Nous avons pour but de développer un système microfluidique en gouttes, capable, à l’échelle de la cellule/bactérie unique, de détecter et de co-localiser plusieurs marqueurs génétiques, en utilisant une version digitale et multiplexée de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Les systèmes de PCR digitale actuellement commercialisés ne le permettent toujours pas. Un tel prototype garantira la présence de multiples marqueurs à l’intérieur d’un même génome, ce qui permettra l’identification du pathogène avec précision et un taux de faux-positifs proche de zéro. Comme première application, nous démontrerons la possibilité de co-localiser quatre gènes de virulence de la souche O157:H7 d’Escherichia coli, un pathogène majeur, qui est détecté dans des échantillons alimentaires ou provenant de fèces cliniques pouvant aussi contenir des E. coli non pathogènes porteuses d’une partie des gènes de virulence. Avant de procéder à des tests TaqMan multicolores en point final, E. coli sera d’abord encapsulée dans des gouttes micrométriques et lysée par la chaleur in situ. Notre objectif est de démontrer que ce test peut être appliqué avec succès à un petit ensemble d’échantillons cliniques ou alimentaires / We aim to develop a prototype of droplet-based microfluidic system capable of detecting and colocalizing multiple genetic markers at the single cell/bacteria level, using the Polymerase Chain Reaction (PCR) in a digital multiplexed version. This cannot be achieved using current commercial digital PCR systems, and should increase the sensitivity and reliability of the detection of pathogens. Importantly, the system will guarantee the presence of multiple markers within the same genome and enable accurate identification, and bring the false positive rate close to zero. As a first application, we will demonstrate the possibility to co-localize 3 virulence genes in the E.coli strain O157:H7, a major foodborne pathogen, which has to be detected in clinical feces samples or food samples, which may also contain non pathogenic E. coli carrying only a subset of these virulence genes. E. Coli will be encapsulated in micrometric droplets, lysed by heating in situ prior performing a multicolour end-point Taqman assay. Our objective is to demonstrate that this test can be successfully applied to real clinical or food samples

L’efficacité des traitements contre diverses pathologies dépend dans bien des cas de la précocité de la prise en charge des patients. Ce contexte pousse de nos jours les chercheurs à élaborer de nouvelles méthodes de diagnostic, généralement basées sur la détection de biomarqueurs spécifiques, permettant d’établir une corrélation entre un dérèglement moléculaire de l’organisme et la survenue d’une maladie. L’objectif de ces travaux était, par l’utilisation de la microfluidique digitale en gouttelettes, d’établir de nouvelles procédures simples et reproductibles, témoignant d’une sensibilité importante afin de déterminer d’infimes variations de l’état moléculaire de l’organisme à travers la recherche de biomarqueurs spécifiques. Pour cela nous avons élaboré une nouvelle gamme de tensioactifs fluorées adaptés aux applications biologiques en microfluidique digitale, ainsi que différentes stratégies d’étude des variations de l’expression de microARN extrait d’échantillons biologiques, basées respectivement sur les réactions induites par hybridation nucléotidique et sur la réaction de RT-PCR digitale. / Efficiency of treatments for various diseases depends in many cases in precocity of patient management. Nowadays, this context urges researchers to develop new methods of diagnosis, generally based on the detection of specific biomarkers. These new methods allowing to establish correlations between physiological disorders and arisen of diseases states.The aim of this study was, by the use of droplet-based microfluidic, to work out a simple and reproducible procedure, with an increased sensitivity, to determine tiny variations of physiological state through the detection of specific biomarkers. Thus, we developed a new range of fluorinated surfactants fitted to biological applications in droplet-based microfluidics as well as various strategies to study variations of microRNA expressions in a biological sample. These methods, based on DNA-template reaction and digital PCR reaction, allows performing a substantial number of simultaneous reactions in micro-compartments (microdroplets) of picolitre volumes.

Cette thèse concerne le développement d’outils microfluidique pour l’ingénierie d’enzymes d’intérêt thérapeutique. La microfluidique à base de gouttelettes présente un énorme potentiel dans le domaine de la biologie quantitative. Nous développons des outils microfluidiques pour l’évolution dirigée de l’enzyme L-asparaginase, enzyme utilisée comme traitement de laleucémie lymphoblastique aiguë. Ce traitement est basée sur une enzyme d’origine bactérienne,ce qui conduit à déclencher des réactions immunitaires qui se traduit par l’interruption du traitement, souvent fatale pour le patient. Cependant, une version humaine de l’enzyme L-asparaginase, qui est moins immunogénique, n’est à l’heure actuelle pas suffisamment active pour être utilisée. L’objectif principal de cette thèse est d’alors d’analyser et de cribler des banques de mutants d’enzymes en utilisant des méthodes classiques de mutagenèse et d’analyser chaque mutant individuellement par le biais de la microfluidique. Pour cela, plusieurs systèmes microfluidiques ont été développés et optimisés afin de répondre à différents critères de sélection pour l’analyse et la sélection de l’enzyme L-asparaginase. La version bactérienne a servi de contrôle positif pour l’optimisation des systèmes microfluidiques afin de pouvoir analyser et de cribler des banques de mutants de la version humaine de l’enzyme L-asparaginase. / This thesis deals with the development of microfluidic tools for the engineering ofenzymes of therapeutic interest. Droplet microfluidics has enormous potential in the field ofquantitative biology. We are developing microfluidic tools based on the directed evolutionof the enzyme L-asparaginase, an enzyme used to treat acute lymphoblastic leukemia. Thistreatment is based on an enzyme of bacterial origin, which leads to immune reactions thatresult in the interruption of treatment, often fatal for the patient. However, a human version ofthe enzyme L-asparaginase, which is less immunogenic, is currently not sufficiently active to beused. The main objective of this thesis is to analyze and screen enzyme mutant libraries usingstandard mutagenesis methods and to analyze each mutant individually through microfluidics.For this, several microfluidic systems have been developed and optimized for different selectioncriteria for the analysis and selection of the enzyme L-asparaginase. The bacterial versionserving as a positive control for the optimization of microfluidic workflows to analyze andscreen mutant libraries of the human version of the enzyme L-asparaginase.