Projekten wurden Datensätze zu den Entitäten Multiples Myelom (MM), Burkitt Lymphom (BL) und Follikuläres Lymphom (FL) erstellt und analysiert. Die Selektion geeigneter Softwaretools und die Generierung der Pipeline basieren auf komparativen Analysen dieser Daten, sowie auf geteilte Ergebnisse und Erfahrungen in der Literatur und auch in Foren. Durch die gezielte Entwicklung von Skripten konnten biologische und klinische Fragestellungen bearbeitet werden. Hierzu zählten eine einheitliche Annotation der Gennamen, sowie die Erstellung von Genmutations-Heatmaps mit nicht Variant-Calling-File (VCF)-Syntax konformen Dateien. Des Weiteren konnten nicht abgedeckte Regionen des Genoms in den NGS-Daten identifiziert und analysiert werden. Neue Projekte zur detaillierten Untersuchung der Verteilung von wiederkehrender Mutationen und Funktionsassays zu einzelnen Mutationskandidaten konnten basierend auf den Ergebnissen initiiert werden. Durch eigens erstellte Python-Skripte konnte somit die Funktionalität der Pipeline erweitert werden und zu wichtigen Erkenntnissen bei der biologischen Interpretation der Sequenzierungsdaten führen, wie beispielsweise zu der Detektion von drei neuen molekularen Subgruppen im MM. Die Erweiterungen, der in dieser Arbeit entwickelten Pipeline verbesserte somit die Effizienz der Analyse und die Vergleichbarkeit unserer Daten. Des Weiteren konnte durch die Erstellung eines eigenen Skripts die Analyse von unbeachteten Regionen in den NGS-Daten erfolgen. / The sequencing technologies, while still being under further development, render it possible to develop novel experiments and allow the generation of larger amounts of utilizable data. At the same time novel software tools, databases and algorithms are developed to analyze these larger amounts of data. The analysis of somatic mutations in hematological malignancies showed that a high variety of alternative software tools can be used for different analysis steps. Furthermore there is currently no standardized procedure for the efficient identification and analysis of mutations in NGS data. The different pipeline and methods are, for the most part, able to identify the same mutation candidates, however there are software specific candidates which are not called by all pipelines. The scope of this dissertation was therefore to develop a user-friendly pipeline which is able to call candidate mutations uniformly and efficiently. For this purpose necessary analysis steps including base calling, alignment generation and variant calling were investigated. Furthermore available software tools were tested and evaluated regarding their efficiency and performance. Possible improvements of these software tools and previously performed analysis are explained and discussed in this work. NGS data sets of the different cancer entities multiple myeloma (MM), Burkitt lymphoma (BL) and follicular lymphoma (FL) were generated and analyzed within the framework of cooperate projects like the International Cancer Genome Consortium (ICGC) and the Clinical Research Group 216 (KFO) as well as for internal projects. The development of the pipeline and selection of suitable software tools is based on the comparative analysis of the generated data sets, as well as previously described results and experiences in literature and forums. The selective development of certain python scripts enabled the evaluation of novel biological and clinical questions by standardizing gene names in the annotation step, generating heat- maps of non-standardized VCF-files as well as the identification and analysis of uncovered regions in NGS data sets. This work and the obtained results thereby provide the groundwork for further projects e.g. the analysis of the distribution of recurrent mutations or the functional analysis of specific mutation candidates. This extensions of the developed pipeline with python scripts helped to improve the efficiency and comparability of the NGS data. The interpretation of the NGS data with the extended script for example led to the discovery of three distinct molecular subgroups in MM. Furthermore the generation of the novel python scripts helped to analyze uncovered regions in the NGS data sets.

Computer networks are constantly being attacked by malicious entities for various reasons. Network based attacks include but are not limited to, Distributed Denial of Service (DDoS), DNS based attacks, Cross-site Scripting (XSS) etc. Such attacks have exploited either the network protocol or the end-host software vulnerabilities for perpetration. Current network traffic analysis techniques employed for detection and/or prevention of these anomalies suffer from significant delay or have only limited scalability because of their huge resource requirements. This dissertation proposes more scalable techniques for network anomaly detection. We propose using DNS analysis for detecting a wide variety of network anomalies. The use of DNS is motivated by the fact that DNS traffic comprises only 2-3% of total network traffic reducing the burden on anomaly detection resources. Our motivation additionally follows from the observation that almost any Internet activity (legitimate or otherwise) is marked by the use of DNS. We propose several techniques for DNS traffic analysis to distinguish anomalous DNS traffic patterns which in turn identify different categories of network attacks. First, we present MiND, a system to detect misdirected DNS packets arising due to poisoned name server records or due to local infections such as caused by worms like DNSChanger. MiND validates misdirected DNS packets using an externally collected database of authoritative name servers for second or third-level domains. We deploy this tool at the edge of a university campus network for evaluation. Secondly, we focus on domain-fluxing botnet detection by exploiting the high entropy inherent in the set of domains used for locating the Command and Control (C&C) server. We apply three metrics namely the Kullback-Leibler divergence, the Jaccard Index, and the Edit distance, to different groups of domain names present in Tier-1 ISP DNS traces obtained from South Asia and South America. Our evaluation successfully detects existing domain-fluxing botnets such as Conficker and also recognizes new botnets. We extend this approach by utilizing DNS failures to improve the latency of detection. Alternatively, we propose a system which uses temporal and entropy-based correlation between successful and failed DNS queries, for fluxing botnet detection. We also present an approach which computes the reputation of domains in a bipartite graph of hosts within a network, and the domains accessed by them. The inference technique utilizes belief propagation, an approximation algorithm for marginal probability estimation. The computation of reputation scores is seeded through a small fraction of domains found in black and white lists. An application of this technique, on an HTTP-proxy dataset from a large enterprise, shows a high detection rate with low false positive rates.

In this thesis Direct Numerical Simulation (DNS) is used to investigate the development of turbulent premixed flame kernels during the early stages of growth typical of the period following spark ignition. Two distinct aspects of this phase are considered: the interaction of the expanding kernel with a field of decaying turbulence, and the chemical and thermo-diffusive response of the flame for different fresh-gas compositions. In the first part of the study, three-dimensional, repeated simulations with single-step chemistry are used to generate ensemble statistics of global flame growth. The surface-conditioned mean fluid-velocity magnitude is found to vary significantly across different isosurfaces of the reaction progress variable, and this is shown to lead to a bias in the distribution of the Surface Density Function (SDF) around the developing flame. Two-dimensional simulations in an extended domain indicate that this effect translates into a similar directional bias in the Flame Surface Density (FSD) at later stages in the kernel development. Properties of the fresh gas turbulence decay are assessed from an independent, non-reacting simulation database. In the second part of this study, two-dimensional simulations with a detailed 68-step reaction mechanism are used to investigate the thermo-diffusive response of pure methane-air, and hydrogen-enriched methane-air flames. The changes in local and global behaviour due to the different laminar flame characteristics, and the response of the flames to strain and curvature are examined at different equivalence ratios and turbulence intensities. Mechanisms leading to flame quenching are discussed and the effect of mean flame curvature is assessed through comparison with an equivalent planar flame. The effects of hydrogen addition are found to be particularly pronounced in flame kernels due to the higher positive stretch rates and reduced thermo-diffusive stability of hydrogen-enriched flames.

A framework for assessing the key statistical parameters of complex flows in choosing appropriate turbulence prediction methods on a quantitative basis is developed. These parameters characterise flow/modelling matching conditions quantified in this work. Matching conditions are important in classifying complex turbulent flows in order to frame best practice for model predictions to inform computational aerodynamics design optimisation in the context of virtual test beds. In the incompressible low Reynolds number shear flows considered here, the boundaries of the 'conforming domain' within which turbulence models are valid need to be defined, based on basic mechanisms of turbulence, and the statistical parameters. This has led to a new guideline ‘localness map’ for standard model applications. Since the choice of turbulence model depends on the complexity of the flows considered, it is useful if systematic sets of the parameters indicate the type of flow. They are that of residence time, the degree of spatial non-locality, the straining, and the non-Gaussianity, each of which is appropriately normalised. It can be demonstrated that the quantified map, in particular that of localness for the shear flows, provides a firm foundation for evaluating a wider range of Underlying Flow Regimes, including locating the Underlying Flow Regimes on the generalised localness modeling map as a framework for best practice guidelines. This work produces 7 sets of quantitative localness-structural parameters, which are used as baseline sets for grouping the Underlying Flow Regimes, and hence it opens the possibility of having complete modelling maps for Application Challenges to assess the need for zonal modelling.

El chorro plano es una configuración resultante de la interacción de dos capas de corte simétricas, paralelas y de diferente signo de vorticidad. Se trata de un flujo de gran interés práctico por sus aplicaciones directas en procesos industriales y medioambientales.Este trabajo que se presenta analiza la interacción entre las estructuras de flujo y el transporte de materia en el chorro plano. El estudio realizado demuestra que el flujo aguas abajo está determinado por las condiciones en la región de entrada del chorro. Así, mediante perturbaciones artificiales en la entrada se puede determinar la posterior evolución de las estructuras características del flujo. Este control permite aumentar y disminuir el consumo de especies químicas en un sistema reactivo en el chorro. Escogiendo las perturbaciones adecuadas en la entrada del dominio, se puede conseguir influenciar en desarrollo de la reacción química a lo largo del chorro y obtener una conversión deseada lejos del punto donde el flujo ha sido perturbado.Para realizar este trabajo, se ha desarrollado un código de simulación de dinámica de fluidos con el lenguaje de programación Fortran 90 y bajo la interficie de envío de mensajes (MPI) entre procesadores. Este programa informático resuelve numéricamente las ecuaciones de transporte de cantidad de movimiento, energía y materia en un dominio computacional rectangular y abierto. Con las condiciones de contorno implementadas se puede incorporar fluido externo y las recirculaciones del flujo pueden salir del dominio, reproduciendo el comportamiento físico real del chorro en un dominio infinito.Las ecuaciones están discretizadas mediante diferentes esquemas: en los términos convectivos se ha utilizado un esquema QUICK de segundo orden, para los difusivos un esquema centrado y para los temporales un esquema Adams-Bashfort. Para el transporte de materia y energía se ha utilizado un esquema centrado con la corrección ULTIMATE de Leonard para los términos convectivos, ya que este esquema corrige las inestabilidades y falsas oscilaciones del transporte altamente convectivo cuando existen fuertes gradientes.El código ha sido paralelizado para poder ejecutarse en máquinas multicomputadoras.El dominio computacional se divide entre los procesadores y cada uno resuelve las 1 ecuaciones discretizadas sobre los nodos de una región determinada. Para intercambiar datos entre los diferentes procesadores se utilizan los comandos de la librería MPI (Message Passing Interface). Los resultados demuestran que hay una gran mejora en el tiempo de cálculo y que se puede conseguir una buena eficiencia si se compara con un código secuencial optimizado.Para evaluar los efectos de las perturbaciones artificiales sobre el campo de velocidades y caracterizar las estructuras coherentes se han realizado una serie de simulaciones bidimensionales a Reynolds 7000. En estos casos se han considerando chorros planos débiles, es decir, con una velocidad de flujo co-corriente alto. De esta manera la zona de autosimilitud se aleja de la entrada y se puede centrar el análisis sobre la región inicial del chorro. Con las simulaciones computacionales realizadas se ha evaluado detalladamente la influencia de las perturbaciones sobre el flujo, demostrando que las estructuras coherentes son periódicas en el tiempo.En estos casos también se ha estudiado el efecto que producen el número de Schmidt, Strouhal y Damk®ohler sobre la conversión de la reacción química en chorros con y sin premezcla de reactivos. Se ha comprobado que determinadas frecuencias de perturbaciones facilitan la formación de estructuras coherentes que mejoran la mezcla y aumentan la conversión de la reacción. También se ha demostrado la poca influencia del término difusivo ya que el flujo está fuertemente dominado por el transporte convectivo. Implementado en el código la técnica de simulación de grandes escalas con el modelo de Smagorinsky, se ha estudiado un chorro plano tridimensional turbulento a Reynolds 3000. En este caso la velocidad del _flujo co-corriente se ha escogido pequeña para obtener la región de autosimilitud cerca de la entrada y dentro del dominio computacional.Además, el chorro se ha inestabilizado aplicando un pequeño ruido en la entrada. Los resultados obtenidos para el campo dinámico presentan gran concordancia con los experimentales disponibles en la bibliografía y siguen el patrón de la zona de autosimilitud.Se ha analizado el sistema reactivo bajo estas condiciones, estudiando la evolución de la conversión en las regiones de régimen de transición y turbulento. Se ha demostrado que el gran número de estructuras existentes en la región turbulenta del campo instantáneo facilita la mezcla entre las especies químicas aumentado la conversión de los reactivos.

A method for developing an erosive burning model for use in solid propellant design-and-analysis interior ballistics codes is described and evaluated. Using Direct Numerical Simulation, the primary mechanisms controlling erosive burning (turbulent heat transfer, and finite rate reactions) have been studied independently through the development of models using finite rate chemistry, and infinite rate chemistry. Both approaches are calibrated to strand burn rate data by modeling the propellant burning in an environment with no cross-flow, and adjusting thermophysical properties until the predicted regression rate matches test data. Subsequent runs are conducted where the cross-flow is increased from M=0.0 up to M=0.8. The resulting relationship of burn rate increase versus Mach Number is used in an interior ballistics analysis to compute the chamber pressure of an existing solid rocket motor. The resulting predictions are compared to static test data. Both the infinite rate model and the finite rate model show good agreement when compared to test data. The propellant considered is an AP/HTPB with an average AP particle size of 37 microns. The finite rate model shows that as the cross-flow increases, near wall vorticity increases due to the lifting of the boundary caused by the side injection of gases from the burning propellant surface. The point of maximum vorticity corresponds to the outer edge of the APd-binder flame. As the cross-flow increases, the APd-binder flame thickness becomes thinner; however, the point of highest reaction rate moves only slightly closer to the propellant surface. As such, the net increase of heat transfer to the propellant surface due to finite rate chemistry affects is small. This leads to the conclusion that augmentation of thermal transport properties and the resulting heat transfer increase due to turbulence dominates over combustion chemistry in the erosive burning problem. This conclusion is advantageous in the development of future models that can be calibrated to heat transfer conditions without the necessity for finite rate chemistry. These results are considered applicable for propellants with small, evenly distributed AP particles where the assumption of premixed APd-binder gases is reasonable.